專利名稱：用于結(jié)腸癌的藥物組合物及其有效單體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和/或治療結(jié)腸癌的藥物組合物，其中所述組合物活性 成分由小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿組成。
背景技術(shù)：
腸癌是大腸粘膜上皮和腺體發(fā)生的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌。它是一種常 見的惡性腫瘤，在過去的20多年時間內(nèi)世界大多數(shù)國家或地區(qū)大腸癌發(fā)病呈上升趨勢，并 以發(fā)病率低的發(fā)展中國家上升更為明顯。腸癌是西方國家人群的主要病死原因之一，同時， 也是我國人群中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在各種惡性腫瘤中僅次于肺癌及乳腺 癌。多年來，結(jié)直腸癌5年生存率并未因手術(shù)進步得到顯著提高，仍停留在50%左右。腸癌的藥物治療，目前國際上主要采用三種治療方法1.化學(xué)藥物治療，手術(shù) 后的病人化療一般一年到一年半內(nèi)可使用2至3個療程，常用藥物主要是5-氟脲嘧啶 (5-FU)，也可聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素、環(huán)磷酰胺等。骨髓抑制明顯時可及時停藥。口服法胃腸道 反應(yīng)比靜脈給藥大，但骨髓抑制反應(yīng)輕。由于該藥物具有明顯的毒副作用，因此，用藥期間 必須注意支持治療，并且聯(lián)合應(yīng)用減少副作用的藥物。2.免疫治療，可以提高病人抗腫瘤 的能力，近年來發(fā)展很快，諸如干擾素、白細胞介素、轉(zhuǎn)移因子、腫瘤壞死因子等，已逐漸廣 泛應(yīng)用，不但可以提高病人的免疫能力、而且可以配合化療的進行。3.中藥治療，可改善癥 狀，增強機體的抗病能力，減少放療、化療的副作用，有的中藥有直接的抗癌作用，如白花蛇 舌草、半枝蓮、山慈姑、龍葵等。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的優(yōu)越性已為廣大醫(yī)患所認(rèn)同，中西醫(yī) 結(jié)合治療在提高生存質(zhì)量、阻斷癌前病變等方面有獨特的優(yōu)勢。用藥時可辨證、辨病兼顧， 加入清熱解毒、活血攻堅、滋陰養(yǎng)血、除痰散結(jié)、調(diào)補脾胃等方面的藥物。因此，中藥在治療 腸癌方面具有西藥無法比擬的優(yōu)勢。左金丸是出自《丹溪心法·火六》的名方，在《中國藥典》有收載，臨床上主要用 于治療胃腸道疾病。其組方藥材黃連Coptis ch inensis Franch.為毛莨科黃連屬多年 生草本植物，具清熱燥濕、瀉火解毒等功效，并有良好的抗菌、抗炎作用，主要活性成分為 小檗堿、黃連堿、巴馬亭和藥根堿等生物堿類成分。另一組方藥材吳茱萸Evodia rutaeca rpa(Juss.)Benth為蕓香科植物吳茱萸近干燥成熟的果實，具有溫胃止吐、溫脾止瀉、鎮(zhèn)痛 等功效，主要活性成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿和多糖等化合物，可舒張血管、促進胃排空 等。有關(guān)左金丸的研究主要集中在復(fù)方的藥理作用和組方不同比例配伍后對主要成分溶出 率的影響等方面。左金丸以及加味左金丸目前在臨床上被用于結(jié)腸癌的治療，取得了一定 的臨床效果，但其治療結(jié)腸癌的真正物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制不清楚。本發(fā)明旨在對左金丸中的單體化合物進行分離純化以得到單體成分，并通過上述 單體進行有效配伍，篩選出它們之間的最佳配比，以獲得療效確切的治療結(jié)腸癌的藥物組 合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種治療結(jié)腸癌的藥物組合物，所述藥物組合物的活性成分由小 檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿組成，其中所述小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿之間的比例 為5 10 3 8 1 5，優(yōu)選為5 7 3 5 1 2，最優(yōu)選為6 3 1。本發(fā)明還提供小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的分離和純化方法；同時提供一種 新的評價復(fù)雜藥物作用效果的方法，用于指導(dǎo)臨床上將左金丸用于腸癌的合理用藥。在本發(fā)明的一個具體實施方案中小檗堿的制備方法為取新鮮的黃連曬干粉碎， 得到黃連粗粉，粗粉用乙醇提取，濾過，合并濾液，濾液濃縮，放冷，加入冰醋酸，析出沉淀， 沉淀過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié) 晶，用有機溶劑重結(jié)晶，用氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值，得到純度為98%以上，單個有關(guān)物質(zhì)均小于 0. 的小檗堿單體化合物。其中，所述冰醋酸優(yōu)選為冰醋酸；所述加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH 值的步驟中，優(yōu)選調(diào)節(jié)PH為3-4 ；所述加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值的步驟中，優(yōu)選調(diào)節(jié)pH為 7. 5-10，更優(yōu)選為 7. 5-8. 0，或 8. 5-9. 0 或 9. 5-10，最優(yōu)選為 8. 5-9. 0。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法中優(yōu)選為采用5-15倍 量的乙醇提取，更優(yōu)選為5倍量乙醇，或10倍量乙醇，或15倍量乙醇，最優(yōu)選為5倍量乙醇。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法中提取用的乙醇為 10-95%乙醇，優(yōu)選為30-75%更優(yōu)選為50-70%乙醇，最優(yōu)選為60%乙醇。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法中提取時間為1-5小 時，優(yōu)選為1-4小時，更優(yōu)選為2-3小時，最優(yōu)選為2小時。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法中提取次數(shù)為1-5 次，優(yōu)選為1-4次，更優(yōu)選為2-3次，最優(yōu)選為3次。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法中重結(jié)晶的步驟中優(yōu) 選的有機溶劑為低級醇如甲醇，乙醇，丙醇等，氯代烴如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等，醚類 如石油醚、乙醚等，丙酮，乙酸乙酯，四氫呋喃、己烷等，更優(yōu)選位低級醇如甲醇，乙醇，丙醇 等，最優(yōu)選為乙醇。在本發(fā)明的更一個優(yōu)選的具體實施方案中，小檗堿的制備方法具體是指取新鮮的 黃連曬干粉碎，得到黃連粗粉，粗粉用5倍量60%的乙醇提取3次，每次2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用乙醇重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度大約為98%小檗堿單體化合物。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備方法為將吳 茱萸藥材粉碎后用有機溶劑提取，所述有機溶劑為低級醇如甲醇，乙醇，丙醇等，氯代烴如 氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等，醚類如石油醚、乙醚等，丙酮，乙酸乙酯，四氫呋喃、己烷等，更 優(yōu)選位低級醇如甲醇，乙醇，丙醇等，最優(yōu)選為乙醇；提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮 物用酸，優(yōu)選為無機酸如5%硫酸調(diào)節(jié)pH值，所述pH值優(yōu)選為調(diào)節(jié)至2-2. 5 ；之后放置，得 到褐色不溶物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，然后用堿，優(yōu)選用氨水調(diào)節(jié)PH值，優(yōu)選為調(diào) 至8-9，攪拌，放置，得到沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為 純度大約98%的吳茱萸次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取 至水相無生物堿，有機相濃縮、干燥，有機溶劑重結(jié)晶，得到純度大約98%的吳茱萸堿。
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本發(fā)明提出了一種新的評價治療腸癌藥物的作用效果的方法(機體網(wǎng)絡(luò)向健康 軌跡的回歸)。并且開發(fā)出一種由小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿組成的藥物組合物用于二 甲胼誘發(fā)的結(jié)腸癌大鼠的治療和干預(yù)。為了驗證本發(fā)明的合理性，申請人分別對小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的提取和 純化工藝進行了單因素試驗篩選，具體如下一、小檗堿提取、純化工藝的研究小檗堿的制備方法一般采用水或者是不同濃度的乙醇的提取、濃縮，濃縮液用酸 調(diào)節(jié)成酸性，去除雜質(zhì)，然后濾液在堿性條件下，析出小檗堿，為了提高小檗堿的純度，考慮 了不同有機溶劑進行重結(jié)晶。故，本發(fā)明單因素分別對乙醇濃度、溶劑量、提取時間、提取次 數(shù)、PH值、重結(jié)晶溶劑進行了考察，分別以浸膏率和小檗堿的純度為考核指標(biāo)。1、乙醇濃度的影響 取黃連粗粉適量，分別用5倍量30 %、60 %和75 %的乙醇提取3次，每次提取2小 時，以出膏率和小檗堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用5倍量60%乙醇出膏率最高，小檗堿 的含量最高，達到60%以上。2、溶劑量的影響取黃連粗粉適量，分別用5、10和15倍量60%的乙醇提取3次，每次提取2小時， 以出膏率和小檗堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個不同量的溶劑量對結(jié)果無明顯影響。 故提取溶劑量確定為5倍體積。3、提取時間的影響取黃連粗粉適量，用5倍量60%的乙醇提取3次，提取時間分別為1、2、4、小時，以 出膏率和小檗堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用提取時間為2小時出膏率最高，小檗堿的 含量最高，達到60%以上。4、提取次數(shù)的影響取黃連粗粉適量，用5倍量60%的乙醇分別提取2、3和4次，提取時間分別為2小 時，以出膏率和小檗堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用提取3次和4次時出膏率和小檗堿的 含量相當(dāng)，均大于提取2次的結(jié)果，故提取次數(shù)選擇為3次。5、pH 值考察取提取濃縮液，放冷，加入1 %冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值為5-6，析出大量沉淀，沉淀過濾， 去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，去除沉淀。濾液用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值 分別為7. 5-8. 0,8. 5-9. 0和9. 5-10,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值8. 5-9. 0時，黃色針狀結(jié)晶析出量最大， 并且小檗堿的純度最高，達到91 %以上。6、重結(jié)晶溶劑的考察得到黃色結(jié)晶物，分別用甲醇、乙醇和丙酮重結(jié)晶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙醇重結(jié)晶，得到 純度為98%以上，單個有關(guān)物質(zhì)均小于0. 的小檗堿單體化合物。根據(jù)上述單因素考察的結(jié)果，確定小檗堿的提取和純化工藝取新鮮的黃連曬干 粉碎，得到黃連粗粉，粗粉用5倍量60%的乙醇提取3次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液 濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過濾，去除。 溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶，用乙醇重 結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿單體化合物。
二、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取純化工藝吳茱萸堿和吳茱萸次堿均是從中藥吳茱萸中提取，為了提高收率和純度，將2個 單體采用一條流程提取純化，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取純化方法與小檗堿的相似，一 般采用含有一定濃度的乙醇提取，酸除去雜質(zhì)，堿調(diào)節(jié)PH值，得到吳茱萸堿和吳茱萸次堿， 得到粗品后用有機溶劑重結(jié)晶。故，本發(fā)明單因素考察分別進行了不同濃度的乙醇、乙醇加 入量、提取時間、提取次數(shù)、PH值、重結(jié)晶溶劑進行了考察，分別以浸膏率和吳茱萸堿和吳茱 萸次堿的純度為考核指標(biāo)。1、乙醇濃度的影響取吳茱萸粗粉適量，分別用6倍量50%、60%和75%的乙醇提取3次，每次提取3 小時，以出膏率和吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用6倍量75%乙醇 出膏率最高，吳茱萸堿的含量最高，達到98%以上。3、溶劑量的影響取吳茱萸粗粉適量，分別用4、6和8倍量75%的乙醇提取3次，每次提取3小時， 以出膏率和吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6倍量75%乙醇出膏率最 高，吳茱萸堿的含量最高，達到98%以上。3、提取時間的影響取吳茱萸粗粉適量，用6倍量75%的乙醇提取3次，提取時間分別為2、3、4、小時， 以出膏率和吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用提取時間為3小時和4 小時時，出膏率和吳茱萸堿的含量無明顯變化，吳茱萸堿的含量達到98%以上。4、提取次數(shù)的影響取吳茱萸粗粉適量，用6倍量75%的乙醇分別提取2、3和4次，提取時間分別為3 小時，以出膏率和吳茱萸堿的含量為考核指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用提取3次和4次時出膏率和吳茱 萸堿的含量相當(dāng)，均大于提取2次的結(jié)果，故提取次數(shù)選擇為3次。5、pH 值考察取提取濃縮液，放冷，加入5%硫酸，調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，析出大量褐 色沉淀，沉淀過濾，去除。濾液用氨水調(diào)節(jié)PH值分別為7-8，8-9和9-10，攪拌15分鐘，放置 4小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PH值8-9時，沉淀量最大，并且吳茱萸次堿的純度最高，達到98%以上。6、重結(jié)晶溶劑的考察得到吳茱萸次堿的粗品，分別用氯仿、甲醇、乙醇和丙酮重結(jié)晶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氯 仿-甲醇(8 1)重結(jié)晶，得到純度為98%以上的吳茱萸次堿單體化合物。隨后，氨水沉 淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿，有機相濃縮、干 燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大約98%的吳茱萸堿。根據(jù)上述單因素考察的結(jié)果，確定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取和純化工藝， 將吳茱萸藥材粉碎后用6倍量75%乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 至少量沉淀析出，濃縮物用5 %硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶物，過 濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到沉淀， 該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸次堿。 氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿，有機相 濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大約98%的吳茱萸堿。
三、小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿單體及其不同比例組合以及左金丸對結(jié)腸癌 作用的影響目前認(rèn)為，大腸癌的發(fā)生是一個多基因、多步驟、多途徑的過程，主要可以分為 兩種途徑染色體不穩(wěn)定性和錯配修復(fù)途徑。其中涉及多種癌基因、抑癌基因和錯配修復(fù)基 因以及基因啟動子的甲基化等。染色體不穩(wěn)定性途徑，其基本原理可以描述為染色體的不 穩(wěn)定性引起抑癌基因的失活(雜合性丟失)和癌基因的激活，從而導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生，并且 遵循“正常粘膜一腺瘤一腺癌”的發(fā)展順序。為了闡述小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿單體及其不同比例組合以及左金丸本身 對結(jié)腸癌的作用效果，本發(fā)明利用二甲胼誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型，對小檗堿吳茱萸堿吳茱萸 次堿不同比例組合物(分別為1 8 1、1 1 8、6 3 1、7 2 1、8 1 1)， 單方小檗堿、單方吳茱萸堿、單方吳茱萸次堿和左金丸進行對照研究，以證實小檗堿吳茱 萸堿吳茱萸次堿的藥物組合物比所述單體以及左金丸對結(jié)腸癌具有更好的效果采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對二甲胼誘發(fā)的腸癌模型不同時間點的大鼠的尿 液，進行ECF和TMS衍生化分析，進行GC-MS分析，獲得圖譜進行預(yù)處理后，數(shù)據(jù)分別利用 Turbomass, Matlab和Simca-P 11. O分析，獲得大鼠不同組大鼠代謝軌跡的變化，結(jié)果表 明相對于單體小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿以及左金丸，二甲胼誘導(dǎo)的癌前病變組和癌 癥組大鼠給予適當(dāng)比例的小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿藥物組合物時，大鼠的代謝軌跡 明顯向健康大鼠回歸，提示由小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿組成的組合物，可通過機體 網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控對結(jié)腸癌的預(yù)防和治療起到一定的作用。


圖1代謝組學(xué)研究的一般流程圖2ECF衍生化尿液的GC-MS圖譜圖3TMS衍生化尿液的GC-MS圖譜圖4、健康組大鼠和癌前病變組和癌癥組大鼠的PCA5、健康組大鼠和癌前病變組和癌癥組大鼠的PLS-DA圖(R2X = 0. 698 ；Q2X (cum) =0. 613)圖6、給藥10周小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和左金丸組的PCA7、健康組大鼠、癌前病變組和給藥組大鼠(給藥組比例為小檗堿吳茱萸堿 吳茱萸次堿的比例為6 3 1)的PCA8、健康組大鼠、癌癥組和給藥組(給藥組比例為小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次 堿的比例為6 3 1)大鼠的PCA圖具體實施實例實施實例1 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量30%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例2 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合并
7濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例3 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量75%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例4 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入10倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合 并濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀 過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié) 晶，用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例5 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入15倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合 并濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀 過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié) 晶，用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例6 小檗堿的制備 取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取1小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例7 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取4小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例8 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取2次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例9 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取4次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過 濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶， 用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以上的小檗堿。實施實例10 小檗堿的制備
取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取2次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值為5-6，析出 大量沉淀，沉淀過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié) 晶，黃色針狀結(jié)晶，用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為7. 5-8. 0，得到純度為98%以 上的小檗堿。實施實例11 小檗堿的制備 取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值為5-6，析出 大量沉淀，沉淀過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié) 晶，黃色針狀結(jié)晶，用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為98%以 上的小檗堿。實施實例12 小檗堿的制備取黃連粗粉適量，加入5倍量60%乙醇回流提取3次，每次提取2小時，濾過，合并 濾液，濾液濃縮至40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值為5-6，析出 大量沉淀，沉淀過濾，去除。溶液加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié) 晶，黃色針狀結(jié)晶，用有機溶劑重結(jié)晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為9. 5-10. 0，得到純度為98 %以 上的小檗堿。實施實例13 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用6倍量50 %乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不 溶物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得 到沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%。氨水 沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿，有機相濃縮、 干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例14 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用6倍量60 %乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不 溶物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得 到沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%。氨水 沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿，有機相濃縮、 干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大約98%的吳茱萸堿。實施實例15 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用6倍量75%乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不 溶物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得 到沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例16 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備
9
將吳茱萸藥材粉碎后用4倍量75%乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶 物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到 沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例17 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用8倍量75 %乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60 V旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶 物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到 沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例18 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用8倍量75 %乙醇提取3次，每次提取2小時，提取液60 V旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶 物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到 沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例19 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用8倍量75 %乙醇提取3次，每次提取4小時，提取液60V旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶 物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到 沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施實例20 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用8倍量75 %乙醇提取3次，每次提取4小時，提取液60V旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶 物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為7-8，攪拌15分鐘，放置4小時，得到 沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%的吳茱萸 次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物堿， 有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%，單個雜質(zhì)小于0. 的吳茱萸堿。實施實例21 吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備將吳茱萸藥材粉碎后用8倍量75%乙醇提取3次，每次提取4小時，提取液60°C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不 溶物，過濾，濾液為酸性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為9-10，攪拌15分鐘，放置4小時，得 到沉淀，該沉淀用氯仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約98%，單個雜質(zhì)小于0.1%的吳茱萸次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取 3次至水相無生物堿，有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大于98%的吳茱萸堿。實施例22小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿組合物的制備按照上述方法提取的單體化合物，按照6 3 1(小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次 堿)制備采用混合的方法成固體混合物作為制劑的主藥。采用等量遞加法制備片劑(包括 濕法制粒壓片、干法制粒壓片以及粉末直接壓片的方法制備片劑)，片劑的填充劑主藥是微 晶纖維素、乳糖、淀粉，崩解劑為低取代羥丙基甲基纖維素，潤滑劑為硬脂酸鎂和滑石粉，粘 合劑為3%聚維酮水溶液(片劑的輔料包括上述部分，但是不局限于上述內(nèi)容)；膠囊劑的 制備采用主藥加入一定的輔料(輔料包括微晶纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、滑石粉等)粉末直 接管裝膠囊和制顆粒裝膠囊。實施實例23 大鼠尿液的代謝組學(xué)研究23. 1結(jié)腸癌動物模型的建立二甲胼誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型是一種成熟的動物模型。本研究采用Wistar雄性大鼠230 只，隨機分為2組，對照組10只，按1. 2ml/100g體重腹腔注射lmmol/L EDTA，每周1次；DMF 誘癌組220只，按25mg/kg體重腹腔注射DMH，每周1次，DMH在臨用前用lmmol/L EDTA配 成5mg/ml的溶液，并以Im0VLNaHCO3調(diào)pH到6. 5-7. 0，給藥6周，從病理切片發(fā)現(xiàn)腫塊，11 組停止DMF給藥。給藥10周有病變?yōu)橐罁?jù)，共計11組判斷模型成功。23. 2動物分組和給藥劑量誘癌組動物分為22組(11組為癌前病變組，11組為癌癥組)，分別給與小檗堿 吳茱萸堿吳茱萸次堿1 8 1、1 1 8、6 3 1、7 2 1、8 1 1，單方小 檗堿組、單方吳茱萸堿組、單方吳茱萸次堿和左金丸對照組按照5ml/kg體重腹腔注射混合 溶液(混合溶液的質(zhì)量濃度為lmg/mL)和陽性藥物對照組，每周1次，陽性藥物選擇為阿司 匹林，按照lmg/kg體重腹腔注射，每周1次；和C0X-2抑制劑(塞來昔布)按照0. 25mg/kg 體重腹腔注射，每周1次；分別于造模后4周和8周給與藥物干預(yù)和治療。23. 3大鼠尿液的代謝組學(xué)研究代謝組學(xué)在實驗動物領(lǐng)域的研究流程通常包括前期適合的動物模型的建立，樣品 收集和制備，中期的代謝產(chǎn)物檢測、分析鑒定以及后期的數(shù)據(jù)分析與模型建立和生化解釋。 詳細的流程見圖1。23. 3.1尿液收集癌前病變組和癌癥組大鼠造模成功后，每次給藥后8小時，利用大鼠代謝籠，每籠 一只。收集24小時的全部尿液用于代謝組學(xué)的研究，保存于-20°C冰箱。直至樣本進行儀 器分析。23. 3. 2尿液衍生化方法(I)TMS衍生化方法二甲胼大鼠的尿液，用乙腈沉淀蛋白后用鹽酸和氫氧化鈉調(diào) 節(jié)酸堿度，濃縮、干燥，剩余物用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯層氮氣干燥后進行TMS衍生化。具 體操作如下a.取Iml尿液置于玻璃試管中，依次加入Iml乙腈和Iml 20%的鹽酸，混合物 95 °C水浴水解Ih ；b.向上述水解液中加入0. IM的氫氧化鈉Iml中和水解物，70°C水浴蒸干，殘留物用2ml乙酸乙酯溶解；c.乙酸乙酯溶液震蕩IOmin后，3000rpm離心5min，分離上層(乙酸乙酯層)，氮
氣吹干；d.加入TMS衍生化試劑50 μ L，70°C衍生化反應(yīng)30分鐘。取0. 5 μ L注入GC-MS。(2) ECF衍生化方法尿液加入無水氯甲酸乙酯、氯仿沉淀，氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值，后 超聲、離心，分離氯仿層，直接進樣，氯仿層除去水分直接進樣。具體操作如下a.取300 μ L置于玻璃試管中，依次加入尿液300 μ L、內(nèi)標(biāo)液100 μ L (L-2-氯苯丙 氨酸，0. lmg/mL)、無水乙醇400yL、吡啶100 μ L和氯甲酸乙酯50 μ L，渦旋10s，超聲Imin ；b.加入氯仿 300μ L，渦旋 30s，3000rpm 離心 5min ；c.同時加入7MNa0H溶液100 μ L(調(diào)節(jié)pH值到9-10之間)和氯甲酸乙酯50 μ L， 渦旋 10s，超聲 Imin,渦旋 30s, 3000rpm 離心 5min ；d.將得到的分層溶液取出下層氯仿層，加入適量無水硫酸鈉除凈水分，從中取出 200 μ L左右置于GC-MS進樣瓶。23. 3. 3 GC-MS 分析將衍生化的樣品在優(yōu)化的條件下，進行GC-MS分析，獲得分析圖譜如下(圖2和圖 3)23. 4數(shù)據(jù)處理和模式識別尿液經(jīng)衍生化GC-MS分析，獲得的原始圖譜需要經(jīng)過一個前處理過程，這個過程 主要包括去噪音、除內(nèi)標(biāo)、峰判別，峰對齊，歸一化等步驟，經(jīng)過前處理后的數(shù)據(jù)方可進行多 維及單維數(shù)據(jù)分析，從而得到更接近生物學(xué)意義的結(jié)果和解釋。通過Turbomass軟件的和 Matlab7. 0判峰程序，處理過程大致可以分為基線矯正、峰判別和匹配、內(nèi)標(biāo)和一些系統(tǒng)雜 峰的排除以及用峰面積總和的方法進行峰歸一化。最終得到一個由指定的峰序列號(與保 留時間和質(zhì)荷比對應(yīng))、觀測點(樣品號)以及歸一化后的峰強度組成的三維矩陣，然后，將 上述經(jīng)過Matlab處理的三維矩陣導(dǎo)入到Simca-P 11. 0軟件包(Umetrics，Umea, Sweden) 中用于多維統(tǒng)計和模式識別，在模式識別中，本研究采用了代謝組學(xué)常用的非監(jiān)督和監(jiān)督 的多維統(tǒng)計方法，先用非監(jiān)督的模式識別方法_主成分分析PCA，來觀察樣品的自然聚集、 離散及離群點。進而在模式識別的不同象限確定其不同生物樣本的網(wǎng)絡(luò)變化軌跡情況。分 別獲得如下結(jié)果從PCA得分圖中我們可以看到，健康組大鼠與其他兩組在PC—維上分離明顯，而 癌前病變組和癌癥組在PC 二維上產(chǎn)生分離，可以初步推斷健康組代謝譜相對于模型組產(chǎn) 生了 一定的變化。為了進一步證明，大鼠癌前病變組在給予一定的藥物干預(yù)后，機體代謝網(wǎng)絡(luò)變化 的軌跡，我們分別進行了大鼠癌前病變組給藥6周時健康對照組、9組癌前病變給藥組和2 組陽性藥物組的模式識別。發(fā)現(xiàn)給予大鼠不同比例的小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿藥物 組合物時，大鼠的代謝輪廓向健康組有回歸的趨勢。但是單獨給予單體小檗堿、吳茱萸堿、 吳茱萸次堿及左金丸組時，大鼠的代謝輪廓和2個化學(xué)藥物的陽性對照組無顯著性差別， 向健康回歸的趨勢不明顯(給藥10周后小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和左金丸組的PCA 圖變化見圖6)。然而，當(dāng)給予小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿6 3 1時，給藥不同時間 點大鼠的代謝模式發(fā)生了一定的變化(PCA圖見圖7)，大鼠給藥后2周代謝模式有向健康回歸的趨勢，給藥后4周和5周有一定的交叉，該2組分離不是十分明顯，但是給藥后6周 大鼠的代謝輪廓向健康組回歸十分明顯。說明，大鼠給予小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿 6:3: 1時，大鼠達到了一個在整體代謝網(wǎng)絡(luò)上更趨近于健康的平衡。說明小檗堿吳茱 萸堿吳茱萸次堿631對結(jié)腸癌的癌前病變有明顯的干預(yù)作用。同時為了進一步證明，癌癥組在給予一定的藥物干預(yù)后，機體代謝網(wǎng)絡(luò)變化的軌 跡，我們分別進行了大鼠癌癥組給藥10周時健康對照組、9組癌癥組給藥組(包括單體小 檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和左金丸組)和陽性藥物組的模式識別。發(fā)現(xiàn)給予大鼠不同比 例的小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿，大鼠的代謝輪廓向健康組有回歸的趨勢。并且，當(dāng)給 予小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿6 3 1時(PCA圖見圖8)，大鼠回歸的軌跡與癌前 病變組回歸的軌跡基本相似，給藥后2周有一定的回歸趨勢，給藥后4周和6周代謝模式基 本相同，2組基本上沒有任何區(qū)分，說明大鼠在病態(tài)下，可能機體達到了一個穩(wěn)態(tài)，然而，給 藥后10周，大鼠向健康組回歸十分明顯，。說明，大鼠給予小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿 6:3: 1時，大鼠達到了一個在整體代謝網(wǎng)絡(luò)上更趨近于健康的平衡。說明小檗堿吳茱 萸堿吳茱萸次堿631對結(jié)腸癌的癌證有明顯的治療作用。結(jié)論通過以上實驗表明，小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿6 3 1時對二甲胼 誘導(dǎo)的結(jié)腸癌癌前病變和結(jié)腸癌在代謝模式上有明顯向健康回歸的趨勢，初步可以說明該 組合物可能通過對集體網(wǎng)絡(luò)變化的改變而產(chǎn)生干預(yù)和治療結(jié)腸癌的作用。
1權(quán)利要求
一種用于預(yù)防和/或治療結(jié)腸癌的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的活性成分由小檗堿∶吳茱萸堿∶吳茱萸次堿組成。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿的比例為5 10 3 8 1 5。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿的比例為5 7 3 5 1 2。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述小檗堿吳茱萸堿吳茱萸次堿的比例為 6 ！ 3 ！ I0
5.如權(quán)利要求1-4之一的藥物組合物，所述組合物是以片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑 等劑型存在。
6.純度大于99%小檗堿的制備方法，其特征在于將新鮮的黃連曬干粉碎，得到黃連 粗粉，然后用含水有機溶劑提取，提取液濃縮，濃縮物用醋酸去除雜質(zhì)后溶液氫氧化鈣調(diào)節(jié) PH值，得到黃色針狀結(jié)晶，所述針狀結(jié)晶用有機溶劑和/或水重結(jié)晶，得到純度為99%以上 的小檗堿。
7.純度大于99%吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備方法，其特征在于將吳茱萸藥材粉碎 后用含水有機溶劑提取，提取液濃縮，濃縮物分別用硫酸、堿調(diào)節(jié)PH值，氯仿-丙酮不同比 例重結(jié)晶，得到純度為99%以上的吳茱萸堿和吳茱萸次堿。
8.按照權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于所述的提取有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷。
9.按照權(quán)利要求7所述的重結(jié)晶小檗堿的制備方法，其特征在于使用的有機溶劑為 甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
10.按照權(quán)利要求6所述小檗堿的制備方法，其特征在于取新鮮的黃連曬干粉碎，得 到黃連粗粉，粗粉用10倍量60%的乙醇提取3次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液濃縮至 40°C測定相對密度為1.45，放冷，加入冰醋酸，析出大量沉淀，沉淀過濾，去除。溶液加 入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3-4，放置過夜，得到黃色針狀結(jié)晶，黃色針狀結(jié)晶，用有機溶劑重結(jié) 晶，氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值為8. 5-9. 0，得到純度為99%以上的小檗堿。
11.按照權(quán)利要求7所述吳茱萸堿和吳茱萸次堿的制備方法，其特征在于將吳茱萸藥 材粉碎后用6倍量75%乙醇提取3次，每次提取3小時，提取液60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量沉淀 析出，濃縮物用5%硫酸調(diào)節(jié)pH值為2-2. 5，放置6小時，得到褐色不溶物，過濾，濾液為酸 性稀乙醇溶液，用氨水調(diào)節(jié)PH值為8-9，攪拌15分鐘，放置4小時，得到沉淀，該沉淀用氯 仿-甲醇(8 1)洗滌至白色，得到白色晶體，為純度大約99%，單個雜質(zhì)小于0.1%的吳 茱萸次堿。氨水沉淀后過濾，得濾液，該濾液用氯仿-丙酮(6 1)萃取3次至水相無生物 堿，有機相濃縮、干燥，乙醇重結(jié)晶，得到純度大約99%，單個雜質(zhì)小于0. 1 %的吳茱萸堿。
12.采用氯甲酸乙酯(ECF)和三甲基硅烷(TMS)衍生化，氣相色譜和質(zhì)譜連用(GC-MS) 測定二甲胼誘發(fā)的腸癌模型不同時間點的大鼠的尿液的優(yōu)化的分析方法。
13.采用12的分析方法，結(jié)合PLS-DA和PCA進行多維統(tǒng)計的方法評價二甲胼大鼠代謝 軌跡回歸的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于結(jié)腸癌的藥物組合物及其有效單體的制備方法。本發(fā)明以臨床上應(yīng)用經(jīng)典左金丸組方治療結(jié)腸癌為依據(jù)，通過對多種組方進行配伍篩選出小檗堿∶吳茱萸堿∶吳茱萸次堿藥物組合物。采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定二甲肼誘發(fā)的腸癌模型不同時間點的大鼠的尿液，結(jié)合模式識別的方法，發(fā)現(xiàn)二甲肼誘導(dǎo)的癌前病變組和癌癥組大鼠給予適當(dāng)比例的小檗堿∶吳茱萸堿∶吳茱萸次堿藥物組合物時，大鼠的代謝軌跡明顯向健康大鼠回歸，提示由小檗堿∶吳茱萸堿∶吳茱萸次堿組成的組合物，可通過機體網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控對結(jié)腸癌的預(yù)防和治療起到一定的作用。
文檔編號A61P35/00GK101978962SQ20101028685
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者龐偉, 王金龍, 陳蓉娜, 陳鵬, 陶秀梅 申請人:陶秀梅;陳鵬;陳蓉娜