專利名稱：：具有降低絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的接骨木活性部位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及接骨木活性部位對絕經(jīng)后骨的保護(hù)作用，具體的說是接骨木活性部位及所含活性成分在制備預(yù)防或治療絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病的藥物或保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步、人類壽命的延長，女性絕經(jīng)后的生存時(shí)間有了顯著的延長。因此，由絕經(jīng)所引發(fā)的更年期綜合征、肥胖癥、骨質(zhì)疏松、泌尿生殖道萎縮、糖尿病、心血管疾病與老年癡呆等疾病的發(fā)病率也有了顯著的增加。這些疾病不僅影響了患者個(gè)人的生活質(zhì)量，亦給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。女性絕經(jīng)后110年內(nèi)，體內(nèi)會出現(xiàn)鈣的快速丟失，易于發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松是一種骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞，骨骼脆性增加，從而易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病[l]。WHO資料顯示，骨質(zhì)疏松居于老年人常見病、多發(fā)病的第六位[2]。在歐洲、日本和美國，每年有超過7500萬人患有骨質(zhì)疏松癥。50%的女性可因骨質(zhì)疏松而發(fā)生骨折；據(jù)統(tǒng)計(jì)，骨質(zhì)疏松骨折所致的死亡率超過乳腺癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的總和[3_6]。我國是全世界老齡人口最多的國家，目前受到骨質(zhì)疏松癥威脅的老年人群有8400萬，隨著人口老齡化加劇，這個(gè)數(shù)字還在逐步增長[7]。近幾十年來，治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物發(fā)展迅速。目前所用的治療藥物主要為合成藥，包括雌激素、降鈣素、二磷酸鹽等抗骨質(zhì)吸收藥物，氟化物等促進(jìn)骨形成藥物，鈣劑、維生素D等骨礦化藥物。這些藥物能夠不同程度地預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，緩解病痛癥狀、降低骨折發(fā)生率，但也存在著毒副作用大、遠(yuǎn)期療效不肯定，價(jià)格昂貴等多方面的缺點(diǎn)。至今尚無一種集高效、安全、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)于一身的理想藥物。我國先民在2000多年前的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)著作《素問》中，就對男女在生長發(fā)育不同階段骨的變化作了詳細(xì)描述。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，腎主骨生髓，骨的生長、發(fā)育、強(qiáng)勁、衰弱都與腎精的盛哀有密切關(guān)系。腎精虧損，則骨髓生長乏源，骨骼失養(yǎng)，骨礦含量下降，骨密度下降，則會產(chǎn)生"骨枯"、"骨極"、"骨痿"，即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義的骨質(zhì)疏松。中醫(yī)藥的辯證施治也將骨與腎緊密相連，提出補(bǔ)腎益精、補(bǔ)腎益肝、補(bǔ)腎健脾、補(bǔ)腎活血益氣等治療方法。中草藥資源豐富、毒副作用小、價(jià)格相對低廉且有豐富的中醫(yī)理論和臨床實(shí)踐支持，已成為當(dāng)代尋找治療骨質(zhì)疏松藥物的重要源泉。接骨木(Samb腦swilli塞iiHance)始載于《唐本草》，別名續(xù)骨木(《綱目》)、鐵骨散(《植物名實(shí)圖考》)、接骨丹(《草木便方》)等，為忍冬科接骨木的干燥莖枝。其味甘、苦，性平，無毒，歸肝經(jīng)。接骨木具有祛風(fēng)利濕、活血止痛、接骨續(xù)筋的功效，主要用于治療風(fēng)濕筋骨疼痛、腰痛、跌打腫痛、骨折、創(chuàng)傷出血等癥[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明接骨木所含的部分木脂素成分在體外能夠促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖和ALP活性。然而對于上述成分的研究缺乏體內(nèi)動物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)接骨木抗骨質(zhì)疏松活性部位及其作用機(jī)理也尚未明晰。為此，有必要對其提取物及其餾分，采用國際公認(rèn)的藥效學(xué)動物模型，開展深入的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是確定接骨木活性部位及所含的主要活性成分。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種接骨木活性部位，用于制備預(yù)防或治療絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病的藥物、食品或食品添加劑，以及接骨木活性部位與具有緩解和改善骨相關(guān)疾病的藥物、傳統(tǒng)中藥、天然產(chǎn)物混合，制備具有防治絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病作用的藥物、食品或食品添加劑。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明公開了接骨木活性部位，及其所含的主要活性成分，該活性部位的成分主要有7個(gè)化合物香草酸、松柏醇、左旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇_13-0-4'_松柏醇基醚、右旋赤式-1-(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-甲氧苯氧基]-1，3-丙二醇、右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-P_0-4'_松柏醇基醚、去氫二松柏醇，二氫去氫二松柏醇，所述7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別是6去a二松柏醇所述接骨木活性部位按重量百分比該活性部位由以下化學(xué)成分組成香草酸(1)0.5%-5%松柏醇(2)0.5%-10%左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-|3-0-4'_松柏醇基醚(3)1.0%-15%右旋蘇式-1_(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)_2-羥基苯氧基]-1，3-丙二醇(4)1.0%-15%5右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-|3-0-4'_松柏醇基醚(5)1.0%-15%去氫二松柏醇(6)2.0%-20%二氫-去氫二松柏醇(7)2.0%-20%其他組分余量所述其他組分主要是提取過程中得到的其他苯丙素、木脂素、酚酸及糖苷類物質(zhì)。所述接骨木活性部位的HPLC指紋圖譜包含10個(gè)主要色譜峰，其中7個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)，以去氫二松柏醇(峰9)的保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為0.40±0.02(香草酸)、0.55±0.02(松柏醇)、0.67±0.02(左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-P_0-4'-松柏醇基醚)、0.69±0.02(右旋蘇式-1_(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-羥基苯氧基]-1，3-丙二醇)、0.71±0.02(右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇_P-0-4'-松柏醇基醚)、1.00(去氫二松柏醇)、1.02±0.02(二氫-去氫二松柏醇)。所述接骨木活性部位的HPLC指紋圖譜是采用反相高效液相色譜法建立的，所述反相高效液相色譜法的條件是以十八烷基硅氧鍵和硅膠為固定相；以含有O.1%醋酸的甲醇-水溶液作為流動相，梯度洗脫流速為0.8mL/min;檢測波長為280nm;色譜柱溫度為35°C，以去氫二松柏醇計(jì)算理論塔板數(shù)，不低于2000。本發(fā)明公開了一種接骨木活性部位的制備方法，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)接骨木干燥莖枝適當(dāng)粉碎后，用甲醇、乙醇或水，采用不同提取次數(shù)和時(shí)間，通過冷提取、熱提取或者超聲提取提取，收集提取液，將提取液減壓濃縮后得到接骨木總提物；(2)以適量水溶解接骨木總提物，進(jìn)行大孔樹脂開放柱層析，用水或30%_95%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，得到洗脫部分即為接骨木活性部位。上述提取步驟中，在步驟(1)中優(yōu)選用10倍量的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)；在步驟(2)中優(yōu)選用50%乙醇洗脫。本發(fā)明公開了接骨木活性部位在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述藥物是藥學(xué)上可接受的劑型，所述劑型包括但不限于片劑、膠囊劑、口服液。本發(fā)明公開了接骨木活性部位在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的食品或食品添加劑中的應(yīng)用。將前述接骨木活性部位，直接與適量藥物制劑輔料或食品混合，制成適于服用的藥物、食品或食品添加劑?；?qū)⑶笆鼋庸悄净钚圆课慌c一種或多種具有緩解或改善骨相關(guān)疾病的藥物、傳統(tǒng)中藥、天然產(chǎn)物(淫羊藿、仙茅、女貞子、熟地、當(dāng)歸、澤瀉等)及適量輔料混合，制成藥品、食品或食品添加劑。對制得的含有接骨木活性部位的藥品、食品或食品添加劑進(jìn)行去卵巢小鼠骨相關(guān)疾病的活性評價(jià)，結(jié)果顯示與病理模型組比較，上述含有接骨木活性部位的藥品、食品或食品添加劑可以不同程度的抑制去卵巢所引發(fā)的股骨及脛骨的骨量丟失，而對子宮指數(shù)無影響。表明上述含有接骨木活性部位的藥品、食品或食品添加劑具有不同程度的緩解和改善絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失，提高股骨及脛骨骨密度，增加骨容積，且不增加子宮重量，提示上述藥品、食品或食品添加劑能夠安全有效地緩解和改善絕經(jīng)后婦女骨相關(guān)疾病各種癥狀。綜上，本發(fā)明公開的接骨木活性部位能夠顯著改善去卵巢小鼠的骨質(zhì)流失，提高股骨及脛骨骨密度，增加骨容積，且不增加子宮重量，是一種安全有效地緩解和改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病各種癥狀的成分。本發(fā)明的有益效果是提供了一種接骨木活性部位，可以用于制備具有防治絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病作用的藥物、食品或食品添加劑。圖1是通過HPLC分析液相確定的接骨木50%乙醇洗脫部分的指紋圖譜；圖2是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；圖3是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物1在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖4是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物2在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖5是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物3在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖6是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物4在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖7是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物5在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖8是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物6在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖9是從接骨木50%乙醇洗脫部分中分離得到的化合物7在相同HPLC條件下的色譜峰指認(rèn)圖譜；圖10是本發(fā)明接骨木各餾分對小鼠子宮重量的影響分析圖；圖11是本發(fā)明接骨木各餾分對小鼠股骨及脛骨骨密度的影響分析圖；圖12是本發(fā)明接骨木各餾分對小鼠股骨及脛骨骨容積的影響分析圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例以及應(yīng)用研究、驗(yàn)證的數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但
發(fā)明內(nèi)容并不局限于所列實(shí)施例。實(shí)施例1:接骨木活性部位的制備方法取接骨木的干燥莖枝50公斤，經(jīng)適當(dāng)粉碎后，用10倍量的60%乙醇加熱回流提取3次，每次2小時(shí)。合并提取液，減壓蒸去溶劑，得到接骨木總提物2160克。隨后取接骨木總提物1250克，以適量水溶解，進(jìn)行大孔樹脂開放柱層析，依次用5倍柱床體積的水、30%、50%、95%的乙醇-水溶液梯度洗脫，收集各部分洗脫液，分別減壓回收溶劑，得到水洗脫部分712.5克，30%乙醇洗脫部分160克，50%乙醇洗脫部分125克及95%乙醇洗脫部分111克，其中50%乙醇洗脫部分即為接骨木活性部位(活性篩選數(shù)據(jù)，參見實(shí)施例4、5)。實(shí)施例2:接骨木活性部位中主要成分的分離及鑒定實(shí)施例1中制備的接骨木50X乙醇洗脫部分通過HPLC分析液相確定了其指紋圖譜，見圖1。在指紋圖譜指導(dǎo)下經(jīng)過ODS柱色譜、HW40柱色譜、RP-HPLC制備液相等分離手段，通過HPLC、MS、NMR等分析鑒定方法，確定了7個(gè)化合物，香草酸(1)、松柏醇(2)、左旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-P-0-4'-松柏醇基醚(3)、右旋赤式-1-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-羥基苯氧基]-l，3-丙二醇(4)、右旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-13-0-4'-松柏醇基醚(5)、去氫二松柏醇(6)，二氫去氫二松柏醇(7)。分離得到化合物結(jié)構(gòu)式見圖2。在與接骨木50X乙醇洗脫部分HPLC指紋圖譜相同的色譜條件下，對分離得到的化合物進(jìn)行指認(rèn)，具體指認(rèn)過程見圖3。2.l具體分離過程如下接骨木50%乙醇洗脫部分(SWC)20.33g，60%乙醇-水溶解、過濾，濾液進(jìn)行ODS中低壓柱色譜分離(小2.2X30cm)，30%、50%、100%甲醇-水梯度洗脫，得到三個(gè)餾分SWC1(5.20g)，SWC2(7.68g)，SWC3(4.19g)。SWC1經(jīng)過HW40柱色譜分離(小3X60cm)，20%、40%、100%甲醇-水梯度洗脫得到6個(gè)餾分(fractionA-F)，其中fractionC(40X甲醇_水洗脫物)再經(jīng)過ODS柱色譜分離，30%、50%、100%甲醇-水梯度洗脫得到7個(gè)餾分(subfractionCl-7)，對得到的餾分SubfractionC2(30X甲醇-水洗脫物)進(jìn)行制備型高效液相分離，以28%甲醇-水洗脫，得到化合物2(7.2mg);對SubfractionC3(30%甲醇-水洗脫物)進(jìn)行制備型高效液相分離，30%甲醇-水洗脫，隨后進(jìn)一步通過S印hadexLH20柱色譜純化后，得到化合物3(15.3mg)。同樣fractionD(40%甲醇-水洗脫物)經(jīng)過0DS柱色譜，30%、50%、100%甲醇-水梯度洗脫及制備型高效液相分離，30%甲醇-水洗脫，得到化合物1(31.0mg)、4(15.2mg)、5(15.4mg)。SWC2經(jīng)過HW40柱色譜分離(小3X60cm)，20%、40%、100%甲醇-水梯度洗脫得到7個(gè)餾分(fractionA-G)，其中fractionC(20%甲醇_水洗脫物)進(jìn)行制備型高效液相分離，40%甲醇-水洗脫，得到化合物7(180.0mg);fractionD(40%甲醇-水洗脫物)經(jīng)過0DS柱色譜分離(小3X60cm)，30%、50%、100%甲醇_水梯度洗脫后得到5個(gè)餾分(subfractionD1-5)，其中subfractionD3進(jìn)一步進(jìn)行ODS柱色譜分離((MX30cm)，30%甲醇-水等度洗脫后得到4個(gè)餾分(subfractionD3a-d)，其中subfractionD3c進(jìn)行制備型高效液相分離，38%甲醇-水洗脫，得到化合物6(22.7mg)。2.2化合物結(jié)構(gòu)解析過程如下2.21化合物1白色粉末(甲醇)。ESI-MS實(shí)驗(yàn)給出m/z167[M_H]—，提示這是一個(gè)分子量為168的小分子化合物。化合物1的^NMR圖譜較簡單，低場區(qū)只有三組信號，S7.55(1H，d，J=8.7，1.9Hz，H-6);S7.54(1H，d，J=1.9HzH_2);S6.83(1H，d，J=8.7Hz，H_5)禾口，為典型的苯環(huán)ABX耦合系統(tǒng)氫信號。高場區(qū)有一個(gè)甲氧基信號S3.88(3H，s，3-0Me)?；衔锏?CNMR顯示一個(gè)羰基信號S170.l，由于化學(xué)位移相對于醛羰基偏向高場，說明這是一個(gè)酸羰基或酯羰基。此外在低場區(qū)還出現(xiàn)6個(gè)苯環(huán)上的碳信號Sl52.7(C-4)，Sl48.7(C-3)，S125.3(C_6)，S123.2(C_1)，S113.9(C-2)及在高場區(qū)出現(xiàn)l個(gè)甲氧基碳信號。經(jīng)過與文獻(xiàn)[9]比較，化合物1的結(jié)構(gòu)確定為3-甲氧基-4-羥基苯甲酸，即香草酸，vanillicacid，化合物的"CNMR參見表1。2.22化合物2淡黃色膠狀固體(甲醇)。ESI-MS實(shí)驗(yàn)給出m/z179[M_H]—，提示這是一個(gè)分子量為180的小分子化合物。顯示在低場區(qū)有一組典型的苯環(huán)ABX耦合氫信號S6.98(lH，d，J=1.9Hz，H_2);S6.83(1H，dd，J=8.1，1.9Hz，H-6);S6.72(1H，d，J=8.lHz，H-5)和一對反式烯氫信號S6.52(1H，d，J=15.8Hz，H_7);S6.49(1H，dt，J=15.8，5.9Hz，H_8)。高場區(qū)顯示一個(gè)亞甲基氫信號S4.18(2H，dd，J=5.9，1.4Hz，H-9)，由其裂分情況可知其連接在雙鍵上，此外還有一個(gè)甲氧基氫信號S3.85(3H，s，H-10)。在化合物的13CNMR和DEPT-135圖譜上，可以清楚的看到在S132.1，121.0處的不飽和雙鍵的碳信號，S63.9處的亞甲基碳信號及S56.4處的甲氧基碳信號，其余為苯環(huán)上碳信號。因此確定化合物2結(jié)構(gòu)為松柏醇(Coniferylalcohol)?；衔锏暮舜艛?shù)據(jù)參見表l。表1化合物1和2的^NMR(400MHz，CD3OD)和13CNMR(100MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)Compound1Compound2Position5CSc1123.2130.7113.91H，7.54(d),凡9110.71H,6"8(d)，93148.7147.54152.7149.1U5.81H,6.83(d),116.21H，6.72(d),風(fēng)l6125.31H，7.55,，/=8.7,1.9127.11H，6.83,,/二8.1，1.97170.1132.11H,6.4915.88121.01H，6.18(qt)，J-l5.S，5.9963.92H，4.186.2，1.41056.43H，3.88(s)56.43H:3.85(s)2.23化合物3黃色油狀(甲醇)，[a]27D_1.5°(c=0.67，MeOH)。結(jié)合^NMR、13CNMR和DEPT-135確定化合物的分子式為(:2。112407，計(jì)算其不飽和度為9。在化合物3的^NMR(400腿z，inCD30D)圖譜上，低場區(qū)給出8組氫信號，其中一個(gè)單峰積分值為2。盡管有信號重疊，但根據(jù)化學(xué)位移值及耦合常數(shù)仍可以判斷存在2個(gè)ABX耦合系統(tǒng)和1個(gè)反式雙鍵耦合，ABX耦合系統(tǒng)分別為S7.01(1H，d，J=1.8Hz，H_2)，S6.72(1H，d，J=8.1Hz，H-5)和S6.83(1H，dd，J=8.1，1.8Hz，H-6);S6.98(1H，d，J=1.9Hz，H-2')，S6.86(lH，H-5')和S6.86(IH，H_6')，反式雙鍵為S6.50(1H，d，J=16.0Hz，H-7')禾PS6.22(1H，dt，J=15.8，5.8Hz，H-8')。91HNMR圖譜在高場區(qū)有2個(gè)明顯的甲氧基信號S3.86(3H，s，3_0Me)，S3.82(3H，s，3'-OMe);2個(gè)連氧次甲基氫信號S4.82(1H，d，J=5.8Hz，H_7)，S4.35(lH，m，H-8);1個(gè)連氧亞甲基氫信號S4.18(2H，dd，J=5.8，1.4Hz，H_9')以及l(fā)個(gè)被甲氧基氫掩蓋的連氧亞甲基氫信號S3.81(2H，o，H-9)?；衔?的13CNMR(lOOMHz，inCD30D)圖譜給出20個(gè)碳信號，結(jié)合DEPE-135圖譜，顯示低場區(qū)有6個(gè)SP2雜化的季碳信號S151.9(C-3')、148.9(C-4')、148.7(C_3)、147.0(C-4)、134.1(C-l)、133.1(C_l')，8個(gè)SP2雜化叔碳信號S131.4(C_7')、128.5(C-8')、121.0(C-6)、120.7(C-6')、118.9(C_5')、115.7(C_5)、111.9(C_2)、111.4(C-2');2個(gè)連氧的次甲基碳信號S86.2(C_8)、74.1(C_7)，還有2個(gè)連氧的亞甲基碳信號S63.7(C-9')、62.2(C_9)以及2個(gè)甲氧基碳信號S56.5(3_0Me)、56.3(3'-OMe)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10，11]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，化合物3確定為左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-P-0-4'_松柏醇基醚，艮P(-)-erythro-guaiacylglycerol-P-0-4'-coniferyether。核磁數(shù)據(jù)見表2。2.24化合物4黃色油狀(甲醇)，[a]26D11.3°(c=0.67，MeOH)。ESI-MS給出m/z387[M+Na]+，363[M-H]—提示化合物的分子量為364。結(jié)合^NMR、13CNMR和DEPT-135確定化合物的分子式為(:19112407，計(jì)算其不飽和度為8?；衔?與化合物3在^NMR(400腿z，inCD3OD)低場區(qū)的圖譜比較相似，除少了1個(gè)反式烯鍵耦合的氫外，也類似的有2個(gè)ABX耦合系統(tǒng)S7.00(1H，d，J=1.8Hz，H_2)，S6.75(1H，d，J=8.lHz，H_5)和S6.84(1H，dd，J=8.2，1.8Hz，H_6);S6.68(1H，d，J=2.OHz，H-2')，S6.90(1H，d，J=8.2HzH—5')禾PS6.55(1H，dd，J=8.3，2.1HzH-6')。在高場，除了只有一個(gè)甲氧基氫信號及在最低場出現(xiàn)2個(gè)亞甲基氫信號外，其余氫信號也與化合物3類似，甲氧基氫信號S3.80(3H，s，3-0Me);2個(gè)亞甲基氫信號S2.54(2H，t，J=7.4Hz，H-7')，S1.77(2H，m，H_8');2個(gè)連氧次甲基氫信號S4.89(1H，d，J=6.2Hz，H-7)，S4.07(1H，dd，J=10.5，4.8Hz，H-8);2個(gè)連氧亞甲基氫信號S3.72(1H，dd，J=11.8，4.1Hz，H-9'b)，S3.47(1H，dd，J=11.8，5.OHz，H_9'a)，S3.53(2H，t，J=6.5HzH_9)?；衔?的"CNMR(lOOMHz，inCD3OD)圖譜給出19個(gè)碳信號，結(jié)合DEPE-135圖譜，可以看出與化合物3比較少了一個(gè)甲氧基碳信號及兩個(gè)烯碳信號，其余碳信號較類似。低場區(qū)6個(gè)SP2雜化的季碳信號S149.3(C-3')、146.0(C-4')、148.9(C-3)、147.3(C-4)、134.0(C-l)、138.6(C-l')，6個(gè)SP2雜化叔碳信號:120.8(C-6)、120.6(C-6')、119.5(C-5')、117.2(C-2')、116.0(C-5)、111.5(C-2);高場區(qū)有2個(gè)連氧的次甲基碳信號:S87.8(C-8)、74.2(C-7)，還有2個(gè)連氧的亞甲基碳信號:S62.3(C-9')、61.8(C_9)以及1個(gè)甲氧基碳信號S56.3(3-0Me)。由于化合物4中C-8的化學(xué)位移值S87.8(C_8)與化合物3中的S86.2(C_8)相比向低場位移，由此推斷，該化合物相對構(gòu)型為反式。參照文獻(xiàn)[12]，確定化合物4為右旋蘇式-1_(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-羥基苯氧基]-1，3-丙二醇，即(+)_thero_l_(4-hydroxy-3-methoxypheny1)_2_[_4_(3-hydroxyprop肌yl)-2-hydroxy-p10henoxy]_1，3_propanediol。核磁數(shù)據(jù)見表2。2.25化合物5黃色油狀(甲醇)，[a]27D11.9°(c=0.67，Me0H)。ESI-MS給出m/z399[M+Na]+，775[2M+Na]+提示化合物的分子量為376。結(jié)合^NMR、13CNMR和DEPT-135確定化合物的分子式為(:2。112407，計(jì)算其不飽和度為9。化合物5的與化合物3的^NMR(400MHz,inCD30D)圖譜比較相似，在低場區(qū)給出8組氫信號，根據(jù)化學(xué)位移和耦合常數(shù)可以確定也存在兩個(gè)ABX耦合系統(tǒng)和一個(gè)反式雙鍵耦合，ABX耦合系統(tǒng)為S7.02(1H，d，J=1.8Hz，H_2)，S6.75(1H，d，J=8.lHz，H_5)和S6.85(1H，dd，J=8.1，1.8Hz，H-6);S7.04(1H，d，J=1.9Hz，H-2')，S6.99(1H，d，J=8.3HzH-5')禾PS6.90(1H，dd，J=8.3，1.9HzH-6')，反式雙鍵為S6.52(1H，d，J=16.0Hz，H-7')和S6.24(1H，dt，J=16.0，5.7Hz，H-8')，不過這里的H_5和H_6未重疊，有了很好的裂分。在高場區(qū)有2個(gè)明顯的甲氧基信號S3.86(3H，s，3_0Me)，S3.82(3H，s，3'-OMe);2個(gè)連氧次甲基氫信號:S4.89(1H，d，J=5.8Hz，H_7)，S4.28(1H，m，H_8)和l個(gè)連氧亞甲基氫信號S4.19(2H，dd，J=5.8，1.4Hz，H-9')都發(fā)生了一些變化；而被掩藏在甲氧基里的l個(gè)亞甲基氫信號在該化合物中向高場位移至S3.72(1H，dd，J=11.9，4.lHz，H-9b)，S3.47(1H，dd，J=11.9，5.4HzH_9a)?；衔?與化合物3的13CNMR數(shù)據(jù)更為接近，僅是化合物3中C_8的化學(xué)位移值S86.2(C-8)在化合物5中向低場位移至S87.2(C_8)。根據(jù)核磁數(shù)據(jù)推測化合物5與3結(jié)構(gòu)相同，僅立體構(gòu)型不同，與文獻(xiàn)[11]對比，肯定了這種推測，確定化合物5為右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇一P_0_4'—豐公禾白醇基鵬，艮卩(+)_thero_gimiacylglycerol_P_0_4'—coniferyether。核磁數(shù)據(jù)見表2。表2化合物3、4和5的^NMR(400MHz，CD3OD)和13CNMR(100MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)Compound.3(inCD3OD)Compound.4(inCD3OD)Compound.5(inCD3OD)Position1134.1134.0133.82111.91H，7.01(d),/=1.8111.51H,7.00(d),7=1.8Hz111.81H,7.02(d),/=1.83148.7148.9148.84147.0147.3147.25115.71H,6.72(d),/=8.1116.01H,6.75(d),8.1Hz115.91H,6.75(d),6121.0lH,6.83(dd)，J=8.2,1.8120.81H,6.84(dd),/=8.2,1.8Hz120—81H，6-85(dd)，/=8.1,1.8774.11H，4.82(d),J=5.874.21H，4.89(d),J=6.2Hz74.11H，4.89(d)'J=5.8886.21H，4.35(m)，87.81H，4.07(dd),J=10.5,4.887.21H,4.28(m)lH，3.72(dd),7=11.8，4.1Hz1H,3.72(dd),7=11.9,4.1962.22H，3.81(o)61.862.01H,3.47(dd),7=11.8，5.0IIz1H,3.47(dd),7=11.9,5.41'133.1138.6133.22'111.41H，6.98(s)117.21H,6.68(d),^2.0Hz111.41H,7.04(d),7=1.93'151.9149.3151.84'148.9146.0149.35'118.9lH,6.86(s)119.51H，6.90(d),J=8.2Hz119.01H,6.99(d),/=8.36'120.71H,6.86(s),120.61H,6.55(dd)，/=8.2，2.1Hz120.81H,6.卯(dd),_/=8.3,1.97'131.41H,6.50(d),7=16.032.52H，2.54(t),J=7.4Hz131.41H,6.52(d),J=168'128.5lH,6.22(dt;015.8,5.835.52H，1.77(m)128.71H,6.24(dt),/=16，5.79'63.72H,4.18(d),7=5.8,1.462.32H,3.53(t),J=6.5Hz63.72H,4.19(dd)，J=5.8，1.43-OMe56.53H,3.7y(s)56.33H,3.80(s)56.63H,3.86(s)3'-OMe56.33H,3.79(s)56.43H,3.82(s)2.26化合物6黃色油狀，[a]26D10.4°(c=0.67，Me0H)。結(jié)合^NMR、13CNMR和DEPT-135確定化合物的分子式為(:2。112206，計(jì)算其不飽和度為io。在化合物6的^NMR(400MHz,inCD30D)圖譜上，低場顯示8組氫信號。根據(jù)化學(xué)位移值和耦合常數(shù)推斷含1個(gè)ABX耦合系統(tǒng)、1個(gè)四取代的苯環(huán)及1個(gè)反式雙鍵耦合。ABX12耦合系統(tǒng):S6.94(1H，d，J=1.8Hz，H_2)，S6.81(1H，d，J=8.lHz，H_5)和S6.82(1H，dd，J=8.1，1.8Hz，H-6);四取代苯環(huán):S6.95(1H，s，H-2')，S6.93(1H，s，H-6');反式雙鍵耦合S6.53(1H，d，J=15.9Hz，H-7')，S6.21(1H，dt，J=15.8，5.9Hz，H_8')。在111NMR圖譜的高場區(qū)，可以看到兩個(gè)明顯的甲氧基信號S3.86(3H，s，3-0Me)，S3.80(3H，s，3'-OMe);2個(gè)次甲基氫信號:S5.51(1H，d，J=6.3Hz，H_7)，S3.48(1H，dd，J=12.3，6.2Hz，H-8);1個(gè)連氧亞甲基氫信號S4.19(2H，dd，J=5.9，1.3Hz，H-9')以及1個(gè)被甲氧基氫掩蓋的連氧亞甲基氫信號S3.73-3.85(2H，o，H-9)?；衔?的13CNMR(100MHz，inCD3OD)圖譜給出20個(gè)碳信號，結(jié)合DEPE-135圖譜，顯示低場區(qū)有7個(gè)SP2雜化的季碳信號149.2(C-4')、S145.5(C-3')、149.1(C-3)、147.6(C-4)、134.5(C-1)、132.5(C-5')、130.3(C-1')，7個(gè)SP2雜化叔碳信號Sl32.0(C-7')、127.5(C-8')、119.8(C-6)、116.5(C-6')、116.2(C-5)、112.1(C-2')、110.5(C-2);l個(gè)連氧的次甲基碳信號l個(gè)次甲基碳信號S55.1(C-8);2個(gè)連氧的亞甲基碳信號S64.8(C-9)、63.9(C-9')以及2個(gè)甲氧基碳信號S56.7(3-0Me)、56.4(3'-OMe)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)基本一致，化合物6確定為去氫二松柏醇，即dehydrodiconiferylalcohol。核磁數(shù)據(jù)見表3。2.27化合物7黃色油狀，[a]26D17.3°(c=0.67，MeOH)。ESI-MS給出m/z383[M+Na]+，359[M-H]—提示化合物的分子量為360。結(jié)合NMR、13CNMR和DEPT-135確定化合物的分子式為(:2。112406，計(jì)算其不飽和度為9?；衔?的111NMR(400MHz，inCD3OD)圖譜，在低場區(qū)顯示一個(gè)典型的ABX耦合系統(tǒng)和一個(gè)積分值為2的單峰，ABX耦合系統(tǒng):S6.94(1H，d，J=1.8Hz，H-2)，S6.83(1H，dd，J=8.2，1.7Hz，H-6)和S6.75(lH，d，J=8.1Hz，H-5);單峰:S6.71(1H，s，H—2')，S6.71(1H，s，H-6')。在111NMR圖譜的高場區(qū)，可以看到兩個(gè)明顯的甲氧基氫信號S3.80(3H，s，3-0Me)，S3.84(3H，s，3'-OMe);此外還有1個(gè)連氧亞甲基氫信號S3.56(2H，t，J=6.5Hz，H-9');2個(gè)亞甲基信號S2.60(2H，t，J=8.0Hz，H-7')，S1.80(2H，m，H-8');2個(gè)次甲基氫信號S5.48(1H，d，J=6.2Hz，H-7)，S3.46(1H，dd，J=12.4，6.2Hz，H-8)以及2個(gè)單氫信號S3.82(1H，m)，S3.76(1H，m)?；衔?的13CNMR(100腿z，inCD3OD)圖譜與化合物6較相似，除了在低場區(qū)少了兩個(gè)烯碳而在高場區(qū)增加了兩個(gè)仲碳外，其余較接近，由此推斷化合物7是化合物6雙鍵氫化后的衍生物。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10，14]基本一致，該化合物確定為二氫去氫二松柏醇，艮卩dihydrodehydodiconiferylalcohol。核石茲數(shù)據(jù)見表3。表3化合物6和7的^NMR(400MHz，CD3OD)和13CNMR(100MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例3:指紋圖譜的建立及各化合物的指認(rèn)3.1指紋圖譜的建立取上述接骨木50X乙醇洗脫部分40mg，溶解于2mL60%甲醇-水后過ODS固相萃取柱，10mL甲醇洗脫，洗脫液蒸干后，溶于2mL甲醇，再過O.45ym濾膜，即得接骨木活性部位的供試品溶液。精密取上述供試品溶液lOi!L，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖(見圖l)。液相色譜條件為采用十八烷基硅氧鍵合硅膠為固定相；以含有0.1%醋酸的甲醇_水溶液作為流動相，梯度洗脫；流速為0.8mL/min;檢測波長為280nm;色譜柱溫度為35°C。獲得的接骨木活性部位高效液相標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有10個(gè)色譜峰，以9號峰的色譜保留時(shí)間為1.00計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為0.40±0.02(峰1)、0.55±0.02(峰2)、0.67±0.02(峰3)、0.69±0.02(峰4)、0.71±0.02(峰5)、0.73±0.02(峰6)、0.86±0.02(峰7)、0.93±0.02(峰8)、1.00(峰9)、1.02±0.02(峰10)。以去氫二松柏醇(9號峰)計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于2000。3.2各化合物的色譜峰指認(rèn)各化合物適量分別溶于甲醇中，過0.45ym的濾膜后，制得供試品溶液。參照國家藥典附錄中規(guī)定得高校液相分析方法，依次注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，分別記錄色譜圖(見圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9)，色譜條件與實(shí)施例3.l相同。從而，借助分離得到的化合物1-7作為對照品，完成了對HPLC特征圖譜中主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn)。實(shí)施例4:實(shí)施例1制得的接骨木總提物及總提物的各洗脫餾分對體外培養(yǎng)的類成骨UMR106細(xì)胞的影響以大鼠成骨樣UMR106細(xì)胞的增殖和ALP活性，評價(jià)實(shí)施例1中得到化合物的體外抗骨質(zhì)疏松活性。4.1實(shí)驗(yàn)樣品取實(shí)施例1制得的餾分，即指實(shí)施例1制得的接骨木總提物、接骨木總提物水洗脫部分、30%乙醇洗脫部分、50%乙醇洗脫部分及95%乙醇洗脫部分。4.2實(shí)驗(yàn)方法UMR106細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化分散后，以5000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，置于37°C、濕度95%、含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在10%FBS(胎牛血清)-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天后，用1%CharcoalStri卯edFBS(活性炭處理去除激素的胎牛血清)-Phenolred-freeDMEM(去除酚紅的DMEM)再培養(yǎng)1天。將實(shí)施例1中所述的餾分以Pheno1red—freeDMEM稀釋成不同濃度(0.1iig/mL、1iig/mL、10iig/mL、100iig/mL)力口入至lj96孑L板中，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，再培養(yǎng)24或48小時(shí)。17|3-雌二醇(E2，10nM)為陽性對照組，無樣品加入的細(xì)胞為正常組。4.3細(xì)胞增殖活性檢測細(xì)胞檢測細(xì)胞在藥物的作用下培養(yǎng)24或48小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗后，加入MTS/PMS試劑培養(yǎng)3小時(shí)，于490nm處測定吸光度值，以吸光度值來評價(jià)細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析，表示為mean士S.E.M.。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4各餾分對UMR106細(xì)胞增殖的影響15濃度組別((ig/niL)UMR106細(xì)胞增殖率(％)E2(10iiM)24hours48hours24hours48hours接骨木總提物0.1101.90±0.72101.S7±0.7510110.17丄0.85***99.37土0.47110.55±0.60***110.41士0.83***106.44±0.95**102.40士0.6710096.92±0.69103.00士1.65水洗脫部分0.1120.66土0.81***124.44上1.69***120.55±0.59***128.60士4.38**1122.49士10113.58±0.85***114.77±0.70***100111,30±0.75**103.90士0.65**30%乙醇洗0.1雨.21±1.03106.61土1.60脫部分103.65±1.01109.53士1.29120.55士0.59**128.60±4.38***10117.58±2.56"127.30士2.50***100121.5S±0.66***138.57土4.12禱50%乙醇'洗0.1125.68±2.46***155.23±2.33***120,54士0,51***128.60士4.38***脫部分1114.73士0.15***152.48士2.55,10142.02土2.14*"10092.69士0.19118.35士3.06幽95%乙醇洗0.197.11±0.44105.09士1.49120.55士0.59*襯128.60士4.38***脫部分1100.76士0.6295.88±1.031097.56士0.3594.91±1.5810044.86±0.76,42.04士0.72***注與正常組比較，**P<0.01，***P<0.001結(jié)論與正常組比較，接骨木總提物在1Ug/mL時(shí)對細(xì)胞的增殖有顯著性的差異，而水洗脫部分及50%乙醇洗脫部分在0.1ug/mL即較正常組有十分顯著的差異，且50%16乙醇洗脫部分表現(xiàn)出更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，提示總提物中的活性成分大多被富集到50%乙醇洗脫部分。4.4細(xì)胞ALP活性檢測ALP活性檢測ALP(alkalinephosphatase)，堿性磷酸酶，成骨細(xì)胞分化的一種酶，也是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，通過分解磷酸酯，增加局部無機(jī)磷的濃度，從而促進(jìn)骨基質(zhì)的鈣化[15]。細(xì)胞在藥物作用下培養(yǎng)24小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，3個(gè)復(fù)孔各加入20iiL裂解液，5個(gè)復(fù)孔加入100iiLALP試劑(4-NPP)，96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15、30、45分鐘，405nm測定ALP吸收值，595nm測定蛋白的吸收值。ALP活性以單位蛋白堿性磷酸酶活性的變化率來表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析，表示為mean士S.E.M.。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5各餾分對UMR106細(xì)胞ALP活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，微P<0.001結(jié)論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與正常組比較，接骨木總提物在0.1g/mL表現(xiàn)出顯著性差異，而30%乙醇洗脫部分及50%乙醇洗脫部分在該濃度可以極其顯著的促進(jìn)細(xì)胞的分化，且50%較30%乙醇洗脫部分的活性更強(qiáng)。綜合體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，無論對細(xì)胞的增殖還是ALP活性，50%乙醇洗脫部分都表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性。實(shí)施例5:接骨木總提物及總提物的各洗脫餾分對去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠的影響5.l實(shí)驗(yàn)樣品及試劑實(shí)施例1制得的各餾分，即指實(shí)施例1制得的接骨木總提物、接骨木總提物水洗脫部分、30%乙醇洗脫部分以及50%部分(由50%及95%乙醇洗脫部分合并而成)。1713-雌二醇(Sigma，USA)5.2實(shí)驗(yàn)動物清潔級C57BL/6J小鼠，雌性，3月齡，購自于香港中文大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。5.3實(shí)驗(yàn)方法分組及給藥小鼠乙醚麻醉后俯位固定，在背部脊柱處切口，于無菌條件下摘除雙側(cè)卵巢作為骨質(zhì)疏松癥模型小鼠，假手術(shù)組背部脊柱兩側(cè)切口后再縫合作為對照。手術(shù)后恢復(fù)兩周，存活下來健康的小鼠55只，隨機(jī)分為7組，分別灌胃給予以下藥物。小鼠每天給予雙蒸水和去除雌激素的鼠糧(AIN93M)。假手術(shù)組(Sham，n=8)0.1%乙醇水10mL/Kg體重/d病理模型組(OVX，n=8)0.1%乙醇水10mL/Kg體重/d陽性對照組(0VX+E2，n=8)17P-雌二醇3.2mg/Kg體重/d受試藥組接骨木總提物(0VX+SWT，n=7):lg/Kg體重/d水洗脫部分(0VX+SWA，n=8):570mg/Kg體重/d30%乙醇洗脫部分(0VX+SWB，n=8):128mg/Kg體重/d50%+95%乙醇洗脫部分(0VX+SWC，n=8):189mg/Kg體重/d5.4對小鼠子宮重量的影響連續(xù)灌胃給藥三個(gè)月后，小鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血后，摘出子宮，迅速稱重，計(jì)算子宮臟器系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析，表示為mean士S.E.M.。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6及附圖10。表6各餾分對小鼠子宮系數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注與模型組比較，***P<0.001結(jié)論小鼠去卵巢后，病理模型OVX組與假手術(shù)Sham組比較，子宮系數(shù)顯著下降，表明造模成功。與OVX組比較，雌激素組使子宮指數(shù)急劇的增加，可以看出雌激素的副作用非常顯著。與OVX組比較接骨木各餾分子宮系數(shù)與模型組無差異，說明接骨木各餾分無雌激素樣副作用。5.5骨密度及骨容積的測定小鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血后，取出小鼠左側(cè)的股骨和脛骨，剔除肌肉和軟骨，用浸潤了PBS的紗布包好，采用Micro-CT技術(shù)測定股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端的骨密度及形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)骨容積(BV/TV)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)T檢驗(yàn)分析，表示為mean士S.E.M.。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表7、圖ll及圖12:表7各餾分對小鼠股骨及脛骨骨密度及骨容積的影響組別股骨脛骨骨密度(mg/ccm)骨容積(BV/TV)骨密度(mg/ccm)骨容積(BV/TV)Sham119.20±16.00*0.043±0.008*119.81±16.71*0.039±0.001*OVX69.35±3.660.018±0.00457.23±5.980.023±O扁E2168.24±11.85***0.074±0.006***176.72±9.34***0.071±0馬***SWT117.50±6.14***0.041±0.006*123.10±6.62,0.045±0,004**SWA105.79±2.68***0.037±0.003**102.76±6.39*0.037±0.002*SWB86.59±8.780.029±0.00281.71±8.750.035±0.002SWC124.00±10.63**0.043±0.004**113.17±5.94***0.046±0.003**注與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，微P<0.001結(jié)論Micro-CT掃描結(jié)果表明，模型組大鼠股骨及脛骨骨密度與假手術(shù)Sham組比較明顯降低。與OVX組比較，SWT(接骨木乙醇總提物)、SWA(水洗脫部分)及SWC(50%+95%乙醇洗脫部分)可以顯著的促進(jìn)股骨及脛骨的骨密度，同時(shí)可以顯著的增加骨容積。其中SWC的作用，接近或強(qiáng)于SWT。實(shí)施例6:接骨木活性部位相關(guān)制劑的制備6.1接骨木活性部位片劑的制備處方接骨木活性部位(50%乙醇洗脫部分)，20克；可壓性淀粉，20克；50%糖漿，適量；硬脂酸鎂，1%。制備方法將接骨木50^乙醇洗脫部分在6(TC-80°〇烘箱中烘干，磨成細(xì)粉過80目篩，加50%糖漿制成合適軟材，用16目篩網(wǎng)制粒，6(TC干燥，整粒(16目)，加入硬脂酸鎂混合均勻，壓片，即得。6.2接骨木活性部位膠囊劑的制備處方接骨木活性部位(50%乙醇洗脫部分)，45克；淀粉，2克；微晶纖維素，3克；75%乙醇，適量。制備方法將接骨木50^乙醇洗脫部分在6(TC-S(TC烘箱中烘干，粉碎成細(xì)粉過80目篩，6(TC干燥。按比例加入藥粉、微晶纖維素、打糊后的淀粉及75%乙醇適量，制成合適軟材，40目篩網(wǎng)制粒，7(TC烘干，整粒，60目篩去細(xì)粉，灌裝膠囊，即得。6.3接骨木活性部位口服液的制備處方接骨木活性部位(50%乙醇洗脫部分)，100克；甜菊晶，10克；苯甲酸，l克；尼泊金乙酯，0.3克；1%甲殼素稀醋酸溶液，適量。制備方法取接骨木50%乙醇洗脫部分，溶解于適量60%乙醇中，攪拌均勻，靜置于2°C-St:冷庫沉淀48小時(shí)，過濾，濾液回收乙醇，至無醇味，加入適量水及處方劑量的甜菊晶、苯甲酸、尼泊金乙酯，攪拌均勻，再加入1%的甲殼素稀醋酸溶液適量，過濾，分裝，壓蓋，IO(TC流通蒸汽滅菌30分鐘，即得。206.4接骨木復(fù)方藥酒的制備藥物組成接骨木活性部位10克，淫羊藿10克，仙茅10克，女貞子8克，熟地8克，當(dāng)歸8克，澤瀉8克，茯苓8克，白酒適量(50度以上)。制備方法將接骨木50^乙醇洗脫部分在6(TC-8(rC烘箱中烘干，粉碎成細(xì)粉；將藥材仙茅、熟地、當(dāng)歸、澤瀉、茯苓切成3毫米薄的藥片；淫羊藿切成23厘米的段；女貞子粉碎。處理后的藥材按處方配比裝入布袋，置于酒壇內(nèi)，加入812倍白酒，密封，于常溫下浸泡1525天，即得。6.5接骨木牦牛骨髓骨粉的制備藥物組成接骨木活性部位(50%乙醇洗脫部分)，牦牛骨粉，香菇，杏仁，薏米，黃豆。制備方法將接骨木50^乙醇洗脫部分在6(TC-S(TC烘箱中烘干，粉碎成細(xì)粉過80目篩。香菇、杏仁、薏米、黃豆均干燥后粉碎過80目篩。接骨木50%乙醇洗脫部分、牦牛骨粉、香菇、杏仁、薏米、黃豆按i:2:i:2:3:3混合均勻，即得。實(shí)施例7:接骨木活性部位制劑對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨的影響7.1動物實(shí)驗(yàn)方法動物實(shí)驗(yàn)方法，同實(shí)施例5。組別如下假手術(shù)組雙蒸水10mL/Kg體重/d病理模型組空白片劑10mL/Kg體重/d片劑處方組接骨木活性部位片劑300mg/Kg體重/d膠囊劑處方組接骨木活性部位膠囊劑300mg/Kg體重/d口服液處方組接骨木活性部位口服液15ml/Kg體重/d藥酒處方組接骨木活性部位酒劑15ml/Kg體重/d牦牛骨髓骨粉處方組接骨木牦牛骨髓骨粉300mg/Kg體重/d7.2實(shí)驗(yàn)樣品片劑分別取空白片劑及接骨木活性部位片劑，研磨、混懸于雙蒸水中，灌胃給藥。膠囊劑分別取空白膠囊劑及接骨木活性部位膠囊劑，取出內(nèi)容物，混懸于雙蒸水中，灌胃給藥。口服液取出口服液用雙蒸水配成適宜的濃度，灌胃給藥。藥酒按照劑量灌胃給藥。牦牛骨髓骨粉取出適量的接骨木牦牛骨髓骨粉，沸水調(diào)成糊狀，灌胃給藥。7.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表8。表8灌胃給予接骨木活性部位各種制劑對小鼠骨密度的影響:0190]21組別動物數(shù)(n)股骨骨密度(rag/ccm)脛骨骨密度(mg/ccm)假手術(shù)組10115.35±4.69116.13±3.87病理模型組1055.89±5.1254.28±6.27片劑組1097.89±3.92***93.08±5.47承"膠囊劑組10120.39±6.45*"118.13±5.68***口服液組1083.91±8.02**80.08±5.47"藥酒組1075.69士8,3073.48±6.17骨髓骨粉組1064.27士5.0860.38±4.15注與模型組比較，**P<0.01，微P<0.0017.4結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)施例6制得的接骨木活性部位片劑、膠囊劑及口服液，均能顯著改善由于去卵巢所引起的小鼠股骨及脛骨骨量的流失，可以作為治療骨量流失相關(guān)疾病的藥物使用。同時(shí)結(jié)果顯示，膠囊劑對骨的保護(hù)作用最好，其次是片劑，再次是口服液。接骨木活性部位藥酒組與骨髓骨粉組對骨的作用雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卻表現(xiàn)出抑制骨量流失的趨勢，可以作為預(yù)防骨質(zhì)疏松的保健品應(yīng)用。實(shí)施例8:接骨木活性部位及其制劑主要活性成分的含量測定取接骨木活性部位片劑20片，研磨后稱取40mg，溶解于2mL60%甲醇-水后過ODS固相萃取柱，10mL甲醇洗脫，洗脫液蒸干后，溶于2mL甲醇，再過O.45iim濾膜，即得接骨木活性部位片劑的供試品溶液。分別取接骨木膠囊內(nèi)容物和牦牛骨髓骨粉各40mg，用與上述相同的方法制得接骨木膠囊劑和牦牛骨髓骨粉的供試品溶液。分別取接骨木口服液和藥酒各4mL，蒸干后，溶解于2mL60%甲醇-水，用與上述相同的方法制得接骨木口服液與酒劑的供試品溶液。采用實(shí)施例3.1中所述液相條件進(jìn)行液相分析。參照2005版藥典附錄中高效液相法項(xiàng)下含量測定中的面積歸依化法計(jì)算各化合物的含量，含量測定結(jié)果如下表9接骨木活性部位及其制劑中各活性成分的含量化合物活性部位(%)片劑(%)膠囊劑(%)口服液(%)酒劑(%)牦牛骨髓骨粉(％)含量范圍(%)12.903.103.742.641.040.540.5-5.023.235.437.823.021.380.730.5-10.022<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>目前幾乎沒有市售的療效好、副作用小且價(jià)格相對較低的用于治療絕經(jīng)后骨相關(guān)性疾病的藥物，本發(fā)明提供了一種接骨木活性部位提取物，結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明了該活性部位對子宮無副作用且對骨有很好的保護(hù)作用，同時(shí)應(yīng)用該活性部位制備了多種劑型，為充分的開發(fā)、研制絕經(jīng)后骨保護(hù)作用的藥物及保健品提供了依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1]ConsensusDevelopmentConference.Prophilxisandtreatmentofosteoporosis[J]AmJMed，1991,90:107—110[2]Healthageingpracticalpointersonkeepingwell.WorldHealthOrganizationRegionalOfficeforthewesternpacific.2005[3]田秦杰.婦女絕經(jīng)后相關(guān)問題的處理.臨床藥學(xué)雜志.2004，2(3):47_50.[4]楊聞，楊述華.骨質(zhì)疏松癥的病因與骨折發(fā)病率調(diào)查研究.中國中醫(yī)骨傷科雜志2003,11(2):49-51[5]MaaritPiirtola，TeroVahlberg，MinnaLo"ppo"nen，etal.Fracturesaspredictorsofexcessmortalityintheaged_Apopulation—basedstudywitha12-yearfollow-up.EurJEpidemiol.2008，23:747-755[6]GeorgeIoannidis，AlexandraPapaioannou，WilmaM.Hopman，etal.Relationbetweenfracturesandmortality:resultsfromtheCanadianMulticentreOsteoporosisStudy.CMAJ.2009，181(5):265-271[7]趙燕玲，潘子昂，王石麟等.中國原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué).中國骨質(zhì)疏松雜志.1998,4(1):1-5「81接骨木百科.htto:〃baike.baidu.com/view/192551.htm[9]徐志紅，劉星楷，徐光升.蛇葡萄根化學(xué)成分的研究.中國中藥雜志.1995，20(8):484-512[10]楊序娟.接骨木中抗骨質(zhì)疏松活性成分的研究.中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫2005[ll]TakeshiKatayamaYukiKado.Formationofopticallyactiveneolignansfromachiralconiferylalcoholbycell—freeextractsofEucommia23ulmoides.TheJapanWoodResearchSociety.1998.44:244-246[12]Cutillo，F(xiàn)rancesca;D'Abrosca，Brigida;DellaGreca，Marina;Fiorentino，Antonio;Zarrelli，Armando.LignansandneolignansfromBrassicafruticulosa:effectsonseedgerminationandplantgrowth.JournalofAgriculturalandFoodChemistry(2003)，51(21)，6165-6172.[13]韓美華，楊秀偉，鐘國躍，張明.鮮半夏中抑制腫瘤壞死因子-a產(chǎn)生的活性成分.中國中藥雜志.2007,32(17):1755-1759[14]Chin，Young-Won;Chai，Hee_Byung;Keller，WilliamJ.;Kinghorn，A.Douglas.LignansandOtherConstituentsoftheFruitsofEuterpeoleracea(Acai)withAntioxidantandCytoprotectiveActivities.JournalofAgriculturalandFoodChemistry(2008)，56(17)，7759-7764.[15]薛延.骨質(zhì)疏松癥的生化診斷.中國骨質(zhì)疏松雜志，1995，1(1):58-62。權(quán)利要求一種用于絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病防治的接骨木活性部位，其特征是該活性部位的成分主要有7個(gè)化合物香草酸、松柏醇、左旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、右旋赤式-1-(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-甲氧苯氧基]-1，3-丙二醇、右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、去氫二松柏醇，二氫去氫二松柏醇，所述7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別是FSA00000008941600011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位，其特征是按重量百分比該活性部位由以下化學(xué)成分組成香草酸(1)0.5%-5%松柏醇(2)0.5%-10%左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-0-4'-松柏醇基醚(3)1.0%-15%右旋蘇式-1-(4羥基_3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)松柏醇基醚(5)-2-羥基苯氧基]-1，3-丙二醇(4)右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇_P-0-4'去氫二松柏醇(6)二氫_去氫二松柏醇(7)其它組分所述其它組分主要是提取過程中得到的其他苯丙素、木脂素、酚酸及糖苷類物質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位，其特征是所述接骨木活性部位的HPLC指紋圖譜包含10個(gè)主要色譜峰，其中7個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)，以去氫二松柏醇(峰9)的保留時(shí)間為l計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為0.40士0.02(香草酸)、0.55±0.02(松柏醇)、0.67±0.02(左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇_P_0_4'-松柏醇基醚)、0.69±0.02(右旋蘇式-1-(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-羥基苯氧基]-l，3-丙二醇)、0.71±0.02(右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-13-0-4'-松柏醇基醚)、1.00(去氫二松柏醇)、1.02±0.02(二氫-去氫二松柏醇)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位，其特征是所述接骨木活性部位的HPLC指紋圖譜是采用反相高效液相色譜法建立的，所述反相高效液相色譜法的條件是以十八烷基硅氧鍵和硅膠為固定相；以含有O.1%醋酸的甲醇_水溶液作為流動相，梯度洗脫流速為0.8mL/min;檢測波長為280nm;色譜柱溫度為35°C，以去氫二松柏醇計(jì)算理論塔板數(shù)，不低于2000。5.—種接骨木活性部位的制備方法，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)接骨木干燥莖枝適當(dāng)粉碎后，用甲醇、乙醇或水，采用不同提取次數(shù)和時(shí)間，通過冷提取、熱提取或者超聲提取提取，收集提取液，將提取液減壓濃縮后得到接骨木總提物；(2)以適量水溶解接骨木總提物，進(jìn)行大孔樹脂開放柱層析，用水或30%-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，得到洗脫部分即為接骨木活性部位。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征是在步驟(1)中用10倍量的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，在步驟(2)中用50%乙醇洗脫。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是藥學(xué)上可接受的劑型，所述劑型包括但不限于片劑、膠囊劑、口服液。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的食品或食品添加劑中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位，與一種或多種具有緩解或改善骨相關(guān)疾病的藥物、傳統(tǒng)中藥、天然產(chǎn)物及適當(dāng)?shù)乃幬镙o料混合，在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接骨木活性部位，與一種或多種具有緩解或改善骨相關(guān)疾病的藥物、傳統(tǒng)中藥、天然產(chǎn)物混合，在制備緩解及改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病的食品與食品添加劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有改善絕經(jīng)后骨量丟失作用的接骨木活性部位，其化學(xué)成分明確，主要含有7個(gè)化合物香草酸、松柏醇、左旋赤式愈創(chuàng)木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、右旋蘇式-1-(4羥基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羥丙基)-2-羥基苯氧基]-1，3-丙二醇、右旋蘇式愈創(chuàng)木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、去氫二松柏醇，二氫去氫二松柏醇。該活性部位能夠顯著改善去卵巢小鼠的骨質(zhì)流失，提高股骨及脛骨骨密度，增加骨容積，且不增加子宮重量，是一種安全有效地緩解和改善絕經(jīng)期婦女骨相關(guān)疾病各種癥狀的成分。本發(fā)明的有益效果是提供了一種接骨木活性部位，可用于制備具有防治絕經(jīng)后骨相關(guān)疾病作用的藥物、食品或食品添加劑。文檔編號A61K36/35GK101773490SQ20101010372公開日2010年7月14日申請日期2010年1月25日優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日發(fā)明者姚新生,戴毅,肖輝輝,黃文秀申請人:香港理工大學(xué)深圳研究院;暨南大學(xué)