專利名稱：磷脂爬行酶1在制備抗乙型肝炎病毒感染藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物化學物質在制藥工程中的新用途，更具體地說就是磷脂爬行酶l (phospholipid scramblase l，PLSCRl)在制備治療和預防乙型肝炎病毒(HBV)感染相關性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
乙型肝炎病毒(HBV)感染嚴重威脅人類的健康，是導致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。全世界有3. 5億乙型肝炎病毒攜帶者，中國約有1. 2億HBV攜帶者，其中2000多萬人為慢性乙肝患者。每年我國在慢性病毒性肝炎方面的直接治療費用超過500億人民幣。HBV感染不僅給患者及其家庭造成巨大的經(jīng)濟和精神負擔，而且給國家造成了巨大的勞動力和經(jīng)濟損失，乃至導致嚴重的就業(yè)等社會問題。然而目前仍然缺乏特別有效的治療藥物，疫苗雖然可起到一定的預防作用，但對已感染者及免疫耐受者無效。臨床應用的抗HBV藥物主要有干擾素以及一些核苷類似物。干擾素的痊愈率有限，停用后通常會出現(xiàn)復發(fā)現(xiàn)象。核苷類似物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等是HBV DNA聚合酶的強抑制劑，能有效阻斷病毒復制，但長期用藥會導致病毒變異，產生耐藥性，而且部分病人停藥后會復發(fā)。因此，新型抗HBV藥物的研制具有重大的社會和經(jīng)濟效益。 磷脂爬行酶l (phospholipid scramblase l，PLSCRl)屬于0&2+結合的棕櫚酰化11型膜蛋白，非棕櫚酰化的PLSCRl蛋白可定位于細胞核內，并與基因組DNA序列結合。最初的研究顯示，PLSCRl參與細胞膜磷脂跨膜活動。隨后的研究發(fā)現(xiàn)多種細胞因子如干擾素、表皮生長因子等能夠調節(jié)PLSCRl的表達，而且發(fā)現(xiàn)，PLSCRl蛋白可與多種蛋白如c-Abl、EGFR、 c-Src、 PKC S和onzin等相互作用，提示PLSCRl在細胞信號傳遞中的作用。有關磷脂爬行酶1抗乙型肝炎病毒的作用尚未見文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種磷脂爬行酶1用于治療HBV感染相關疾病中的新用途。具體說，本發(fā)明涉及磷脂爬行酶1在制備治療或預防HBV感染引起的相關疾病的藥物中的應用。 人磷脂爬行酶1是天然存在于細胞內的一種蛋白，分子量約為37000道爾頓，它是有318個氨基酸殘基組成的一條單肽鏈。 一級結構參考NCBI公布的蛋白序列，序列號為NP_066928. 1。 本發(fā)明提供一種磷脂爬行酶1的醫(yī)藥新用途以磷脂爬行酶1為活性成分，配以制
藥可接受的載體，制成多種制劑，用以治療和預防HBV感染及其相關疾病。 所說的制藥可接受的載體包括藥用稀釋劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、吸收促進劑、促滲透
齊U、蛋白酶抑制齊U、阻聚劑等，如甘氨酸、PH7.0磷酸鹽緩沖液、右旋糖酐、乳糖、氯化鈉、檸
檬酸、明膠、注射用水、生理鹽水、脂質體、膽鹽、脂肪酸、皂角苷、辛酸鈉、月桂酸鈉、聚丙烯
酸、梭鏈孢酸衍生物(如?；撬岫渌箧滄咚猁}、環(huán)糊精等)、甘油、A-zone、表面活性劑、脂肪酸、膽鹽、水楊酸鈉、Zonula occludens toxin(Z0T)、甘膽酸鈉、camostatmesilate、bacitracin、 aprotinin、大豆胰酶抑制劑、非離子表面活性劑、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等，可同時使用其中的一種或多種。 本發(fā)明藥物可制作適合于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔給藥、肺部給藥、口服給藥以及透皮給藥用劑型，包括溶液型注射劑、凍干粉針、微球、粉末、粉霧劑、氣霧劑、腸溶衣、毫微球、微乳、復乳等劑型。 根據(jù)本發(fā)明，細胞內高表達PLSCR1或者在細胞培養(yǎng)液中加入體外重組表達獲得的PLSCR1蛋白或其突變體蛋白均可特異性抑制乙肝病毒的復制和表達，PLSCR1可能成為治療及預防HBV感染相關疾病的新型生物工程藥物。 根據(jù)本發(fā)明，將含有PLSCR1表達序列標簽(CDS)序列的載體轉染入HBV1. 3瞬時轉染H印G2細胞模型以及H印G2. 2. 15細胞模型，能夠特異性抑制乙肝病毒的復制和表達，因此含有PLSCR1 CDS序列的載體可能成為制備治療及預防HBV感染相關疾病的生物工程藥物。 根據(jù)本發(fā)明，為增強PLSCR1的抗HBV活性，降低PLSCR1的毒性，本發(fā)明包含了突變其中部分氨基酸或者增加其它氨基酸序列的PLSCR1蛋白的各種變異體。
根據(jù)本發(fā)明，氨基酸的長度與其細胞通透性，與作用特異性以及活性等因素相關，PLSCR1氨基酸的長度根據(jù)實驗確定，羧基端分別缺失28個氨基酸、162個氨基酸，仍然具有顯著的抑制HBV復制的作用，因此本發(fā)明包含了與PLSCR1具有相同序列的任何長度氨基酸。優(yōu)選的長度為全長318個氨基酸。 根據(jù)本發(fā)明，為增強蛋白的生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了 PLSCR1的各種化學修飾如PEG、跨膜肽、右旋糖酐、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多聚唾液酸等修飾。 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的蛋白及其修飾物可按本領域已知方法配成制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的蛋白及其修飾物治療組成可應用單獨的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其他藥物等形式。聯(lián)合的其它藥物包括干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等用于治療HBV感染相關疾病的藥物。 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學、藥代動力學、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質、程度及治療時限等，以適宜的劑量給藥。 本發(fā)明的實施對嚴重危害人類健康的乙型肝炎及其相關疾病的治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。


為了更好的理解本發(fā)明的實質，下面將結合圖表、附圖來說明其在制藥領域的新用途。 圖lpCMV-HA-PLSCRl真核表達載體轉染H印G2細胞后表達的PLSCR1 western檢測結果 圖2細胞內表達PLSCR1對HBV1. 3瞬時轉染H印G2細胞中HBV復制的影響 圖3細胞內表達PLSCR1對H印G2. 2. 15細胞中HBV復制的影響
圖4帶GST標簽的PLSCR1-GST蛋白原核誘導表達結果 圖5帶GST標簽的PLSCR1-GST蛋白純化結果 圖6PLSCR1-GST對H印G2細胞增殖的影響 圖7PLSCR1-GST對H印G2. 2. 15細胞增殖的影響 圖8PLSCR1-GST對HBV1. 3轉染H印G2細胞中HBV復制的影響 圖9PLSCR1-GST對H印G2. 2. 15細胞中HBV復制的影響 圖10PLSCR1-His蛋白純化結果 圖11PLSCR1-His對H印G2. 2. 15細胞中HBV復制的影響
圖12PLSCR1蛋白純化結果 圖13PLSCR1蛋白對H印G2. 2. 15細胞中HBV復制的影響 圖14PLSCR1各功能域片段表達載體與HBV1. 3共轉染對HBV復制的影響 具體實施方法 實施例一細胞內表達PLSCR1對HBV復制的抑制作用
材料與方法
1.細胞培養(yǎng) 所用細胞為肝癌細胞系H印G2細胞株以及轉染有HBV DNA的H印G2. 2. 15細胞株。H印G2. 2. 15細胞來源于H印G2細胞，含有整合的HBV DNA，在細胞培養(yǎng)過程中可持續(xù)穩(wěn)定地向培養(yǎng)液中分泌Dane氏顆粒以及HBsAg， HBV DNA等。H印G2細胞用含有10%胎牛血清(FBS， Gibco)的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，H印G2. 2. 15細胞用含有10%胎牛血清，380 y g/mlG418 (Promega)的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。
2.質粒 pCMV-HA-PLSCRl質粒由本實驗室構建，根據(jù)NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105. 2)設計引物，擴增PLSCR1 CDS區(qū)，通過克隆的方法將其插入pCMV-HA質粒中，經(jīng)陽性克隆篩選，測序，BLAST比對結果顯示構建的pCMV-HA-PLSCRl完全正確。HBV復制型質粒HBV1. 3含1. 3拷貝HBV DNA并有完整轉錄單元，其能在轉染細胞內完成病毒的復制，細胞培養(yǎng)液上清中可檢測到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，細胞內可檢
測到病毒復制中間體。
3.細胞轉染 H印G2細胞在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)液中，于37 °C 、 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2細胞接種24孔板，8乂104細胞/孔，371:，5% C02孵育24小時，待長至80% _90%細胞匯合后，采用FugeneHD(Roche)轉染試劑并參照說明書操作轉染，同時設HBV1.3與空質粒(pCMV-HA)共轉染作為對照。轉染后48h，收集細胞培養(yǎng)液，_201:保存?zhèn)溆谩?為檢測pCMV-HA-PLSCRl轉染后在細胞內能否表達帶HA標簽的PLSCR1蛋白，將H印G2細胞接種6孔板，6X 105細胞/孔，37°。，5% C02孵育24小時，待長至80% -90%細胞匯合后，采用Fugene HD(Roche)轉染試劑并參照說明書操作轉染，轉染后48h，提取細胞總蛋白，-2(TC保存?zhèn)溆谩?H印2. 2. 15細胞在含10%胎牛血清(Gibco)及380 ii g/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印2. 2. 15細胞接種24孔板，2X 105細胞/孔，37°C ， 5% C02孵育48-72小時，待長至80-90%細胞匯合后，采用FugeneHD (Roche)轉染試劑并參照說明書操作轉染，同時設空質粒(pCMV-HA)對照。轉染后48h，收集細胞培養(yǎng)液，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 4. Western檢領lj 對轉染有pCMV-HA-PLSCRl的總蛋白進行10 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后采用半干轉印法將蛋白轉至硝酸纖維素膜(PR0TRAN①BA-S 83 Reinforced NC，Schleicher&Schuell)上。4。C封閉過夜，封閉液組成10%脫脂奶粉，1 XTBST。然后與鼠抗HA抗體(Santa cruz)結合lh， TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根過氧化酶標記的抗鼠二抗(中杉)結合lh， TBST洗膜3次，每次10min， ECL (Pharmacia)顯色系統(tǒng)顯色，X光片曝光。 5. HBsAg、 HBeAg檢測 取收集好的細胞培養(yǎng)液，按照HBsAg， HBeAg ELISA檢測試劑盒(科華公司)說明書操作步驟檢測。取50 ill細胞培養(yǎng)液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50 1表面抗原或e抗原對應的酶標結合物，37t:孵育lh后，用洗液洗板5次，加入顯色液A50 ill ，再加入顯色液B50 ill ， 37t:孵育15min，加入終止液50 ill ，在多標記檢酶聯(lián)免疫檢測儀(VICTOR Wallac 1420 Multilabel Counter, Wallac)上測定450nm處Is吸光值A。根據(jù)IR二 (A450對gfA450纟摘)/A450對gg計算抑制率。
6. HBV DNA檢測 取細胞培養(yǎng)液，10(TC煮沸15min，12000r/min離心10min，取上清作為熒光定量PCR的模板，實驗過程按本實驗室建立的復合探針PCR定量檢測HBV的方法操作(何云燕，王升啟等，中華肝臟病雜志，2001， V9N6 :376-377)。定量檢測HBV DNA的引物序列為:P1 :5， -GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3' ;P2 :5' -TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3';熒光探針序列F :5' -ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3';淬滅探針序列Q :5' -GTAGTT TCCGGA AGT-3' 。 20 ii 1反應體系含200nmol/L引物，670nmol/L熒光探針F， 180nmol/L淬滅探針，200iimol/LdNTP，4. Ommol/L的Mg2+， 2 模板，混勻后將各反應管與標準曲線反應管一起放入iCycle自動PCR儀中進行擴增，擴增條件為94。C 30s，55。C 30s，72。C 30s，共40個循環(huán)，反應結束后由電腦自動計算出定量結果。
結果 1. pCMV-HA-PLSCRl質粒轉染后PLSCR1表達檢測 為檢測pCMV-HA-PLSCRl質粒轉染細胞是否能夠表達PLSCR1，將pCMV-HA-PLSCRl質粒轉染H印G2細胞，提取細胞總蛋白，Western檢測PLSCR1蛋白表達，結果如圖1所示。由圖中可見在相應的蛋白位置能夠檢測到PLSCR1-HA的蛋白表達，表明pCMV-HA-PLSCRl質粒轉染細胞后能夠在細胞內表達PLSCRl。 2.在HBV1. 3瞬時轉染細胞模型表達PLSCRl蛋白可抑制HBV的復制
為檢測PLSCRl蛋白在HBV1. 3瞬時轉染細胞模型是否具有抑制HBV復制的作用，將pCMV-HA-PLSCRl與HBV1. 3質粒以不同比例共轉染H印G2細胞，同時設空質粒與HBV1. 3共轉染細胞對照。48h后收集細胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測各組細胞中分泌的HBV DNA拷
貞，，g'E^&《IR = (C空質粒與HBVL3共轉染細胞對照組—Cpc群—HA—pLsdd與H肌L3共轉染組)/C空質粒與H肌L 3共轉染細胞
對昭組計算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表檢測出的細胞培養(yǎng)液中HBV DNA拷貝數(shù)。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達情況，根據(jù)公式
IR = (A空質粒與昍vL 3共轉染細胞對照組—Apc群—m—pLSCR1與朋vl 3共轉染組)/A空質粒與h肌l 3共轉染細胞對照組i+胃^Pf^J帛，
公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖2所示。由圖中可見，PLSCR1可顯著抑制HBV1.3瞬時轉染細胞模型中HBV的復制，且這種抑制作用具有劑量依賴性。在pCMV-HA-PLSCRl與HBV1.3質粒以4 : l的比值轉染時，對細胞培養(yǎng)也中HBV DNA、 HBsAg和HBeAg的抑制率分別為51. 54%，79. 80%和81. 02%。 3.在H印G2. 2. 15細胞中表達PLSCR1蛋白可抑制HBV的復制 為檢測瞬時表達PLSCR1對H印G2. 2. 15細胞中HBV復制的影響，將
pCMV-HA-PLSCRl轉染H印G2. 2. 15細胞，48h后收集細胞培養(yǎng)液，ELISA檢測PLSCR1對細胞
培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的影響。結果如圖3所示。由圖中可見，PLSCR1可劑量依賴性地抑
制H印G2. 2. 15細胞中HBV的復制。 結論 細胞內表達PLSCR1可抑制HBV1. 3瞬時轉染H印G2細胞模型及H印G2. 2. 15細胞
模型中HBV的復制。 實施例二加入外源重組GST-PLSCR1蛋白對HBV復制的抑制作用 材料與方法 1. pGEX-4T-l-PLSCRl質粒構建pGEX-4T-l-PLSCRl為本實驗室構建，根據(jù)NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105. 2)設計引物，擴增PLSCRlCDS區(qū)，通過克隆的方法將其插入pGEX-4T-l質粒中，經(jīng)陽性克隆篩選，測序，BLAST比對結果顯示構建的pGEX-4T-l-PLSCRl完全正確。
2. GST-PLSCR1融合蛋白誘導表達 將轉化有表達GST融合蛋白載體pGEX-4T-l-PLSCRl的大腸桿菌DH5 a接種到LB培養(yǎng)基中，37t:震蕩過夜，再按2X的接種量接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，3(rC培養(yǎng)5小時后，加入IPTG至終濃度為0. lmmol/L lmmol/L，繼續(xù)16。C或4。C誘導培養(yǎng)過夜。
3. GST-PLSCR1融合蛋白純化 用GST-S印harose 4B親和層析法純化GST融合蛋白。基本按Pharmacia公司提
供的方法進行。收集上述誘導菌，按IO : 1的比例加入細胞裂解液，超聲破碎，收集上清，
加入適量GST-S印harose 4B，結合3小時。再收集GST-S印harose 4B小顆粒，充分洗脫后
即得到純化的GST融合蛋白。 4.細胞培養(yǎng) 方法同實施例一。 5.細胞轉染和加藥 H印G2細胞在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)液中，于37 。C 、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2細胞接種24孔板，8乂104細胞/孔，371:，5% C02孵育24小時，待長至80% _90%細胞匯合后，采用FugeneHD (Roche)轉染試劑并參照說明書操作轉染HBVl. 3質粒，6小時后加入GST-PLSCR1融合蛋白或GST蛋白，48h后收集細胞培養(yǎng)液，_20°〇保存?zhèn)溆?。H印2. 2. 15細胞在含10%胎牛血清(Gibco)及380 y g/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% (A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印2.2. 15細胞接種24孔板，2 X 105細胞/孔，37°C ， 5% C02孵育48小時，加入不同濃度的GST-PLSCR1融合蛋白、GST融合蛋白或者IFN。加藥后3天換含有等濃度藥物的細胞培養(yǎng)液，第6天收集細胞培養(yǎng)液，_201:保存?zhèn)溆谩?br> 6.細胞毒性檢測 H印G2細胞、H印2. 2. 15細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種96孔板，H印G2細胞鋪板密度為0. 5X1()5細胞/孑L H印2. 2. 15細胞鋪板密度為0. 75X 105細胞/孑L 37°C ， 5% C02孵育24h(H印G2)和48h(H印2. 2. 15)。加入1. 5、3、6、 12、 100 ii g/mL的GST-PLSCR1蛋白，并設細胞對照，每濃度重復三孔。H印G2細胞加入蛋白后48h， H印G2. 2. 15細胞加入蛋白后三天換新鮮培養(yǎng)液并加入新鮮蛋白至第6天，參照MTS(Promega)使用說明書，每孔加入MTS20 ii 1/100 ii 1培養(yǎng)液，37t:避光孵育1. 5小時，在多標記酶聯(lián)免疫檢測儀490nm檢測吸光度。同時，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
7. HBsAg、 HBeAg檢測
方法同實施例一。
8. HBV DNA檢測
方法同實施例一。
結果 1. GST-PLSCR1蛋白表達純化 將轉化有表達GST融合蛋白載體pGEX-4T-l-PLSCRl的大腸桿菌DH5 a經(jīng)擴增后，加入IPTG至終濃度為0. lmmol/L lmmol/L， 16。C或4。C誘導培養(yǎng)過夜。PAGE膠檢測結果如圖4所示，顯示在63KDa處均能誘導表達出相應的蛋白條帶，其中以低轉速，溫度為16t:，IPTG濃度為0. lmM時，融合蛋白表達量較高。 將上清中表達獲得的GST-PLSCR1蛋白經(jīng)GST-S印harose 4B親和層析法純化獲得
GST-PLSCR1融合蛋白。PAGE膠檢測結果如圖5所示。 2. GST-PLSCR1對H印G2、 H印G2. 2. 15細胞增殖的影響GST-PLSCR1融合蛋白以1. 5、3、6、 12、 100 ii g/mL的濃度加入H印G2、H印G2. 2. 15細
胞后，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，加藥組細胞形態(tài)與對照組細胞形態(tài)無顯著變化。細胞增殖實驗結果見圖6、圖7。圖中顯示在0-100 ii g/mL范圍內，各劑量組0D值與正常細胞對照基本相同。 3.在HBV1. 3瞬時轉染細胞模型GST-PLSCR1蛋白可抑制HBV的復制
為檢測PLSCR1蛋白在HBV1. 3瞬時轉染細胞模型是否具有抑制HBV復制的作用，將HBV1. 3質粒轉染H印G2細胞，6h后加入不同濃度的GST-PLSCR1蛋白，以不加蛋白組為空白細胞對照，同時加入12 y g/mL GST蛋白作為對照，48h后收集細胞培養(yǎng)液，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg、 HBeAg的表達情況，結果顯示加入12 y g/mL GST蛋白細胞培養(yǎng)液中HBsAg、HBeAg的分泌量與細胞對照組無顯著差異，而加入不同濃度GST-PLSCR1蛋白的細胞培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg分泌量顯著降低。根據(jù)公式IR = (A對照組—AGST—PLSCKlffl)/A對照組計算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖8所示。由圖中可見，PLSCR1可顯著抑制HBV1.3瞬時轉染細胞模型中HBV的復制，且這種抑制作用具有劑量依賴性。在GST-PLSCR1融合蛋白濃度為1. 5 y g/mL時，對培養(yǎng)液中HBsAg、 HBeAg的抑制率分別為52. 24%、30. 60%，而在GST-PLSCR1融合蛋白濃度為12ii g/mL時，對培養(yǎng)液中HBsAg、 HBeAg的抑制率分別達到72. 57% 、61. 93%。
4.在H印G2. 2. 15細胞中GST-PLSCR1蛋白可抑制HBV的復制
為檢測PLSCR1蛋白在H印G2. 2. 15細胞是否具有抑制HBV復制的作用，H印G2. 2. 15細胞鋪板后48h，加入12 y g/mlGST蛋白以及不同濃度的GST-PLSCR1融合蛋白，以不加任何蛋白細胞為空白細胞對照，以2ii g/ml干擾素(IFN)作為陽性藥對照組，第6天收集細胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測各組細胞中分泌的HBV DNA拷貝數(shù)，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達情況，結果顯示加入12 ii g/mL GST蛋白細胞培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、 HBeAg的分泌量與細胞對照組無顯著差異，而加入不同濃度GST-PLSCR1蛋白或者2 ii g/ml IFN的細胞培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg分泌量顯著降低。根據(jù)公式IR = (A對照組-AWM)/AwM纟fl計算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度或者熒光定量PCR檢測結果中DNA的拷貝數(shù)。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖9所示。由圖中可見，PLSCR1可顯著抑制H印G2. 2. 15細胞中HBV的復制，且這種抑制作用具有顯著的劑量依賴性。在GST-PLSCR1融合蛋白濃度為1. 5 ii g/mL時，對培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分別為79X、28. 69%和20. 76% ，而干擾素在2 y g/mL時對培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分別為46. 58%、39. 67%和14. 84%。在GST-PLSCR1融合蛋白濃度為12 y g/mL時，對培養(yǎng)液中HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg的抑制率分別達到89. 69%、46. 21%、27. 05%。
結論 加入外源重組PLSCR1-GST融合蛋白可抑制HBV1. 3瞬時轉染H印G2細胞模型及H印G2. 2. 15細胞模型中HBV的復制。 實施例三加入外源重組His-PLSCR1融合蛋白對HBV復制的抑制作用 材料與方法 1. Pet28a-PLSCR1質粒構建 Pet28a-PLSCR1為本實驗室構建，根據(jù)NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105. 2)設計引物，擴增PLSCR1 CDS區(qū)，通過克隆的方法將其插入Pet28a質粒中，經(jīng)陽性克隆篩選，測序，BLAST比對結果顯示構建的Pet28a-PLSCR1完全正確。
2. His-PLSCR1融合蛋白誘導表達和純化 將含重組表達質粒的大腸桿菌接種瓊脂板，從新鮮瓊脂平板上挑取單菌落，接種2mlLB培養(yǎng)基，補加適當?shù)目股?終濃度100mg/L)在20ml的培養(yǎng)管中，在定軌搖床上培養(yǎng)過夜，按照l : 100比例稀釋過夜培養(yǎng)細菌，抗生素濃度不變，37t:培養(yǎng)至0D值約為0.8，加入IPIG至終濃度為0. lmol/L， 25"C誘導過夜。8000r/min， 4°C ，離心10min收集菌體，加適量1 XPBS緩沖液重懸菌體，在冰浴條件下超聲裂解，12000r/min離心15min，樣品沉淀用20mM PBPH 7.8懸起后，8M、1X P-ME脲溶解，離心后上HiSTrapTMHP柱，柱子用結合緩沖液(20mMPB 6M脲1 % P -ME PH 7. 8) 3個柱體積平衡柱子，上樣流速調整后，每小時10個柱體積(20ml)，0. 3ml/min用結合緩沖液(20mM PB 6M脲1X P-ME PH 7.8)洗柱，6個柱體積用洗滌緩沖液((20mM PB 6M脲1X P-ME PH 6.0)洗柱，4個柱體積用250mM咪唑洗脫緩沖液(含洗滌緩沖液ra6.0)洗脫。洗脫液用20mM PB透析，最后純化后的融合蛋白用截流分子質量為10000的超濾離心管于4000r/min離心濃縮至lml ，加入ddH20洗滌2次并離心濃縮至500ul。得到最終純化的融合蛋白。
4.細胞培養(yǎng)
方法同實施例一。
5.細胞加藥 H印2. 2. 15細胞在含10%胎牛血清(Gibco)及380 ii g/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印2. 2. 15細胞接種24孔板，2X 105細胞/孔，37。C ， 5% C02孵育48小時，加入不同濃度的His-PLSCR1融合蛋白。加藥后3天換含有等濃度藥物的細胞培養(yǎng)液，第6天收集細胞培養(yǎng)液，-20°〇保存?zhèn)溆谩?6. HBsAg、 HBeAg檢測
方法同實施例一。
7. HBV DNA檢測
方法同實施例一。
結果 1. His-PLSCR1蛋白表達純化 將轉化有表達His標簽融合蛋白載體PET28a-PLSCRl的大腸桿菌BL21經(jīng)擴增后，加入IPTG至終濃度為0. lmmol/L， 25tH秀導培養(yǎng)過夜。經(jīng)HiSTrapTMHP柱純化，透析復性，超濾濃縮，得到純化的融合蛋白，PAGE膠檢測結果如圖10所示。
2.在H印G2. 2. 15細胞中His-PLSCR1蛋白可抑制HBV的復制
為檢測PLSCR1蛋白在H印G2. 2. 15細胞是否具有抑制HBV復制的作用，H印G2. 2. 15細胞鋪板后48h，加入不同濃度的his-PLSCRl融合蛋白，以不加任何蛋白細胞為空白細胞對照，第6天收集細胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測各組細胞中分泌的HBV DNA拷貝數(shù)，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達情況，結果顯示加入不同濃度His-PLSCR1蛋白的細胞培養(yǎng)液中HBV DNA、 HBsAg和HBeAg分泌量顯著降低。根據(jù)公式IR = (A對照組-A加藥組)/A對g魏計算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度或者熒光定量PCR檢測結果中DNA的拷貝數(shù)。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖ll所示。由圖中可見，PLSCR1可顯著抑制H印G2. 2. 15細胞中HBV的復制，且這種抑制作用具有顯著的劑量依賴性。在his-PLSCRl融合蛋白濃度為0. 01 ii g/mL時，就顯示出抑制HBV復制的作用，在his-PLSCRl融合蛋白濃度達到1 y g/mL時，對培養(yǎng)液中HBV DNA、 HBsAg、 HBeAg的抑制率分別達到62. 17% 、71. 94%和54. 73%。
結論加入外源重組His-PLSCR1蛋白可抑制H印G2. 2. 15細胞模型中HBV的復制。 實施例四加入外源重組PLSCR1蛋白對HBV復制的抑制作用 材料與方法 1. Pet40b (+) -PLSCR1質粒構建 Pet40b(+)-PLSCRl為本實驗室構建，根據(jù)NCBI公布的PLSCRl序列(NM_021105. 2)設計引物，在上游引物翻譯起始密碼子前加入腸激酶酶切位點，擴增PLSCR1CDS區(qū)，通過克隆的方法將其插入Pet40b(+)質粒中，經(jīng)陽性克隆篩選，測序，BLAST比對結果顯示構建的Pet40b (+)-PLSCR1完全正確。
2. PLSCR1蛋白表達 將含有重組質粒的大腸桿菌接種瓊脂平板，從新鮮瓊脂平板上挑取單菌落，接種2mlLB培養(yǎng)基，補加適當?shù)目股?終濃度100mg/L)在20ml的培養(yǎng)管中，在定軌搖床上培養(yǎng)過夜，按照l : 100比例稀釋過夜培養(yǎng)細菌，抗生素濃度不變，37t:培養(yǎng)至0D值約為0.8，加入IPIG至終濃度為0. lmol/L，25。C誘導過夜。
3. PLSCR1蛋白純化8000r/min，4t:，離心10min收集菌體，加適量1 XPBS緩沖液重懸菌體，在冰浴條件下超聲裂解，12000r/min離心15min，用QIAexpress Ni-NTA純化試劑盒在非變性狀態(tài)下純化重組人PLSCR1融合蛋白(具體操作步驟參照試劑盒說明書)；純化后的融合蛋白用截流分子質量為30000的超濾離心管于4000r/min離心濃縮至500uL，加入lOmmol/LTris-HCI (pH8. 0)緩沖液洗滌2次并離心濃縮至500 y L。純化的融合蛋白在酶切反應緩沖液(20mmol/LTris-HCI(pH8.0)，50mmol/L NaCI，2mmol/L CaCl2)中加入適量的帶His標簽的腸激酶，于25。C孵育16h，用10mL QIAexpress Ni-NTA純化試劑盒提供的Native LysisBuffer稀釋后，上樣于Ni-NTA柱，立即收集蛋白穿透液，用截流分子質量為10000的超濾離心管于4000r/min離心濃縮至500 y L，加入ddH20洗滌2次并超濾離心濃縮至500 y L，得到最終純化的PLSCR1蛋白。
4.細胞培養(yǎng)
方法同實施例一。
5.細胞加藥H印2. 2. 15細胞在含10%胎牛血清(Gibco)及380 y g/ml的MEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% (A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印2.2. 15細胞接種24孔板，2X 105細胞/孔，37°C ， 5% C02孵育48小時，加入不同濃度的PLSCR1蛋白。加藥后3天換含有等濃度藥物的細胞培養(yǎng)液，第6天收集細胞培養(yǎng)液，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 6. HBsAg、 HBeAg檢測
方法同實施例一。
7. HBV DNA檢測
方法同實施例一。
結果 l.PLSCRl蛋白純化 將轉化有PET40b(+)-PLSCRl的大腸桿菌BL21經(jīng)擴增后，加入IPTG至終濃度為0. lmmol/L，25t:誘導培養(yǎng)過夜。經(jīng)QIAexpress Ni-NTA柱純化，超濾濃縮，腸激酶酶切，QIAe鄧ress Ni-NTA柱純化去除標簽蛋白以及腸激酶，經(jīng)超濾濃縮，得到純化的PLSCR1蛋白，PAGE膠檢測結果如圖12所示。 2.在H印G2. 2. 15細胞中PLSCR1蛋白可抑制HBV的復制 為檢測PLSCR1蛋白在H印G2. 2. 15細胞是否具有抑制HBV復制的作用，H印G2. 2. 15細胞鋪板后48h，加入不同濃度的PLSCR1蛋白，以不加任何蛋白細胞為空白細胞對照，第6天收集細胞培養(yǎng)液，熒光定量PCR檢測各組細胞中分泌的HBV DNA拷貝數(shù)，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達情況，結果顯示加入不同濃度PLSCR1蛋白的細胞培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg分泌量顯著降低。根據(jù)公式IR = (A對照組-A加藥組)/A對照組計算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度或者熒光定量PCR檢測結果中DNA的拷貝數(shù)。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖13所示。由圖中可見，PLSCR1可顯著抑制H印G2. 2. 15細胞中HBV的復制，且這種抑制作用具有顯著的劑量依賴性。在PLSCR1蛋白濃度為0. 03 ii g/mL時，就顯示出抑制HBV復制的作用，在PLSCR1蛋白濃度達到1 g/mL時，對培養(yǎng)液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分別達到93. 17%、83. 82%和77. 77%。
結論 加入外源重組PLSCR1蛋白可抑制H印G2. 2. 15細胞模型中HBV的復制。 實施例五PLSCR1蛋白各功能域片段對HBV的復制的影響 材料與方法 1.細胞培養(yǎng) 方法同實施例一。 2.質粒 能夠表達包含不同長度氨基酸序列的表達質粒由本實驗室構建，根據(jù)NCBI公布的PLSCRl序列(NM_021105. 2)設計引物，分別擴增PLSCR1 CDS區(qū)1-870核酸片段、1-468核酸片段、1-354核酸片段、355-954核酸片段、469-954核酸片段，通過克隆的方法將其插入pCMV-HA質粒中，經(jīng)陽性克隆篩選，測序，BLAST比對結果顯示構建的質粒完全正確，分別命名為pCMV-HA-PLSCRl (1) 、 pCMV-HA-PLSCRl (2) 、 pCMV-HA-PLSCRl (3) 、 pCMV-HA-PLSCRl (4)、pCMV-HA-PLSCRl (5)。這5個質粒轉染細胞后，可在細胞內分別表達PLSCR1的第1-290位氨基酸、第1-156位氨基酸、第1-118位氨基酸、第119-318位氨基酸、第157-318位氨基酸。HBV復制型質粒HBV1. 3含1. 3拷貝HBV DNA并有完整轉錄單元，其能在轉染細胞內完成病毒的復制，細胞培養(yǎng)液上清中可檢測到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，細胞內可檢測到病毒復制中間體。
3.細胞轉染
方法同實施例一。
4. HBsAg、 HBeAg檢測
方法同實施例一。
結果 1.在HBV1.3瞬時轉染細胞模型表達PLSCR1蛋白各功能域片段對HBV的復制的影響 為檢測PLSCR1蛋白各功能域片段在HBV1.3瞬時轉染細胞模型是否具有抑制HBV復制的作用，將pCMV-HA-PLSCRl、 pCMV-HA-PLSCRl (1)、 pCMV-HA-PLSCRl (2)、pCMV-HA-PLSCRl (3) 、 pCMV-HA-PLSCRl (4) 、 pCMV-HA-PLSCRl (5)分別與等量HBV1. 3質粒共轉染H印G2細胞，同時設空質粒與HBV1. 3共轉染細胞對照。48h后收集細胞培養(yǎng)液，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HBsAg的表達情況，根據(jù)公式IR = (A空質粒與鵬.3共轉染細胞對照組-Ap，—HA—PLSCK1一5HBVUftftJfe纟fl)/AgM^Hm.^l^ffliMM纟fl計算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各檢測孔在450nm的吸光度。重復三次實驗，計算抑制率的平均值。結果如圖14所示。由圖中可見，細胞內表達PLSCR1全長(1-318位氨基酸)、表達PLSCR1第1-290位氨基酸以及表達PLSCR1第1-156位氨基酸對HBV的復制均具有顯著的抑制作用，以細胞內表達PLSCR1全長蛋白抑制HBV復制的作用最強。在pCMV-HA-PLSCRl與HBV1. 3質粒共轉染時，對細胞培養(yǎng)液中 HBsAg和HBeAg的抑制率分別為77. 71% ，72. 45% ;pCMV-HA-PLSCRl (1)與HBV1. 3共轉染 時，對細胞培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg的抑制率分別為44. 79% ， 60% ;pCMV-HA-PLSCRl (2)與 HBV1. 3質粒共轉染時，對細胞培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg的抑制率分別為39. 75% ，51. 25%。
結論 細胞內表達PLSCR1不同氨基酸長度的蛋白片段對HBV的復制具有一定的抑制作 用。
權利要求
磷脂爬行酶1在制備治療和預防HBV感染相關疾病的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權利要求1的用途，其中所述磷脂爬行酶1的分子量約為37000道爾頓，由318個氨基酸殘基組成一條單鏈，一級結構為NCBI公布的蛋白序列，序列號為NP_066928. 1。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1為從體內純化獲得的天然蛋白質、體外重組表達的蛋白質或變異體。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1為包含與PLSCR1具有相同序列的任何長度的氨基酸、多肽及其組合物。
5. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1經(jīng)過聚乙二醇、跨膜肽、右旋糖酐、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸或多聚唾液酸修飾。
6. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述藥物含有一種或多種制藥可接受的載體。
7. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其中所述藥物可以制成注射劑、凍干粉針、微球、粉末、粉霧劑、氣霧劑、腸溶衣、毫微球、微乳或復乳。
8. 根據(jù)權利要求3，其中所述變異體為突變了部分氨基酸或者增加其它氨基酸序列的PLSCR1蛋白的各種變異體。
9. 根據(jù)權利要求8，其中所述增加其它氨基酸序列包括增加HIS標簽序列、GST標簽序列、HA標簽序列等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物化學物質在制藥工程中的新用途，更具體地說就是磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1，PLSCR1)在制備治療和預防乙型肝炎病毒(HBV)感染相關疾病的藥物中的應用。本實驗室通過酵母雙雜交技術篩選發(fā)現(xiàn)PLSCR1與HBV表面蛋白的PreS1結構域具有相互結合的特性。進一步研究首次證實該蛋白在培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞以及HBV1.3轉染HepG2細胞模型中均能有效地抑制乙型肝炎病毒的復制和表達。因此，本發(fā)明涉及到PLSCR1蛋白成為治療乙型肝炎病毒相關疾病，減小乙型肝炎相關性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號A61P31/20GK101791395SQ201010151140
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權日2010年4月20日
發(fā)明者丁曉然, 朱向前, 楊靜, 王升啟, 王學軍, 胡偉, 蘇婧 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所