專利名稱：轉(zhuǎn)錄因子FOXO1調(diào)控人肝臟特異性小RNA miR-122的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究中的真核基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小RNA的表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
microRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度約20 非編碼的單鏈小分子RNA，它們通過與目標(biāo)mRNA分子的3，端非翻譯區(qū)(3' -untranslated region，3，UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致該 mRNA分子的翻譯受到抑制，從而調(diào)控下游的生物學(xué)過程。miR-122是一個(gè)人肝臟特異性小RNA。它的初始轉(zhuǎn)錄本來源于her基因轉(zhuǎn)錄本的剪切，定位于人類18號(hào)染色體18q21. 31上。miR-122在肝臟發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，并在進(jìn)化過程中高度保守。研究表明在病理狀態(tài)下，miR-122促進(jìn)丙型肝炎病毒(HCV)在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，另外miR-122與肝細(xì)胞肝癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)；在生理狀態(tài)下，miR-122參與肝細(xì)胞表型，肝臟的分化，發(fā)育與代謝，以及肝細(xì)胞應(yīng)急應(yīng)答等基本生命活動(dòng)過程。在研究miR-122調(diào)控肝臟脂類代謝的實(shí)驗(yàn)中，沉默miR-122可導(dǎo)致血漿膽固醇和甘油三酯水平的顯著降低，推測(cè)其可能與膽固醇和甘油三酯的生物合成基因表達(dá)降低有關(guān)，說明miR-122是肝臟脂肪代謝的重要調(diào)控者。F0X01是哺乳動(dòng)物叉頭蛋白家族0亞族四個(gè)成員之一，R)x0家族蛋白成員的潛在功能都緊密地被病生理狀態(tài)下復(fù)雜的信號(hào)通路所控制。叉頭蛋白家族中，特別是F0X01在整個(gè)機(jī)體的能量代謝中起著至關(guān)重要的作用。在饑餓狀態(tài)下，肝臟通過F0X01在促進(jìn)糖異生酶類表達(dá)中的關(guān)鍵作用維持糖量的水平。而在進(jìn)食后，胰臟β細(xì)胞分泌胰島素，促進(jìn)外周組織包括骨骼肌和脂肪組織對(duì)糖的攝入，同時(shí)通過PII-Akt途徑磷酸化F0X01使其出核，從而部分地抑制糖異生酶類在肝臟中的表達(dá)。除了直接調(diào)控代謝，F(xiàn)0X01還在骨骼肌和脂肪組織這兩大維系能量穩(wěn)態(tài)平衡的重要器官的形成過程中起作用。另外，通常由于胰島素需求的增高導(dǎo)致的胰臟β細(xì)胞數(shù)量增多的變化也會(huì)由于細(xì)胞核內(nèi)F0X01的表達(dá)而變得遲鈍。然而，在這些相同的病理生理學(xué)條件下，F(xiàn)0X01的表達(dá)會(huì)促進(jìn)抵抗氧化應(yīng)激的基因表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞功能。F0X01也能促進(jìn)碳水化合物向脂肪酸的轉(zhuǎn)換，使其在饑餓狀態(tài)下成為主要的能量來源。但是，關(guān)于F0X01是否與miR-122的表達(dá)和功能有關(guān)未見報(bào)道。因此本領(lǐng)域中需要對(duì)F0X01是否調(diào)控miR-122的表達(dá)進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步明確它在miR-122上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述需要，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)F0X01的潛在結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)明人證明F0X01可作為miR-122新的調(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合到miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE位點(diǎn)來調(diào)控miR-122初始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，從而可參與miR-122的功能的調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)的信號(hào)通路的影響，同時(shí)也受到HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，可最終參與到脂代謝的精細(xì)調(diào)控過程中。因此，本發(fā)明的一方面涉及轉(zhuǎn)錄因子F0X01在制備調(diào)控人肝臟特異性小RNA miR-122的制劑中的用途。具體而言，通過制備調(diào)控人肝臟特異性小RNA miR-122的制劑， 可以應(yīng)用于科學(xué)研究，也可通過調(diào)節(jié)miR-122的功能從而應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元
件結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，IRE元件的序列為AGMTTGTTTACTTT(SEQ ID NO 1)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合受到營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合以及HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合是互逆的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合受到HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子F0X01對(duì)人肝臟特異性小RNA miR-122的調(diào)控受到胰島素的調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，胰島素的濃度為ΙΟηΜ。


圖1 :UCSC Genome Browser預(yù)測(cè)F0X01在miR-122上游的潛在結(jié)合位點(diǎn)。圖2 =ECR Browser對(duì)miR-122及其上游51Λ進(jìn)行進(jìn)化保守性分析。圖3 :rVista 2. 0預(yù)測(cè)miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。圖4 對(duì)miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的F0X01潛在結(jié)合位點(diǎn)做WebLogo分析。圖5 利用胰島素刺激驗(yàn)證F0X01表達(dá)質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中的有效表達(dá)。圖6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01質(zhì)粒后檢測(cè)pri-miR-122的轉(zhuǎn)錄。圖7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01質(zhì)粒后梯度增加的胰島素對(duì)pri-miR-122轉(zhuǎn)錄的影響。圖8 =FOXOl穩(wěn)定克隆中pri-miR-122的轉(zhuǎn)錄變化。圖9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)聚焦F0X01在miR-122上游51Λ范圍內(nèi)的潛在調(diào)控區(qū)域。圖10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)胰島素應(yīng)答元件(IRE)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。圖11 利用Huh7細(xì)胞核蛋白提取物進(jìn)行凝膠遷移速率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)F0X01與miR-122 核心啟動(dòng)子區(qū)IRE位點(diǎn)的結(jié)合1、生物素標(biāo)記探針；2、生物素標(biāo)記探針+核蛋白提取物；3、 生物素標(biāo)記探針+核蛋白提取物+F0X01抗體；4、生物素標(biāo)記探針+核蛋白提取物+過量冷探針。圖12 利用過表達(dá)F0X01的細(xì)胞核蛋白提取物進(jìn)行凝膠遷移速率實(shí)驗(yàn)檢測(cè) F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)IRE位點(diǎn)的結(jié)合1、生物素標(biāo)記探針；2、生物素標(biāo)記探針+ 核蛋白提取物；3、生物素標(biāo)記探針+核蛋白提取物+F0X01抗體；4、生物素標(biāo)記探針+核蛋白提取物+過量冷探針。圖13 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)IRE位點(diǎn)
的結(jié)合。
圖14 營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)改變時(shí)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)IRE位點(diǎn)的結(jié)合。圖15 干擾HNF4后染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)IRE位點(diǎn)的結(jié)合。圖16 過表達(dá)F0X01后染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源HNF4在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式1.利用生物信息學(xué)工具分析F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)存在的潛在結(jié)合位點(diǎn)在用實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證F0X01是否在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄之前， 先利用現(xiàn)在比較成熟的對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)的在線工具，如UCSC，ECR Browser等對(duì)miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將焦點(diǎn)適當(dāng)縮小后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。1. IUCSC Genome Bioinformatics 分析對(duì)于miR-122上游5kb調(diào)控區(qū)域利用在線工具UCSC GenomeBrowser http:// genome, ucsc. edu/預(yù)測(cè)F0X01的潛在結(jié)合位點(diǎn)。如圖1所示，有兩個(gè)F0X01的潛在調(diào)控位點(diǎn)，一個(gè)是距離miR-122成熟本上游4870bp的遠(yuǎn)端調(diào)控位點(diǎn)I (site I) (chr!8 54264417-54264430)，另一個(gè)是距離miR-122成熟本上游914bp的近端調(diào)控位點(diǎn)II (site II) (chr!8 :54268372-54268385)。在位點(diǎn)I，同時(shí)還預(yù)測(cè)到同屬于叉頭(forkhead box)轉(zhuǎn)錄因子家族的F0X03，F(xiàn)OXJ2, HNF3B (F0XA2)的結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列為 5' -GAATTGTTTACTTT-3 ‘；與此類似，在位點(diǎn)II也預(yù)測(cè)到同屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的 F0X03、F0X04的結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列為5 ‘ -GAGTTGTTAACATC-3 ‘。1. 2ECR Browser 保守性分析為進(jìn)一步從生物信息學(xué)角度分析F0X01在miR-122上游最有可能的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì) miR-122及其上游51Λ調(diào)控區(qū)域利用另一個(gè)在線工具ECR Browser http//ecrbrowser. dcode. org/進(jìn)行進(jìn)化保守性分析。如圖2所示，在把人的基因組與魚到靈長(zhǎng)類的七個(gè)物種進(jìn)行比對(duì)時(shí)，除miR-122自身形成成熟本的莖環(huán)區(qū)域在各物種中均保守的，并對(duì)應(yīng)右側(cè)紅色峰(red peak)所對(duì)的粉紅色短棒(pink bar)外，只有miR-122上游約51Λ有另一個(gè)從禽類到靈長(zhǎng)類保守的區(qū)域，對(duì)應(yīng)左側(cè)紅色峰所對(duì)的粉紅色短棒，這段區(qū)域即是本室李振亞博士實(shí)驗(yàn)鑒定的mir-122的啟動(dòng)子區(qū)。對(duì)比1. 1中分析得出的F0X01在miR-122上游潛在結(jié)合的兩個(gè)位點(diǎn)，只有遠(yuǎn)端調(diào)控位點(diǎn)I處于圖2中左側(cè)紅色峰所對(duì)的進(jìn)化保守區(qū)域，而近端調(diào)控位點(diǎn)II不位于保守區(qū)域內(nèi)，預(yù)示著位點(diǎn)I更有可能被調(diào)控因子F0X01作為關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)來結(jié)合從而調(diào)節(jié)miR-122初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-122的轉(zhuǎn)錄。1. 3rVista 2. O預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)進(jìn)一步的，對(duì)于上述位點(diǎn)I所在的mir-122上游51Λ處的核心啟動(dòng)子區(qū)利用ECR Browser網(wǎng)站內(nèi)嵌的軟件rVista2. O進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，共得到44個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如圖3所示?？梢娖渲蠪0X01或其叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)值都為100. 00，這樣的位點(diǎn)有10個(gè)，分別是18V$HNF3B_01+179-193 agaATTGTTTACTTt 187-201cgaATTGTTTACTTt 100.00
19V$F0XJ2_01-179-196 agaatTGTTTACttttaa 187_204cgaatTGTTTACttttaa 100.0021V$F0X01_02+180-193 gaaTTGTTTACttt 188-201gaaTTGTTTACttt 100.0022V$F0X03_01+180-193 gaaTTGTTTACttt 188_201gaaTTGTTTACttt 100.0023V$F0X04_02+180-193 gaaTTGTTTACttt 188_201gaaTTGTTTACttt 100.0024V$F0X04_01-180-190 gaatTGTTTac 188-198 gaatTGTTTaclOO. OO29V$F0XD3_01+181-192 aatTGTTTACTt 189_200aatTGTTTACTt 100.0030V$F0X_Q2+181-193 aatTGTTTACTTt 189-20IaatTGTTTACTTt 100.0032V$F0X01_01-182-191 atTGTTTact 190-199 atTGTTTactlOO. OO33V$HNF3_Q6-182-194 atTGTTTactttt 190-202 atTGTTTacttttlOO. OO將這十個(gè)與FOXOl及其家族有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)歸納起來，它們實(shí)際都位于相似的位點(diǎn)(從這段啟動(dòng)子區(qū)的179bp到204bp范圍)，也即UCSC預(yù)測(cè)的FOXOl在距離 miR-122成熟本上游4870bp的遠(yuǎn)端調(diào)控位點(diǎn)I (chr!8 :54264417-54264430)所在的位置， 并包含了同一保守結(jié)合序列，即agaATTGTTTACTTt，其中紅色部分為IRE (insulinresponse element)元件保守序列。而F0X01可以通過結(jié)合IRE元件對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如 Jennifer Altomonte和同事所做的F0X01對(duì)ApoC3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工作中，F(xiàn)0X01就是通過結(jié)合到ApoC3上游啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件上對(duì)其進(jìn)行調(diào)控的。保守序列用WebLogo工具作圖后如4所示。2. F0X01的過表達(dá)和突變對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮不同調(diào)控作用2. 1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01對(duì)miR-122轉(zhuǎn)錄的影響2. 1. 1F0X01系列表達(dá)質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中的有效性鑒定*艮據(jù)文獻(xiàn)(Biggs, W. H. ,3rd, Meisenhelder, J.，Hunter, Τ.，Cavenee, W. K.， andArden, K. C. (1999). Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclearexclusion of the winged helix transcription factor FKHR1. Proc Natl Acad Sci U S A 96,7421-7426 ；Kamagate, Α. ， and Dong, H. H. (2008). FoxOl integrates insulin signalingto VLDL production. Cell Cycle 7，3162-3170.)，在胰島素刺激的情況下，野生型F0X01蛋白受胰島素激活的PII-Akt途徑磷酸化后出核，而組成型的F0X01 蛋白因?yàn)榱姿峄稽c(diǎn)的突變而無法被磷酸化出核，始終定位在細(xì)胞核內(nèi)。構(gòu)建F0X01的野生型表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-F0X01-WT和三個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Thr-M， Ser-253, Ser-316)突變的表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP_F0M)l-CA F0X01-WT質(zhì)粒構(gòu)建將F0X01基因編碼區(qū)357bp 2343bp片段經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到產(chǎn)物后通過上游B10 I位點(diǎn)，下游pst I位點(diǎn)連接到PEGFP-N2載體 (PEGFP-N2:購(gòu)自clotech公司，貨號(hào)(Catalog#6081-1))的多克隆位點(diǎn)中。F0X01-CA質(zhì)粒構(gòu)建將F0X01基因編碼區(qū)162bp 2346bp片段經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到產(chǎn)物后通過上游B10 I位點(diǎn)，下游Kpn I位點(diǎn)連接到PEGFP-N2載體的多克隆位點(diǎn)中，其中F0X01-CA較F0X01-WT對(duì)于F0X01的基因編碼區(qū)有如下括號(hào)所對(duì)應(yīng)區(qū)域的三個(gè)下劃線堿基的突變Thr-24 :ACC-GCC (455-457)Ser-253 :TCC-&CC (1151-1153)
Ser-316 :TCA-GCA (1340-1342)將F0X01的野生型表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-F0X01-WT和三個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Thr_24， Ser-253, Ser-316)突變的表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-FOXOl-CA及對(duì)照質(zhì)粒pEGFP_N2在肝癌細(xì)胞系 Huh7中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后66小時(shí)加入IOOnM胰島素，轉(zhuǎn)染后68小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖5所示，加胰島素的這組細(xì)胞里野生型的F0X01有出核現(xiàn)象，而磷酸化位點(diǎn)突變的F0X01 沒有出核，說明F0X01表達(dá)質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞系中可以正常工作。2. 1. 2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01質(zhì)粒后對(duì)miR-122轉(zhuǎn)錄的影響用Engreen公司的轉(zhuǎn)染試劑Enhancer-D瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒pEGFP-FOXOl-WT與核內(nèi)組成型質(zhì)粒pEGFP-FOXOl-CA和對(duì)照質(zhì)粒pEGFP_N2于Huh7細(xì)胞系中。完成轉(zhuǎn)染66小時(shí)后分為兩組，一組加IOOnM胰島素，另一組不加，兩小時(shí)后(即轉(zhuǎn)染6 后)用Trizol收集樣品提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，后利用miR-122的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-122來檢測(cè)miR-122 轉(zhuǎn)錄情況的變化。這里之所以用初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-122來檢測(cè)miR-122的轉(zhuǎn)錄變化，是因?yàn)樵?009年DavidGatfield和他的同事所做的關(guān)于miR-122節(jié)律性變化的研究工作中發(fā)現(xiàn)，miR-122的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-122和前體pre-miR-122這兩種轉(zhuǎn)錄的中間產(chǎn)物由于半衰期很短，比成熟本更能真實(shí)的反映miR-122的轉(zhuǎn)錄情況(如果前兩者的半衰期是幾分鐘，那么后者的半衰期就至少是M小時(shí))。如圖6所示，野生型的F0X01使miR-122轉(zhuǎn)錄增加，在有胰島素的情況下，miR-122轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的作用更加明顯，約為不加胰島素時(shí)的8倍。 而組成型的F0X01使miR-122的轉(zhuǎn)錄減少，并且這種減少不受胰島素的影響。2. 1. 3不同濃度的胰島素對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01質(zhì)粒后miR-122轉(zhuǎn)錄的影響同2. 1. 2方法，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01兩種質(zhì)粒48小時(shí)后，分別加入梯度濃度的胰島素于已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Huh7中，兩小時(shí)后(轉(zhuǎn)染后50h)收集樣品提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用 Realtime-PCR檢測(cè)pri-miR-122的變化，如圖7所示。不論胰島素是何種濃度，核內(nèi)組成型表達(dá)的質(zhì)粒F0X01-CA都使miR-122的轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照；而野生型的F0X01對(duì)miR-122 的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用隨著胰島素濃度的增加而增強(qiáng)，但濃度到達(dá)一定閾值后這種作用反而減弱 miR-122的轉(zhuǎn)錄。2. 2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染F0X01對(duì)miR-122轉(zhuǎn)錄的影響在2. 1中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染F0X01質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)過表達(dá)后，其中組成型表達(dá)F0X01-CA的樣品中 F0X01的表達(dá)量與野生型F0X01-WT及對(duì)照相比高出200多倍(圖6A)，這一實(shí)驗(yàn)重復(fù)了多次均是該結(jié)果。那么這種異常高表達(dá)F0X01蛋白于核內(nèi)的條件下，靶基因的改變是生理狀態(tài)下的情況嗎？基于這個(gè)問題，發(fā)明人后續(xù)篩選了 F0X01穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞克隆，并再次檢測(cè)了 F0X01的表達(dá)情況和對(duì)pri-miR-122的轉(zhuǎn)錄影響。首先，從Realtime-PCR 結(jié)果和 Western blot 結(jié)果顯示(圖 8A)，F(xiàn)0X01-WT 穩(wěn)定克隆中F0X01自身表達(dá)量較對(duì)照略有增高，但并不明顯；而F0X01-CA穩(wěn)定克隆中F0X01自身表達(dá)量比對(duì)照有明顯增高，且增高的幅度在生理范圍內(nèi)，此時(shí)對(duì)靶基因的影響應(yīng)該更接近真實(shí)的情況。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染F0X01的克隆內(nèi)，發(fā)明人利用Realtime-PCR檢測(cè)miR-122的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miR-122的轉(zhuǎn)錄情況，如圖8B所示，miR-122在F0X01-WT穩(wěn)定克隆中轉(zhuǎn)錄被激活，而在F0X01-CA穩(wěn)定克隆中轉(zhuǎn)錄被抑制。雖然miR-122在兩種穩(wěn)定克隆中的轉(zhuǎn)錄變化不顯著，但趨勢(shì)與之前2. 1中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果一致，即miR-122受野生型表達(dá)的F0X01蛋白轉(zhuǎn)錄激活作用，而受核內(nèi)組成型表達(dá)的F0X01蛋白轉(zhuǎn)錄抑制作用。
3. F0X01調(diào)控miR-122轉(zhuǎn)錄的機(jī)制研究確定miR-122的轉(zhuǎn)錄受到F0X01蛋白的調(diào)控之后，發(fā)明人需要進(jìn)一步鑒定F0X01 調(diào)控miR-122的具體機(jī)制。作為轉(zhuǎn)錄因子F0X01調(diào)控基因表達(dá)有兩種方式一種是通過結(jié)合特異的DNA序列來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，另一種是作為不依賴DNA結(jié)合的核受體的輔因子來起作用。發(fā)明人也分別從這個(gè)兩個(gè)方面來鑒定F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的具體作用模式。3. 1通過截短實(shí)驗(yàn)來聚焦F0X01在miR-122上游的相應(yīng)順式調(diào)控區(qū)域發(fā)明人選取miR-122成熟本上游約51Λ區(qū)域進(jìn)行短截，并構(gòu)建了帶以下三種片段的報(bào)告基因載體從上游_5181bp至-2944bp的片段Del 1，從上游_2944bp至_842bp的片段Del2，從上游-1646bp至+Ibp的片段Del3。然后將它們和帶全長(zhǎng)51Λ片段的載體分別與F0X01表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染M小時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。首先，相對(duì)全長(zhǎng)而言，截短片段Dell和Del2均能使報(bào)告基因的活性顯著增加，截短片段Del3雖然也能部分增加報(bào)告基因活性，但增幅不顯著，由此可知片段Dell與Del2 比Del3更具有作為啟動(dòng)子區(qū)的潛力。這一結(jié)論也與發(fā)明人之前1. 2中利用生物信息學(xué)軟件分析miR-122上游51Λ區(qū)域的結(jié)論一樣，即保守的啟動(dòng)子區(qū)也位于這個(gè)51Λ片段靠前部分。接著考慮F0X01對(duì)不同片段的調(diào)控作用，與對(duì)照相比，在Dell與Del2這兩組中，F(xiàn)0X01 僅對(duì)Dell的轉(zhuǎn)錄激活有抑制作用，而對(duì)Del2的轉(zhuǎn)錄激活沒有影響，也就是說F0X01的調(diào)控靶點(diǎn)位于Dell，這也與之前1. 1中UCSC網(wǎng)站預(yù)測(cè)的位點(diǎn)位置范圍一致。同時(shí)觀察到F0X01對(duì)于非保守啟動(dòng)子區(qū)的Del3也有一定的轉(zhuǎn)錄抑制作用，那么是否F0X01也有調(diào)控靶點(diǎn)位于Del3呢？發(fā)明人將與F0X01有相同DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的R)x0家族成員F0X03a轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞后看報(bào)告基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于F0X01潛在的兩個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)Dell與Del3，F(xiàn)0X03a只對(duì)Dell的轉(zhuǎn)錄激活有抑制作用，而對(duì)Del3的轉(zhuǎn)錄激活沒影響；如果同時(shí)共轉(zhuǎn)染F0X01與F0X03a，它們對(duì)Dell轉(zhuǎn)錄激活的抑制作用比單獨(dú)轉(zhuǎn)染F0X01 或F0X03a都更顯著，與此同時(shí)它們的聯(lián)合也沒有對(duì)Del3的轉(zhuǎn)錄激活起到任何影響。綜合分析生物信息學(xué)和這一階段報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果，發(fā)明人得出結(jié)論F0X01最為保守和最能介導(dǎo)其調(diào)控功能的靶位點(diǎn)在miR-122成熟本上游-5181bp至_2944bp的約 2kb區(qū)域，由此排除了 1. 1中提到的F0M)1兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)中的近端調(diào)控位點(diǎn)II。那么接下來，發(fā)明人根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的位點(diǎn)，看能否將F0X01的結(jié)合位點(diǎn)精確定位到miR-122 核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE位點(diǎn)(即1. 1中預(yù)測(cè)的位點(diǎn)I)。3. 2通過突變實(shí)驗(yàn)來精確定位F0X01在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)調(diào)控 pri-miR-122轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)那么在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)(成熟本上游_5181bp至_4563bp的618bp)內(nèi)， F0X01的具體結(jié)合位點(diǎn)究竟位于什么地方呢？之前1. 3中利用生物信息學(xué)工具rVista2. 0 進(jìn)行預(yù)測(cè)得知，F(xiàn)0X01的結(jié)合位點(diǎn)在距離miR-122成熟本上游4870bp 的遠(yuǎn)端調(diào)控位點(diǎn)I (chr!8 :54264417-54264430)，其保守的結(jié)合序列為agaATTGTTTACTTt，其中紅色部分即為IRE (insulin responseelement)元件的基序。于是發(fā)明人針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 IRE-mutant的報(bào)告基因載體，將其與miR-122正常的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體分別與F0X01組成型表達(dá)載體F0X01-CA共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，24小時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。如圖IOB所示，當(dāng)miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)未突變IRE元件時(shí)，組成型表達(dá)的F0X01 蛋白能顯著抑制miR-122啟動(dòng)子對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活作用；當(dāng)miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)突變了 IRE元件時(shí)(如圖10A)，這種抑制作用將消失，可見F0X01對(duì)miR-122啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄抑制作用是通過I結(jié)合IRE元件來實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步說明F0X01通過結(jié)合IRE元件調(diào)控miR-122啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)明人用一種能夠阻斷三磷酸酰肌醇蛋白激酶(Phosphotidylinsitol-3-Kinase，PI3K)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白激酶抑制劑LY^4002來代替F0X01-CA質(zhì)粒，加到三組報(bào)告基因細(xì)胞中。得到與表達(dá)組成型F0X01蛋白一致的結(jié)果，即與對(duì)照相比，蛋白激酶抑制劑能使未突變的mir-122啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用下降，而在突變IRE組則沒有這種效應(yīng)?？梢奆0X01 通過IRE元件結(jié)合并調(diào)控miR-122轉(zhuǎn)錄的過程受PII-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，即在有 LY294002時(shí)，內(nèi)源F0X01被磷酸化出核的途徑被阻斷了，因此留在細(xì)胞核內(nèi)的F0X01增多， 其通過結(jié)合IRE元件對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄抑制作用也體現(xiàn)出來，但此時(shí)若IRE元件被突變，核內(nèi)雖然有F0X01蛋白的增多，但無法行使結(jié)合并調(diào)控miR-122轉(zhuǎn)錄的功能。以上均說明，F(xiàn)0X01通過結(jié)合mir-122核心啟動(dòng)子區(qū)上的IRE元件(上游-4870 至-4856)來抑制miR-122的轉(zhuǎn)錄。4. F0X01作為miR-122上游轉(zhuǎn)錄因子的體外和體內(nèi)鑒定那么F0X01蛋白是否具有結(jié)合miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)上IRE元件的能力呢？它在行使功能時(shí)在這個(gè)位點(diǎn)上是否有結(jié)合呢？接下來發(fā)明人對(duì)F0X01作為miR-122上游的轉(zhuǎn)錄因子做了體外的凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA來驗(yàn)證F0X01蛋白是否可以在體外與這段特異的DNA 片段結(jié)合，并通過做體內(nèi)的染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)ChIP來驗(yàn)證生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的F0X01 蛋白是否能結(jié)合這段DNA行使特定的功能。4. 1F0X01作為miR-122上游轉(zhuǎn)錄因子的體外實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)明人利用Pierce的核蛋白提取試劑盒抽提過表達(dá)了 F0X01蛋白的Huh7細(xì)胞的核蛋白，并設(shè)計(jì)了兩對(duì)生物素標(biāo)記的WT-IRE和Mutant-IRE探針，依照EMSA的protocol進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的體外實(shí)驗(yàn)。如圖11所示，箭頭所指shift帶即為F0X01蛋白與含IRE的探針結(jié)合的滯后帶， 加入F0X01特異抗體后，不論突變還是未突變的探針其3號(hào)泳道都顯示這條帶的消失；如果加冷探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核蛋白抽提物，突變與否的探針對(duì)應(yīng)的4號(hào)泳道也都顯示該條帶的減弱或完全消失。另外相對(duì)未突變IRE元件的探針，2號(hào)泳道中突變IRE后的探針與F0X01結(jié)合的特異條帶明顯減弱了，也證明了這一突變使F0X01蛋白與該特異DNA片段的結(jié)合隨著特異基序的部分改變而降低。因?yàn)橥茰y(cè)利用Huh7細(xì)胞核蛋白提取物沒有出現(xiàn)super shift是由于肝細(xì)胞系 Huh7細(xì)胞核內(nèi)有多種相互作用的蛋白復(fù)合體，單獨(dú)的F0X01抗體不足以結(jié)合并滯后相互結(jié)合的IRE片段與蛋白復(fù)合體。故發(fā)明人利用試劑盒抽提過表達(dá)F0X01蛋白量更大，組成更單一的細(xì)胞的核蛋白，來重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。如圖12所示，箭頭所指“shift”帶即為核蛋白提取物與含IRE的探針結(jié)合的滯后帶，加入F0X01特異抗體后，未突變的探針其3號(hào)泳道顯示這條帶的減弱，并在這條帶位置上方出現(xiàn)兩條大小相近的“supershift”帶；如果加冷探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核蛋白抽提物，未突變的探針對(duì)應(yīng)的4號(hào)泳道顯示shift帶減弱至近乎消失。另外對(duì)于突變IRE元件的的這組， 2號(hào)泳道中突變IRE后的探針與F0X01幾乎沒有特異結(jié)合的條帶，3號(hào)泳道中也顯示了加入 F0X01抗體后無任何變化，而4號(hào)泳道加入冷探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核蛋白抽提物后無任何條帶。以上體外實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)0X01蛋白在體外可以直接與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件結(jié)合。4. 2F0X01作為miR-122上游轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鑒定進(jìn)一步的，發(fā)明人需要在生理?xiàng)l件下原位鑒定Huh7細(xì)胞內(nèi)的F0X01蛋白是否能結(jié)合這段DNA行使特定的功能?？紤]到功能型F0X01蛋白受多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響和調(diào)控， 并多數(shù)通過出核和入核來行使其生理功能，發(fā)明人通過兩種營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)來鑒定這種原位的結(jié)合是否存在，這兩種營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)為高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)(Mn) 和低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)Oht)，同時(shí)收取細(xì)胞樣品，進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。如圖13 所示，A 圖為 semi-quantity PCR 結(jié)果，B 圖為 Realtime-PCR 結(jié)果。相似的，在高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24小時(shí)的Huh7細(xì)胞樣品Mn中，F(xiàn)0X01抗體特異結(jié)合的DNA 片段的量與IgG非特異結(jié)合的DNA量基本無差異，而在低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下無血清培養(yǎng)M小時(shí)后的樣品Mst中，F(xiàn)0X01抗體特異結(jié)合的DNA片段信號(hào)顯著高于IgG組，這一結(jié)果用靈敏的Realtime-PCR來檢測(cè)時(shí)差異更明顯?？梢娫谕耆コ搴螅渲械囊葝u素成分激活 PI3K-Akt通路的效應(yīng)被阻斷，F(xiàn)0X01蛋白無法被磷酸化出核，而更多的滯留于細(xì)胞核內(nèi)，也因此增強(qiáng)了結(jié)合于miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)中IRE元件的潛力。以上用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了，Huh7細(xì)胞在完全去除血清的低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)M小時(shí)后，內(nèi)源的F0X01蛋白能增強(qiáng)入核而結(jié)合miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)中IRE元件。為進(jìn)一步證明這種結(jié)合是有功能的，發(fā)明人對(duì)Huh7細(xì)胞進(jìn)行了從高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài) (24η)到低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)Oht)再回復(fù)到高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)培養(yǎng)的過程。即模擬去除胰島素又回復(fù)胰島素的效應(yīng)。結(jié)果如圖14所示，A圖可見F0X01在miR-122啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合的確是隨著營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的改變而改變，即在去除胰島素激活的磷酸化途徑時(shí)，F(xiàn)0X01與IRE的結(jié)合增多，而在回復(fù)含有胰島素的血清12小時(shí)后這種結(jié)合完全消失了。有趣的是，此時(shí)檢查之前本室李振亞博士鑒定的miR-122轉(zhuǎn)錄因子HNF4在 miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)該位點(diǎn)所使用的ChIP引物擴(kuò)增片段中包含了 F0X01結(jié)合的IRE元件。于是使用HNF4特異抗體做針對(duì)其結(jié)合位點(diǎn)的ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖 14B所示，血清剝奪后的低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下HNF4在IRE元件附近的結(jié)合有微弱的減少趨勢(shì)但不顯著，然而當(dāng)從低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)回復(fù)到高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)后，HNF4在該區(qū)域的結(jié)合顯著增多。4. 3F0X01和HNF4在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)上相同區(qū)域的結(jié)合呈互逆狀態(tài)由于在不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下檢測(cè)有著相同區(qū)域靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子F0X01與HNF4的結(jié)合情況時(shí)發(fā)生了有趣的互逆情況，發(fā)明人要進(jìn)一步確證這種互逆的狀態(tài)是由于營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)改變時(shí)體內(nèi)第三方改變的效應(yīng)還是F0X01與HNF4對(duì)相同區(qū)域的結(jié)合相互拮抗引起的。于是發(fā)明人首先利用RNA干擾技術(shù)敲低了 HNF4在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在對(duì)其表達(dá)進(jìn)行干擾后HNF4自身在mir-122核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是否降低。如圖15，首先A圖和B圖通過RT-PCR和Western blot兩種方法分別從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了 Huh7細(xì)胞中的確實(shí)現(xiàn)了 HNF4的干擾。接下來，圖C中也用ChIP實(shí)驗(yàn)證明了與對(duì)照株相比，干擾細(xì)胞株中HNF4蛋白在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)上的結(jié)合的確顯著減少。此時(shí)圖D顯示了 F0X01在與HNF4同樣區(qū)域的結(jié)合顯著增多了。可見，HNF4在該區(qū)域結(jié)合的減少是導(dǎo)致F0X01在該區(qū)域結(jié)合增多的直接原因。然后反過來，發(fā)明人改變F0X01的表達(dá)狀態(tài)，在Huh7細(xì)胞中進(jìn)行F0X01的過表達(dá)， 并用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)后F0X01自身在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是否增高。如圖16所示，A圖和B圖通過RT-PCR和Western blot兩種方法分別從mRNA水平和蛋白水平的來驗(yàn)證了 Huh7細(xì)胞中的確實(shí)現(xiàn)了 F0X01的過表達(dá)。接下來，圖C中也用ChIP 實(shí)驗(yàn)證明了與對(duì)照株相比，過表達(dá)組成型質(zhì)粒F0X01-CA細(xì)胞株中的F0X01蛋白在miR-122 核心啟動(dòng)子區(qū)上的結(jié)合的確比其余兩組細(xì)胞株多。此時(shí)圖D顯示了 HNF4蛋白在與F0X01 蛋白同樣區(qū)域的結(jié)合顯著減少了?？梢?，F(xiàn)0X01在該位點(diǎn)結(jié)合的增多是導(dǎo)致HNF4在該位點(diǎn)結(jié)合減少的直接原因。綜合以上兩個(gè)方面的結(jié)果，更進(jìn)一步確證了 F0X01和HNF4在miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)上相同區(qū)域的結(jié)合呈拮抗?fàn)顟B(tài)。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)錄因子F0X01在制備調(diào)控人肝臟特異性小RNAmiR-122的制劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的IRE元件的序列為SEQID NO :1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合受到營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合以及HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合是互逆的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄因子F0X01與miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE元件的結(jié)合受到HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于轉(zhuǎn)錄因子F0X01對(duì)人肝臟特異性小 RNAmiR-122的調(diào)控受到胰島素的調(diào)節(jié)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的胰島素的濃度為ΙΟηΜ。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄因子FOXO1調(diào)控人肝臟特異性小RNA miR-122的用途。發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明FOXO1可作為miR-122新的調(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合到miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE位點(diǎn)來調(diào)控miR-122初始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，從而可參與miR-122的功能的調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)的信號(hào)通路的影響，同時(shí)也受到HNF4對(duì)該位點(diǎn)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，可最終參與到脂代謝的精細(xì)調(diào)控過程中。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102309742SQ20101022180
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者習(xí)楊, 劉德培, 呂湘, 曾超, 朱文楠, 李振亞 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所