專利名稱：阿嗎堿類衍生物及制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬酶化學(xué)、藥物化學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種阿嗎堿類衍生物及制備方法，
以及該類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
萜類吲哚生物堿是天然產(chǎn)物中的一大類，它具有非常廣泛的藥理活性，如具有 抗癌活性的長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿和喜樹(shù)堿等，研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的萜類吲哚生物堿都是從 異胡豆苷經(jīng)不同的次生代謝轉(zhuǎn)化而來(lái)的，而異胡豆苷合成酶(STR)是異胡豆苷合成中 的關(guān)鍵酶。在了解生源途徑的基礎(chǔ)上，研究人員對(duì)其生源合成途徑中的關(guān)鍵酶異胡豆苷 合成酶進(jìn)行了深入的研究，對(duì)其三維結(jié)構(gòu)、催化功能等方面有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)(Joachim Stockigt， Santosh Panjikar， Structural biology in plant natural product biosynthesis—architecture of enzymesfrom mono_terpenoid indole and tropane alkaloid biosynthesis. Natural ProductR印orts， 2007， 24， 1382-1400)。然而基于該 酶催化活性功能基礎(chǔ)上的新活性生物堿化合物的合成卻鮮有報(bào)道。由于萜類吲哚生物 堿具有良好的藥理活性，發(fā)明人在上述研究基礎(chǔ)上已經(jīng)有對(duì)異胡豆苷合成酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行 一定的改造經(jīng)驗(yàn)，從而使其能催化合成一系列的取代異胡豆苷(Elke A丄oris， Santosh Panjikar， Martin Ruppert， Leif Barleben， Matthias Unger， Helmut Schubel， Joachim Stockigt, Structure—Based Engineering of Strictosidine Synthase -Auxiliary for AlkaloidLibraries. Chemistry & Biology, 14， 1-6.)。因此，本發(fā)明著重從通過(guò)獲得的取 代異胡豆苷衍生物通過(guò)一定的化學(xué)方法將其轉(zhuǎn)化為新的阿嗎堿類衍生物，豐富了生物堿的 多樣性，同時(shí)體外的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)表明，該發(fā)明為發(fā)現(xiàn)抗腫瘤生物堿藥物提供了一種機(jī)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽，具有以下結(jié)構(gòu)通式 R。、 9i<formula>formula see original document page 3</formula>式(i) 其中 W，X，Y，Z相同或不同，選用碳、氮； &， R2， R3， &相同或不同，選用氫、硝基、鹵素、羥基、胺基、酰基、含1 和或不飽和烴基或烷氧基或含1 8個(gè)碳的烷胺基或酰基；
8個(gè)碳的飽
當(dāng)W， X， Y， Z都為碳時(shí)，若R2， R3， R4都為氫時(shí)，&不能為甲氧基；若R" R3， R4都為 氫時(shí)，&不能為甲基、氯、氟、甲氧基、胺基、羥基、硝基或甲?；蝗?^，1 2，1 4都為氫時(shí)，1 3不 能為羥基或甲氧基；若&， R2， R3都為氫時(shí)，R4不能為甲基；若R" R4都為氫時(shí)，R2， R3不能同 時(shí)為甲氧基。
優(yōu)選的式(I)化合物是
<formula>formula see original document page 4</formula>
烷_(kāi)16-
烷_(kāi)16-
1-1
1-1 :(3a ，15a ，19a) 甲酸甲酯，
I_2 :(3a ，15a ，19a) 甲酸甲酯，
I_3 :(3a ，15a ，19a)
1-2
1-3
-12-氮雜-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓 -12-甲氧基-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓
-ii-氯-16， 17-雙脫氫-ig-甲基-氧代育亨賓烷-ie-甲
酸甲酯。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由取代異胡豆苷類化合物制備式a)化合物的
方法將取代異胡豆苷在酶(P-糖苷酶)的作用下脫去一分子葡萄糖，然后經(jīng)過(guò)量的硼氫
化鈉還原制備得到式(I)化合物，反應(yīng)式為
<formula>formula see original document page 4</formula> 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供阿嗎堿類衍生物及其可要用的鹽在制備防治肺癌和 慢性髓原細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明式(I)化合物具有重要的生物活性，體外對(duì)人肺癌細(xì)胞(A549)，人慢性髓
原細(xì)胞白血病細(xì)胞(K562)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)表明此類新阿嗎堿類衍生物對(duì)腫瘤
細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，可在制備防治肺癌和慢性髓原細(xì)胞白血病藥物中應(yīng)用。 本發(fā)明的有益之處是著重對(duì)阿嗎堿類衍生物進(jìn)行探索，提供了基于異胡豆苷合
成酶催化的快速一步法合成具有多個(gè)手性中心多環(huán)結(jié)構(gòu)的吲哚類生物堿的方法；提供的新
阿嗎堿類衍生物具有重要的生物活性，體外對(duì)多株腫瘤細(xì)胞有抑制作用，可制備成新的防治肺癌和慢性髓原細(xì)胞白血病的藥物。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例給出了代表性化合物的合
成及相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，下述實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 實(shí)施例1 :(3 a ,15 a ， 19 a )-12-氮雜-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓
烷-16-甲酸甲酉旨(化合物1-1)的制備 本例涉及到一類如式(I)所示的具有細(xì)胞毒活性的新阿嗎堿類衍生物的一般合 成方法。具體涉及(3 a ，15 a ，19 a )-12-氮雜-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓 烷-16-甲酸甲酯的合成。將12-氮雜異胡豆苷(20毫克，0. 0376毫摩爾)溶于醋酸緩沖液 (pH 5.0，2.0毫升)，再將P-糖苷酶(IO毫克)加入反應(yīng)液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于37t:攪拌 24小時(shí)，而后反應(yīng)液冷凍干燥，凍干產(chǎn)物加入適量甲醇溶解后離心，取上清液加入到反應(yīng)瓶 中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入冰醋酸(32.0毫升)和過(guò)量的硼氫化鈉(21.0毫克)，室溫反應(yīng)過(guò)夜， 減壓蒸餾除去溶劑并用水(5.0毫升)溶解，然后用乙酸乙酯萃取三次(3X10.0毫升)，合 并后的有機(jī)相分別用水和飽和食鹽水洗滌后濃縮除去溶劑，所得粗品用制備液相分離得到 (3a ，15a ，19a)-12-氮雜-16，17-雙脫氫-19-甲基_氧代育亨賓烷-16-甲酸甲酯(化 合物1-1)。 下面用統(tǒng)一方式表述合成得到的化合物的物理及化學(xué)數(shù)據(jù)。包括比移值(Rf)及 其展開(kāi)溶劑、核磁共振氫譜CH NMR，數(shù)據(jù)于500MHz核磁共振儀得到)、核磁共振碳譜(13C NMR，數(shù)據(jù)于125MHz核磁共振儀得到)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS) ,H NMR和"C NMR所使用的試 劑一般為氖代氯仿(CDC13) ;NMR譜圖峰形表示為單峰(s)、雙峰(d)、寬單峰(brs)、雙雙 峰(dd)、三重峰(t)、四重峰(q);耦合常數(shù)(J)的單位用赫茲(Hz)表示；化學(xué)位移值(S) 單位用卯m表示。 化合物1-1 :淡黃色固體；收率49. 7% ;Rf (氯仿/甲醇18 : 1)0. 36 ;ESI-MS m/ z[M+H]+354 一H NMR(500MHz， CDC13) :S9.92(1H， s， NH)，8.28(1H， d， J = 5. OHz， H-9)， 7. 60(1H， d， J = 8. OHz， H—11) ，7. 56(1H， s， H—17) ，7. 04(1H， dd， J = 8. 0，5. OHz， H—10)， 4. 52(1H， m， H-19) ，3. 76 (3H， s， C00CH3_16) ， 3. 43(1H， dd， J = 11. 5， 2. OHz， H—3) ， 3. 12(1H， dd，J = 12. 5， 1. 5Hz，H-21b) ，2. 98 (1H， m， H-5a) ， 2. 92 (1H， m， H-6b) ， 2. 83(1H，dt，J = 12.0， 4. 5Hz， H-6a) ， 2. 76 (1H， dd， J = 12. 5， 3. 5Hz， H—21a) ， 2. 68 (1H， m， H—5b) ， 2. 61 (1H， m， H—15)， 2.58(1H， m， H-20) ， 1. 59(2H， m， H-14) ， 1. 41 (3H， d， J = 6. 5Hz， CH3-19) ;13C-NMR(125MHz，CDC13) :168. 0(C00CH3_16) ， 155. 8(C_17) ， 149. 2(C_13) ， 142. 3 (C_2) ， 135. 5(C_11)， 126. 2 (C_8) ，120. 1 (C_10) ， 115. 7 (C_9) ， 109. 7 (C_16) ， 106. 6 (C_7) ， 72. 5 (C_19)， 59. 9 (C_3) ， 56. 6 (C_21) ， 53. 5 (C_5) ，51.3 (C00CH3_16) ， 38. 6 (C_20) ， 34. 3 (C_14)， 31.5 (C-15) ，21.8 (C-6) ， 18. 7 (CH3_19)。
實(shí)施例2 :化合物1-2和1-3的制備 根據(jù)實(shí)施例1的方法，以相應(yīng)的12-甲氧基異胡豆苷和ll-氯代異胡豆苷為原料， 經(jīng)13 _糖苷酶脫糖和硼氫化鈉還原制備得到化合物1-2和1-3。 化合物1-2 :淡黃色固體；收率51. 3% ;Rf (氯仿/甲醇15 : 1)0. 35 ;ESI-MS m/ z[M+H]+431 一H NMR(500MHz，CDC13) : S 7. 81 (1H， s， NH) ， 7. 56 (1H， s， H—17) ， 7. 46 (1H， d， J = 8. OHz， H-9) ，7. 17(1H， d， J = 7. 5Hz， H-ll) ，7. 08(1H， dd， J = 7. 5，8. OHz， H-10) ，4. 50(1H， m， J = 6. 5Hz，H-19) ，3. 84 (3H， s， CH30_12) ， 3. 75 (3H， s， C00CH3_16) ， 3. 60(1H，dd， J = 11. 5，
1. 5Hz， H-3) ， 3. 11 (1H， dd， J = 12. 5， 1. 5Hz， H_21b) ， 2. 96 (1H， m， H_5a) ， 2. 92 (1H， m， H_6b)，
2. 68-2. 78 (3H， m， H_6a， 21a， 5b) ， 2. 47—2. 59 (2H， m， H_15， 20) ， 1. 53 (2H， m， H—14) ， 1. 41 (3H， d， J = 6. 5Hz， CH3-19)。 化合物1-3 :淡黃色固體；收率54. 8% ;Rf (氯仿/甲醇15 : 1)0. 38 ;ESI-MS m/ z[M+H]+371 一H NMR(500MHz， CDC13) :S8.25(1H， s， NH) ， 7. 73 (1H， s， H-12) ， 7. 56 (1H， s， H-17) ，7. 43(1H，d， J = 7. 5Hz，H-9) ，7. 07(1H，d， J = 7. 5Hz，H-10) ，4. 48(1H，m， J = 6. 5Hz， H-19) ，3. 76(3H，s，C00CH3-16) ，3. 58(1H，dd， J = 11. 5， 1. 5Hz，H-3) ，3. 10(1H，dd， J = 12. 5，
1. 5Hz， H-21b)， 2. 95(1H， m， H_5a)， 2. 90(1H， m， H_6b)， 2. 66-2. 76(3H， m， H_6a， 21a， 5b)，
2. 49-2. 58 (2H， m， H_15， 20) ， 1. 55 (2H， m， H—14) ， 1. 39 (3H， d， J = 6. 5Hz， CH3_19)。 為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)藥理實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。藥理實(shí) 施例給出了代表性化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，下述藥理實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明 而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保 護(hù)的范圍。 實(shí)施例3 :化合物1-1對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒活性 A549(人肺癌)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10 %的胎牛血清， 100U/毫升青霉素和100U/毫升的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5X 103的濃度加入到96孔板中，在 37t:含5% C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。 細(xì)胞存活率的測(cè)定用改良MTT法。細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小時(shí)的孵育后，分別將新配的化 合物i-i的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最終濃度分別為100微 克/毫升，33. 3微克/毫升，11. 1微克/毫升和3. 7微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升 MTT (5毫克/毫升)的磷酸鹽緩沖液，再繼續(xù)在37t:培養(yǎng)4小時(shí)后，離心5分鐘除去未轉(zhuǎn)化 的MTT，每孔中加入200微升二甲亞砜，以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的 formazan用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品相對(duì)于對(duì)照品的比值計(jì)算。
其中化合物1-1對(duì)A549細(xì)胞半抑制濃度IC5。由劑量效應(yīng)曲線得到?；衔?_1 的IC5。為16. 6 ii M。 本試驗(yàn)以抗腫瘤一線用藥喜樹(shù)堿(CPT)作為陽(yáng)性對(duì)照，CPT對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的 半抑制濃度ICs。為0. lliiM。 本試驗(yàn)表明此類新阿嗎堿類衍生物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗肺癌作用的藥物。 實(shí)施例4 :化合物1-2對(duì)人慢性髓原細(xì)胞白血病細(xì)胞(K562)的細(xì)胞毒活性
人慢性髓原細(xì)胞白血病細(xì)胞(K562)用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%小 牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔1 X 104個(gè)密度接種到96孔板 中，在37°C，5% C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。 細(xì)胞存活率的測(cè)定方法用改良MTT法。細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)的孵育后，分別將新配的化 合物1-2的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最終濃度分別為100 微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5 毫克/毫升)的生理鹽水溶液，再繼續(xù)在37°C ， 5% C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，每 孔中加入150毫升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的甲臜用酶 標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品OD值對(duì)于對(duì)照OD值的比值計(jì)算。其中化合 物I-2對(duì)K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5。)由劑量效應(yīng)曲線得到。
細(xì)胞存活率的測(cè)定用改良MTT法，具體方法同實(shí)施例4。 對(duì)人慢性髓原細(xì)胞白血病K562細(xì)胞半抑制濃度IC5。由劑量效應(yīng)曲線得到?；?物1-2的IC5。為58. 3iiM。 本試驗(yàn)以抗腫瘤一線用藥喜樹(shù)堿(CPT)作為陽(yáng)性對(duì)照，CPT對(duì)人慢性髓原細(xì)胞白 血病細(xì)胞的半抑制濃度IC5。為0. 6 ii M。 本實(shí)驗(yàn)表明此類新阿嗎堿類衍生物對(duì)人慢性髓原細(xì)胞白血病癌細(xì)胞K562細(xì)胞具 有細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗慢性髓原細(xì)胞白血病作用的藥物。
權(quán)利要求
一種阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽，具有以下結(jié)構(gòu)通式其中W，X，Y，Z相同或不同，選用碳、氮；R1，R2，R3，R4相同或不同，選用氫、硝基、鹵素、羥基、胺基、?；?、含1～8個(gè)碳的飽和或不飽和烴基或烷氧基或含1～8個(gè)碳的烷胺基或酰基；當(dāng)W，X，Y，Z都為碳時(shí)，若R2，R3，R4都為氫時(shí)，R1不能為甲氧基；若R1，R3，R4都為氫時(shí)，R2不能為甲基、氯、氟、甲氧基、胺基、羥基、硝基或甲?；蝗鬜1，R2，R4都為氫時(shí)，R3不能為羥基或甲氧基；若R1，R2，R3都為氫時(shí)，R4不能為甲基；若R1，R4都為氫時(shí)，R2，R3不能同時(shí)為甲氧基。FSA00000081995600011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽，其特征在于，具體涉及化合物為是1-1 : (3 a ， 15 a ， 19 a ) -12-氮雜-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓烷-16-甲酸 甲酯；1-2 : (3 a ， 15 a ， 19 a ) -12-甲氧基-16， 17-雙脫氫-19-甲基-氧代育亨賓烷-16-甲 酸甲酯；1-3 :(3 a ，15 a ，19 a)-11-氯-16， 17-雙脫氫-19-甲基_氧代育亨賓烷-16-甲酸甲酯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)將異胡豆苷衍生物在P-糖苷酶的作用下脫去一分子葡萄糖，再經(jīng) 過(guò)量的硼氫化鈉還原制得式(I)化合物，反應(yīng)式為
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽在制備防治肺癌和慢性 髓原細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種阿嗎堿類衍生物及其可藥用的鹽，通過(guò)將取代異胡豆苷在β-糖苷酶的作用下脫去一分子葡萄糖，然后經(jīng)過(guò)量的硼氫化鈉還原制備得到。本發(fā)明提供的化合物，體外對(duì)人肺癌細(xì)胞和人慢性髓原細(xì)胞白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)表明，此類阿嗎堿類衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，可在制備防治肺癌和慢性髓原細(xì)胞白血病藥物中應(yīng)用；具有以下結(jié)構(gòu)通式
文檔編號(hào)A61K31/4375GK101792449SQ201010143719
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者俞永平, 祝華建, 約阿施·史托克希特, 鄒宏斌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)