專利名稱：一種半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝修復(fù)用支架的制備方法，尤其是半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合
物復(fù)合支架的制備方法。
背景技術(shù)：
肝臟是人體的重要器官之一，擔(dān)負(fù)著代謝、解毒和糖類蛋白質(zhì)的釋放等多種功能。 然而，人類卻經(jīng)常受到各種肝臟疾病的困擾。世界各國(guó)罹患病毒性肝炎、脂肪性肝病、酒精 性肝病等多種肝臟疾病患者的數(shù)量在逐年增加。由各種慢性肝病引發(fā)的急性肝衰竭有著極 高的致死率。肝臟移植雖然是目前治療肝衰竭最有效的手段，但是其面臨著肝臟供體短缺、 手術(shù)創(chuàng)口大、花費(fèi)昂貴等問題。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展，肝細(xì)胞移植和體外 生物人工肝支持系統(tǒng)等治療方法為肝病的治療提供了新的途徑，并具有良好的治療效果。 其中，組織工程支架在其中起著十分重要的作用。 肝臟是由多種細(xì)胞組成的具有復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的器官。肝小葉是肝臟的基本結(jié)
構(gòu)單位。每個(gè)肝小葉的中央沿長(zhǎng)軸部貫穿著一條中央靜脈。肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心放射
狀排列生長(zhǎng)構(gòu)成板狀結(jié)構(gòu)，又稱肝板。肝板相互間連接成網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)之間的空隙處稱為
竇狀隙。竇狀隙的竇壁由是由扁平的肝內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。此外，在竇腔內(nèi)還有許多體積較大、
形狀不規(guī)則的星狀細(xì)胞，以細(xì)胞的突起與竇壁相連。相鄰緊密接觸的肝細(xì)胞之間存在著間
隙，這些間隙相連構(gòu)成了一些微管道，稱為膽小管，其管壁即是肝細(xì)胞膜。 作為肝臟修復(fù)基礎(chǔ)的肝細(xì)胞是一種錨著依賴性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)容易迅速失去
其正常表型及分泌代謝等功能。研究表明利用肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體與支持細(xì)
胞黏附生長(zhǎng)的基質(zhì)材料表面存在的半乳糖基配體的特異性識(shí)別作用，可以促使肝細(xì)胞之間
相互聚集形成細(xì)胞聚集體，在聚集體中生長(zhǎng)的肝細(xì)胞能夠較好維持的表型和功能。肝修復(fù)
用支架通常是將含有半乳糖基配體的天然大分子配制成一定濃度的溶液，然后利用冷凍干
燥法制備。這類支架組分單一，存在著機(jī)械性能差、難以加工、降解過快等缺陷，難以滿足生
物人工肝等治療方法的應(yīng)用要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有肝修復(fù)支架的不足，提供一種能有效促進(jìn)肝細(xì)胞的生 長(zhǎng)和功能維持、尺寸形狀可控、機(jī)械性能良好的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架 的制備方法。 半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架的制備方法，其步驟如下
(1)將半乳糖化殼聚糖溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0. 01-0. 05g/mL的半乳糖 化殼聚糖溶液，靜置脫泡；將聚酯類聚合物溶解于二氧六環(huán)或四氫呋喃中，配制成濃度為 0. 02-0. 2g/ml的溶液; (2)將尺寸為280-450 y m的明膠粒子倒入模具中，用注射器將體積分?jǐn)?shù)為85%的 乙醇溶液注入模具中至浸沒粒子；將模具放置于50-7(TC烘箱中2-5分鐘，使明膠粒子粘結(jié)成模板，取出模具，放置數(shù)天至乙醇揮發(fā)完畢，冷凍干燥；取出明膠模板，浸入到聚酯類聚合
物溶液中，反復(fù)使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法將聚酯類聚合物溶液導(dǎo)入模板內(nèi)部，冷
凍干燥，然后置于37t:熱水中浸泡至明膠完全溶解，得到聚酯類聚合物多孔支架； (3)將步驟(2)得到的聚酯類聚合物多孔支架浸入0. 5-2mol/L的氫氧化鈉溶液
中，反復(fù)使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法，將氫氧化鈉溶液導(dǎo)入到聚酯類聚合物多孔支
架內(nèi)部；將盛有支架的容器在37t:水浴中放置5-60min，取出支架，用lmol/L的鹽酸溶液終
止反應(yīng)，用蒸餾水洗滌至中性； (4)將經(jīng)步驟(3)處理的聚酯類聚合物多孔支架浸入碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥
珀酰亞胺按摩爾比l : l混合的溶液中活化4-12小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗，浸入步驟(1)
配制的半乳糖化殼聚糖的水溶液中，在37t:水浴中攪拌下反應(yīng)4-16小時(shí)，取出支架，用蒸
餾水沖洗，冷凍干燥，得到半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架。 上述的聚酯類聚合物可以是聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚乳酸_乙醇酸共聚物。 本發(fā)明的有益效果在于 本發(fā)明制備的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架，其中聚酯類聚合物多孔 支架可以提供良好的力學(xué)強(qiáng)度和肝細(xì)胞生長(zhǎng)的空間；而半乳糖化殼聚糖中含有半乳糖配 體，具有良好的生物相容性和生物活性，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、肝細(xì)胞球形聚集體的形成 和其特異性功能的維持。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)效率高，具有在生物人 工肝和肝組織修復(fù)方面的應(yīng)用價(jià)值。


圖l(a)為制備的聚己內(nèi)酯多孔支架橫截面的掃描電鏡照片； 圖l(b)為制備的聚己內(nèi)酯多孔支架中大孔形貌的掃描電鏡照片； 圖2(a)為在堿液中處理15分鐘后的聚己內(nèi)酯多孔支架橫截面的掃描電鏡照片； 圖2(b)為在堿液中處理15分鐘后的聚己內(nèi)酯多孔支架大孔形貌的掃描電鏡照
片； 圖3為半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架內(nèi)部形貌的掃描電鏡照片； 圖4為半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架的激光共聚焦顯微鏡照片；其中
半乳糖化殼聚糖用異硫氰酸熒光素進(jìn)行標(biāo)記，為較亮區(qū)域； 圖5為半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架的應(yīng)力應(yīng)變曲線圖 圖6為人肝癌細(xì)胞在半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架中的分布及細(xì)胞骨
架形態(tài)的激光共聚焦顯微鏡照片； 圖7(a)為人肝癌細(xì)胞在半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架中的分布及形 態(tài)的掃描電鏡照片； 圖7(b)為人肝癌細(xì)胞在半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合多孔支架中形成的細(xì)胞 球形聚集體的掃描電鏡照片。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來(lái)限制本發(fā)明。
實(shí)例1 :
4
(1)將半乳糖化殼聚糖溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0. Olg/mL的半乳糖化殼聚 糖溶液，靜置脫泡；將聚己內(nèi)酯溶解于二氧六環(huán)中，配制成濃度為0. lg/ml的聚合物溶液；
(2)將用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩篩分的尺寸為280-450iim的明膠粒子倒入模具中，用注射器 將體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液注入模具中至浸沒粒子；將模具放置于7(TC烘箱中5分鐘， 使明膠粒子粘結(jié)成模板，取出模具，放置數(shù)天至乙醇揮發(fā)完畢，冷凍干燥；取出明膠模板， 浸入到聚己內(nèi)酯溶液中，反復(fù)使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法將聚己內(nèi)酯溶液導(dǎo)入模板 內(nèi)部，冷凍干燥，然后置于37t:熱水中浸泡至明膠完全溶解，得到聚己內(nèi)酯多孔支架；如圖 l(a)所示，可以看出支架具有多孔結(jié)構(gòu)，連通性良好；如圖l(b)所示，可以看出支架具有 300iim左右的大孔結(jié)構(gòu)； (3)將步驟(2)得到的聚己內(nèi)酯多孔支架浸入0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液中，反復(fù)
使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法，將氫氧化鈉溶液導(dǎo)入到聚己內(nèi)酯多孔支架內(nèi)部；將盛 有支架的容器在37t:水浴中放置15min，取出支架，用lmol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)，用蒸餾 水洗滌至中性；在氫氧化鈉溶液中處理15分鐘的支架，其微觀形貌如圖2所示，可以看出支 架經(jīng)氫氧化鈉溶液處理15分鐘后，內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)仍然得到良好的保持，微觀形貌與未處理 的支架相比基本沒有變化； (4)將經(jīng)步驟(3)處理的聚己內(nèi)酯多孔支架浸入碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰 亞胺按摩爾比l : l混合的溶液中活化4小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗，浸入步驟(1)配制的半 乳糖化殼聚糖的水溶液中，在37t:水浴中攪拌下反應(yīng)8小時(shí)，取出支架，用蒸餾水沖洗，冷 凍干燥，得到半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架。如圖3所示，可以看到在多孔支架的孔 壁上復(fù)合有纖維層狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，這種物質(zhì)即為半乳糖化殼聚糖。圖4進(jìn)一步確認(rèn)了半乳 糖化殼聚糖在多孔支架中的存在，并且從照片上可看出其分布較均勻。該復(fù)合支架的應(yīng)力 應(yīng)變曲線如圖5所示，可見該復(fù)合支架具有較好的壓縮強(qiáng)度。 (5)將步驟(4)中制備的半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架放置于24孔培養(yǎng)板 中，在其上接種人肝癌細(xì)胞，加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)一周后的形 態(tài)采用激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果分別見圖6和圖7，由圖可見，人肝癌 細(xì)胞在半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架上生長(zhǎng)良好，形成了球形聚集體，有望應(yīng)用到 生物人工肝反應(yīng)器中。
實(shí)例2: 步驟同實(shí)例1中的步驟，但在半乳糖化殼聚糖的水溶液中37t:下攪拌下反應(yīng)16小
時(shí)，得到半乳糖化殼聚糖/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架。
實(shí)例3 : 步驟同實(shí)例1的步驟，但采用的是聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六環(huán)溶液，且在 0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液溶液中的處理60分鐘，然后在碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰 亞胺按摩爾比l : l混合的溶液中活化12小時(shí)，最后在半乳糖化殼聚糖的水溶液中37t:下 攪拌下反應(yīng)4小時(shí)，得到半乳糖化殼聚糖/聚乳酸_乙醇酸共聚物復(fù)合支架。
實(shí)例4 : 步驟同實(shí)例1的步驟，但采用的是聚乳酸的四氫呋喃溶液，且在2mol/L的氫氧化 鈉溶液中處理10分鐘，得半乳糖化殼聚糖/聚乳酸復(fù)合多孔支架。
權(quán)利要求
一種半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架的制備方法，其步驟如下(1)將半乳糖化殼聚糖溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0.01-0.05g/mL的半乳糖化殼聚糖溶液，靜置脫泡；將聚酯類聚合物溶解于二氧六環(huán)或四氫呋喃中，配制成濃度為0.02-0.2g/ml的溶液；(2)將尺寸為280-450μm的明膠粒子倒入模具中，用注射器將體積分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液注入模具中至浸沒粒子；將模具放置于50-70℃烘箱中2-5分鐘，使明膠粒子粘結(jié)成模板，取出模具，放置數(shù)天至乙醇揮發(fā)完畢，冷凍干燥；取出明膠模板，浸入到聚酯類聚合物溶液中，反復(fù)使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法將聚合物溶液導(dǎo)入模板內(nèi)部，冷凍干燥，然后置于37℃熱水中浸泡至明膠完全溶解，得到聚酯類聚合物多孔支架；(3)將步驟(2)得到的聚酯類聚合物多孔支架浸入0.5-2mol/L的氫氧化鈉溶液中，反復(fù)使用先抽真空后恢復(fù)至常壓的方法，將氫氧化鈉溶液導(dǎo)入到聚酯類聚合物多孔支架內(nèi)部；將盛有支架的容器在37℃水浴中放置5-60min，取出支架，用1mol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)，用蒸餾水洗滌至中性；(4)將經(jīng)步驟(3)處理的聚酯類聚合物多孔支架浸入碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按摩爾比1∶1混合的溶液中活化4-12小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗，浸入步驟(1)配制的半乳糖化殼聚糖的水溶液中，在37℃水浴中攪拌下反應(yīng)4-16小時(shí)，取出支架，用蒸餾水沖洗，冷凍干燥，得到半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架。
2. 按權(quán)利要求1所述的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架的制備方法，其特征 在于所說(shuō)的聚酯類聚合物是指聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚乳酸_乙醇酸共聚物。
全文摘要
本發(fā)明公開的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架的制備方法，步驟包括將半乳糖化殼聚糖溶于蒸餾水中配制成溶液；用明膠粒子做致孔劑制備聚酯類聚合物多孔支架；將聚酯類聚合物支架在堿液中處理后，用碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液進(jìn)行活化；將活化后的聚酯類聚合物支架浸入半乳糖化殼聚糖溶液中，反應(yīng)后冷凍干燥，獲得具有生物活性的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架。本發(fā)明制備的半乳糖化殼聚糖/聚酯類聚合物復(fù)合支架，具有良好的力學(xué)強(qiáng)度，可以提供肝細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，具有良好的生物相容性和生物活性，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能的維持。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料尺寸形狀可控、生產(chǎn)效率高，具有在生物人工肝和肝組織修復(fù)方面的良好應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/18GK101791432SQ201010127810
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者勞麗紅, 章繼川, 邱媛, 高長(zhǎng)有 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)