專利名稱：一種制備App菌影的方法及App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說，是一種利用E. COli-App穿梭載體 pMC-Express和雙基因裂解制備App菌影的方法及利用App菌影裝載巴氏桿菌抗原OmpH外 膜蛋白制備亞單位疫苗的方法。
背景技術(shù)：
胸膜肺炎放線桿菌(App)和多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道常見的重要致病菌，引起 的臨床癥狀很難區(qū)分，常呈混合感染。大量流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，由于抗菌藥物的大量 使用，導(dǎo)致胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌細(xì)菌耐藥性普遍存在，特別是高耐藥菌株的出現(xiàn)， 致使多數(shù)藥物對耐藥菌的臨床療效降低或無效。目前常用的豬傳染性胸膜肺炎疫苗有滅活 苗、弱毒苗和亞單位疫苗；豬肺疫疫苗有滅活苗及弱毒苗。各類疫苗均存在優(yōu)缺點(diǎn)滅活苗 成本低、安全、方便，但交叉保護(hù)能力差；弱毒苗交叉保護(hù)及免疫效果好，但有返毒危險；亞 單位疫苗安全，制備方便，卻需與適當(dāng)佐劑配合，才能發(fā)揮最佳效果，且交叉保護(hù)能力不如 弱毒苗，加之滅活過程造成抗原表位的缺失或抗原性減弱，免疫效果不確定且副作用較大 等缺點(diǎn)。因此，開展新型疫苗的研究變得尤為必要和緊迫。目前，利用菌影技術(shù)制備疫苗已在多國進(jìn)行，但尚處于研發(fā)階段，還未有產(chǎn)品推向 市場。菌影技術(shù)被用于多種革蘭氏陰性菌疫苗制備試驗，效果良好，但存在裂解不完全的問 題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過引入金黃色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)Ji 其與裂解蛋白E串聯(lián)表達(dá)，提高裂解效率，制備APP菌影。將多殺性巴氏桿菌保護(hù)性抗原 OmpH外膜蛋白導(dǎo)入APP菌影，以菌影為載體，發(fā)揮靶向作用，從而實現(xiàn)并達(dá)到二聯(lián)疫苗的 免疫效果。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用E. coli-App穿梭載 體pMC-Expres s和雙基因裂解制備App菌影的方法，包括以下步驟1)通過PCR擴(kuò)增噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因 SN編碼序列，通過柔性氨基酸linker串聯(lián)上述雙基因得到E-15aalinker_SN，將E_15aa Iinker-SN與含有λ pL/pR-cI857溫控啟動子的表達(dá)載體pBV220構(gòu)建溫控重組表達(dá)載體 pBV-E-15aa Iinker-SN ；2)利用引物擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒插入到E. coli-App穿梭載體pMC-Express中， 構(gòu)建重組穿梭表達(dá)載體；3)采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入App菌體，通過升溫誘導(dǎo)制備App菌影， 菌影凍干保存。具體包括步驟如下
1)E、SN 禾口 E-15aa linker-SN 基因的擴(kuò)增根據(jù)噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列設(shè) 計引物El :5，-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3，(EcoRI)E2 :5， -GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3， (Sail)SNl :5，-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3，(EcoRI)SN2 :5， -GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3， (Sail)再設(shè)計含15個柔性氨基酸linker的引物，用于將裂解基因E和核酸酶A基因SN 串聯(lián)E2，5，-TGC AGMCCACCACCACCAGMCCACCACCACCAGMCCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3，SNl'5' -GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCMCTTCMCT-3，以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，分別采用E1、E2和E1、E2，為上、下引物， 擴(kuò)增裂解基因E，得到兩組產(chǎn)物，后者在E基因后帶有l(wèi)inker ；以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC25923基因組DNA為模板，分別以SN1、SN2和SNl \ SN2為上、下游引物，擴(kuò)增基因SN, 得到兩組產(chǎn)物，后者于SN基因前帶有l(wèi)inker ；以帶有l(wèi)inker的E和SN基因為模板，以El 和SN2為引物，通過降落PCR法，得到雙基因串聯(lián)產(chǎn)物E-15aa 1 inker-SN ；2)重組表達(dá)質(zhì)粒及雙基因裂解體系的構(gòu)建將獲得的E、SN和E_15aa linker-SN與pMD_18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ε. coli DH5 α，抗性平板篩選陽性菌落后，提質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD-E、pMD-SN和 pMD-E-15aa linker-SN ；雙酶切 pMD_E、pMD-E-15aalinker-SN 和溫控表達(dá)載體 pBV220,經(jīng) 連接、轉(zhuǎn)化、篩選重組子、提質(zhì)粒酶切鑒定后，分別獲得重組表達(dá)載體PBV-E和pBV-E-15aa linker-SN,通過菌體裂解試驗，對溫控裂解體系功能進(jìn)行評價；3)E. coli-App重組穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Genbank中λ pL/pR-cI857溫控啟動子序列及pBV220質(zhì)粒序列設(shè)計溫控裂 解盒上游引物XpL/pR-cI857FP，與SN基因下游引物SN2，結(jié)合，以pBV_E_15aa linker-SN 為模板，對該融合基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下λ pL/pR-cI857 FP :5’ -ATAGGGCCCTCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’ (ApaI)SN2， 5， -CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3， (BamHI)擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化、篩選重組子，提質(zhì)粒酶切鑒定后得到重組克 隆載體攜帶的溫控裂解盒；用ApaI和BamHI分別酶切穿梭載體pMC-Expres s和溫控裂解 盒克隆載體，膠回收試劑盒回收目的片段，以T4DNA連接酶將線性化載體與目的片段進(jìn)行連 接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，提質(zhì)粒酶切鑒定后獲得重組穿梭表達(dá)載體；4) App重組菌的構(gòu)建及菌影的制備采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入App菌體，通過升溫誘導(dǎo)制備App菌影。以 pMC-Express轉(zhuǎn)化App菌為對照，測定溫控雙基因裂解系統(tǒng)對App菌的裂解特性，并鏡檢升 溫前后菌體的形態(tài)變化。用上述制備的App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法，通過PCR擴(kuò)增 巴氏桿菌保護(hù)性抗原OmpH外膜蛋白基因，構(gòu)建克隆載體和以pET-21a(+)為基礎(chǔ)的重組表 達(dá)載體，經(jīng)酶切、測序鑒定后，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，蛋白鑒定純化后，以浸泡法載入權(quán)利要求1得到的App菌影，制成App菌影裝載巴氏桿菌抗原亞單位疫苗。具體包括步驟如下1)巴氏桿菌OmpH基因的擴(kuò)增設(shè)計一對引物，序列如下BSl :5，-CAC GGATCC GCAACAGTTTACAATC-3，(BamHI)BS2 :5， -CTAGCGT AAGCTTAGAAGTTACGCG-3’ (HindIII)以巴氏桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增；2) OmpH基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定回收后，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH5a，抗 性平板篩選陽性菌落后，提質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD-OmpH，雙酶切pMD-OmpH 和pET-21a (+)，回收線性化載體和目的片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選重 組子，提質(zhì)粒酶切鑒定后獲得重組表達(dá)載體pET-OmpH ；3)重組表達(dá)菌的構(gòu)建及OmpH外膜蛋白的表達(dá)以pET-OmpH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli BL21 (DE3)，篩選重組子，提質(zhì)粒鑒定后，菌 體加甘油-80°C保存，挑單菌落搖菌，待0D600值為0. 3-0. 4時，添加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，超 聲破碎細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，并純化目的蛋白；4) App菌影裝載巴氏桿菌抗原OmpH外膜蛋白亞單位疫苗的制備 OmpH外膜蛋白純化后，通過親和素-生物素系統(tǒng)裝入APP菌影載體，制成App菌影 裝載巴氏桿菌抗原亞單位疫苗。本發(fā)明的有益效果是菌影是基因組學(xué)和蛋白組時代最有效的疫苗研究技術(shù)。本 發(fā)明采用可控雙裂解技術(shù)制備重組豬胸膜肺炎放線桿菌App菌影，將巴氏桿菌保護(hù)性抗 原導(dǎo)入App菌影載體，制成豬胸膜肺炎和巴氏桿菌二聯(lián)疫苗。用以預(yù)防豬胸膜肺炎和巴氏 桿菌病。實現(xiàn)菌影載體的制備及其在重要動物傳染病預(yù)防中的應(yīng)用，同時為多聯(lián)疫苗的研 究提供方法。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明1材料和方法1. 1 材料限制性內(nèi)切酶EcoRI，SalI，Apa I和BamHI，PhiX174噬菌體RF I質(zhì)粒、pMC-Expres s和pBV220質(zhì)粒購自美國Fermentas MBI公司。克隆載體pMD18_T和E. coli DH5 α購自 大連TaKaRa公司。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923和App 1型Shope 4074株購自中國 獸藥監(jiān)察所。1. 2 方法1.2. 1引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中噬菌體PhiX174裂解基因E (序列號9626372)和金黃色葡萄球 菌核酸酶A基因SN(序列號21281729)編碼序列設(shè)計兩對引物El :5，-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3，(EcoRI)E2 :5， -GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3， (Sail)
SNl :5，-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3，(EcoRI)SN2 :5， -GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3， (Sail)再設(shè)計含15個柔性氨基酸linker的引物，用于將裂解基因E和核酸酶A基因SN 串聯(lián)。E2，5，-TGC AGMCCACCACCACCAGMCCACCACCACCAGMCCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3，SNl， 5，"G AG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCMCTTCMCT-3，斜體部分為linker，編碼GGGGS柔性氨基酸組，引物均由上海生工生物工程公司 合成。1. 2· 2E基因的PCR擴(kuò)增以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴(kuò)增裂解基因E。反應(yīng)條件為96 °C 5min ； 94°C 45s, 55°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin0 取 PCR 產(chǎn)物 5ul 進(jìn)行 瓊脂糖凝 膠電泳鑒定。1. 2. 3SN 基因的 PCR 擴(kuò)增酚仿抽提法提取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923細(xì)菌基因組DNA。以其DNA為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增SN。反應(yīng)體系同E基因擴(kuò)增體系。PCR產(chǎn)物同樣電泳測定。1.2. 4雙基因串聯(lián)以El和E2，擴(kuò)增E基因，Sm，和SN2擴(kuò)增SN基因。再以此法擴(kuò)增的E基因和SN 基因為模板，以El和SN2為引物，擴(kuò)增帶15個柔性氨基酸linker的雙基因串聯(lián)產(chǎn)物E-15aa Iinker-SN0采用降落PCR法擴(kuò)增，反應(yīng)體系為96°C 5min ；94°C 45s, 65°C 30s，每兩循環(huán)降 10C, 720C lmin，26 個循環(huán)；接著 94°C 45s, 52°C 30s, 72°C lmin，15 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物電泳鑒定。1. 2. 5克隆載體的制備與鑒定PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(上海生工生物工程公司)回收?；厥债a(chǎn)物依據(jù)pMD-18T 載體試劑盒說明，按比例和步驟與PMD-18T載體連接。16°C過夜后，熱激轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài) 細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌用Amp抗性平板篩選陽性菌落，37°C過夜培養(yǎng)后，挑取陽性單菌落搖菌，提質(zhì) 粒，進(jìn)行酶切鑒定，重組質(zhì)粒分別命名為pMD-E，pMD-SN，pMD-E-15aa Iinker-SN0重組菌加 甘油-80°C保存，質(zhì)粒送上海生工生物工程公司對克隆基因進(jìn)行測序。1. 2. 6重組表達(dá)載體的制備與鑒定以限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI分別酶切溫控表達(dá)載體pBV220和重組克隆載體 pMD-E及pMD-E-15aa Iinker-SN,回收相應(yīng)目的片段，以T4DNA連接酶分別將E和E_15aa Iinker-SN基因與載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pBV_E和pBV_E_15aa Iinker-SN0連接產(chǎn) 物16°C過夜后，熱激轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp抗性平板進(jìn)行篩選，28°C過夜培養(yǎng) 后，挑取陽性單菌落搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定。1. 2. 7重組表達(dá)質(zhì)粒功能檢測及雙基因裂解體系優(yōu)越性評價對重組菌pBV-E DH5a 和 pBV-E_15aa linker-SN DH5 α 及對照菌 PBV220DH5 α 28°C過夜增菌后，以0. 5%比例分別接種于400ml Amp抗性LB液體培養(yǎng)基中。 280C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值為0. 3-0. 4時，各取Iml菌液稀釋IO6倍，涂板進(jìn)行菌落 計數(shù)，并對單位菌落數(shù)進(jìn)行換算。而后，每種菌液平分為4份，一份繼續(xù)置于28°C培養(yǎng)，作為 水平對照；一份置于42°C培養(yǎng)，作為空白誘導(dǎo)菌；一份于42°C升溫誘導(dǎo)時加入終濃度為ImM的Mg2+(MgCl2)和IOMm的Ca2+(CaCl2)；另一份在42°C升溫誘導(dǎo)90min后加入上述濃度的二 價陽離子，以此來評價二價陽離子及其加入時間對不同裂解體系的影響。升溫誘導(dǎo)后，每隔 30min對各培養(yǎng)條件下各種菌液OD6tltl值進(jìn)行測定并記錄，直至重組菌菌液OD值不再降低 為止。裂解過程中，每隔Ih收集5ml菌液，離心后取上清，進(jìn)行酚仿抽提，觀察DNA漏出及 裂解情況。裂解結(jié)束后，各培養(yǎng)液取一定體積進(jìn)行IO6倍稀釋，涂板計數(shù)。42°C誘導(dǎo)pBV-E DH5a和pBV-E-15aalinker-SN DH5 α系列菌再取一定體積不進(jìn)行稀釋涂板，計算單位體 積菌落數(shù)。以公式裂解率=(1-誘導(dǎo)后菌落數(shù)/誘導(dǎo)前菌落數(shù))X 100%計算各組裂解率。 菌體染色后顯微鏡觀測，進(jìn)行誘導(dǎo)前、后形態(tài)學(xué)比較。培養(yǎng)液再繼續(xù)在各條件下培養(yǎng)一段時 間，觀察結(jié)果。1. 2. 8Ε. coli-App重組穿梭表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定1. 2. 8. 1溫控裂解盒的克隆及鑒定根據(jù)Genbank中λ pL/pR-cI857溫控啟動子序列及生物公司提供的pBV220質(zhì)粒 序列設(shè)計溫控裂解盒上游引物，與SN基因下游引物結(jié)合，以pBV-E-15aa Iinker-SN為模 板，對該融合基因進(jìn)行擴(kuò)增。λ pL/pR-cI857FP :5，-ATA GGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3，(ApaI)SN2， 5， -CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3， (BamHI)引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)體系同E基因擴(kuò)增體系。PCR產(chǎn)物電泳鑒 定、回收，與PMD-18T載體連接，16°C過夜，熱激轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，Amp平板篩選，28°C 過夜培養(yǎng)，陽性菌落搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。1. 2. 8. 2重組穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定ApaI和BamHI分別酶切pMC-Expres s和溫控裂解盒克隆載體，膠回收試劑盒回收 目的片段，以T4DNA連接酶將線性化載體與目的片段進(jìn)行連接，氯霉素抗性平板28°C培養(yǎng)， 篩選重組子，陽性菌落搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定。1.2.9App 1型重組菌的構(gòu)建及菌影的制備采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入Appl型菌體。通過升溫誘導(dǎo)制備App菌 影。以pMC-Express轉(zhuǎn)化App菌為對照，測定溫控雙基因裂解系統(tǒng)重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒App 菌的裂解特性。裂解率達(dá)到99. 9999%。鑒定為菌影。2動物實驗結(jié)果設(shè)計4組，每組50只SPF小鼠，分別皮下注射生理鹽水，App菌影，菌影裝載亞單位 疫苗，弗氏完全佐劑亞單位疫苗。于注射后7天，14天，21天，28天、90天，120天，180天， 240天分別采血測血清中抗體水平，進(jìn)行疫苗免疫保護(hù)效果評價。并于第7天，14天，21天， 28天、90天，120天，180天，240天每組取出5只攻毒，攻毒臨床表現(xiàn)均正常。所有小鼠于 35天后處死，解剖進(jìn)行病理觀察均正常。動物實驗顯示菌影疫苗對小鼠的保護(hù)率為100%為擴(kuò)大試驗效果，選擇某豬場進(jìn)行疫苗保護(hù)率實驗，分組與實驗方法同上。動物實 驗顯示該疫苗對豬的保護(hù)率分別為99%和99. 2%。利用菌影技術(shù)制備疫苗已在多國進(jìn)行，但尚處于研發(fā)階段，還未有產(chǎn)品推向市場。 菌影技術(shù)被用于多種革蘭氏陰性菌疫苗制備試驗，效果良好，但存在裂解不完全的問題。本 試驗通過弓I入金黃色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)，使其與裂解蛋白E串聯(lián)表達(dá)，提高裂解效 率。APP菌影作為載體，發(fā)揮靶向作用，提高疫苗的免疫效果，App菌影在此不但起到優(yōu)良佐劑的作用，還可發(fā)揮其免疫原的功效，使機(jī)體產(chǎn)生雙重免疫。以APP菌影為裝載載體，導(dǎo)入 多殺性巴氏桿菌OmpH外膜蛋白，制備胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌二聯(lián)疫苗。杜絕 豬傳染性胸膜肺炎和多殺性巴氏桿菌病的感染。因此在技術(shù)上有一定的創(chuàng)新之處。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種利用E.coli App穿梭載體pMC Express和雙基因裂解制備App菌影的方法，其特征在于，包括以下步驟1)通過PCR擴(kuò)增噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列，通過柔性氨基酸linker串聯(lián)上述雙基因得到E 15aalinker SN，將E 15aa linker SN與含有λpL/pR cI857溫控啟動子的表達(dá)載體pBV220構(gòu)建溫控重組表達(dá)載體pBV E 15aa linker SN；2)利用引物擴(kuò)增溫控雙基因裂解盒插入到E.coli App穿梭載體pMC Express中，構(gòu)建重組穿梭表達(dá)載體EAlysis vector；3)采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入App菌體，通過升溫誘導(dǎo)制備App菌影，菌影凍干保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用E.coli-App穿梭載體pMC-Express和雙基因裂解制備 App菌影的方法，其特征在于，包括步驟如下1)E、SN禾口 E-15aa linker-SN 基因的擴(kuò)增根據(jù)噬菌體PhiX174裂解基因E和金黃色葡萄球菌核酸酶A基因SN編碼序列設(shè)計引物El :5’ -CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’ (EcoRI) E2 :5’ -GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3， (Sail) SNl :5，-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3，(EcoRI) SN2 :5’ -GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3， (Sail)再設(shè)計含15個柔性氨基酸linker的引物，用于將裂解基因E和核酸酶A基因SN串聯(lián)E2， 5， -TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3， SNl' :5’ -GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3' 以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，分別采用E1、E2和E1、E2，為上、下引物，擴(kuò)增裂解 基因E，得到兩組產(chǎn)物，后者在E基因后帶有l(wèi)inker ；以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923 基因組DNA為模板，分別以Sm、SN2和SN1，、SN2為上、下游引物，擴(kuò)增基因SN，得到兩組產(chǎn) 物，后者于SN基因前帶有l(wèi)inker ；以帶有l(wèi)inker的E和SN基因為模板，以El和SN2為引 物，通過降落PCR法，得到雙基因串聯(lián)產(chǎn)物E-15aa linker-SN ；2)重組表達(dá)質(zhì)粒及雙基因裂解體系的構(gòu)建將獲得的E、SN和E-15aa linker-SN與pMD_18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ε. coli DH5 α，抗性平板篩選陽性菌落后，提質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD-E、pMD-SN和 pMD-E-15aa linker-SN ；雙酶切 pMD_E、pMD-E-15aalinker-SN 和溫控表達(dá)載體 pBV220,經(jīng) 連接、轉(zhuǎn)化、篩選重組子、提質(zhì)粒酶切鑒定后，分別獲得重組表達(dá)載體PBV-E和pBV-E-15aa linker-SN,通過菌體裂解試驗，對溫控裂解體系功能進(jìn)行評價；3)E.coli-App重組穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Genbank中λ pL/pR-cI857溫控啟動子序列及pBV220質(zhì)粒序列設(shè)計溫控裂解盒 上游引物XpL/pR-cI857FP，與SN基因下游引物SN2，結(jié)合，以pBV-E-15aa linker-SN為模 板，對該融合基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下λ pL/pR-cI857 FP :5，-ATAGGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3，(ApaI)SN2， 5， -CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3， (BamHI)擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化、篩選重組子，提質(zhì)粒酶切鑒定后得到重組克隆載 體攜帶的溫控裂解盒；用ApaI和BamHI分別酶切穿梭載體pMC-Express和溫控裂解盒克隆 載體，膠回收試劑盒回收目的片段，以T4DNA連接酶將線性化載體與目的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，提質(zhì)粒酶切鑒定后獲得重組穿梭表達(dá)載體；4) App重組菌的構(gòu)建及菌影的制備采用電轉(zhuǎn)化法將重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入App菌體，通過升溫誘導(dǎo)制備App菌影，以 pMC-Express轉(zhuǎn)化App菌為對照，測定溫控雙基因裂解系統(tǒng)對App菌的裂解特性，并鏡檢升 溫前后菌體的形態(tài)變化，獲得App菌影。
3.一種用權(quán)利要求1制備的App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法， 其特征在于，通過PCR擴(kuò)增巴氏桿菌保護(hù)性抗原OmpH外膜蛋白基因，構(gòu)建克隆載體和以 pET-21a(+)為基礎(chǔ)的重組表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測序鑒定后，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，蛋白鑒定純化后， 以浸泡法載入權(quán)利要求1得到的App菌影，制成App菌影裝載巴氏桿菌抗原亞單位疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法，其特征 在于，包括步驟如下1)巴氏桿菌OmpH基因的擴(kuò)增設(shè)計一對引物，序列如下BSl :5’ -CAC GGATCC GCAACAGTTTACAATC-3’ (BamHI)BS2 :5’ -CTAGCGT AAGCTT AGAAGTTACGCG-3’ (Hind III)以巴氏桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增；2)OmpH基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定回收后，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH5 α，抗性 平板篩選陽性菌落后，提質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD-OmpH，雙酶切pMD-OmpH和 pET-21a (+)，回收線性化載體和目的片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組 子，提質(zhì)粒酶切鑒定后獲得重組表達(dá)載體pET-OmpH ；3)重組表達(dá)菌的構(gòu)建及OmpH外膜蛋白的表達(dá)以pET-OmpH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli BL21 (DE3)，篩選重組子，提質(zhì)粒鑒定后，菌體加 甘油-80°C保存，挑單菌落搖菌，待0D600值為0. 3-0. 4時，添加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，超聲破 碎細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，并純化目的蛋白；4)App菌影裝載巴氏桿菌抗原OmpH外膜蛋白亞單位疫苗的制備OmpH外膜蛋白純化后，通過親和素-生物素系統(tǒng)裝入APP菌影載體，制成App菌影裝載 巴氏桿菌抗原亞單位疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備App菌影的方法及App菌影裝載巴氏桿菌抗原制備亞單位疫苗的方法，采用可控雙裂解技術(shù)制備重組豬胸膜肺炎放線桿菌APP菌影，將巴氏桿菌保護(hù)基因?qū)階PP菌影載體，制成豬胸膜肺炎和巴氏桿菌二聯(lián)基因疫苗。用以預(yù)防豬巴氏桿菌病和胸膜肺炎。實現(xiàn)菌影載體的制備及其在重要動物傳染病預(yù)防中的應(yīng)用，同時為多聯(lián)基因疫苗的研究提供方法。動物實驗顯示該二聯(lián)疫苗對豬傳染性胸膜肺炎和巴氏桿菌病保護(hù)率達(dá)分別為99％和99.2％。
文檔編號A61K39/116GK101934072SQ20101013090
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者劉田生, 孫穎, 金天明, 高靜 申請人:天津農(nóng)學(xué)院