專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及核磁共振造影劑，具體涉及一種腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑及其制備方法，尤其是一種多肽修飾的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
對(duì)腫瘤采用核磁共振造影診斷以及研究高效的造影劑是近年來(lái)引人注目的熱點(diǎn)。 目前臨床上使用的造影劑多為親水的小分子，不能進(jìn)入細(xì)胞，往往通過(guò)血管內(nèi)皮空隙停留在組織間隙和血管內(nèi)空腔，清除很快，不能長(zhǎng)時(shí)間顯像；并且由于缺乏特異性的輸送，僅靠血管間隙滲透進(jìn)入組織，導(dǎo)致造影劑蓄積在炎癥部位，容易造成對(duì)炎癥的誤診。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的造影劑釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)，尚存在穩(wěn)定性問(wèn)題，常對(duì)機(jī)體正常器官如腎等造成非常大的損害；此外，釓噴酸葡胺的弛豫率較低，需要提高磁場(chǎng)強(qiáng)度，這也增加了患者診斷時(shí)的危險(xiǎn)。因此，提供高效的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，有效專(zhuān)一地將造影劑運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位并進(jìn)入細(xì)胞，長(zhǎng)時(shí)間高效地對(duì)腫瘤組織顯像，同時(shí)減少全身毒副作用，是目前腫瘤診斷的關(guān)鍵。樹(shù)枝狀高分子材料如聚酰胺一胺樹(shù)狀分枝物(polyamidoamine，簡(jiǎn)稱(chēng)PAMAM)和聚賴(lài)氨酸(dendri-graft polylysines，簡(jiǎn)稱(chēng)DGL)是近年來(lái)出現(xiàn)的一類(lèi)新型納米級(jí)的合成高分子，高度分枝，呈單分散性，其末端氨基豐富，并易于經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)男揎椷B接靶向頭基等生物活性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)這類(lèi)新型的納米級(jí)的樹(shù)枝狀高分子可與二乙三胺五乙酸(DTPA)連接進(jìn)而螯合釓離子(Gd3+)，大幅提高造影劑的弛豫率和顯像效果。主動(dòng)靶向是構(gòu)建靶向遞釋系統(tǒng)的一個(gè)主要策略，利用特定的頭基修飾系統(tǒng)，特異性結(jié)合特定細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的受體以達(dá)到靶向輸送的作用。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)一系列受體，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，簡(jiǎn)稱(chēng)為T(mén)f)受體被用作靶點(diǎn)已有較長(zhǎng)的研究歷史。但是，內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度很高，約為25 mM，可與以Tf作為靶向頭基的給藥系統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)腫瘤細(xì)胞表面的Tf受體，從而影響腫瘤靶向效率。近期醫(yī)學(xué)研究使用噬菌體展示技術(shù)篩選出一種新型多肽——T7肽，其序列為HAIYPRHJf Tf受體的親和力和Tf相當(dāng)；T7 肽與Tf受體的結(jié)合位點(diǎn)與Tf不同，不會(huì)與Tf競(jìng)爭(zhēng)抑制且不影響Tf本身的生理功能，相反 Tf與Tf受體的結(jié)合會(huì)促進(jìn)T7肽的入胞效率。迄今，尚未見(jiàn)有關(guān)多肽修飾的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，提供一種腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑及其制備方法，具體是提供一種多肽修飾的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑。本發(fā)明通過(guò)多肽修飾高分子材料，以多肽為靶向頭基，樹(shù)枝狀高分子材料為基礎(chǔ)高分子載體，表面連接小分子造影劑，制成腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑。該造影劑以?xún)?nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)造影劑的攝取，并且安全。
具體而言，本發(fā)明的一種腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、雙功能配體和三氯化釓制成。本發(fā)明中，所述高分子材料與聚乙二醇的分子比為1:2 1:10 ；高分子材料與多肽的分子比為1:1 1:5 ；高分子材料與雙功能配體的分子比為1:236 1:256 ；高分子材料與三氯化釓的分子比為1:236 1:1416。本發(fā)明中，高分子材料為樹(shù)枝狀，其內(nèi)部有空腔；本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中選用的高分子材料為聚酰胺-胺型樹(shù)狀分枝物和聚賴(lài)氨酸。本發(fā)明中，所述的載體系統(tǒng)采用多肽修飾高分子材料形成納米粒；所述的多肽 (T7)其氨基酸序列為HAIYPRH，該多肽通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選得到。本發(fā)明中，所述的聚乙二醇選自馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亞胺 (MAL-PEG3500-NHS)；
本發(fā)明中，所述的雙功能配體包括雙功能二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-DTPA )、 p-SCN-Bn-DOTA, p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-oxo-D03A 或 p-SCN-Bn-PCTA ； 本發(fā)明中，所述的螯合離子為三氯化釓(GdCl3)。本發(fā)明提供了腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑的制備方法，其特征在于，其包括步驟
步驟1 將高分子材料溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┲信渲瞥蓛?chǔ)備液，取適量于西林瓶中吹干， 稱(chēng)取適量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料比例為1:2 1:10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)即可；
步驟2:將多肽溶于適量磷酸鹽緩沖液里，配制成適當(dāng)濃度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，與高分子材料比例1:1 1:5，一定溫度下反應(yīng)對(duì)h，制得腫瘤靶向納米載體，轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG和 T7肽，pH值9. 0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶；
步驟3 將上述步驟2制得的多肽溶液與雙功能配體按1:2361:256的比例混合，在室溫條件下攪拌反應(yīng)48 h，轉(zhuǎn)移到MWCO 3000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未連接的雙功能配體，PH值6. 0的乙酸鹽緩沖液復(fù)溶；
步驟4 將上述步驟3制得的多肽溶液與螯合離子按1 236^1 1416的比例混合，在4 °C 條件下反應(yīng)M h，轉(zhuǎn)移到MWCO 3000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未螯合的釓離子，制得腫瘤靶向核磁共振造影劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面Tf受體的多肽T7肽修飾高分子材料，連接造影劑制成腫瘤靶向核磁共振造影劑，使造影劑的分布具有了 T7肽的腫瘤靶向特征和細(xì)胞攝取特征，提高腫瘤細(xì)胞的攝取效率和腫瘤的診斷效率；本腫瘤靶向核磁共振造影劑，具有Tf作為靶向頭基的特點(diǎn)，能有效避免內(nèi)源性Tf的干擾，靶向和診斷效率高，適用于靶向人體來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源的腫瘤細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞。


圖1是氫核磁共振表征腫瘤靶向納米載體PAMAM-PEG-T7。圖2是氫核磁共振表征腫瘤靶向造影劑中間體DTPA-PAMAM-PEG-T7。
圖3是核磁共振造影劑體外溶血情況比較。圖4是核磁共振造影劑體外弛豫率比較，斜率代表弛豫率，斜率越大，弛豫率越大。圖5是人腫瘤細(xì)胞Bel-7402對(duì)造影劑載體的攝取情況，細(xì)胞培養(yǎng)于M孔板，待密度達(dá)到8(Γ90%時(shí)，孵育綠色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體30 min,吸去藥液，緩沖液清洗， OLYMPUS IX 71熒光顯微鏡觀察并拍照
其中，A 和 D 是 PAMAM，B 禾口 E 是 PAMAM-PEG, C 禾口 F 是 PAMAM-PEG-T7，G 禾口 J 是 Tf+PAMAM, H 和 K 是 Tf+PAMAM-PEG, I 和 L 是 Tf+PAMAM_PEG_T7。圖6是大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6對(duì)造影劑載體的攝取情況，細(xì)胞培養(yǎng)于M孔板，待密度達(dá)到8(Γ90%時(shí)，孵育綠色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體30 min,吸去藥液，緩沖液清洗， OLYMPUS IX 71熒光顯微鏡觀察并拍照
其中，A 和 D 是 PAMAM，B 禾口 E 是 PAMAM-PEG, C 禾口 F 是 PAMAM-PEG-T7，G 禾口 J 是 Tf+PAMAM, H 禾口 K 是 Tf+PAMAM-PEG, I 禾口 L· 是 Tf+PAMAM_PEG_T7。圖7是人腫瘤細(xì)胞Bel-7402皮下移植裸鼠模型尾靜脈給予紅色熒光探針BODIPY 標(biāo)記的載體，不同時(shí)間CRI活體成像觀察各載體的體內(nèi)分布情況。 圖8是大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6顱內(nèi)原位裸鼠模型尾靜脈給予紅色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體，不同時(shí)間CRI活體成像觀察各載體的體內(nèi)分布情況。圖9是采用Bruker Biospec 4. 7 T/30 cm Scanner觀察核磁共振造影劑尾靜脈注射后不同時(shí)間對(duì)人腫瘤細(xì)胞Bel-7402皮下移植瘤(A)和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6顱內(nèi)原位瘤 (B)的診斷情況。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 7.0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1:5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與T7肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的T7肽，核磁共振氫譜表征靶向載體的合成。實(shí)施例2
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 9. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，與13. 4 mg雙功能靶向配體二乙三胺五乙酸 (ρ-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1 236，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h， SCN基團(tuán)與PAMAM表面的氨基發(fā)生特異性的反應(yīng)，得到核磁共振造影劑中間體，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的雙功能配體，核磁共振氫譜表征載體上螯合配體的連接效率。實(shí)施例3
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 9. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，與13. 4 mg雙功能靶向配體二乙三胺五乙酸 (ρ-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1 236，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h， SCN基團(tuán)與PAMAM表面的氨基發(fā)生特異性的反應(yīng)，得到核磁共振造影劑中間體，MWCO 5000 超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的雙功能配體，pH 6. 0乙酸鹽緩沖液復(fù)溶，與三氯化釓(GdCl3,100 mg/ml pH 6. 0乙酸鹽溶液)，摩爾比例為1 236，4 °C反應(yīng)24 h,MWC0 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的三氯化釓，pH 7. 4生理磷酸鹽緩沖液溶解，制成非靶向核磁共振造影劑，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜表征釓的螯合效率。實(shí)施例4
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 9. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，與13. 4 mg雙功能靶向配體二乙三胺五乙酸 (p-SCN-Bn-DTPA, 4 mg/ml pH 9. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1 236，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h， SCN基團(tuán)與PAMAM表面的氨基發(fā)生特異性的反應(yīng)，得到核磁共振造影劑中間體，MWCO 5000 超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的雙功能配體，pH 6. 0乙酸鹽緩沖液復(fù)溶，與三氯化釓(GdCl3,100 mg/ml pH 6. 0乙酸鹽溶液)，摩爾比例為1 236，4 °C反應(yīng)24 h,MWC0 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的三氯化釓，pH 7. 4生理磷酸鹽緩沖液溶解，制成非靶向核磁共振造影劑。實(shí)施例5
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 7.0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1:5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與T7肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的T7肽，pH 9. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，與13. 4 mg 雙功能靶向配體二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1:236，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h，SCN基團(tuán)與PAMAM表面的氨基發(fā)生特異性的反應(yīng)，得到核磁共振造影劑中間體，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的雙功
6能配體，PH 6.0乙酸鹽緩沖液復(fù)溶，與三氯化釓(GdCl3,100 mg/ml pH 6.0乙酸鹽溶液)，摩爾比例為1:236，4 °C反應(yīng)M h, MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的三氯化釓，pH 7. 4生理磷酸鹽緩沖液溶解，制成靶向核磁共振造影劑。實(shí)施例6
制成靶向核磁共振造影劑和非靶向核磁共振造影劑，采用市售的釓噴酸葡胺作為對(duì)照，將各組造影劑稀釋成 0,2. 52,5. 03、10. 1,25. 2、50. 3、100. 7、503 μ g 6(1/1111，與覬紅細(xì)胞混懸液37 °C孵育1 h，測(cè)定溶血情況。實(shí)施例7
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為 1 10， 于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 7.0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1:5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與T7肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的T7肽，pH 9. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，與13. 4 mg 雙功能靶向配體二乙三胺五乙酸(P-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1:236，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h，SCN基團(tuán)與PAMAM表面的氨基發(fā)生特異性的反應(yīng)，得到核磁共振造影劑中間體，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的雙功能配體，PH 6.0乙酸鹽緩沖液復(fù)溶，與三氯化釓(GdCl3,100 mg/ml pH 6.0乙酸鹽溶液)，摩爾比例為1:236，4 °C反應(yīng)M h, MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的三氯化釓，PH 7. 4生理磷酸鹽緩沖液溶解，制成靶向核磁共振造影劑。將靶向核磁共振造影劑和市售的釓噴酸葡胺稀釋分別稀釋成一系列濃度，采用Bruker Biospec 4.7 T / 30 cm farmer測(cè)定造影劑的弛豫率。實(shí)施例8
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入綠色熒光探針(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例為1:10，4 °C反應(yīng)12 h，得到綠熒光標(biāo)記非靶向載體。實(shí)施例9
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入綠色熒光探針(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例 % 1:10,4。C 反應(yīng) 12 h，加入 3. 64 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8.0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1:10，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，得到綠熒光標(biāo)記非靶向載體。實(shí)施例10
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入綠色熒光探針(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例 % 1:10,4。C 反應(yīng) 12 h，加入 3. 64 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH8.0磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1:10，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1 5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與T7 肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成率熒光標(biāo)記的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，麗CO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的T7肽，得到綠熒光標(biāo)記靶向載體。實(shí)施例11
綠熒光標(biāo)記的非靶向載體和靶向載體分別用緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度。人腫瘤Bel-7402 細(xì)胞培養(yǎng)于M孔板，待密度達(dá)到80、0%時(shí)，孵育綠色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體30 min, 吸去藥液，緩沖液清洗，OLYMPUS IX 71熒光顯微鏡觀察并拍照，觀察造影劑載體的攝取情況。實(shí)施例12
綠熒光標(biāo)記的非靶向載體和靶向載體分別用緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度。大鼠膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞培養(yǎng)于M孔板，待密度達(dá)到80、0%時(shí)，孵育綠色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體30 min, 吸去藥液，緩沖液清洗，OLYMPUS IX 71熒光顯微鏡觀察并拍照，觀察造影劑載體的攝取情況。實(shí)施例13
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入紅色熒光探針(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例為 1:10，室溫反應(yīng)1 h，得到紅熒光標(biāo)記非靶向載體。實(shí)施例14
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入紅色熒光探針(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例為 1:10,室溫反應(yīng) 1 h，加入 3.64 mg 聚乙二醇(MAL_PEG;B500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1:10，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，得到紅熒光標(biāo)記非靶向載體。實(shí)施例15
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氫鈉溶液溶解，加入紅色熒光探針(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩爾比例為 1:10,室溫反應(yīng) 1 h，加入 3.64 mg 聚乙二醇(MAL_PEG;B500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為1:10，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，NHS基團(tuán)與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)復(fù)合物溶液，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG，pH 7. 0磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸鹽溶液)，摩爾比例為1 5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)M h，MAL基團(tuán)與T7肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成率熒光標(biāo)記的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽 (PAMAM-PEG-T7)復(fù)合物，MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的 T7肽，得到紅熒光標(biāo)記靶向載體。
實(shí)施例16
人腫瘤細(xì)胞Bel-7402皮下移植裸鼠模型尾靜脈給予紅色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體，不同時(shí)間CRI活體成像觀察各載體的體內(nèi)分布情況。實(shí)施例17
大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6顱內(nèi)原位裸鼠模型尾靜脈給予紅色熒光探針BODIPY標(biāo)記的載體， 不同時(shí)間CRI活體成像觀察各載體的體內(nèi)分布情況。實(shí)施例18
采用Bruker Biospec 4. 7 T / 30 cm scanner觀察腫瘤靶向核磁共振造影劑尾靜脈注射后不同時(shí)間對(duì)人腫瘤細(xì)胞Bel-7402皮下移植瘤的診斷情況。非靶向核磁共振造影劑和市售核磁共振造影劑釓噴酸葡胺作為對(duì)照。實(shí)施例19
采用Bruker Biospec 4. 7 T / 30 cm scanner觀察腫瘤靶向核磁共振造影劑尾靜脈注射后不同時(shí)間對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6顱內(nèi)原位移植瘤的診斷情況。非靶向核磁共振造影劑和市售核磁共振造影劑釓噴酸葡胺作為對(duì)照。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利用可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面Tf受體的多肽T7肽修飾高分子材料，連接造影劑制成腫瘤靶向核磁共振造影劑，使造影劑的分布具有腫瘤靶向特征和細(xì)胞攝取特征，能提高腫瘤細(xì)胞的攝取效率和腫瘤的診斷效率；具有Tf作為靶向頭基的特點(diǎn)，能有效避免內(nèi)源性Tf的干擾，靶向和診斷效率高，適用于靶向人體來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源的腫瘤細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞。
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權(quán)利要求
1.一種腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽、雙功能配體和三氯化釓制成；所述高分子材料與聚乙二醇的分子比為1:2 1:10 ；高分子材料與多肽的分子比為 1:1 1:5 ；高分子材料與雙功能配體的分子比為1:236 1:256 ；高分子材料與三氯化釓的分子比為1:236 1:1416。
2.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的載體系統(tǒng)采用多肽修飾樹(shù)枝狀高分子材料形成納米粒。
3.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的高分子材料為聚酰胺-胺型樹(shù)狀分枝物和聚賴(lài)氨酸。
4.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的高分子材料為樹(shù)枝狀，其內(nèi)部有空腔。
5.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的聚乙二醇選自馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亞胺。
6.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的多肽其氨基酸序列為HAIYPRH。
7.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的雙功能配體選自雙功能二乙三胺五乙酸、p-SCN-Bn-DOTA, p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-oxo-D03A 或 P-SCN-Bn-PCTA0
8.按權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑，其特征在于，所述的多肽特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
9.權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑在用于攝取人體來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源的腫瘤細(xì)胞及其它癌細(xì)胞中的用途。
10.權(quán)利要求1的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑的制備方法，其特征在于，其包括步驟步驟1 將高分子材料溶于適量適當(dāng)?shù)娜軇┲信渲瞥蓛?chǔ)備液，取適量于西林瓶中吹干， 稱(chēng)取適量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸鹽緩沖液中配制成適宜濃度的溶液，加入到上述容器中，與高分子材料比例為1:2 1:10，一定溫度下攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)即可；步驟2 將多肽溶于適量磷酸鹽緩沖液里，配制成適當(dāng)濃度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，與高分子材料比例1:1 1:5，一定溫度下反應(yīng)對(duì)h，制得腫瘤靶向納米載體，轉(zhuǎn)移到MWCO 5000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未反應(yīng)的PEG和 T7肽，pH值9. 0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶；步驟3 將上述步驟2制得的多肽溶液與雙功能配體按1:2361:256的比例混合，在室溫條件下攪拌反應(yīng)48 h，轉(zhuǎn)移到MWCO 3000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未連接的雙功能配體，PH值6. 0的乙酸鹽緩沖液復(fù)溶；步驟4 將上述步驟3制得的多肽溶液與螯合離子按1:2361:1416的比例混合，在4 0C 條件下反應(yīng)M h，轉(zhuǎn)移到MWCO 3000超濾離心管中以12000 rpm超濾30 min去除未螯合的釓離子，制得腫瘤靶向核磁共振造影劑。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽修飾的腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑及其制備方法。本發(fā)明采用高分子材料、聚乙二醇、多肽、雙功能配體和三氯化釓，以多肽為靶向頭基，樹(shù)枝狀高分子材料為基礎(chǔ)高分子載體，表面連接小分子造影劑，制成腫瘤靶向診斷核磁共振造影劑。本發(fā)明通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出的多肽修飾高分子材料，以?xún)?nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)造影劑的攝取，并且具有安全性高的特點(diǎn)。本發(fā)明使用的靶向頭基多肽具有轉(zhuǎn)鐵蛋白的優(yōu)點(diǎn)，并且可有效避免內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白的干擾，靶向和診斷效率高、制備簡(jiǎn)捷，可進(jìn)一步應(yīng)用于其它腫瘤組織的靶向診斷。
文檔編號(hào)A61K49/12GK102397564SQ201010286508
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者蔣晨, 韓亮, 黃容琴 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)