專利名稱：抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方法，尤其涉 及銀杏聚戊烯醇、黃酮和萜內(nèi)酯組合物對IfepG 2215細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用，可用于 治療和輔助治療乙型肝炎的藥物。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前，全球約有3. 5億人為慢性肝炎患者或?yàn)闊o癥狀病 毒感染者。這些慢性肝炎的病人有轉(zhuǎn)為肝硬化、肝癌的高危險性，每年有100多萬人死于和 肝炎、肝硬化及肝癌有關(guān)的疾病。我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，乙型肝炎病毒攜帶者有1. 2億人，丙型肝炎病毒攜 帶者0. 38億人，加上其他類型的肝炎，罹患肝炎的總?cè)藬?shù)近2億人，估計每年因病毒性肝炎 導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失300億 500億人民幣。尤其是脂肪肝人群日益增多，而脂肪肝變性是 慢性丙肝病毒感染者罹患肝細(xì)胞癌的危險因子。目前，用于治療肝臟疾病的藥物有三類1)抗病毒藥主要有干擾素和核苷類似 物，如拉米夫定、法昔洛韋等；2)免疫調(diào)節(jié)藥主要有轉(zhuǎn)移因子、白細(xì)胞介素_2、胸腺肽、皮質(zhì) 激素等；3)改善肝功能藥或抗肝細(xì)胞損傷藥主要有易善力(肝得健)和各種中藥復(fù)方制 劑。國內(nèi)外已有研究表明，聚戊烯醇參與細(xì)胞膜N-糖蛋白生物合成，對保持細(xì)胞膜穩(wěn) 定性和流動性具有重要作用。聚戊烯醇系天然產(chǎn)物，無毒副作用，具有免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn) 肝細(xì)胞保護(hù)和再生，適于開發(fā)保肝藥物。聚戊烯醇還可和干擾素共用，或代替干擾素治療肝 炎病毒。因?yàn)楦蓴_素價格貴，因此利用聚戊烯醇開發(fā)保肝藥物具有很好的市場競爭力。國內(nèi)外對于植物聚戊烯醇的分離、純化已有文獻(xiàn)報道，主要純化路線是通過幾次 硅膠柱層析將聚戊烯醇粗提物的純度提高到90%以上。此外，還有一些其他純化方法，如 采用極性介質(zhì)樹脂(氧化鋁或聚酰胺等)吸附，溶劑萃取和結(jié)晶，得到70% 75%的聚戊 烯醇，得率1. 0%左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷凍脫雜后再進(jìn)行硅膠柱層析純化，制備純 度92.7%聚戊烯醇。但產(chǎn)品中仍含有大量的類胡蘿卜素等黃色素，Tetsuo Takigawa等曾 采用活性炭一種脫色劑對聚戊烯醇粗提物脫色，但活性炭用量大，脫色效果差，聚戊烯醇損 失大。因此，傳統(tǒng)的聚戊烯醇純化路線存在明顯缺點(diǎn)繁瑣、成本高、收率低，不適合工業(yè)化 生產(chǎn)。國內(nèi)外有關(guān)專利報道了聚戊烯醇對肝疾病的保護(hù)作用，銀杏提取物主要活性成分 為黃酮和萜內(nèi)酯，廣泛用于治療和預(yù)防心腦血管疾病，本專利以聚戊烯醇含量低于40%的 植物脂溶性不皂化物為原料，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，對聚戊烯醇粗品脫 色。脫色后的聚戊烯醇再經(jīng)過中壓柱層析分離，即獲得90%以上聚戊烯醇，輔以銀杏黃酮 和萜內(nèi)酯，制備銀杏葉聚戊烯醇活性組合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝藥物開 發(fā)。該方法與以往純化方法相比，具有收率高、方便、經(jīng)濟(jì)、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明了一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備 方法，其特征在于由以下步驟組成第一步、聚戊烯醇類化合物粗品的脫色以聚戊烯醇含量低于40%的銀杏葉脂溶物為原料，按固液比(g/mL)為1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭與凹凸棒土按質(zhì)量比為1 (1 20)作為脫色劑，脫色劑 與聚戊烯醇粗品質(zhì)量比為(10 150) 100,50 120°C下攪拌脫色10 80min。過濾， 二次，合并脫色清液，室溫真空回收溶劑，制備脫色聚戊烯醇；第二步、柱純化將脫色聚戊烯醇與硅膠按質(zhì)量比1 (15 50)吸附，洗脫劑為石油醚乙酸乙 酯=100 (1 30)混合溶劑，硅膠柱柱長20 300cm，柱直徑2 30cm，柱壓為0. 3 3MPa,檢測波長199 220nm，流速2 200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室溫真空回收溶劑， 制備90%以上聚戊烯醇；第三步、制備抗乙肝病毒制劑基于IOOg原料中含有4 8g 90%聚戊烯醇、10 15g銀杏黃酮、2 6g銀杏萜內(nèi) 酯、15 20g植物油、3 5g日本木蠟、5 IOg卵磷脂、0. 5 3gVE、3 5g吐溫_80、1 5g脫水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去離子水。在室溫下超聲波乳化10 30min， 4°C以下保存，使用前用去離子水稀釋到所需濃度，攪拌均勻，制成聚戊烯醇活性組合物制 劑。本專利以銀杏葉為原料，通過非極性溶劑提取銀杏葉聚戊烯醇乙酸酯，再通過皂 化水解，將聚戊烯醇乙酸酯轉(zhuǎn)化為聚戊烯醇，同時將浸膏中酸性物以及其他酯類轉(zhuǎn)變?yōu)樗?溶性的鹽，聚戊烯醇仍溶解在非極性溶劑中，從而達(dá)到分離。皂化均化方式、皂化溫度、時 間和皂化劑對皂化反應(yīng)有明顯影響，優(yōu)化結(jié)果表明均化方式為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速50 300r/ min，溫度55 65°C，時間45 50min，皂化劑為5% 40% NaOH-EtOH，石油醚軟膏與皂化 劑的比例為1 (5 10) (g/mL)。皂化后的銀杏葉聚戊烯醇軟膏為脂溶性不皂化物，按固液比(g/mL)為1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，質(zhì)量比1 (1 20)，脫色 劑與聚戊烯醇粗品質(zhì)量比為(10 150) 100，50 120°C下攪拌脫色10 80min。過濾， 二次，合并脫色清液，室溫真空回收溶劑，制備脫色聚戊烯醇。本專利篩選普通顆粒炭、糖用脫色磷酸炭、味精脫色用炭、分子篩、活性白土、凹凸 棒土、混合脫色劑等脫色劑，優(yōu)化脫色工藝。首次公開一種分光光度法，在451nm比色測定 聚戊烯醇脫色率。聚戊烯醇脫色率=[(AcrA1)ZAJXlOO^,式中=Atl-聚戊烯醇脫色前的吸 光度；A「聚戊烯醇脫色后的吸光度。設(shè)定原料中色素含量為％，脫色一次，結(jié)果表明活性炭 與凹凸棒土的混合脫色劑的脫色效果最好。較未脫色聚戊烯醇相比，脫色色度降低200倍 以上。如表1和圖1。表1不同脫色劑對GPP的脫色效果 本專利采用L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳脫色條件，將聚戊烯醇軟膏按固液比(g/mL) 為1 (1 30)溶解于石油醚中，優(yōu)選1 (6 10)；混合脫色劑活性炭與凹凸棒土質(zhì)量比 為1 (3 8)，優(yōu)選1 (5 6)；聚戊烯醇軟膏與脫色劑用量質(zhì)量比為(1 5) (1 5)，優(yōu)選(1 5) (1 2)；脫色溫度50 120°C，優(yōu)選50 80°C;脫色時間20 50min。 過濾，二次，合并脫色清液，室溫真空回收溶劑，制備脫色聚戊烯醇，脫色率大于96 %，較未 脫色聚戊烯醇相比，脫色后色度降低200倍以上。本發(fā)明不僅脫色效果好，而且采用活性 炭與凹凸棒土作為混合脫色劑。如，IOg純度38%的聚戊烯醇粗品溶于IOOmL石油醚，脫 色劑用量10 15g，活性炭與凹凸棒土之比為1 5，脫色溫度70 80°C，脫色時間20 30min。經(jīng)過脫色，純度提高到50%，聚戊烯醇基本無損失。為了制備90%以上無色的聚戊烯醇，本專利采用中壓正相柱純化，中壓柱柱長 20 300cm，柱直徑2 30cm，填料選擇200 500目的硅膠，流速2 200mL/min，將聚戊烯 醇粗制品與硅膠按質(zhì)量比1 (15 50)吸附，洗脫劑為石油醚乙酸乙酯=100 (1 30)混合溶劑，優(yōu)選石油醚乙酸乙酯=100 (1 10)沖壓柱填料采用干法裝柱，N2加 壓，柱壓為0. 3 3MPa，紫外檢測波長199 230nm，優(yōu)選210nm，流速2 200mL/min，優(yōu)選 5 20mL/min，根據(jù)UV吸收峰值富集聚戊烯醇部位，室溫真空回收溶劑，制備90%以上無色 的聚戊烯醇。采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析的純化方法，聚戊烯醇粗提物須經(jīng)過連續(xù)三次硅膠柱層 析，將聚戊烯醇的純度提高到90%以上，最終收率7.4%。采用本發(fā)明的中壓柱純化，聚戊 烯醇粗提物先在最佳條件下脫色，再經(jīng)過一次中壓柱層析即可將聚戊烯醇的純度提高到 90%以上，收率30%。與以往純化方法相比，此種方法具有簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，而且收 率明顯提高4倍以上，同時適合工業(yè)化生產(chǎn)。本專利公開HPLC外標(biāo)法測定聚戊烯醇的純度。通過HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定聚戊烯醇的純度。色譜柱為Kromasil C18 0DS-1 (5 μ m，150 X 4. 6mm)，柱溫為室溫，紫夕卜 檢測波長210nm，流動相為異丙醇甲醇=38 37，流速為1. OmL/min。本發(fā)明以無色的聚戊烯醇為原料，基于IOOg原料中含有4 8g 90%聚戊烯醇、 10 15g銀杏黃酮、2 6g銀杏萜內(nèi)酯、15 20g植物油、3 5g日本木蠟、5 IOg卵磷 脂、0. 5 3gVE、3 5g吐溫_80、1 5g脫水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去離子 水。在室溫下超聲波乳化10 30min，4°C以下保存，使用前用去離子水稀釋到所需濃度，攪 拌均勻，制成的聚戊烯醇活性組合物可制備膠囊，口服液，滴丸，乳液和注射劑。本專利中銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯來源于銀杏葉提取物，其中銀杏黃酮>24%，萜內(nèi) 酯> 6 %，銀杏酚酸< lppm。而國際上標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物中銀杏黃酮> 24 %，萜內(nèi)酯> 6 %， 銀杏酚酸< 5ppm，因此本發(fā)明中銀杏酸的含量更少，對人體更有利。通過本專利制備的聚 戊烯醇活性組合物可制備膠囊，口服液，滴丸，乳液和注射劑，用于治療乙肝病毒藥物的應(yīng) 用，對細(xì)胞毒性較弱，實(shí)驗(yàn)中未見到細(xì)胞形態(tài)異常及細(xì)胞破碎等毒性變化。在濃度最高到 100 μ M時，對細(xì)胞生長沒有抑制作用，與陽性藥3TC效果相當(dāng)，對H印G 2215細(xì)胞分泌乙肝 s抗原、e抗原具有明顯的抑制作用，對細(xì)胞分泌HBV DNA有較好的抑制作用。本發(fā)明獲得以下技術(shù)效果(1)首次將銀杏葉聚戊烯醇、黃酮和萜內(nèi)酯活性物按功效作用組成復(fù)合制劑，應(yīng)用 于抗乙肝HBV DNA病毒，與陽性藥3TC效果相當(dāng)，對H印G 2215細(xì)胞分泌乙肝s抗原、e抗 原具有明顯的抑制作用，對細(xì)胞分泌HBV DNA有較好的抑制作用，其效果比單一組方提高 50%，相對于化藥，具有明顯的減毒增效的作用。(2)本發(fā)明采用活性炭與凹凸棒土的混合脫色劑脫色，較未脫色聚戊烯醇相比，脫 色后色度降低200倍以上，脫色率大于96%，制備的無色聚戊烯醇可用于醫(yī)藥注射劑，并且 凹凸棒土價格低廉，脫色裝置設(shè)備易于實(shí)現(xiàn)，脫色條件容易控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(3)本發(fā)明采用活性炭與凹凸棒土的混合脫色劑，經(jīng)過脫色，聚戊烯醇純度提高到 50%，聚戊烯醇基本無損失。而以往任何聚戊烯醇的純化工藝都會伴隨聚戊烯醇的損失。(4)采用傳統(tǒng)的硅膠柱層析的純化方法，聚戊烯醇粗提物須經(jīng)過連續(xù)三次硅膠柱 層析，將聚戊烯醇的純度提高到90%以上，最終收率7.4%。采用本發(fā)明的中壓柱純化，聚 戊烯醇粗提物先在最佳條件下脫色，再經(jīng)過一次中壓柱層析即可將聚戊烯醇的純度提高到 90%以上，收率30%。與以往純化方法相比，此種方法具有簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，而且收 率明顯提高4倍以上，同時適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1冷凍脫色后聚戊烯醇的HPLC 2C95polyprenol 標(biāo)準(zhǔn)曲線3GP-1對IfepG 2215分泌的HBV DNA的抑制作用
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。實(shí)施例1聚戊烯醇的HPLC方法本實(shí)施通過HPLC分析，色譜柱為Kromasil C18 0DS-1 (5 μ m，150 X 4. 6匪)，柱溫
6為室溫，紫外檢測波長210nm，流動相為異丙醇甲醇=38 37，流速為1. OmL/min。以 C95polyprenol為標(biāo)準(zhǔn)對照品，純度98% (瑞典Larodan Fine Chemiclals公司提供)。(1)標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液的配制用分析天平準(zhǔn)確稱取聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)對照品(C95 polyprenolH.Omg，用正己烷溶 解，定容到10mL，配制的標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0. 40mg/mL。(2)標(biāo)準(zhǔn)對照品曲線的繪制用微量注射器分別吸取聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液(0. 4mg/mL) 1 μ L、2 μ L、3 μ L、 4 μ L和5 μ L，按上述色譜條件進(jìn)樣，各重復(fù)三次，測定相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性 方程Y= 1.5751X+1. 1546。根據(jù)HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣條件下測定樣品中聚戊烯醇的純度。 如圖2。(3)樣品的處理精密稱取銀杏葉聚戊烯醇樣品10mg，用正己烷溶解，定容到10mL，為HPLC供試樣 品。取配制好的供試樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5yL，測定聚戊烯醇的含量。(4)精密度試驗(yàn)取銀杏葉聚戊烯醇(批號為090420T)樣品，按上述擬定的方法測定聚戊烯醇的含
量，其結(jié)果如下 (5)加樣回收率試驗(yàn)分別精確稱取已知含量的銀杏葉聚戊烯醇樣品(批號090420T，聚戊烯醇含 量65.3% ) 5. Omg，置于錐形瓶中，各精密加入聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液(每ImL溶液含 0. IOmg聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品)lmL、2mL、3mL、4mL、5mL，按樣品含量測定方法處理分析，計算加樣
回收率，其結(jié)果如下 (6)穩(wěn)定性試驗(yàn)精確稱取已知含量的銀杏葉聚戊烯醇樣品(批號090420T，聚戊烯醇含量 65.3%) 5. Omg，用正己烷溶解，定容到IOmL, % HPLC供試樣品。分別于O、2、4、6、8、10、12h 進(jìn)樣，測定樣品的峰面積，計算，RSD = 1. 06% (η = 7)。 實(shí)施例290%銀杏葉聚戊烯醇制備方法以聚戊烯醇含量低于40%的銀杏葉脂溶物為原料，按固液比(g/mL)為1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，質(zhì)量比1 (1 20)，脫色 劑與聚戊烯醇粗品質(zhì)量比為(10 150) 100,50 120°C下攪拌脫色10 80min。過濾， 二次，合并脫色清液，室溫真空回收溶劑，制備脫色聚戊烯醇。將脫色聚戊烯醇與硅膠按質(zhì) 量比1 (15 50)吸附，洗脫劑為石油醚乙酸乙酯=100 (1 30)混合溶劑，硅膠 柱柱長20 300cm，柱直徑2 30cm，柱壓0. 3 3MPa，檢測波長199 220nm，流速2 200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室溫真空回收溶劑，制備90%以上聚戊烯醇。實(shí)施例3聚戊烯醇的中壓硅膠柱純化方法取25%聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物20g，加入250mL正己烷乙酸乙酯丙 酮=8 3 89的混合溶劑中，-30°C冷凍3h，-20°C離心過濾，二次，合并上清液，室溫真 空回收溶劑，制備聚戊烯醇軟膏16g。取IOg純度為31. 8%的聚戊烯醇軟膏，溶于IOOmL石 油醚，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，脫色劑用量12g，活性炭與凹凸棒土之比為 1 5，脫色溫度70°C，攪拌脫色20min。經(jīng)過脫色，純度提高到49. 6%。取硅膠400目，干 法裝柱(柱長30cm，柱直徑2. 5cm)，在-0. 05至-0. 08MPa抽空氣20 30min，從柱的底部 加入石油醚，直到石油醚全部充滿柱子，空氣排盡，在柱壓為0. 3 3MPa，檢測波長210nm， 流速lOmL/min循環(huán)5_10Bv柱平衡后，將脫色后純度為49. 6%的聚戊烯醇6g溶于50mL石 油醚中，柱壓0. 3 3MPa，檢測波長199nm，流速6mL/min，依次使用石油醚、1 %乙酸乙酯/ 石油醚、2%乙酸乙酯/石油醚、3%乙酸乙酯/石油醚洗脫，3%乙酸乙酯/石油醚的洗脫液 富集聚戊烯醇部位，室溫真空回收溶劑，制備93%聚戊烯醇。實(shí)施例4銀杏葉聚戊烯醇脫色方法篩選普通顆粒炭、糖用脫色磷酸炭、味精脫色用炭、分子篩、活性白土、凹凸棒土、 混合脫色劑等脫色劑，在451nm比色測定聚戊烯醇脫色率。聚戊烯醇脫色率=[(A0-A1)/ AJ X100%，式中=Atl-聚戊烯醇脫色前的吸光度聚戊烯醇脫色后的吸光度。IOg聚戊烯醇粗品置于250mL三口燒瓶中，加入IOOmL石油醚溶解，按選擇的因素 和水平進(jìn)行脫色。脫色后的產(chǎn)品過濾、濃縮，測定吸光度，計算聚戊烯醇的脫色率。設(shè)定原 料中色素含量為％，脫色一次，結(jié)果表明活性炭與凹凸棒土的混合脫色劑的脫色效果最好， 選擇活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑。
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選取混合脫色劑的比例、脫色劑用量、脫色溫度、脫色時間4個因素，以收率和脫 色率兩個指標(biāo)考查脫色工藝，設(shè)計了 4因素3水平L9 (34)正交試驗(yàn)，得出銀杏葉聚戊烯醇的 最佳脫色條件。如表2和表3。表2正交試驗(yàn)因素水平表
水平AB因素 CD脫色劑用量活性炭凹凸棒土?xí)r間々日 FiF ism.) 又1101:510502121:320603141:13070表3正交試驗(yàn)結(jié)果與分析因素試驗(yàn)號A BC D 收率/%脫色率/%
1111181.1293.852122278.1696.253133378.2897.444212377.6497.915223173.0996.556231266.3896.967313274.5098.738321371.0898.819332159.6898.68K1237.56233.26218.58213.89K2217.11222.33215.48219.04K3205.26204.34225.87227kt79.1977.7572.8671.30k272.3774.1171.8373.01k368.4268.1175.2975.67R10.779.643.464.37K1'287.54290.49289.62289.08K2'291.42291.61292.84291.94K3'296.22293.08292.72294.16ki'95.8596.8396.5496.36k2'97.1497.2097.6197.31k3'98.7497.6997.5798.05R'2.890.861.071.69通過對各因素的綜合評價，由極差大小可見，A、B、C、D 4個因素影響收率的主次順 序?yàn)锳 > B > D > C，即脫色劑用量>脫色劑比例>溫度>時間；影響脫色率的主次順序?yàn)?A > D > C > B，即脫色劑用量>溫度>時間>脫色劑比例?？疾榭傮w脫色效果時，要求收 率和脫色率盡量都要高，由表4可以看出最佳脫色工藝為A2B1C2D3和A3B1C3D215兩者脫色劑 用量分別為12g和14g，而通過HPLC測定，得出這兩種脫色條件下得到的聚戊烯醇純度相差 不大，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最終選擇A2B1C2D3為最佳脫色工藝，即脫色劑用量12g，活性炭與凹 凸棒土之比為1 5，脫色溫度70°C，脫色時間20min。實(shí)施例5聚戊烯醇的活性組合物制劑的制備方法基于IOOg原料，其中含有4 8g 90%聚戊烯醇、10 15g銀杏黃酮、2 6g銀 杏萜內(nèi)酯、15 20g植物油、3 5g日本木蠟、5 IOg卵磷脂、0. 5 3g VE、3 5g吐 溫-80、1 5g脫水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去離子水。在室溫下超聲波乳化 10 30min，4°C以下保存，使用前用去離子水稀釋到所需濃度，攪拌均勻，可制成IOOOmL聚戊烯醇活性組合物口服液，乳液，滴丸和注射液。實(shí)施例6聚戊烯醇的活性組合物膠囊取聚戊烯醇活性組合物30g、橄欖油55g、日本木蠟3g、蜂蠟4g、微晶纖維素Sg。依 次加入到500mL反應(yīng)器中，60 70°C，真空700 760mmHg，攪拌20 30min，混勻。將明 膠、甘油、純水按1 0.5 1.2的比例加入溶膠罐中攪拌，蒸汽夾層加熱，溫度50 80°C， 使其溶化，保溫1 2h，真空脫氣，過濾，膠液待用。調(diào)整壓丸室的環(huán)境條件，使其達(dá)到恒溫 恒濕，溫度為25°C、相對濕度為35%。將物料壓制成圓形軟膠囊800 1000粒。實(shí)施例7聚戊烯醇的活性組合物注射劑取聚戊烯醇活性組合物15g、聚氧乙烯硬蓖麻油60g、脫水山梨醇2g、丙二醇5g、去 離子水18g。在室溫下超聲波乳化10 30min，使用前用去離子水稀釋到所需濃度，攪拌均 勻，分別裝入IOmL安瓿，在100°C蒸汽下滅菌40min，制成聚戊烯醇活性組合物注射劑。實(shí)施例8聚戊烯醇抗乙型肝炎病毒的藥理試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠肏印G 2215細(xì)胞作為模型，研究銀杏葉聚戊烯醇(GP-1)的細(xì)胞毒性以及抗乙型 肝炎病毒的藥效，包括對細(xì)胞毒性、乙肝病毒表面和核心抗原的分泌及對DNA的復(fù)制水平 的影響。二、受試藥物GP-1，實(shí)驗(yàn)室制備?；贗OOg原料，其中含有5g90%聚戊烯醇、15g銀杏黃酮、6g 銀杏萜內(nèi)酯、20g橄欖油、8g卵磷脂、2gVE、3g吐溫-80、5g脫水山梨醇、7g丙二醇、4g日本木 蠟、25g去離子水。在室溫下超聲波乳化10 30min，4°C以下保存，使用前用去離子水稀釋 到所需濃度，攪拌均勻，可制成IOOOmL聚戊烯醇活性組合物乳液。每個樣品做5個稀釋濃 度試驗(yàn)，陽性對照藥物拉米夫定(3TC)，購自葛蘭素史克。三、實(shí)驗(yàn)方法采用四氮唑還原法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay MTT)檢測藥物對IfepG 2215生長的抑制作用；ELISA法測定 上清液中HBsAg、HBeAg含量；熒光定量PCR法測定上清中病毒DNA含量四、主要步驟1)取H印G 2215細(xì)胞一瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃 度至2X104cell/mL，加入96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μ L)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C、5% CO2 培養(yǎng)過夜。2)取出培養(yǎng)板，吸去上清后加入含有不同濃度藥物的DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛 血清)；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，繼續(xù)37°C、5%C02培養(yǎng)48小時。藥物濃度分別為100yg/mL， 10 μ g/mL,1 μ g/mL,0. 1 μ g/mL,0. 01 μ g/mL。3)在96孔培養(yǎng)板各孔中加入10 μ L的ΜΤΤ，重新放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時。仔 細(xì)吸去上清，每孔加入150 μ L DMS0，輕輕振蕩使甲溶解，用酶標(biāo)儀檢測570nm處的OD值。4)細(xì)胞處理取H印G 2215細(xì)胞一瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 2X104cell/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(lmL/well)。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37°C、5 % CO2培 養(yǎng)過夜。取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸出上清后依次加入不同濃度的藥物。藥物濃度分別為100 μ g/mL，50 μ g/mL，25 μ g/mL，12. 5 μ g/mL，6. 25 μ g/mL 以及 3TC 20 μ g/mL (陽性對照)。 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37°C、5%C02培養(yǎng)。分別于第3、6、9天更換新鮮培養(yǎng)基，并將各孔上清液 收集至1. 5mL的離心管中凍存?zhèn)溆谩?)上清 HBsAg，HBeAg 的檢測采用科華ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，操作按照試劑盒的使用說明進(jìn)行。最后用酶標(biāo) 儀讀取波長450nm處的OD值。6)病毒基因組DNA 的分離(CASsuper Virus Genomic DNA Isolation Kit)取藥物 作用第9天的細(xì)胞培養(yǎng)上清200 μ L于1.5mL離心管中，然后加入200 μ L Binding Buffer, 立即混勻，室溫孵育lOmin。加入IOOyL異丙醇，混勻。將混合液轉(zhuǎn)移到一個已經(jīng)套入收集 管的吸附柱內(nèi)，于12000rpm離心lmin。棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管 中。加入500 μ L WBl，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一收集管 中。加入500 μ L WB2，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一收集管 中。12000rpm離心2min。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mL離心管中，室溫放置數(shù)分鐘以確 保乙醇完全揮發(fā)干凈。在吸附柱的膜中央小心加入100 μ L Elution Buffer (65°C水浴預(yù)熱 可有效提高得率)，室溫或37°C水浴靜置2min。12000rpm離心lmin，得到洗脫液，-20°C保 存。7)熒光定量 PCR 反應(yīng)(ICycler)依次序在0. 2mL PCR管中加入以下成分 混勻后短暫離心，放入PCR儀的樣品孔上，進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)設(shè)置如下95 0C 90s, 95 0C 5s, 55 °C 15s，72°C 20s，5 個循環(huán)；95°C 5s，60°C 30s, 40 個循環(huán)； 95°C 60s, 55°C 60s, 55°C 10s, 80 個循環(huán)；4°C保存。8)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)表示為means士SD ；采用t_test檢驗(yàn)，當(dāng)P < 0. 05時認(rèn)為具有顯著意義。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.藥物毒性實(shí)驗(yàn)不同稀釋倍數(shù)的藥物加于單層H印G 2215細(xì)胞上，每日觀察細(xì)胞生長形態(tài)，檢測 有無病變；并以MTT法測定細(xì)胞的活力(表4)。
表4. GP-I對IfepG 2215的生長抑制作用 藥物作用48小時，MTT法測定細(xì)胞活力。χ士s，η = 4.結(jié)果表明，GP-I (0. 01 100 μ Μ)作用下，用藥組和未用藥組均未見到明顯的細(xì)胞 形態(tài)異常及細(xì)胞破碎等毒性變化。2.病毒抗原抑制試驗(yàn)HepG 2215在24孔培養(yǎng)板上生長至單層，加入不同稀釋倍數(shù)的GP_1，同時設(shè)細(xì)胞 對照組和藥物對照組，培養(yǎng)3、6、9天分別取上清液測定HBsAg和HBeAg，并與細(xì)胞對照組比 較，計算抑制率、IC50以及TI。對HBsAg的抑制情況如表5，對HBeAg的抑制情況如表6。表5. GP-I對H印G2215分泌HBsAg的抑制作用
實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，X士S，η = 3，**Ρ < 0. 01，compared with control.
表6. GP-I作用不同的時間對H印G2215分泌的HBeAg的抑制作用 實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，χ士s，η= 3，*P < 0. 05，**P < 0. 01, compared with control.結(jié)果表明高濃度GP-1與陽性藥3TC效果相當(dāng)，對H印G 2215細(xì)胞分泌乙肝s抗 原、e抗原具有明顯的抑制作用。3.病毒核酸抑制實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取HBV DNA，用熒光定量PCR進(jìn)行定量。使用的引物序列為 5，-AACTGA AAG CCA AAC AGT G-3，和 5，-CCT CTT CAT GCT GCT-3，。如表 7 禾口圖 3。表7. HBV DNA 定量 結(jié)果表明GP_1在各個濃度上對細(xì)胞分泌HBV DNA有較好的抑制作用。
權(quán)利要求
一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方法，其特征在于由以下步驟組成第一步、聚戊烯醇類化合物粗品的脫色以聚戊烯醇含量低于40％的銀杏葉脂溶物為原料，按固液比(g/mL)為1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，質(zhì)量比為1∶(1～20)，脫色劑與聚戊烯醇粗品質(zhì)量比為(10～150)∶100，在50～120℃下攪拌脫色10～80min，過濾，二次，合并脫色清液，室溫真空回收溶劑，制備脫色聚戊烯醇；第二步、柱純化將脫色聚戊烯醇與硅膠按質(zhì)量比1∶(15～50)吸附，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶劑，硅膠柱柱長20～300cm，柱直徑2～30cm，柱壓為0.3～3MPa，檢測波長199～220nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室溫真空回收溶劑，制備90％以上聚戊烯醇；第三步、制備抗乙肝病毒制劑基于100g原料中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g銀杏黃酮、2～6g銀杏萜內(nèi)酯、15～20g植物油、3～5g日本木蠟、5～10g卵磷脂、0.5～3gVE、3～5g吐溫 80、1～5g脫水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去離子水，在室溫下超聲波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去離子水稀釋到所需濃度，攪拌均勻，制成聚戊烯醇活性組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方 法，其特征在于第一步中銀杏葉脂溶物來源于銀杏葉，經(jīng)石油醚、正己烷、溶劑汽油非極性 溶劑浸提，皂化，萃取等工藝處理，得到聚戊烯醇含量低于40%的軟膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方 法，其特征在于第三步中銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯來源于銀杏葉提取物，其中銀杏黃酮> 24%， 萜內(nèi)酯> 6%，銀杏酚酸< lppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方 法，其特征在于所述的聚戊烯醇活性組合物可制備膠囊，口服液，滴丸，乳液和注射劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方 法，其特征在于所述的聚戊烯醇活性組合物用于治療乙肝病毒藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗乙肝病毒的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物及其制備方法，是以聚戊烯醇含量低于40％的銀杏葉脂溶物為原料，采用活性炭與凹凸棒土作為混合脫色劑，質(zhì)量比為1∶(1～20)，脫色劑與聚戊烯醇粗品質(zhì)量比為(10～150)∶100，50～120℃下攪拌脫色10～80min。脫色后的聚戊烯醇再經(jīng)過中壓柱層析分離，純度達(dá)到90％以上，輔以銀杏黃酮和萜內(nèi)酯，制備的銀杏葉聚戊烯醇活性組合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝藥物開發(fā)。
文檔編號A61K36/16GK101890059SQ20101022184
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者葉建中, 楊蘭, 王成章, 陳虹霞 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所