專利名稱：云南松屬植物的松塔提取物及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及云南松屬植物的松塔提取物及其醫(yī)藥用途。該提取物表現(xiàn)出有效的體外抑制艾滋病病毒復制作用，治療指數較高，可以預期發(fā)展成為防治艾滋病的藥物。

背景技術：
艾滋病的醫(yī)學全名為“獲得性免疫缺陷綜合征”(AcquiredImmune Deficiency Syndrome，即AIDS)，由人類免疫缺陷病毒(HIV，又稱艾滋病病毒)引起。HIV病毒是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴細胞作為攻擊目標，大量吞噬、破壞T4淋巴細胞，從而破壞人的免疫系統(tǒng)，最終使免疫系統(tǒng)崩潰，使人體因喪失對各種疾病的抵抗能力而發(fā)病，從而發(fā)生多種感染或腫瘤，最后導致死亡。當HIV感染者的免疫功能受到病毒的嚴重破壞、以至不能維持最低的抗病能力時，感染者便發(fā)展為艾滋病病人。
HIV在病毒分類學上屬逆轉錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(lentivirus)，目前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV病毒株系，分別為HIV-1和HIV-2。兩者具有相似的病毒結構和傳播途徑。HIV-2主要分布于非洲西部，在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測到。其毒力和傳播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-1廣泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1為主進行的。
艾滋病的危害席卷全球，蔓延之勢十分迅猛。1984年，全世界報告的艾滋病患者不足3000人。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署發(fā)布的《2008艾滋病流行狀況報告》指出截至2007年底，艾滋病已經導致2500萬人死亡，另有3300萬人受感染，其中我國有70萬人。我國自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV病毒感染者，至今已有60～80萬人發(fā)生了感染，專家估計，如果不迅速采取有效的預防措施，按目前的年平均30％的增長速度，到2010年，我國的HIV感染者將超過1000萬。在非洲的有些國家，HIV的感染率達總人口30％以上。因此，預防和治療艾滋病，已不僅僅是挽救個人生命的問題，而是關系到民族存亡的大事。
艾滋病目前仍是不治之癥。歷史上許多曾嚴重威脅人類健康的疾病，都因開發(fā)出有效的疫苗而被控制甚至消滅，例如天花、小兒麻痹、麻疹等。但目前人類還沒有研制成功艾滋病疫苗，科學家們仍在努力。因此，研制抗HIV藥物迫在眉睫。目前，艾滋病的治療一方面是抑制病毒，增強免疫功能，另一方面是防治機會性感染，緩解癥狀、延長生命。經過幾年的實踐證明，最行之有效的治療措施是增加使用有效的抗HIV藥物，通常使用聯(lián)合療法，包括核苷類(如美國FDA推薦應用的AZT(重氮脫氧胸苷))、非核苷類及蛋白酶抑制劑在內的兩種或多種藥物。這樣的聯(lián)合療法被認為是高效的抗逆轉錄病毒治療(HAART，或稱“雞尾酒療法”)。但HAART并不能根除體內的病毒，而長期的藥物治療也會帶來一些副作用，且價格較高。
中國經濟發(fā)展的現(xiàn)狀決定，在艾滋病的治療上無法承擔美國FDA推薦應用的AZT的費用(每人每年8000-10000美金)，更無法承受“雞尾酒療法”需要的每人每年高達15000美金的治療費用。我們只能結合中國的現(xiàn)狀，充分利用本國資源，發(fā)掘中國醫(yī)藥學寶庫，研發(fā)高效、低毒、廉價的抗HIV藥物，而我們的前期研究已經看到了希望。
松屬植物全世界約有100種，分布于北半球直達極圈，在熱帶和亞熱帶地區(qū)只生于山地。我國有50余種松屬植物，分布極廣。云南產松樹主要有六種，包括①華山松(Pinus armandii Franch)，山西、陜西、貴州、四川、甘肅等省亦有分布；②喬松(P.griffithiiM′delland)；③毛枝五葉松(P.wangii Hu)；④馬尾松(P.massoniaLamb.)，四川也產；⑤云南松(P.yunnanensis Fr.)，四川、廣西有產；⑥思茅松(P.szemaoensis Cheng et Lau)，特產于云南思茅。松樹松塔、松子殼與松子仁中的成分包括萜類、木質素、黃酮、芪類、揮發(fā)油、維生素類、棕櫚堿、礦物質、多糖、蛋白質與脂肪等。長期以來，松子仁作為營養(yǎng)食品，或稱長壽食品、仙人食品，而松塔、松子殼則僅作農家燃料。日本南部九州地區(qū)民間長期用日本白松(Pinuspariflora Sieb.et Zucc)松塔煎水喝治療胃癌；在我國，僅白皮松(Pinusbungeana)松塔為藥典用藥。白皮松松塔性溫味苦，祛痰、止咳、平喘，主治慢性氣管炎、哮喘、咳嗽痰多。
日本學者Sakagami H.等對日本白松松塔的抗腫瘤活性研究中發(fā)現(xiàn)，其熱水提取物可以對移植到小鼠體內的各種固體和腹水腫瘤細胞產生抑制作用；同時發(fā)現(xiàn)日本白松松塔熱水提取物能夠激活小鼠巨嗜細胞；Sakagami等學者還發(fā)現(xiàn)日本白松松塔的提取物有抗HIV的功效(發(fā)明專利申請?zhí)朎P88110142A)。我國呂永俊教授、李好枝教授在對國內的油松、東北紅松等松樹的活性成分研究中發(fā)現(xiàn)，松塔和松子殼均有抗腫瘤活性，但其活性強度具有種的差異。根據中外文獻檢索查詢，除日本學者提出日本白松松塔具有抗HIV作用外，未見來源于其它樹種的松塔具有抗HIV活性的相關報導。此外，日本學者認為日本白松松塔的抗HIV活性部位是大分子的酸性多糖，其提取方式為反復使用堿水提取，工藝復雜。
云南有云南松、華山松等六種松樹，資源豐富。云南農民在采收松子后一般將松塔廢棄或當做燃料燒掉，若能從中提取抗HIV活性成分，變廢為寶，不僅能為山區(qū)農民致富提供良機，更能為艾滋病的防治提供新的選擇。因此，將云南松屬植物的松塔按現(xiàn)代工藝進行提取分離并尋找其有效抑制艾滋病毒的有效部位既有巨大的社會效益又有顯著的經濟效益。在進行了一系列相關研究后，我們發(fā)現(xiàn)了一種十分經濟有效的具有抗HIV活性的云南松屬植物的松塔提取物的制備方法，并據此完成了本發(fā)明。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種適于工業(yè)化生產的抗HIV的云南松屬植物的松塔提取物，并公開了該提取物用于制備防治艾滋病的藥物的用途。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抑制艾滋病病毒復制功能的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的云南松屬植物的松塔提取物和可藥用載體。其制劑形式包括片劑、膠囊劑、控釋劑或緩釋劑。
具體而言，本發(fā)明中云南松屬植物的松塔抗艾滋病毒的活性部位提取物的制備方法如下 a)松塔經粉碎浸泡于乙醇溶液12-30小時，重復1-3次，殘渣用80-100℃熱水提取1-3小時，重復1-3次，再用堿水室溫提取，過濾，得濾液A； b)濾液A用酸性溶液調pH值至5，過濾，得濾液B； c)濾液B依次用1-5倍量乙醇溶液沉淀、過濾1-3次； d)步驟c)中得到的沉淀物用無水乙醇和/或乙醚依次洗滌，在25-55℃減壓干燥，即得。
其中，步驟a)與步驟c)中的乙醇溶液濃度為80％-95％；步驟a)中的堿水選自氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，堿水的濃度為0.5％-2％，優(yōu)選1％氫氧化鈉溶液；步驟b)中的酸性溶液選自鹽酸、硫酸、硝酸、亞硫酸、磷酸、醋酸、碳酸或硫氫酸溶液，濃度為0.5％-2％，優(yōu)選1％醋酸溶液；步驟a)中的松塔是指剝離了松子的新鮮或干燥球果。根據初步的化學分析得知，本發(fā)明的云南松屬植物的松塔提取物為弱堿性物質，其與Sakagami等提出的日本白松松塔提取物(發(fā)明專利申請?zhí)朎P88110142A)為酸性大分子多糖物質不同。
本發(fā)明中的云南松屬植物的松塔提取物來源于云南省內分布的6種松樹，優(yōu)選華山松、云南松、喬松和/或思茅松。
本發(fā)明所述的具有抑制艾滋病病毒復制功能的藥物組合物是由云南松屬植物的松塔提取物和藥學上應用的各種制劑輔料，通過合理組合制成的用于醫(yī)療目的口服制劑。
所述的藥物組合物制劑包括片劑、膠囊劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。所述的藥學上可接受的載體，包括制劑中常規(guī)的稀釋劑、填充劑(如乳糖、聚乙二醇)，粘合劑(如淀粉、微晶纖維素)，崩解劑(如羧甲基纖維素、低取代的羥丙基纖維素)，潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鎂)，濕潤劑(如丙二醇、乙醇)，穩(wěn)定劑(如EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙醇胺、碳酸氫鈉、煙酰胺)等等。上述輔料采用常用劑量，以常用的配比與云南松屬植物的松塔提取物混合，當云南松屬植物的松塔提取物用量確定后，各藥用輔料之間的配比根據需要適當調節(jié)。
本發(fā)明的具有抗HIV病毒功能的云南松屬植物的松塔提取物可以與現(xiàn)已上市的抗艾滋病藥物如重氮脫氧胸苷(AZT)、齊多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、地拉韋定(delavirdine)、沙喹那韋、奈韋拉平(nevirapine)、利托那韋(ritonavir)和吲哚那韋等聯(lián)合使用，制備得到具有艾滋病毒抑制活性的組合物，可用于治療艾滋病。該類藥物組合物可以采用片劑、膠囊劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。這些藥物組合物可以用于治療艾滋病、延長艾滋病人生存時間和/或質量等用途。
本發(fā)明的有益之處是云南松屬植物自然資源豐富，本發(fā)明提取物原料云南松屬植物的松塔資源豐富易得，提取工藝簡單、成分及藥效穩(wěn)定，容易實現(xiàn)產業(yè)化。此外，該項研究完全有希望研發(fā)出一種對邊疆經濟發(fā)展有重大推動作用并對艾滋病防治提供有效策略的抗艾滋新藥。

具體實施例方式 為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例給出了代表性的部分云南松屬植物的松塔提取物的制備方法和抗HIV病毒活性數據的藥理實驗結果，說明其在抗艾滋病藥物研究領域中的用途。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分數是重量百分數。
實施例1云南松屬植物的松塔提取物H-D的制備 華山松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小時×3次，過濾。殘渣用沸水提取2小時×3次，再用1％氫氧化鈉溶液室溫提取，過濾。濾液用醋酸溶液調pH值至5，過濾。濾液用倍量乙醇溶液沉淀，過濾。沉淀物用無水乙醇洗滌，在40℃減壓干燥，得云南華山松的松塔提取物7.52克(樣品編號H-D)。
實施例2云南松屬植物的松塔提取物H-F的制備 華山松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡小時×3次，過濾。殘渣用沸水提取2小時×3次，再用1％氫氧化鈉溶液室溫提取，過濾。濾液用醋酸溶液調pH值至5，過濾。濾液用倍量乙醇溶液沉淀，過濾。濾液再用2倍量乙醇溶液沉淀，過濾。濾液再用5倍量乙醇溶液沉淀，過濾。沉淀物用無水乙醇、乙醚依次洗滌，在40℃減壓干燥，得云南華山松的松塔提取物3.83克(樣品編號H-F)。
實施例3云南松屬植物的松塔提取物Y-E的制備 云南松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小時×3次，過濾。殘渣用沸水提取2小時×3次，再用1％氫氧化鈉溶液室溫提取，過濾。濾液用醋酸溶液調pH值至5，過濾。濾液用倍量乙醇溶液沉淀，過濾。濾液再用2倍量乙醇溶液沉淀，過濾。沉淀物用無水乙醇洗滌，在50℃減壓干燥，得云南松的松塔提取物3.96克(樣品編號Y-E)。
實施例4云南松屬植物的松塔提取物Y-F的制備 云南松干燥松塔10公斤，粉碎，加20升的95％的乙醇溶液浸泡24小時×3次，過濾。殘渣用沸水提取2小時×3次，再用1％氫氧化鈉溶液室溫提取，過濾。濾液用醋酸溶液調pH值至5，過濾。濾液用倍量乙醇溶液沉淀，過濾。濾液再用2倍量乙醇溶液沉淀，過濾。濾液再用5倍量乙醇溶液沉淀，過濾。沉淀物用無水乙醇、乙醚依次洗滌，在40℃減壓干燥，得云南松的松塔提取物3.65克(樣品編號Y-E)。
實施例5云南松屬植物的松塔提取物抑制HIV病毒的活件試驗 5.1實驗原理與依據根據國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)發(fā)布的“抗HIV藥物非臨床藥效學研究技術指導原則(2006)”，采用國際通用實驗方法對藥物的抗HIV-1活性進行檢測。
5.2材料與方法 5.2.1測定藥物和化合物待測樣品為根據實施例1-2制備得到的云南華山松的松塔提取物H-D(以下簡稱“樣品1”)、H-F(以下簡稱“樣品2”)。待測樣品溶解于PRMI-1640中，4℃保存，貯存濃度為10.0毫克/毫升。重氮脫氧胸苷(AZT)為陽性對照藥品。5.2.2試劑和溶液生物緩沖劑HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)、噻唑藍MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均購自Sigma公司；2-巰基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)為Bio-Rad公司產品。RPMI-1640和新生小牛血清為Gibco公司產品。
5.2.3細胞和病毒人T淋巴細胞系C8166細胞、MT-4細胞以及HIV-1實驗株HIV-1IIIB均由英國Medical Research Council，AIDS ReagentProject惠贈。所有細胞和病毒均以含10％小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備HIV-1IIIB，滴定并計算出病毒的TCID50。病毒貯存液分裝后，置-70℃保存。細胞和病毒按常規(guī)方法凍存和復蘇。
5.2.4HIV-1感染性滴定HIV-1IIIB按Johnson & Byington(1990)所述方法改良進行滴定，簡述如下將HIV-1IIIB貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個梯度，每梯度6個重復孔，同時設置對照孔6孔。每孔加入C8166細胞50微升，每孔終體積為200微升。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第3天補加新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基100微升，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-1誘導的細胞病變效應(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞體(Syncytium)的形成確定；按Reed & Muench方法計算病毒的TCID50(50％組織培養(yǎng)染毒濃度)。
5.2.5對C8166細胞的毒性實驗4×105/毫升C8166細胞懸液100微升與不同的待測藥物溶液混合，設3個重復孔。同時設置不含藥物的對照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)3天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。ELx800酶標儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CC50值(50％抑制細胞生長濃度)，即對50％的正常T淋巴細胞系C8166細胞產生毒性時的藥物濃度。
5.2.6對HIV-1IIIB致細胞病變(CPE)的抑制實驗將8×105個/毫升C8166細胞50微升/孔接種到含有100微升/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入50微升的HIV-1IIIB稀釋上清，1300TCID50/孔。設3個重復孔。同時設置不含藥物的正常細胞對照孔。AZT為陽性藥物對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100×)計數合胞體的形成。EC50(50％有效濃度)為抑制合胞體形成50％時的藥物濃度。
5.2.7計算公式根據實驗結果繪制劑量反應曲線，按Reed & Muench法計算出化合物抑制病毒的50％有效濃度(EC50)，50％抑制細胞生長濃度(CC50)及抗HIV-1活性的治療指數TI值(Therapeuticindex)。
(1)細胞生長存活率(％)＝實驗孔OD值/對照孔OD值×100 (2)HIV-1致細胞病變的抑制率(％)＝(1-實驗孔合胞體數/對照孔合胞體數)×100 (3)TI＝CC50/EC50 5.3結果 測試樣品的細胞毒性作用、對HIV-1IIIB誘導C8166細胞病變的抑制作用、抗HIV-1病毒的治療指數如表1至表3所示。
表1測試樣品對人T淋巴細胞系C8166細胞的毒性作用的實驗數據

表2.測試樣品對HIV-1IIIB誘導C8166細胞病變的抑制作用實驗數據
表3.測試樣品的治療指數

5.4結論 樣品1、2對人T淋巴細胞系C8166細胞毒性小，重復試驗顯示其CC50均大于2000微克/毫升；對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體抑制活性較好，EC50為47.44～56.46微克/毫升，治療指數(TI值)為59.99-85.88。實驗結果顯示云南松屬植物的松塔提取物(樣品1-2)具有一定的體外抗HIV-1活性，其治療指數均大于50，可以預期發(fā)展成為用于治療HIV病毒感染引起的艾滋病的藥物。
實施例6云南松的松塔提取物抑制HIV病毒的活性試驗 6.1實驗原理與依據同實施例5。
6.2材料與方法 6.2.1測定藥物和化合物待測樣品為根據實施例31-4制備得到的云南松的松塔提取物Y-E(以下簡稱“樣品A”)和Y-F(以下簡稱“樣品B”)。待測樣品溶解于PRMI-1640中，4℃保存，貯存濃度為10.0毫克/毫升。重氮脫氧胸苷(AZT)為陽性對照藥品。
6.2.2試劑和溶液同實施例5。
6.2.3細胞和病毒同實施例5。
6.2.4HIV-1感染性滴定同實施例5。
6.2.5對C8166細胞的毒性實驗同實施例5。
6.2.6對HIV-1IIIB致細胞病變(CPE)的抑制實驗同實施例5。
6.2.7計算公式同實施例5。
6.3結果 測試樣品的細胞毒性作用、對HIV-1IIIB誘導C8166細胞病變的抑制作用、抗HIV-1病毒的治療指數如表4所示。
表4測試樣品體外細胞毒性和抗HIV-1活性結果匯總表
6.4結論 從實驗結果來看，樣品A和B對C8166細胞毒性不大，其CC50均在685.59～902.22微克/毫升之間；樣品A和B對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體抑制有較強的活性EC50分別為1.33微克/毫升和4.39微克/毫升，治療指數分別為515.48和205.52。實驗結果顯示云南松的松塔提取物樣品A和B體外抗HIV-1的活性較強，可以預期發(fā)展成為用于治療HIV病毒感染引起的艾滋病的藥物。
權利要求
1.一種云南松屬植物的松塔提取物，其由包含下列步驟的方法制備得到
a)松塔經粉碎浸泡于乙醇溶液12-30小時，重復1-3次，殘渣用80-100℃熱水提取1-3小時，重復1-3次，再用堿水室溫提取，過濾，得濾液A；
b)濾液A用酸性溶液調pH值至5，過濾，得濾液B；
c)濾液B依次用1-5倍量乙醇溶液沉淀、過濾1-3次；
d)步驟c)中得到的沉淀物用無水乙醇和/或乙醚依次洗滌，在25-55℃減壓干燥，即得。
2.根據權利要求1的云南松屬植物的松塔提取物，其制備方法的步驟a)與步驟c)中的乙醇溶液濃度為80％-95％。
3.根據權利要求1的云南松屬植物的松塔提取物，其制備方法的步驟a)中的堿水選自氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，堿水的濃度為0.5％-5％；步驟b)中的酸性溶液選自鹽酸、硫酸、硝酸、亞硫酸、磷酸、醋酸、碳酸或硫氫酸溶液，濃度為0.5％-10％。
4.根據權利要求1的云南松屬植物的松塔提取物，其制備方法的步驟a)中的堿水是指1％氫氧化鈉溶液，步驟b)中的酸性溶液是指1％醋酸溶液。
5.根據權利要求1的云南松屬植物的松塔提取物，其制備方法的步驟a)中的松塔是指剝離了松子的新鮮或干燥球果，球果選自華山松、云南松、喬松和/或思茅松。
6.權利要求1-5之一的云南松屬植物的松塔提取物用于制備防治艾滋病的藥物的用途。
7.一種具有抑制艾滋病病毒復制功能的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的權利要求1-5之一的云南松屬植物的松塔提取物和可藥用載體。
8.根據權利要求7的藥物組合物，其是片劑、膠囊劑、控釋劑或緩釋劑。
全文摘要
本發(fā)明“云南松屬植物的松塔提取物及其制備方法和藥物用途”涉及云南產松屬植物華山松、云南松、喬松和/或思茅松的松塔提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途。本發(fā)明的云南松屬植物的松塔提取物由經粉碎的松塔以乙醇溶液浸泡、熱水提取、堿水室溫提取后的濾液再醇沉提取而得，本發(fā)明得到的云南松屬植物松塔提取物能有效抑制艾滋病毒(HIV)，可以預期發(fā)展成為防治艾滋病的藥物。藥效學試驗結果顯示云南松屬植物的松塔提取物具有體外抗HIV-1活性，其治療指數大于50(59.99-515.48)。
文檔編號A61P31/18GK101773527SQ20101011732
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權日2010年3月4日
發(fā)明者劉光明, 趙昱, 呂永俊, 李好枝, 彭芳, 張楨, 李冬梅, 羅建蓉, 巫秀美, 周萍, 楊敏, 張海珠, 張?zhí)m勝, 施貴榮, 李春艷, 董光平 申請人:大理學院