專利名稱：2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯并噁嗪衍生物的用途，尤其涉及2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]_苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的結(jié)構(gòu)式為 分子式=C9H12N2O2分子量180. 2，性狀淺黃色固體，熔點(diǎn)154-156°C。2，3_ 二氫-[1，4]_苯并噁嗪衍生物是一類非常重要的結(jié)構(gòu)單元，許多天然產(chǎn)物和 合成藥物中都含有該結(jié)構(gòu)單元。已知2，3- 二氫-2-取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物具有抑菌、抗血栓、心搏徐 緩、抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)紊亂等藥理活性，如專利號(hào)為US6649610、W02005051934、 W02005058847的專利所涉及的2，3- 二氫-2-取代_[1，4]-苯并噁嗪衍生物結(jié)構(gòu)；2，3- 二 氫-2，3-二取代_[1，4]_苯并噁嗪衍生物具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、通便等藥理活性，如專利號(hào)為 GB1285711、GB1182770、GB883324 的專利所涉及的 2,3- 二氫-2,3- 二取代 _[1，4]_ 苯并噁 嗪衍生物結(jié)構(gòu)；另外，其它位置(如氮和苯環(huán))上含有取代基的2，3_二氫-[1，4]_苯并噁嗪 類化合物具有肌松、鎮(zhèn)痛、抗精神失常、抗震顫麻痹、抗炎、解熱、預(yù)防冠心病和動(dòng)脈硬化、抑 制磷酸二酯酶等藥理作用，如專利號(hào)為US3879522、GBl 173942、W08907596、W02004087694、 W00230914.JP2000327663的專利所涉及的2，3- 二氫_[1，4]-苯并噁嗪衍生物結(jié)構(gòu)。然而 人們對(duì)2，3- 二氫-3-取代_[1，4]-苯并噁嗪衍生物的結(jié)構(gòu)、活性及合成研究尚不多見，僅 有如專利號(hào)為US6872823、US2006014946的專利涉及到的2，3- 二氫-3-甲基-[1，4]-苯并 噁嗪衍生物，該類化合物主要作為合成喹諾酮類抗菌藥及植物保護(hù)劑的重要中間體，其制 備方法包括1)美國專利US6872823涉及的以2，3，4_三氟苯胺和2-羥基丙酸甲酯作為原 料，經(jīng)過三步反應(yīng)制備；2)美國專利US2006014946涉及的以鄰硝基苯氧基丙酮在異丙醇中 以5% Pt/C還原制備。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索，有關(guān)2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在誘導(dǎo)胚 胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種2，3_ 二氫-3-羥甲 基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干 細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化藥物中的應(yīng)用。其中有效誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的2，3_ 二氫-3-羥甲 基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪濃度為1 20 iiM;優(yōu)選濃度為10iiM。本發(fā)明提供的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪為研制開發(fā)促進(jìn) 血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生的藥物奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]-苯并噁嗪還可作為一種有效的工具，用于胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的分子機(jī)制 的研究。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯 并噁嗪的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來說明其在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的應(yīng)用。本發(fā)明所述2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪的制備在回流溫度下，向2，4-二硝基苯氧甲基環(huán)氧乙烷(0. 480g,2mmol)和醋酸(lmL， 17. 5mmol)的 Et0H/H20(v/v = 6 1，100mL)溶液中加入鐵粉(0. 670g，12mmol)。反應(yīng)混 合物繼續(xù)回流120分鐘。冷卻至室溫，以飽和Na2C03溶液調(diào)pH = 8，以C鹽抽濾，濃縮掉濾 液中的乙醇和水，所得固體以乙醇洗(10mLX4)。乙醇相以無水MgS04干燥，過濾，得粗品； 將上述粗品以硅膠柱層析(乙醇作展開劑)分離，得2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]-苯并噁嗪(0. 149g,42% )。采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，以如下實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證本發(fā)明所述2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化中的 作用。1、2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞形態(tài)的影響將胚胎干細(xì)胞均勻種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置正常組在分化培養(yǎng)基(正 常培養(yǎng)基去除白血病抑制因子)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加 入DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M 40 ii M的2，3- 二 氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定 時(shí)更換培養(yǎng)基，并在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化，直至第十天。結(jié)果表明與正常組和溶劑對(duì)照組相比，分化十天之后，實(shí)驗(yàn)組中1 20PM處理 組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相比有變化，10 PM處理組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(見附圖1)，其由 之前的典型的聚集生長的胚胎干細(xì)胞克隆形成血管內(nèi)皮細(xì)胞樣，胞體逐步回縮，立體感增 強(qiáng)；而實(shí)驗(yàn)組中的其他處理組的細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)較弱。2、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(Flk-1)的檢測(cè) 將用濃度為0. 5 ii M 40 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基_6_氨基_[1，4]-苯并噁 嗪誘導(dǎo)5天和10天的胚胎干細(xì)胞均勻種于48孔板中，在37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，待 細(xì)胞貼壁后，利用免疫組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物——Flk-1的表 達(dá)。設(shè)置正常組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件 下加入DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M 40 ii M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。 結(jié)果表明經(jīng)過10天的誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)組中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1表達(dá)逐漸增多， 正常組和溶劑對(duì)照組僅少量增加Flk-1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中濃度為1 y M 20 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪Flk-1表達(dá)增加，10 yM處理組的胚胎干細(xì)胞 Flk-1的表達(dá)增加比較明顯(見附圖2)。說明10yM的2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]_苯并噁嗪能夠明顯誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。3、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(⑶31)的檢測(cè)將用濃度為0. 5 ii M 40 ii M的2，3- 二氫_3_羥甲基_6_氨基-[1，4]-苯并噁嗪 誘導(dǎo)10天的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白。設(shè)置溶劑對(duì)照組在分化培養(yǎng)基的培 養(yǎng)條件下加入DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 y M 40 y M 的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。用提取的胚胎干細(xì)胞總蛋白進(jìn) 行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管內(nèi)皮標(biāo)記物⑶31的表達(dá)。結(jié)果表明經(jīng)過10天的誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)組中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物⑶31明顯比溶劑對(duì)照 組表達(dá)增多，實(shí)驗(yàn)組中濃度為1 P M 20 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯 并噁嗪有⑶31的表達(dá)增多，10yM處理組的胚胎干細(xì)胞⑶31的表達(dá)增加比較明顯(見附圖 3)。說明10 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪能夠明顯誘導(dǎo)胚胎干 細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。4、體外血管形成檢測(cè)將經(jīng)過十天誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞接種于事先鋪好Matrigel的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 給細(xì)胞換檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)，置于37°C，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí) 72小時(shí)，并定時(shí)觀察血管形 成情況。設(shè)置正常組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)十天的胚胎干細(xì)胞；溶劑對(duì)照組在 分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入DMS0培養(yǎng)十天的胚胎干細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng) 條件下加入濃度為0. 5 ii M 40 ii M 2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng) 十天的胚胎干細(xì)胞。在6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)分別對(duì)所有組用倒置相差顯微鏡 觀察細(xì)胞在Matrigel上的血管形成情況。在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，只加入DMS0的溶劑對(duì)照組細(xì)胞，幾乎不能在 Matrigel上分化形成血管樣結(jié)構(gòu)，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，大部分的胚胎干細(xì)胞聚集成 集落。與之相反，加入濃度為1 20 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁 嗪的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在Matrigel上形成不同程度的管腔狀的血管樣結(jié)構(gòu)，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間 的延長，形成的血管樣結(jié)構(gòu)逐漸增粗(見附圖4)。其中10 yM處理組出現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu)尤其 明顯。結(jié)果表明在體外成血管的檢測(cè)中，經(jīng)過濃度為10yM的2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨 基-[1，4]_苯并噁嗪誘導(dǎo)十天的胚胎干細(xì)胞在Matrigel上具有明顯的血管生成的作用。5、吞噬Dil-Ac_LDL(Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?的功能檢測(cè)將經(jīng)過十天誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞接種于鋪被明膠的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C， 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁之后，將用培養(yǎng)液稀釋好的Dil-Ac-LDL加入培養(yǎng)板中，置 于37°C，C02培養(yǎng)箱中孵育六個(gè)小時(shí)。設(shè)置正常組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)十天的 胚胎干細(xì)胞；溶劑對(duì)照組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入DMS0培養(yǎng)十天的胚胎干細(xì)胞； 實(shí)驗(yàn)組在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 y M 40 y M的2，3- 二氫-3-羥甲 基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪培養(yǎng)十天的胚胎干細(xì)胞。孵育完成后，利用激光掃描共聚焦 顯微鏡觀察細(xì)胞吞噬Dil-Ac-LDL的情況。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中濃度為111|1 2011|1的2，3-二氫-3-羥甲 基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪處理的胚胎干細(xì)胞能夠吞噬Dil-Ac-LDL，其中10 y M處理組中吞噬的狀況尤為明顯。(見附圖5)。說明在吞噬Dil-Ac-LDL的功能檢測(cè)中，濃度為 10 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞具有顯著的吞 噬Dil-Ac-LDL的作用。由上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論胚胎干細(xì)胞在分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，濃度為1 y M 20 y M的2，3- 二氫-3-羥 甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪處理胚胎干細(xì)胞5至10天能明顯的促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，濃度10 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪處理 的胚胎干細(xì)胞尤為明顯。體外Matrigel上的血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為10yM的2， 3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天的胚胎干細(xì)胞在體外能明顯形成血 管。吞噬Dil-Ac-LDL功能的檢測(cè)結(jié)果表明，濃度為10 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨 基-[1，4]_苯并噁嗪誘導(dǎo)十天的胚胎干細(xì)胞具有顯著的吞噬Dil-Ac-LDL的作用。因此本 發(fā)明為研究誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本發(fā)明涉 及的2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪可以作為一種有效的工具，用于胚胎 干細(xì)胞的分化和血管新生的分子機(jī)制研究，同時(shí)本發(fā)明為研制開發(fā)有關(guān)促血管新生藥物奠 定了基石出。


圖1，為胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，倒置相差顯微鏡下顯 示的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞10天之后的形態(tài)圖 片。其中A 為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，作為陽性對(duì)照。B 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，自然分化十天。C 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入DMS0，分化十天。D 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為5 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。E:胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為10iiM的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。F 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為20 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。圖2，為胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，激光共聚焦顯微鏡下 顯示的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞10天之后的血管 內(nèi)皮標(biāo)志物Flk-1的表達(dá)狀況。其中A 為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，作為陽性對(duì)照。B 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，自然分化十天。C 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入DMS0，誘導(dǎo)十天。D 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為5 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。
E:胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為10iiM的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。F 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為20 ii M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。圖3，為胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，用western blot檢 測(cè)2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞10天之后的血管內(nèi)皮 標(biāo)志物⑶31的表達(dá)量。圖4，為胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，倒置相差顯微鏡下 顯示的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞10天之后的在 Matrigel上成血管的情況。其中A 為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，在Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)，作為陽性對(duì)照。B:胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，自然分化十天在 Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)。C:胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入DMS0，誘導(dǎo)十天在 Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)。D 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為5 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天在Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)。E 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為10yM的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天在Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)。F 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為20 ii M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天在Matrigel上培養(yǎng)6小時(shí)。圖5，為胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，激光共聚焦顯微鏡下 顯示的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞10天之后吞噬 Dil-Ac-LDL 的情況。其中A 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入DMS0，誘導(dǎo)十天。B 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為5 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。C 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為10 y M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。D 胚胎干細(xì)胞在不含有白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下，加入濃度為20 ii M的2， 3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)十天。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡明，其中本發(fā)明中沒作詳細(xì)敘述的、或與本 領(lǐng)域方法相似的技術(shù)方案，本專業(yè)技術(shù)人員也可根據(jù)具體情況或相關(guān)常識(shí)進(jìn)行調(diào)整實(shí)施。實(shí)施例1 2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪的制備在回流溫度下，向2，4-二硝基苯氧甲基環(huán)氧乙烷(0. 480g,2mmol)和醋酸(lmL，17. 5mmol)的 Et0H/H20(v/v = 6 1，100mL)溶液中加入鐵粉(0. 670g，12mmol)。反應(yīng)混 合物繼續(xù)回流120分鐘。冷卻至室溫，以飽和Na2C03溶液調(diào)pH = 8，以C鹽抽濾，濃縮掉濾 液中的乙醇和水，所得固體以乙醇洗(10mLX4)。乙醇相以無水MgS04干燥，過濾，得粗品； 將上述粗品以硅膠柱層析(乙醇作展開劑)分離，得2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]-苯并噁嗪(0. 149g,42% )。實(shí)施例2 2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪對(duì)胚胎干細(xì)胞形態(tài)影 響的檢測(cè)將胚胎干細(xì)胞以2X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻種于24孔板中，用含有白血病抑 制因子、L型谷氨酰胺、青鏈霉素、0巰基乙醇、非必須氨基酸、核苷酸和15%胎牛血清的 DMEM(高糖)培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后，棄廢液，用1XPBS清洗。設(shè)置正常組在去除白 血病抑制因子的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入 DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M、1 ii M、5 ii M、 10 ii M、20 ii M、30 ii M和40 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基_6_氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。培 養(yǎng)條件37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)換液，連續(xù)培養(yǎng)10天后在倒置相差顯微鏡下觀察。結(jié)果表明與正常組和溶劑對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中，1 20 ii M處理組與對(duì)照組細(xì) 胞形態(tài)相比有變化，在10 y M 2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能夠明顯的 促使胚胎干細(xì)胞呈現(xiàn)血管內(nèi)皮的形態(tài)(見附圖1)。實(shí)施例3血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(Flk-1)的檢測(cè)將胚胎干細(xì)胞均勻種于48孔板中，用含有白血病抑制因子、L型谷氨酰胺、青鏈霉 素、0巰基乙醇、非必須氨基酸、核苷酸和15%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)24小時(shí)。待 細(xì)胞貼壁后，棄廢液，用1XPBS清洗。設(shè)置正常組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下培 養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在去除白血病抑制因子培養(yǎng)條件下加入DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在去白血病 抑制因子的培養(yǎng)條件下分別加入濃度為0.5iiM、liiM、5iiM、10iiM、20iiM、30iiM* 40 u M 的2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪培養(yǎng)。37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每天更 換培養(yǎng)液，10天后，棄廢液，0. 1XPBS清洗三遍后，用4%的多聚甲醛固定15分鐘，清洗后， 山羊血清封閉20分鐘，加入Flk-1的一抗4°C孵育過夜，0. 1XPBS清洗三遍后，加入二抗， 37°C孵育40分鐘，清洗后，在激光掃描共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物——Flk-1的表 達(dá)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中濃度為lyM 20 iiM的2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]-苯并噁嗪Flk-1表達(dá)增加，10 uM 2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]-苯并噁嗪處 理的細(xì)胞比正常組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的其他處理組有較強(qiáng)的Flk-1表達(dá)，說明10 y M的 2，3_ 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪能夠明顯誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞 分化(見附圖2)。實(shí)施例4血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(⑶31)的檢測(cè)將胚胎干細(xì)胞以2X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻種于6孔板中，用含有白血病抑 制因子、L型谷氨酰胺、青鏈霉素、0巰基乙醇、非必須氨基酸、核苷酸和15%胎牛血清的 DMEM(高糖)培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后，棄廢液，用1XPBS清洗。設(shè)置正常組在去除白 血病抑制因子的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入 DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M、1 ii M、5 ii M、10 ii M、20 ii M、30 ii M和40 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基_6_氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。培 養(yǎng)條件37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)換液，連續(xù)培養(yǎng)10天。用細(xì)胞裂解液，提取各組細(xì) 胞的總蛋白。將蛋白樣品100°C變性5min，然后跑膠，完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含 5%脫脂奶粉的PBS/t溶液在室溫下封閉lh。用含3%牛血清白蛋白的PBS/t溶液稀釋一 抗(1 500)，與含目標(biāo)蛋白的PVDF膜在4°C孵育過夜。用PBS/t浸泡膜2次，每次5min。 用PBS浸泡膜1次，5min,用PBS稀釋二抗(1 5000)，室溫孵育lh，用PBS浸泡膜3次，每 次5min。將ECL顯色液均勻涂抹在含有目標(biāo)蛋白的PVDF膜上，反應(yīng)5分鐘，去除多余顯色 液，在暗盒內(nèi)與膠片一同放置5分鐘，并完成膠片顯色。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中濃度為1111 2011|1的2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1， 4]-苯并噁嗪有⑶31的表達(dá)增多，10 uM 2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基_[1，4]_苯并噁 嗪處理的細(xì)胞比溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的其他處理組有較強(qiáng)的⑶31表達(dá)，說明10yM的2， 3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪能夠明顯誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分 化(見附圖3)。實(shí)施例5體外血管形成檢測(cè)將胚胎干細(xì)胞以2X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻種于24孔板中，用含有白血病抑 制因子、L型谷氨酰胺、青鏈霉素、0巰基乙醇、非必須氨基酸、核苷酸和15%胎牛血清的 DMEM(高糖)培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后，棄廢液，用1XPBS清洗。設(shè)置正常組在去除白 血病抑制因子的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入 DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M、1 ii M、5 ii M、 10 ii M、20 ii M、30 ii M和40 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基_6_氨基-[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。培 養(yǎng)條件37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)換液，連續(xù)培養(yǎng)10天后，準(zhǔn)備鋪好Matrigel的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C，C02培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。將各組細(xì)胞按照4 5X 104個(gè)細(xì) 胞/孔的密度懸浮于不含有任何因子的DMEM(高糖)培養(yǎng)液中接種于事先鋪好Matrigel的 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí) 96小時(shí)。分別在 6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)，在倒置相差顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上 的血管形成情況。結(jié)果表明在體外成血管的檢測(cè)中，濃度為1 20iiM的2，3_ 二氫-3-羥甲 基-6-氨基_[1，4]_苯并噁嗪的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在Matrigel上形成不同程度的管腔狀的血管 樣結(jié)構(gòu)，其中濃度為10 y M的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪誘導(dǎo)的胚胎 干細(xì)胞能夠明顯在Matrigel上的形成血管(見附圖4)。實(shí)施例6吞噬Dil-Ac-LDL的功能檢測(cè)將胚胎干細(xì)胞以2X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻種于24孔板中，用含有白血病抑 制因子、L型谷氨酰胺、青鏈霉素、0巰基乙醇、非必須氨基酸、核苷酸和15%胎牛血清的 DMEM(高糖)培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后，棄廢液，用1XPBS清洗。設(shè)置正常組在去除白 血病抑制因子的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入 DMS0培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組在去除白血病抑制因子的培養(yǎng)條件下加入濃度為0. 5 ii M、1 ii M、5 ii M、 10 ii M、20 ii M、30 ii M和40 ii M的2，3- 二氫-3-羥甲基_6_氨基_[1，4]-苯并噁嗪培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件37°C，C02孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)換液，連續(xù)培養(yǎng)10天后，用新鮮分化培養(yǎng)基將 Dil-Ac-LDL稀釋到10 u 1/ml加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C，C02孵箱內(nèi)孵育6個(gè)小時(shí)，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)吞噬Dil-Ac-LDL的情況。 結(jié)果表明在吞噬Dil-Ac-LDL的功能檢測(cè)中，濃度為1 P M 20 y M的2，3_ 二 氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪處理的胚胎干細(xì)胞能夠吞噬Dil-Ac-LDL，濃度為 1(^11的2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]_苯并噁嗪誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞具有明顯吞噬 Dil-Ac-LDL的功能(見附圖5)。
權(quán)利要求
2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，其特征是有效誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞 分化的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪濃度為1 20 y M。
3.如權(quán)利要求2中所述的應(yīng)用，其特征是有效誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞 分化的2，3- 二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪濃度為10 u M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化藥物中的應(yīng)用；其中有效誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪濃度為1～20μM。本發(fā)明提供的2，3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪為研制開發(fā)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的藥物奠定了基礎(chǔ)，并可作為一種有效的胚胎干細(xì)胞研究工具，用于胚胎干細(xì)胞的分化和血管新生的分子機(jī)制的研究。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101836993SQ201010177138
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者張尚立, 蘇樂, 苗俊英, 趙寶祥, 趙靜, 韓雷 申請(qǐng)人:山東大學(xué)