專利名稱：一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和藥物制劑領(lǐng)域，涉及載藥遞釋系統(tǒng)，具體涉及一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，尤其涉及一種腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
臨床腫瘤治療研究顯示，單一藥物用于腫瘤治療已不能徹底治療腫瘤。分析其原因在于，由于腫瘤細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)性，臨床長期給予單一的藥物，致使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受性，導(dǎo)致藥物失去腫瘤治療作用，特別是單純的化學(xué)療法中，普遍存在多藥耐藥的弱點(diǎn)。 因此，臨床嘗試采用聯(lián)合藥物治療解決這一難題?；熕幬锫?lián)合用藥可以有效防止腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐受性，提高藥物的治療作用。療效的提高可以降低所需藥物劑量，進(jìn)而降低對人體正常組織的毒副作用。目前，本領(lǐng)域?qū)τ诨蛩幬锖突熕幬锫?lián)合用藥已經(jīng)顯現(xiàn)出越來越濃厚的興趣。 聯(lián)合藥物治療主要包括不同化療藥物的聯(lián)合以及基因藥物與化療藥物的聯(lián)合。然而，聯(lián)合用藥的發(fā)展卻受制于多次給藥和繁瑣的藥物系統(tǒng)構(gòu)建，特別是基因藥物和化療藥物聯(lián)合用藥，需要分別構(gòu)建系統(tǒng)來進(jìn)行運(yùn)載藥物。因此，腫瘤聯(lián)合用藥成功的一個關(guān)鍵手段就是設(shè)計(jì)簡單高效、高載藥量的基因藥物聯(lián)合遞釋系統(tǒng)，在提高腫瘤治療效果的同時，逆轉(zhuǎn)耐藥性并且降低毒副作用。目前，有研究利用膠束，脂質(zhì)體和納米粒等，將基因藥物和化療藥物遞送至發(fā)揮作用的位點(diǎn)，發(fā)揮作用，并且相互促進(jìn)得到聯(lián)合治療效果，如；將抗腫瘤化療藥物阿霉素、肉紅霉素或5—氟尿嘧啶插入到基因的堿基對形成復(fù)合物，該復(fù)合物可在血液中保持相對完整，阿霉素不會泄露。但較成功的一個載體可以同時遞送基因藥物和化療藥物的遞送系統(tǒng)仍然很少。有文獻(xiàn)報道將高分子材料作為基因藥物載體，樹枝狀高分子材料如聚酰胺一胺樹狀分枝物(polyamidoamine dendrimer,簡稱 PAMAM)和聚賴氨酸(dendri-graft polylysines,簡稱DGL)是近年來出現(xiàn)的納米級的合成高分子，高度分枝，呈單分散性，其末端氨基豐富，并易于經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎椷B接靶向頭基等生物活性物質(zhì)，有望成為良好的藥物載體，而由于這些樹枝狀高分子載體表面的氨基在生理?xiàng)l件下質(zhì)子化，帶正電荷，因此可考慮作為非病毒載體材料攜載基因藥物。主動靶向是構(gòu)建靶向遞釋系統(tǒng)的一個主要策略，利用特定的頭基修飾系統(tǒng)，特異性結(jié)合特定細(xì)胞表面過度表達(dá)的受體以達(dá)到靶向輸送的作用。研究顯示，腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)一系列受體，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體被用作靶點(diǎn)已有較長的研究歷史。但是，內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，簡稱為Tf)濃度很高，約為25 mM，可與以轉(zhuǎn)鐵蛋白作為靶向頭基的給藥系統(tǒng)競爭腫瘤細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，從而影響腫瘤靶向效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，尤其涉及一種多肽修飾的腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明中，選用通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的多肽修飾高分子材料，以多肽為靶向頭基，高分子材料為基礎(chǔ)高分子載體，通過靜電作用與基因化療藥物復(fù)合物形成納米遞釋系統(tǒng)。該遞釋系統(tǒng)以內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對載藥遞釋系統(tǒng)的攝取，并且安全。具體而言，本發(fā)明的一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、治療基因和化療藥物制成。本發(fā)明中，所述高分子材料與聚乙二醇的分子比為1 :2 1 :10 ；高分子材料與多肽的分子比為1 :1 1 :5 ；高分子材料與治療基因的質(zhì)量比為3 :1 10 1 ；治療基因與化療藥物的分子比為0. 025 3000 8 :3000o本發(fā)明中，高分子材料為樹枝狀，其內(nèi)部有空腔；本發(fā)明的一個實(shí)施例選用的高分子材料為聚酰胺一胺型樹狀分枝物和聚賴氨酸。本發(fā)明中，治療基因包括編碼人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)蛋白的基因(pORF-hTRAIL)以及其它所有具有抗腫瘤效果的基因；所述化療藥物包括阿霉素，柔紅霉素和5—氟尿嘧啶等可以插入到基因堿基對的抗腫瘤化療藥物。所述的TRAIL蛋白能介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，其介導(dǎo)凋亡的機(jī)制是通過細(xì)胞表面凋亡受體調(diào)節(jié)的主動的外部的途徑，這些凋亡受體在與凋亡配體結(jié)合后傳導(dǎo)凋亡信號， 另一方面，化療藥物介導(dǎo)的凋亡是典型的內(nèi)部途徑，如基因嚴(yán)重?fù)p壞，低氧，或者其他的細(xì)胞應(yīng)激，因此，本發(fā)明通過聯(lián)合化療藥物和編碼TRAIL蛋白的基因能得到協(xié)同的殺腫瘤細(xì)胞效果。本發(fā)明中，所述的載體系統(tǒng)采用多肽修飾樹枝狀高分子材料形成納米粒，所述的多肽(T7)其氨基酸序列為HAIYPRH，該多肽為可特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多肽，通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到。本發(fā)明所述的多肽(T7)為小分子多肽，可化學(xué)合成，穩(wěn)定性好，作為靶向頭基空間位阻小；對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的親和力和轉(zhuǎn)鐵蛋白相當(dāng)，Kd值大約IOnM左右；多肽(T7)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)與轉(zhuǎn)鐵蛋白不同，不與轉(zhuǎn)鐵蛋白競爭抑制且不影響轉(zhuǎn)鐵蛋白本身的生理功能，相反轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合會促進(jìn)多肽(T7)的入胞效率。本發(fā)明中，所述聚乙二醇選自馬來酰亞胺一聚乙二醇3 500—琥珀酰亞胺 (MAL-PEG3500-NHS)。本發(fā)明腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)適用于靶向人體來源和動物來源的腫瘤細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明提供了多肽修飾的腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括步驟
將高分子材料溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┲信渲瞥蓛湟?，取適量于西林瓶中吹干，稱取適量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料比例為1 :2 1 :10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時即可；
將多肽溶于適量磷酸鹽緩沖液里，配制成適當(dāng)濃度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，與高分子材料比例1 :1 1 :5，一定溫度下反應(yīng)對h，制得腫瘤靶向納米載體， 轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)和多肽(T7)，pH值7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶； 將治療基因溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，與化療藥物阿霉素，分子比例為0.025 3000 8 :3000，質(zhì)量比例為2. 25 :58 720 :58，在pH值7. 4的磷酸鹽緩沖液中復(fù)合，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物；
將腫瘤靶向載體加入以質(zhì)量比為3 1,6 1,10 1 (基礎(chǔ)載體比基因)到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，并立即渦旋30 s，即得腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)利用腫瘤靶向非病毒載體攜載基因的方法，攜載基因藥物和化療藥物的復(fù)合物，并將復(fù)合物輸送至腫瘤細(xì)胞；這些復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后， 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。具有轉(zhuǎn)鐵蛋白作為靶向頭基的優(yōu)點(diǎn)，并且有效避免內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白的干擾，靶向和治療效率高、制備簡捷，可以較廣泛應(yīng)用于其它腫瘤組織的靶向治療。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)及有益效果是，
1)利用阿霉素可以插入到治療基因雙鏈中，形成基因阿霉素復(fù)合物，使得正電性的高分子材料可以通過靜電作用同時攜載兩種藥物，發(fā)揮協(xié)同效果；
2)可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的新型多肽(T7)修飾高分子材料，靜電結(jié)合基因化療藥物復(fù)合物制成腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)，使載藥遞釋系統(tǒng)的分布具有了多肽(T7)的腫瘤靶向特征和細(xì)胞攝取特征，提高腫瘤細(xì)胞的攝取效率和腫瘤的治療效率。3)制備方法簡單，不需要特殊的處理，可直接用于細(xì)胞和動物試驗(yàn)；
4)本藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)由于系統(tǒng)中多肽修飾的作用，賦予了載藥遞釋系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，并且治療基因和化療藥物不同機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生長，提高了載藥遞釋系統(tǒng)對腫瘤的治療效率。


圖1是阿霉素?zé)晒夤庾V表征阿霉素與基因不同比例復(fù)合。圖2是凝膠電泳考察載體對基因阿霉素復(fù)合物的遷移影響。M 基因標(biāo)記物；A 裸基因；B 游離阿霉素；C 基因阿霉素復(fù)合物；D，E和F 載體與基因質(zhì)量比分別為3 1,6 :1， 10 1的非靶向系統(tǒng)PAMAM/DNA-D0X。圖3是體外考察阿霉素自游離阿霉素、基因阿霉素復(fù)合物、非靶向系統(tǒng)PAMAM/ DNA-DOX中的釋放行為。圖4倒置熒光顯微鏡觀察肝腫瘤細(xì)胞Bel-7402對非靶向載體(PAMAM和 PAMAM-PEG)以及靶向載體(PAMAM-PEG-T7)攜載的基因阿霉素復(fù)合物的攝取；綠色表示熒光探針(Y0Y0-1)標(biāo)記的基因，紅色表示阿霉素。圖5是倒置熒光顯微鏡觀察分別給予Bel-7402腫瘤細(xì)胞孵育載綠色熒光蛋白報告基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM/pEGFP-N2和PAMAM_PEG/pEGFP_N2)，載阿霉素和綠色熒光蛋白報告基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM/pEGFP-N2-D0X和PAMAM-PEG/pEGFP-N2_D0X)，載綠色熒光蛋白報告基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2)以及載阿霉素和綠色熒光蛋白報告基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2-D0X) 2 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；其中設(shè)立共同孵育轉(zhuǎn)鐵蛋白(血漿濃度25 μΜ)的對照組，綠色表示綠色熒光蛋白，放大倍數(shù)為100倍。
5
圖6是分別給予Bel-7402腫瘤細(xì)胞載阿霉素和對照基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/ PGL2-D0X )、載阿霉素和對照基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X )、載治療基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)、載治療基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF_hTRAIL)、載阿霉素和治療基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)和載阿霉素和治療基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X)孵育2 h，再換成培養(yǎng)基孵育48 h，然后用凋亡檢測試劑盒(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit)標(biāo)記不同凋亡時期的細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，設(shè)立共同孵育轉(zhuǎn)鐵蛋白(血漿濃度25 μ Μ)的對照組；綠色代表早期凋亡時細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸；紅色代表晚期凋亡或者死細(xì)胞中碘化吡啶標(biāo)記的細(xì)胞核。放大倍數(shù)為200倍。圖7是皮下移植瘤裸鼠模型給予熒光標(biāo)記的載阿霉素和對照基因的非靶向系統(tǒng)(PMAM-PEG/pGL2-D0X,每張照片中左邊動物)和載阿霉素和對照基因的靶向系統(tǒng) (PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X，每張照片中右邊動物)，給藥系統(tǒng)靜脈注射后1 h，4 h和8 h采用熒光活體成像系統(tǒng)拍照，紅色代表熒光標(biāo)記的對照基因。綠色代表近紅外探針標(biāo)記的基礎(chǔ)載體(PAMAM)。圖8 (A)是觀察各給藥系統(tǒng)皮下移植瘤裸鼠模型瘤體積的抑制情況。靜脈注射載阿霉素和對照基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pGL2-D0X)、載阿霉素和對照基因靶向系統(tǒng) (PAMAM-PEG-T7/pGL2 -DOX )、載治療基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAI L )、載治療基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL )、載阿霉素和治療基因非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/ p0RF-hTRAIL-D0X)和載阿霉素和治療基因靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X)后， 給藥系統(tǒng)的劑量是每次4 μ g/鼠，大約0.16 yg/kg，市售組鹽酸阿霉素劑量為5 mg/kg; 各給藥系統(tǒng)分別給藥3次，每隔7天一次，分別是第O天，第7天和第14天；女P < 0.05和 ★★ P < 0.01分別表示市售的鹽酸阿霉素、載阿霉素和治療基因的靶向系統(tǒng)抑制瘤生長對其它組的顯著性差異，(B)是在體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)過程中給藥系統(tǒng)和市售阿霉素對動物體重的影響，箭頭代表了給藥的日程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 :2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，核磁共振氫譜表征載體的合成。實(shí)施例2.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 :2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，核磁共振氫譜表征靶向載體的合成。實(shí)施例3.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例4.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成0.05 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為0.025 :3000，質(zhì)量比為2. 25 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例5.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成0. 1 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為0.05 :3000，質(zhì)量比為4. 5 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例6.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成0.2 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為0. 1 :3000，質(zhì)量比為9 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例7.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成0.5 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為0.25 :3000，質(zhì)量比為22. 5:58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例8.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成1 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為0. 5 :3000，質(zhì)量比為45 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例9.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成2 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為1 :3000，質(zhì)量比為90 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光
■；並實(shí)施例10.
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成4 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為2 :3000，質(zhì)量比為180 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例11
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成8 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為4 :3000，質(zhì)量比為360 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例12
取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成 3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，質(zhì)量比為720 :58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，采用LS-55熒光分光光譜儀480 nm激發(fā)，520-680 nm范圍內(nèi)檢測阿霉素的熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例13.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，制成載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，渦旋30 s，制成載阿霉素和基因的非靶向系統(tǒng)。
實(shí)施例14.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，制成載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 1,6 1和12 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和基因的非靶向系統(tǒng)PAMAM/DNA-D0X。稱取0.14 g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入電泳液IX TAE，加入10 μ 1 500 ug/ml溴乙啶，微波加熱至沸，使瓊脂糖完全溶解，室溫放置約50度，倒入電泳槽中，置入梳子，冷凝成凝膠。將各組樣品加入至凝膠中，開啟電源，電壓為100 V，約25 min停止，紫外燈下觀察載體對基因阿霉素復(fù)合物遷移的影響。實(shí)施例15.
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，制成載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3:1，渦旋30 s，制成載阿霉素和基因的非靶向系統(tǒng)PAMAM/DNA-D0X。采用透析法模擬游離阿霉素和基因阿霉素復(fù)合物在體內(nèi)生理環(huán)境的釋放行為，基因阿霉素復(fù)合物溶液(50 Ug阿霉素/ml，400 μ 1)置于透析袋中(MWC0 ；3500)，并立即扎緊，置于20 ml !1值為7.4 的磷酸鹽緩沖液中。不同時間點(diǎn)取樣，微板讀數(shù)儀537 nm激發(fā)，584 nm發(fā)射測定不同時間阿霉素的釋放情況?？疾彀⒚顾刈苑前邢蛳到y(tǒng)PAMAM/DNA-D0X，將PAMAM/DNA-D0X置于離心管中，37度震蕩，不同時間點(diǎn)直接測量。實(shí)施例16
人肝癌細(xì)胞(Bel-7402)培養(yǎng)在RPMI 1640的培養(yǎng)里，并添加10%熱滅活胎牛血清，100 單位/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素，在37度5% 二氧化碳濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)施例17
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min 去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.10 mg多肽(T7， 2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽 (PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，制成靶向載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4 的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將治療基因(pORF-hTRAIL)用綠色熒光探針(YOYO-I)標(biāo)記，并溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和治療基因的靶向系統(tǒng) PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X 以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM/pORF-hTRAIL-DOX 和 PAMAM-PEG/ pORF-hTRAIL-DOX)。將5萬個Bel_7402細(xì)胞培養(yǎng)在M孔板上，48 h后顯微鏡下觀察融合度，給予上述基因熒光標(biāo)記的載阿霉素和治療基因的給藥系統(tǒng)孵育30 min，用hanks液替換掉藥液，熒光顯微鏡下觀察各組治療基因和阿霉素的攝取情況。實(shí)施例18
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min 去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.10 mg多肽(T7， 2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽 (PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，制成靶向載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入pH值為7. 4 的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將綠色熒光蛋白報告基因(PEGFP-N2)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成43. 2 μ g/ml，將載體溶液加入到基因溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載報告基因的靶向系統(tǒng) (PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2)以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM_PEG/pEGFP_N2)。將綠色熒光蛋白報告基因(PEGFP-N2)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成43. 2 yg/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素質(zhì)量比為720:58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和報告基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/pEGFP-N2-D0X)以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pEGFP-N2-D0X)。將5萬個Bel_7402細(xì)胞培養(yǎng)在M孔板上，48 h后顯微鏡下觀察融合度，給予上述載阿霉素和報告基因以及單純載報告基因的給藥系統(tǒng)孵育2 h，用培養(yǎng)基替換掉藥液，繼續(xù)孵育，48 h后熒光顯微鏡下觀察各組基因表達(dá)出的綠色熒光蛋白的情況。實(shí)施例19
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 :2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，制成靶向載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0. 5 ml于離心管中。將對照基因(pGL2)溶解在50 mM 硫酸鈉溶液中，稀釋成43. 2 yg/ml，取0.5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素質(zhì)量比為720:58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和對照基因的靶向系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pGL2_D0X)。 將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，將載體溶液加入到基因溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載治療基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL)以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)。將治療基因 (pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為 3 1,渦旋30 s，制成載阿霉素和治療基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X) 以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)。將5萬個Bel_7402細(xì)胞培養(yǎng)在M孔板上，48 h后顯微鏡下觀察融合度，給予上述載阿霉素和對照基因、載治療基因以及載阿霉素和治療基因的給藥系統(tǒng)孵育2 h，用培養(yǎng)基替換掉藥液，繼續(xù)孵育，48 h后給予凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測(Apoptosis Detection Kit)，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的死亡情況，初步評價治療基因(pORF-hTRAIL)和阿霉素之間是否存在協(xié)同抑瘤效果。實(shí)施例20
構(gòu)建皮下移植瘤裸鼠模型，采用4周大的雄性裸鼠，體重在16 18 g，培養(yǎng)與SPF級環(huán)境，將300萬的Bel-7402人肝癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下股骨近端區(qū)域，并采用腫瘤體積，動物體重等評價構(gòu)建的模型。實(shí)施例21
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入近紅外熒光探針NIP783(MW 900,0. 31 mg)，使基礎(chǔ)載體與熒光探針的分子比為1 :5，在0. 1 M pH值為 8. 3的HEPES緩沖液中室溫反應(yīng)1 h，透析法純化制得熒光標(biāo)記的基礎(chǔ)載體；加入0. 73 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 :2， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PE(^2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7) 復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，制成靶向載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將對照基因(pGL2)預(yù)先用熒光探針單疊氮化溴化乙錠標(biāo)記，在紫外燈下活化1 h，使熒光探針插入到基因內(nèi)部，并形成共價連接，然后采用70%乙醇沉淀法收集熒光標(biāo)記的基因；將熒光標(biāo)記的對照基因溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成43. 2 μ g/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素質(zhì)量比為720:29，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載
11體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和對照基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X)以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/ PGL2-D0X)。觀察已構(gòu)建的裸鼠皮下移植瘤模型，待瘤半徑不小于0.5 cm時，尾靜脈注射熒光標(biāo)記的載阿霉素和對照基因的給藥系統(tǒng)，觀察阿霉素、基因和載體在體內(nèi)的分布情況。實(shí)施例22
取3 mg聚酰胺一胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0. 73 mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1 :2，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇(PAMAM-PEg2)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0. 10 mg多肽(T7，2 mg/ml pH 7.0磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1 :1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與多肽(T7)半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺一胺一聚乙二醇一多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的多肽(T7)，制成靶向載體溶液。取適量阿霉素甲醇溶液于西林瓶中吹干，加入PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，配制成3. 48 μ g/ml的阿霉素溶液，取0.5 ml于離心管中。將對照基因(pGL2)溶解在50 mM 硫酸鈉溶液中，稀釋成43. 2 yg/ml，取0.5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素質(zhì)量比為720:58，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和對照基因的靶向系統(tǒng)PAMAM-PEG-T7/pGL2-D0X以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pGL2_D0X)。 將治療基因(pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，將載體溶液加入到基因溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，渦旋30 s，制成載治療基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL)以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL)。將治療基因 (pORF-hTRAIL)溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，稀釋成16 pmol/ml，取0. 5 ml加入到上述阿霉素溶液中，使與阿霉素的摩爾比為8 :3000，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因阿霉素復(fù)合物，將載體溶液加入到基因阿霉素復(fù)合物溶液中，使基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為 3 :1，渦旋30 s，制成載阿霉素和治療基因的靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG-T7/p0RF-hTRAIL-D0X) 以及非靶向系統(tǒng)(PAMAM-PEG/pORF-hTRAIL-DOX)。觀察已構(gòu)建的裸鼠皮下移植瘤模型，待瘤體積約為150 mm3時，尾靜脈注射各組載藥的靶向系統(tǒng)和非靶向系統(tǒng)，觀察阿霉素和治療基因之間是否存在協(xié)同抑瘤效果。設(shè)立陰性對照組，并市售的臨床藥物鹽酸阿霉素作為陽性對照，劑量約是給藥系統(tǒng)的30倍左右。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，
本發(fā)明利用阿霉素可以插入到治療基因雙鏈中，形成基因阿霉素復(fù)合物，使得正電性的高分子材料可以通過靜電作用同時攜載兩種藥物，發(fā)揮協(xié)同效果；所制得的腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)，使載藥遞釋系統(tǒng)的分布具有了多肽(T7)的腫瘤靶向特征和細(xì)胞攝取特征，提高腫瘤細(xì)胞的攝取效率和腫瘤的治療效率；載藥遞釋系統(tǒng)具有進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，由于治療基因和化療藥物不同機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生長，提高了載藥遞釋系統(tǒng)對腫瘤的治療效率。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、治療基因和化療藥物制成；所述高分子材料與聚乙二醇的分子比為1 :2 1 :10 ；高分子材料與多肽的分子比為 1 :1 1 :5 ；高分子材料與治療基因的質(zhì)量比為3 :1 10 1 ；治療基因與化療藥物的分子比為 0. 025 3000 8 :3000ο
2.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的高分子材料為聚酰胺一胺型樹狀分枝物和聚賴氨酸。
3.按權(quán)利要求1或2所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的高分子材料為樹枝狀，其內(nèi)部有空腔。
4.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的治療基因選自編碼人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的基因或其它所有具有抗腫瘤效果的基因。
5.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的化療藥物選自阿霉素，柔紅霉素或5—氟尿嘧啶或其他可以插入到基因堿基對的抗腫瘤化療藥物。
6.按權(quán)利要求2所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的載體系統(tǒng)采用多肽修飾樹枝狀高分子材料形成納米粒。
7.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的多肽其氨基酸序列為HAIYPRH。
8.按權(quán)利要求7所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的多肽特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
9.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚乙二醇選自馬來酰亞胺一聚乙二醇3500—琥珀酰亞胺。
10.權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)在用于攝取人體來源和動物來源的腫瘤細(xì)胞及其它癌細(xì)胞中的用途。
11.權(quán)利要求1的腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括步驟將高分子材料溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┲信渲瞥蓛湟?，取適量于西林瓶中吹干，稱取適量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料比例為1 :2 1 10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時；將多肽溶于適量磷酸鹽緩沖液里，配制成適當(dāng)濃度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，與高分子材料比例1 :1 1 :5，一定溫度下反應(yīng)對h，制得腫瘤靶向納米載體， 轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的聚乙二醇和多肽， PH值7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶；將治療基因溶解在50 mM硫酸鈉溶液中，與化療藥物，分子比例為0. 025 3000 8 3000，質(zhì)量比例為2. 25 58 720 :58，在pH值7. 4的磷酸鹽緩沖液中復(fù)合，室溫條件下渦旋1 min，孵育30 min，制成基因化療藥物復(fù)合物；將腫瘤靶向載體加入基礎(chǔ)載體與基因質(zhì)量比為3 :1，6 1,10 :1到基因化療藥物復(fù)合物溶液中，渦旋30 s，制得腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤靶向雙載藥遞釋系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明采用高分子材料、聚乙二醇、多肽、治療基因和化療藥物，以多肽為靶向頭基，高分子材料為基礎(chǔ)高分子載體，將化療藥物阿霉素等插入到治療基因雙鏈中形成基因化療藥物復(fù)合物，然后與高分子載體通過靜電作用，制成腫瘤靶向治療基因與化療藥物雙載藥遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明選用通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的新型多肽修飾高分子材料，以內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對基因和化療藥物的攝取，并且具有安全性高的特點(diǎn)。本發(fā)明使用的靶向頭基多肽(T7)具有轉(zhuǎn)鐵蛋白的優(yōu)點(diǎn)，并且可有效避免內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白的干擾，靶向和治療效率高、制備簡捷，可以進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于其它腫瘤組織的靶向治療。
文檔編號A61K47/42GK102397554SQ201010286479
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者蔣晨, 韓亮, 黃容琴 申請人:復(fù)旦大學(xué)