專利名稱：鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及鋰鹽在制備靶向治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖原合成酶激酶3 β (Glycogen Synthase Kinase 3 β，GSK-3 β )是具有絲氨酸 / 蘇氨酸激酶功能的蛋白分子，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)包括轉(zhuǎn)錄、糖代謝、細(xì)胞周期、凋亡、干細(xì)胞 發(fā)育等在內(nèi)的一系列重要功能。在疾病發(fā)生方面，由于其抑制糖原合成被認(rèn)為是非胰島素 糖尿病發(fā)生的重要機(jī)制；通過(guò)對(duì)胞內(nèi)NF-KB的激活使之在促進(jìn)某些炎癥的發(fā)生；對(duì)tau蛋 白的過(guò)磷酸化使之在阿爾茨海默氏病及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性功能異常中發(fā)揮重要的致病 作用。在腫瘤細(xì)胞中GSK_3i3同樣參與WnlHedgehog等通路的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中 扮演重要角色。GSK-3b在腫瘤細(xì)胞凋亡增殖方面的功能，目前尚存在爭(zhēng)議。大多數(shù)作者認(rèn) 為其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的功能，在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，然而近年來(lái)在 膠質(zhì)瘤、胰腺癌、甲狀腺髓樣癌、腎癌及MLL白血病中認(rèn)為該分子具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、 抗凋亡的功能，可能在這些類別腫瘤中是癌基因，同時(shí)是相關(guān)腫瘤治療的良好靶點(diǎn)。目前尚 無(wú)研究報(bào)道GSK-3i3在骨肉瘤中的功能。早在1940年初，氯化鋰曾代替氯化鈉用于高血壓及心臟病患者，以減少鈉的攝 入。與此同時(shí)，John Cade發(fā)現(xiàn)鋰能控制豚鼠的攻擊行為，使其變得安靜，認(rèn)為鋰有“鎮(zhèn)靜作 用”。Cade在經(jīng)自身安全性試驗(yàn)后，用鋰治療了 10例躁狂癥患者獲得了良好的效果。1949 年，Cade發(fā)表了 “鋰治療精神運(yùn)動(dòng)興奮” 一文，從此將鋰正式引入精神科臨床而用于治療躁 狂癥。鋰鹽的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)立了精神藥理學(xué)的先河，然而鋰鹽具有一定的毒副作用，限制了其廣泛 使用。1957年澳洲醫(yī)生Noack和Trautner提出了有效的血鋰濃度及為安全而進(jìn)行血鋰監(jiān) 測(cè)的重要性。此后的數(shù)年中，由于血鋰監(jiān)測(cè)的引入大大降低了鋰鹽毒副反應(yīng)的發(fā)生，因此自 1965年起鋰在歐洲被廣泛應(yīng)用，1970年美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)正式批準(zhǔn)鋰在美國(guó)使 用，我國(guó)也于20世紀(jì)70年代初應(yīng)用鋰治療躁狂癥。至此，鋰已被世界精神醫(yī)學(xué)界廣泛應(yīng)用 于精神科臨床，但迄今為止，未見(jiàn)鋰鹽在靶向抗骨肉瘤治療方面應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了提供鋰制劑在制備靶向抗骨肉瘤治療藥物的新用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含鋰制劑在靶向抗骨肉瘤治療方面的藥物組合物。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)磷酸化GSK-3 β (p_GSK_3 β )水平在人骨肉 瘤細(xì)胞U20S、U20S/MTX300、MG63、SA0S2及原代骨肉瘤細(xì)胞ZOS、ZOS-M中較人永生化骨肉 瘤細(xì)胞株hFOBl. 19低，而總的GSK-3i3表達(dá)水平無(wú)明顯差異。比較上述幾株骨肉瘤細(xì)胞 系平板克隆形成能力發(fā)現(xiàn)P_GSK-3i3水平越高克隆形成的能力越差，同時(shí)進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成 瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)p-GSK-3 0水平較低的幾株細(xì)胞U20S/MTX300、MG63及原代骨肉瘤細(xì)胞Z0S、 ZOS-M均可在裸鼠體內(nèi)成瘤而p-GSK-3 0水平較高的細(xì)胞株U20S、SA0S2未見(jiàn)腫瘤形成。噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GSK-3 β抑制劑氯化鋰對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S、U20S/MTX300、 MG63、SA0S2及原代骨肉瘤細(xì)胞ZOS具有明顯的細(xì)胞增殖抑制，在流式細(xì)胞檢測(cè)可見(jiàn)氯化鋰 可誘導(dǎo)明顯的凋亡峰出現(xiàn)，Western Blot檢驗(yàn)凋亡相關(guān)分子Caspase3及p_GSK_3 β同樣 呈現(xiàn)隨加藥時(shí)間變化出現(xiàn)顯著改變而GSK-3總量未見(jiàn)明顯變化。采用小片段干擾核糖核酸 (siRNA)干擾GSK-3b后也同樣能引起骨肉瘤細(xì)胞系的凋亡。我們通過(guò)空載體(vector)、 持續(xù)活化(constitutively active, CA)、持續(xù)失活(kinase dead, KD)的 GSK-3 β 質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染U20S骨肉瘤細(xì)胞，單克隆篩選并以western blot檢測(cè)，成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，包括 VeCtor、CA、KD的GSK-3i3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U20S骨肉瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)各株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆 形成及增殖能力發(fā)現(xiàn)，CA穩(wěn)定株在克隆形成及增殖速度上明顯快于vector及KD組。將上 述本身非成瘤的骨肉瘤細(xì)胞株U20S穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以IX IO6個(gè)接種于裸鼠腋下，經(jīng)過(guò)6周 后可見(jiàn)CA組裸鼠明顯成瘤而載體組及KD組未見(jiàn)明顯腫瘤形成。氯化鋰穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分 別給予20mM的氯化鋰(LiCl)，作用72小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染CA組凋亡顯著減少。為 探討LiCl誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，我們分別收取生理鹽水及LiCl 20mM處理72h的U20S 細(xì)胞，抽提蛋白后用于蛋白芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中XIAP、BCL2、CIAP、Survivin等NF-KB相關(guān)的 下游分子在LiCl處理后出現(xiàn)最為顯著的變化，結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道GSK-3 β可與1KB作用進(jìn) 而影響NF-KB通路的作用，進(jìn)而采用western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1KB及NF-KB均出現(xiàn)了相應(yīng)的 變化，因此LiCl誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡可能是通過(guò)GSK-3 β -IKB-NF-KB途徑發(fā)揮作用。隨后體 內(nèi)試驗(yàn)采用患者體內(nèi)分離的原代骨肉瘤細(xì)胞Z0S，于30只裸鼠內(nèi)建立皮下移植瘤模型，分 成對(duì)照組(生理鹽水)，阿霉素組(6mg/kg)，氯化鋰組(340mg/kg)，氯化鋰(340mg/kg) +小 劑量阿霉素組(3mg/kg)，氯化鋰(340mg/kg)+大劑量阿霉素組(6mg/kg)，每組6只。LiCl 腹腔給藥，隔天給藥一次，阿霉素腹腔給藥每周一次。當(dāng)對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)至1. 5cm時(shí)終止實(shí) 驗(yàn)，可見(jiàn)在氯化鋰、阿霉素及兩組聯(lián)合用藥組，腫瘤生長(zhǎng)均呈現(xiàn)明顯抑制，其中氯化鋰組與 阿霉素組腫瘤抑制率無(wú)明顯差異，氯化鋰+小劑量阿霉素組抑制腫瘤效果明顯優(yōu)于單用阿 霉素組且裸鼠體重減輕明顯少于單用阿霉素組，氯化鋰+大劑量阿霉素組抑制腫瘤效果在 各組中最佳，且該組裸鼠體重與單用阿霉素組不存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傊?，多項(xiàng)細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)藥理試驗(yàn)表明GSK_3i3是骨肉瘤治療的潛在 靶點(diǎn)，鋰制劑對(duì)于骨肉瘤具有顯著抗腫瘤效果，其抗骨肉瘤可能的作用機(jī)制是通過(guò) GSK-3 β-IKB-NF-KB途徑發(fā)揮作用，鋰在骨肉瘤的靶向藥物輔助治療方面具有臨床應(yīng)用 價(jià)值。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，鋰制劑具有顯著體內(nèi)及體外抗骨肉瘤作用，其作用可能是通 過(guò)磷酸化GSK-3 β抑制其功能而得以實(shí)現(xiàn)的，與經(jīng)典化療藥阿霉素等聯(lián)合使用明顯增強(qiáng)其 殺滅腫瘤的效果，是潛在的骨肉瘤靶向治療藥物。本發(fā)明的鋰鹽可以采用氯化鋰(LiCl)、碳酸鋰、硫酸鋰、枸櫞酸鋰、乳清酸鋰，以及 其他藥學(xué)上可以或者已經(jīng)使用的鋰鹽。本發(fā)明的另一方面，提供鋰制劑的藥物組合物，其包含鋰鹽以及藥學(xué)上可接受的 載體或賦形劑，如對(duì)于粉針劑而言，可以是等滲劑如NaCl、葡萄糖，對(duì)于注射液為水和粉針 劑的輔料；對(duì)于口服制劑包括但不限于粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑等。該藥物組合物 的劑型為粉針劑或注射液，也可以是口服制劑，口服制劑可以是口服液、片劑、膠囊劑、顆粒等。
制備片劑、膠囊劑、顆粒劑的崩解劑可以采用干燥淀粉、羥甲基淀粉鈉、微晶纖維 素、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，粘合 劑可以采用淀粉、乙醇、糊精、羥甲基纖維素鈉、潤(rùn)滑劑、助流劑可采用滑石粉、微粉硅膠、硬 脂酸鎂，也可以采用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的其他輔料。鋰制劑應(yīng)用于骨肉瘤靶向治療藥物的藥物時(shí)，通常采用以下治療方案添加等滲 調(diào)節(jié)劑如NaCl、葡萄糖等，制備成粉針劑或注射液，肌注或靜脈注射10-70mg/次(以鋰 計(jì))，每8 24小時(shí)一次，7 14天為一療程。也可以采用口服劑型，但同時(shí)劑量應(yīng)加倍。本發(fā)明的鋰制劑也可以與其他抗腫瘤藥物制成復(fù)方制劑，例如與阿霉素復(fù)方，能 達(dá)到增強(qiáng)甚至協(xié)同治療效果。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例是為了闡述對(duì)本發(fā)明所述藥物的有益效果及其制備方法的科學(xué) 性，但本發(fā)明的實(shí)施例決不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的任何限制。[實(shí)施例1]骨肉瘤細(xì)胞系中GSK_3i3的功能。1.1試驗(yàn)材料1. 1. 1 細(xì)胞系U20S、U20S/MTX300、MG63、SA0S2、Z0S、ZOS-M1. 1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6_8周齡BALB/c裸鼠(購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)1.1. 3試劑噻唑蘭(MTT) (Sigma，括號(hào)內(nèi)為生產(chǎn)公司，下同)，碘化丙啶(PI) (Sigma), DMSO 二甲基亞砜(Sigma)，LiCl (Sigma)，DMEM (—種含各種氨基酸和葡萄糖的 培養(yǎng)基)培養(yǎng)液(Gibico)，胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)，anti-GSK-3^ ( 一抗， Cell signal), anti-P-GSK-3 β _9Ser (—抗，Cell signal), anti_Caspase3 (—抗，Santa Cruz), anti-bcl2 ( 一 Santa Cruz), anti-bax ( 一 SantaCruz), lipofectamine 2000 (Invitrogen)，小片段干擾核糖核酸GSK-3 β (siRNA-GSK-3 β，廣州銳博合成)， pcDNA3. 1、GSK-3 β -CA及GSK-3 β -KD質(zhì)粒由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供。1. 2試驗(yàn)方法1. 2. Iffestern Blot 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各骨肉瘤株，去除培養(yǎng)液后以磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗2-3遍。加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10-20min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞， 在4°C條件下，12000g離心IOmin后，取少量上清進(jìn)行定量。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度， 充分混合后加上樣緩沖液，每次上樣前樣品于98°C 5-lOmin。電泳以初始電壓為70V時(shí)的 電流強(qiáng)度進(jìn)行，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)到濃縮膠與分離膠界面時(shí)，電壓100V電泳，在目的蛋白泳動(dòng)至 距膠下緣Icm以上結(jié)束。250mA轉(zhuǎn)膜lh。用3%脫脂牛奶封閉lh。1 500 1 1000稀 釋一抗，4°C孵育過(guò)夜。用PBST(抗體稀釋液，磷酸鹽緩沖溶液中加Tween20)浸洗三次， 每次5 lOmin。繼用二抗室溫輕搖lh。用PBST再浸洗三次，每次5-lOmin。使用辣根過(guò) 氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法顯色。1. 2. 2平板克隆形成用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每孔加入200個(gè)細(xì) 胞，每周更換培養(yǎng)基一次。14天時(shí)以PBS沖洗細(xì)胞兩次，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)克 隆數(shù)目。1. 2. 3裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)6_8周齡BALB/c裸鼠，隨機(jī)分組，每組5只，分別于右側(cè)腋部皮下接種5X IO6個(gè)骨肉瘤細(xì)胞，觀察腫瘤形成情況，斷頸處死裸鼠后取下腫瘤，福爾馬 林固定，行HE染色確定腫瘤形成。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株成瘤實(shí)驗(yàn)時(shí)分別于左右腋下各接 種一株克隆，余處理同上。1. 2. 4MTT 用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，計(jì)數(shù)，各孔中加入200 μ 1細(xì)胞懸液， 每孔加2000個(gè)骨肉瘤細(xì)胞。每孔加入LiCl，使各孔中LiCl終濃度依次為5、10、15、20、25、 30mM，處理72h。各孔中加入50μ1 ΜΤΤ，避光于37°C濕潤(rùn)環(huán)境中溫育4h。棄去孔中的培養(yǎng) 基和MTT各孔加入200 μ 1 DMSO搖勻，立即在酶標(biāo)儀上于490nm處記錄吸光值。1. 2. 5流式細(xì)胞儀檢測(cè)將PI溶于PBS (pH7. 4)中，終濃度為100 μ g/ml。用棕色瓶 4°C避光保存。收集LiCl(20mM 96小時(shí))處理過(guò)的骨肉瘤細(xì)胞(數(shù)目約1_5X IO6個(gè)/mL)， 1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌2次。離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇 固定，4°C，1-2小時(shí)。離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min。400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，IOOOr/ min離心5min，棄去PBS。用ImlPI染液染色，4°C避光30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI用氬離 子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光 強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖，于Gl峰之前出現(xiàn)的為亞二倍峰，代 表凋亡細(xì)胞。1. 2. 6siRNA干擾轉(zhuǎn)染前一天，2 X IO5個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上，每孔內(nèi)培養(yǎng)液為 1. 5ml不含抗生素的10% FBS DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。在250 μ 1的DMEM(或Opti-MEM，或其他 無(wú)血清培養(yǎng)基)無(wú)血清培養(yǎng)基加入IOOpmol siRNA柔和混勻；混勻Iipofectamin試劑，用 250 μ 1無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5 μ 1 Iipofectamin試劑，輕 輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋好的siRNA和Lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放 置 20 分鐘，以便形成 siRNA/lipofectamin 復(fù)合物。將 500 μ 1 siRNA/lipofectamin 復(fù)合 物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱 中37°C溫育72h后進(jìn)行檢測(cè)。1. 2. 7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定株篩選轉(zhuǎn)染前一天，5 X IO5個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上，1. 5mL 含F(xiàn)BS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。在250 μ 1的DMEM(或Opti-MEM，或其他無(wú)血清培養(yǎng)基)無(wú) 血清培養(yǎng)基加入4ug質(zhì)粒柔和混勻；混勻Iipofectamin試劑，用250 μ 1無(wú)血清的DMEM或 Opti-MEM,或其他無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5 μ 1 Iipofectamin試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘； 將稀釋好的質(zhì)粒和Lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘，以便形成DNA/ Iipofectamin復(fù)合物。將500 μ 1 DNA/lipofectamin復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng) 板的孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板。24h后由6孔板將細(xì)胞等份傳入直徑IOcm的培養(yǎng)皿 中，培養(yǎng)基中加入800 μ g/ml的G418，每2_3天更換抗生素，一周后G418濃度降為400 μ g/ ml。單克隆生長(zhǎng)至合適大小挑取單克隆，逐步擴(kuò)增并以Western Blot檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染情況。1. 3試驗(yàn)結(jié)果1. 3. Iffestern Blot 比較各株細(xì)胞內(nèi) p-GSK-3 β 水平表1 各株骨肉瘤細(xì)胞p-GSK-3 β表達(dá)水平比較
權(quán)利要求
鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于鋰鹽選自氯 化鋰、碳酸鋰、硫酸鋰、枸櫞酸鋰、乳清酸鋰，以及其他藥學(xué)上可以或者已經(jīng)使用的鋰鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于劑型為注射 液或粉針劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于劑型為口服 劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4之一所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于制 劑包括鋰鹽以及藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。
6.權(quán)利要求1所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于鋰鹽與其它藥物 復(fù)方制成復(fù)方制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的鋰制劑在制備抗骨肉瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于鋰鹽與 阿霉素復(fù)方制成復(fù)方制劑。
全文摘要
鋰制劑在靶向治療骨肉瘤方面的新用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)表明，鋰制劑具有顯著體內(nèi)及體外抗骨肉瘤作用，其作用可能是通過(guò)磷酸化GSK-3β抑制其功能而得以實(shí)現(xiàn)的，與經(jīng)典化療藥阿霉素等聯(lián)合使用明顯增強(qiáng)其殺滅腫瘤的效果。本發(fā)明的鋰制劑中的鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰、硫酸鋰、枸櫞酸鋰、乳清酸鋰，以及其他藥學(xué)上可以或者已經(jīng)使用的鋰鹽，本發(fā)明可以采用口服或注射劑型，也可以與其他藥物例如阿霉素制成復(fù)方制劑，制成制劑時(shí)，制劑中包括鋰鹽和藥學(xué)上可以接受的載體或者賦形劑。
文檔編號(hào)A61K33/00GK101991600SQ201010503829
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者唐清連, 尹軍強(qiáng), 康鐵邦, 曾益新, 沈靖南, 王晉, 謝顯彪, 鄒昌業(yè) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)