專利名稱：酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用酶工程技術(shù)酶解海洋扇貝、四角蛤、牡蠣等海洋貝類，制備免疫增
強(qiáng)肽的技術(shù)方法，屬于應(yīng)用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫是機(jī)體對病原微生物侵襲的防衛(wèi)功能及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定一清除衰老、死 亡、受傷細(xì)胞和監(jiān)視、清除突變細(xì)胞的功能，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或障礙時，將會發(fā)生重癥 感染、腫瘤和肌體早衰等。隨著人們對疾病治療觀念的轉(zhuǎn)變，治療的重點已經(jīng)由直接殺傷 外源性病原體轉(zhuǎn)向調(diào)整生物機(jī)體自身功能，從而免疫增強(qiáng)劑在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān) 注，免疫增強(qiáng)劑的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域之一，尋找天然的免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng) 機(jī)體免疫是當(dāng)今腫瘤治療的重要而有效的途徑。 多數(shù)海洋貝類提取物的抗腫瘤活性與其免疫增強(qiáng)活性相關(guān)，即通過增強(qiáng)機(jī)體免疫 能力而達(dá)到抑制和消除腫瘤的功效。目前人們已經(jīng)從海洋貝類動物中發(fā)現(xiàn)了多種有抑瘤作 用的物質(zhì)。如從文蛤(Meretrix meretrixLin-naeus)中提取的蛤素(mercenene)對月中瘤禾口 白血病有預(yù)防和抑制作用；從蝦夷盤扇貝(Patinopecten yessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)分離的扇貝多肽，糖蛋白都有抗癌作用。從紫貽貝(Mytilus edulis)和地中海 貽貝(Mytilusgalloprovincials)中分離出的多種抗菌肽防御素(defensin)、貽貝素 (mytilin)、貽貝肽(myticin)和貽貝霉素(mytimycin)，皆為小分子肽。
活性肽的抗腫瘤作用大多是通過增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能、促進(jìn)細(xì) 胞活性因子生成、抗自由基與輻射損傷、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡及直接作用于腫瘤細(xì)胞等多種機(jī) 制而實現(xiàn)的。運用生物技術(shù)手段從大量的蛋白資源中酶解獲取新的免疫增強(qiáng)肽，這是在功 能肽的研究與開發(fā)過程中解決肽源問題、實現(xiàn)海洋水產(chǎn)品綜合利用的一個可行的現(xiàn)實途 徑。如公開號為CN1660888的中國專利，公開了利用枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)從中國毛蝦的蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化出新的具有六個氨基酸的降壓肽，具有較 高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性。 已有報道從陸地蛋白資源的酶解物中分離到的免疫增強(qiáng)活性肽具有很好的免疫 促進(jìn)及抑制腫瘤的效果，而來源于海洋蛋白酶解產(chǎn)物的免疫增強(qiáng)肽及相應(yīng)的療效還少有報 道，海洋蛋白以其特殊性和豐富性必將成為酶解制備新型免疫增強(qiáng)肽的更大的資源庫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用酶工程和生化工程技術(shù)，酶解海洋貝 類制備具有免疫增強(qiáng)活性的酶解短肽產(chǎn)品，可用于腫瘤患者或免疫力低下的人群的康復(fù)治 療。
—種酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟如下 (1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)依次經(jīng)種子培養(yǎng)基、三角瓶
液體發(fā)酵培養(yǎng)基、罐發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，離心，取上清液，得粗酶液；
(2)取海洋貝類，去殼后，經(jīng)勻漿機(jī)(江蘇省金壇市宏華儀器廠，型號FSH-2)勻漿， 得貝類糜； (3)向步驟(2)制得的貝類糜中加入步驟(1)制得的粗酶液，添加量為每千克貝類
糜添加450， 000 550， 000活力單位的粗酶液，45 55。C酶解4 6h，然后升溫至90°C，
保溫15min滅酶活，然后降溫至7(TC，取酶解液，離心機(jī)(德國印pendorf ， 5804R)離心，濃
縮，干燥(無錫博達(dá)化機(jī)廠，QZ-5型移動式噴霧干燥機(jī))，得酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽。所述步驟(2)中的海洋貝類，選自扇貝、四角蛤或牡蠣之一或其組合。 所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基組份如下蛋白胨1%，酵母粉0.3%，葡萄糖1%，
瓊脂1. 6%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;培養(yǎng)條件28 30°C， 120rpm，搖床培養(yǎng)36小時。 所述步驟(1)中的三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕
2%，Na2HP04 0. 1%，KH2P04 0 . 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0. 1X，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接禾中
量5wt^液體種子，培養(yǎng)條件28 30°C， 180rpm，搖床培養(yǎng)36小時。 所述步驟(1)中的罐發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%，
Na2HP04 0.1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0.1%， Na2C03 0. 1%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量:
5wt^液體種子，培養(yǎng)條件溶氧DO維持在20%以上，28 3(TC，培養(yǎng)36小時。 所述步驟(3)中的活力單位定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生
成1微克酪氨酸的酶量為1個活力單位。 由上述制備方法制得的海洋貝類免疫增強(qiáng)肽。該產(chǎn)品呈金黃色略帶綠色粉末狀，
帶海洋貝類的鮮香味，易溶于水，水溶液澄清透明，略帶金黃色。 上述海洋貝類免疫增強(qiáng)肽在抗腫瘤活性與免疫增強(qiáng)活性治療中的應(yīng)用。 本發(fā)明通過利用枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)產(chǎn)生的蛋白酶對海
洋貝類進(jìn)行酶解，得到了具有抗腫瘤活性與免疫增強(qiáng)活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其
特殊性和豐富性，因此為人類研究腫瘤發(fā)病機(jī)理，研制抗腫瘤藥物，提高免疫機(jī)能提供了新
的途徑。


圖1是海洋貝類小試、中試及工業(yè)化生產(chǎn)的酶解液中貝類免疫增強(qiáng)肽的HPLC圖
譜；其中A、工業(yè)化生產(chǎn)酶解液，B、中試酶解液，C、小試酶解液； 圖2是海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)的酶解液、濃縮液及噴霧干燥樣品中肽譜的HPLC圖
譜；其中A、噴霧干燥樣品，B、酶解上清液，C、濃縮酶解液；
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。 實施例 1、粗酶液的發(fā)酵制備 (1)本發(fā)明使用的菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)。
(2)種子培養(yǎng)基及其制備采用LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母粉0. 3%，葡萄糖1%，
pH7. 2-7. 5。裝液量100mL/500mL三角瓶，28 30°C ， 120rpm，培養(yǎng)36小時。斜面固體培養(yǎng)
基添加瓊脂1.6%。
(3)三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%， Na2HP04 0.1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0.1%， Na2C03 0. 1%， pH 7. 5，裝液量50mL/500mL三角瓶， 180rpm，發(fā)酵72h，離心，上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。 (4) 5L罐發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2% ，麩皮1 % ，豆粕2% ， Na2HP04 0. 1 % ， KH2P040. 03%， CaCl2 0. l%，Na2C03 0.1%， pH 7.5。裝3. 5L培養(yǎng)基，滅菌后pH 7. 5，接種 5% (重量百分比)液體種子，溶氧D0維持在20X以上，控制培養(yǎng)溫度為28t:，發(fā)酵36h，離 心得上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。 (5)200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%， Na2HP04 0. 1%，KH2P04 0 . 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0.1%，pH 7. 5。裝150L培養(yǎng)基，滅菌后pH 7.5， 接種5% (重量百分比)液體種子，控制通氣量為5L/min，控制培養(yǎng)溫度為28t:，發(fā)酵36h， 離心得上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。
(6)蛋白酶SM98011的酶活測定 采用福林酚法，以2wt^酪蛋白為底物。用0. lmol/L的磷酸緩沖液(pH 7. 0)將酶 液稀釋合適的倍數(shù)，取lmL稀釋好的酶液，在一定的溫度下保溫2min，加入同樣溫度的底物 lmL，恒溫下反應(yīng)10min后，加入2mL 0. 4mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，在40。C下保溫15min 后，10， OOOg離心10min，取lmL上清液加入5mL 0. 4mol/L的碳酸鈉，混勻后加入lmL福林 試劑，混勻后在4(TC保溫20min，然后用722分光光度計測定660nm處的OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線 用不同濃度的酪氨酸來制定。酶活力定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生 成1微克酪氨酸的酶量為1個單位(U)。
2、免疫增強(qiáng)肽的制備
(1)海洋貝類酶解的小試工藝 將去殼鮮貝類(扇貝、四角蛤、牡蠣等)用勻漿機(jī)勻漿，稱重50g到250mL的三角 瓶中，每瓶中加入活力為2500U/mL的酶液10mL和40mL的蒸餾水，對照瓶中加入50mL的蒸 餾水，混勻，放入50°C的水浴搖床在150轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下酶解5h，然后迅速把酶解液加熱 到90°C ，保溫10min，使酶滅活。取酶解物8000g離心20min，將上清用分子量3000Da的膜 超濾(Amicon PM-3 membrane, Milllipore Co. Bediord， USA)，得至l扮子量小于3000Da的 濾過液，即為酶解液，凍干備用。 (2)海洋貝類酶解的中試及工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)工藝 IOOL罐酶解鮮貝類(扇貝、四角蛤、牡蠣等)去殼后用攪拌機(jī)勻漿，稱取40kg貝 類糜到100L的酶解罐中，然后加入500， OOOU/kg的酶液，最后用水補(bǔ)足到總體積75L，連續(xù) 攪拌，在5(TC下酶解5h，然后迅速把酶解罐加熱到9(TC，保溫15min使酶滅活。降到70°C 后，將酶解液放出，用連續(xù)離心機(jī)離心，然后經(jīng)過二級濃縮塔(恒泰化工設(shè)備廠，WZ型系列) 濃縮，將得到的濃縮液在噴霧干燥器里噴霧干燥。 10噸罐酶解將從大魚島集團(tuán)購得的牡蠣去殼后攪拌機(jī)勻漿，稱取3000kg到10 噸的酶解罐中，然后加入500， OOOU/kg的酶液，最后用水補(bǔ)足到總體積7500L，連續(xù)攪拌，在 5(TC下酶解5h，然后迅速把酶解罐加熱到90°C ，保溫15min使酶滅活。降到7(TC后，將酶解 液放出，用連續(xù)過濾機(jī)過濾(江蘇巨能機(jī)械有限公司，GXG系列多功能過濾機(jī))，然后泵入三 級濃縮塔(恒泰化工設(shè)備廠，WZ型系列)濃縮，將得到濃縮液在干燥塔里噴霧干燥。
3、免疫增強(qiáng)肽的質(zhì)量檢測
(1)海洋貝類小試、中試酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析 游離氨基酸測定方法酶解液上清(lmL)加入4%的磺基水楊酸(lmL)，混勻，靜置 30min，4°C 10， 000g離心15min。上清游離氨基酸分析在HITACHI 835氨基酸自動分析儀 上進(jìn)行。 全水解氨基酸取lmL的蛋白酶酶解液，加入等體積的6mol/L HC1，在11(TC水解 22h，然后通過真空干燥使HCl完全揮發(fā)，干燥的樣品重新溶于0. lmol/L的琥珀酸緩沖液中 (pH 2.2)。重溶的樣品在HITACHI 835氨基酸自動分析儀分析，所得結(jié)果為樣品的全水解
氨基酸。 肽含量T肽(％ ) = (W總-WFAA) /W總， 其中W總肽與游離氨基酸混合物重；WFAA :游離氨基酸重。 上述中試及工業(yè)化酶解過程中，上清液顏色橙黃，沉淀為深黃色，都帶有濃郁的鮮
香味。然后在5(TC左右經(jīng)真空濃縮得到濃縮液，酶解液被濃縮了8倍左右。最后噴霧干燥
得到粉狀制品，制品呈金黃色略帶綠色粉末狀，帶海洋貝類的鮮香味，易溶于水，水溶液澄
清透明，略帶金黃色。得到上清液中肽的含量為可溶性蛋白的58.6%。說明海洋貝類在經(jīng)
過蛋白酶SM98011酶解后的酶解產(chǎn)物絕大多數(shù)為肽類物質(zhì)。 (2)海洋貝類小試、中試、工業(yè)化生產(chǎn)的酶解產(chǎn)物的肽譜分析將海洋貝類的酶解產(chǎn)物用分子量3000 Da的膜超濾(Amicon PM_3 membrane
MillliporeCo. Bediord， USA)，得到分子量小于3000Da的濾過液。 再將超濾液用0. 22 ii m的微孔濾膜過濾，然后將濾過液上高壓液相色譜(HPLC)反 相柱進(jìn)行肽的分析。洗脫方法為前40min內(nèi)，洗脫液從95%的流動相A (含0. 1 % TFA的 蒸餾水)變化到50%流動相B (含0. 1 % TFA的甲醇溶液)，再回到95%流動相A，整個梯 度洗脫過程為60min，流速為0. 8mL/min，紫外檢測器的檢測波長為214nm。結(jié)果見圖l，從 HPLC檢測表明，雖然試驗規(guī)模不斷放大，但酶解液的肽分布基本上沒有變化，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的 規(guī)律性，為該產(chǎn)品實行規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的依據(jù)。 進(jìn)一步將海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)過程中得到的酶解上清液，濃縮液和干粉分別進(jìn)行
稀釋離心和重溶稀釋離心處理，將配制好的合適濃度的樣品溶液，用O. 22ym的微孔濾膜
過濾，然后將濾過液上高壓液相色譜反相柱進(jìn)行肽的分析，結(jié)果如圖2所示。 從HPLC檢測表明，雖然在整個海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)的過程中經(jīng)過了 5(TC高速攪
拌酶解，9(TC高溫滅酶活，高溫濃縮和噴霧干燥等條件劇烈的加工步驟，但是各部之間酶解
液中的肽分布還是保持了較好的重復(fù)性，說明劇烈的加工條件對分子量較小的肽的影響不
大，為進(jìn)一步功能評價提供了可靠的依據(jù)。 4、免疫增強(qiáng)肽的性能檢測 (1)實驗動物及細(xì)胞 普通級BALB/c小鼠，6 8周齡共63只，雌性，體重18 22g ;腹水瘤小鼠2只。 YAC-1細(xì)胞系。 (2)分組及給藥劑量 63只BALB/c小鼠置于密封特殊動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后平均分成7個組，分別 為空白對照組，低劑量組(灌胃劑量250mg/kg)，中劑量組(500mg/kg)，高劑量組(1000mg/ kg)，粗品組(未經(jīng)超濾粗樣1000mg/kg)，陰性對照組(灌胃生理鹽水25mL/kg)，陽性對照組(腹腔注射環(huán)磷酰氨20mg/kg)。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰氨2日 一次，每次0. 2mL ;其 它組灌胃牡蠣酶解液每日一次，一次0. 5mL，連續(xù)給藥14天。
(3)瘤種準(zhǔn)備及接種 除正常對照組，其他小鼠提前一天接種鼠肉瘤細(xì)胞株S180。腫瘤移植要求在無菌 條件下進(jìn)行。將腹水瘤種鼠拉頸處死，用酒精棉球消毒其腹部皮膚，再用無菌注射器抽取腹 水，用生理鹽水稀釋5倍，混勻。用無菌注射器按0. 2mL/只接種于小鼠右前側(cè)腋下皮下，建 立實體瘤模型。整個接種時間應(yīng)盡量短，一般不超過30min以上。接完后分籠貼標(biāo)簽飼養(yǎng)。
(4)小鼠體重變化及臟器/體重比值 用電子稱稱量小鼠每日體重變化。最后拉頸處死動物，無菌條件下取胸腺、脾臟稱 重，計算臟器/體重比值。同時制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和NK細(xì)胞活性試 驗。胸腺指數(shù)-胸^^^(mg);脾臟指數(shù)=，:^^^(mg、)。
小鼠重量(g) 小鼠體重(g)
分組胸腺指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)
空白對照組0.6480士0.1143'6.0961±0.3930"*
陽性對照CTX0.5953±0.0565**5.6334士1.010(T
陰性對照組0.8154±0.07408.8186±0.3967
低劑量(250mg/kg)0.6969±0.14109.4700±1.1800
中劑量(500mg/kg)0.8665±0.01009.4267±0.7975
高劑量(1000mg/kg)L0014士0.0898'10.7345±0.7030"
粗品組0.9397±0.1937**10.2135±0.6570* *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與
陰性對照組相比顯著性P < 0. 001.(5)瘤重及抑瘤率 拉頸處死小鼠后，取瘤稱重。
抑瘤一對照組平均g重二實，g平均瘤重x酵,。
對照組平均瘤重分組瘤重(g)抑瘤率(％)
空白對照組--
陽性對照CTX*木* 0.449±0.11882.5
陰性對照組2.567±0.077-
低劑量(250mg/kg)2.393±0.1116.8
中劑量(500mg/kg)1.781±0.226**30.6
高劑量(1000mg/kg)*承* 1,335±0.06648,0 粗品組 1.922士0.216" 25.1 *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與
陰性對照組相比顯著性P < 0. 001. (6)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗 雞紅細(xì)胞懸液制備活雞心臟取血，按30U/mL雞血加入肝素鈉，用生理鹽水洗滌 2-3次后離心(2000r/min，10min)，去上清，用生理鹽水配成20X (v/v)的雞紅細(xì)胞懸液。
吞噬功能測定實驗前2天向小鼠腹腔注射3%淀粉溶液(含0. 4%臺盼藍(lán)，起標(biāo) 記作用)進(jìn)行免疫以剌激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細(xì)胞。實驗時向小鼠腹腔注射20%的雞紅細(xì) 胞懸液lmL，輕揉腹部使雞紅細(xì)胞分散。15 20min后，拉頸處死小鼠。將小鼠置于解剖盤 中，剪開腹腔，把內(nèi)臟推向一側(cè)，用吸管吸取腹腔液，滴在載玻片上，用瑞氏染液染色3min， 漂洗晾干后鏡檢。 油鏡計數(shù)巨噬細(xì)胞每張片計數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
吞隨百分率=^||||||||^畫 計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)
滿*匕教=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù) 計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)分組吞噬百分率(％)吞噬指數(shù)
空白對照組50.0 ±3.61.077 ±0.045
陽性對照CTX373 ± 1.5*0.650 ±0.036*
陰性對照組46.0 ± 1.01.130 ±0.061
低劑量(250mg/kg)45.7 ± 1.51.073 ±0.059
中劑量(500mg/kg)54.3 ±2丫0.970 ± 0.070
高劑量(lOOOmg/kg)61.0 ±3.6*1.173 ±0.061
粗品組43.0 ±2.70.953 ± 0.050 *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與 陰性對照組相比顯著性P < 0. 001. (7) ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法) 脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，用鑷子將脾磨碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾，或用4層紗布將脾磨碎，用無菌Hank's液洗滌2次，每次離心lOmin (1000r/min)。然 后將細(xì)胞懸浮于lmL的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 106個/mL。
淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL， 一孔加 75 ii L100 ii g/mL的ConA液，另一孔作為對照。置5% C02， 37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培 養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0. 7mL，加入0. 7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同 時加入MTT (5mg/mL) 50 y L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入lmL酸性異丙醇，吹打 混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3 6孔作為平行樣， 用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值，以加ConA孔的OD值減去不加ConA孔的 OD值代表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。
(8)NK細(xì)胞活性測定 靶細(xì)胞的制備(YAC-1細(xì)胞)實驗前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用前以 Hank' s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 104個/mL。
NK細(xì)胞活性檢測在U型96孔培養(yǎng)板的實驗孔中分別加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞 各100 ii L，效靶比例為50 : 1 ;在效應(yīng)細(xì)胞對照孔，加入效應(yīng)細(xì)胞100 ii L和RPMI 1640液 100 ii L ;在耙細(xì)胞對照孔，加入耙細(xì)胞100 ii L和RPMI 1640液100 y L ;上述各項均設(shè)三個 復(fù)孔，于37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，然后每孔加入20 ii L MTT (5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h， 吸去部分上清，lOOii L/孔，各孔加入100% DMSO， 100ii L/孔，振蕩、溶解，10min后，在酶聯(lián) 免疫吸附測定儀上，579nm處測定光密度值(0D)。
NK細(xì)胞活性(％) =ODt—(ODs—ODe)x100%
ODt 其中0DS為實驗孔的平均0D值，0DE是效應(yīng)細(xì)胞對照孔的平均OD值，0DT是耙細(xì)胞 對照孔的平均OD值。 運用balb/c小鼠接種S180瘤種建立荷瘤小鼠模型，灌胃牡蠣酶解產(chǎn)品檢測其對 小鼠體內(nèi)S180肉瘤生長的影響。并選用單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞殺傷活性及ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力測定等幾項實驗，研究牡蠣酶解物的免疫增強(qiáng)活性。結(jié)果表明，牡 蠣酶解物對S180肉瘤生長有抑制作用，同時能提高胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、NK細(xì) 胞活性及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，對單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力無影響。實驗說明牡蠣酶解物有 增強(qiáng)小鼠免疫能力的作用。為開發(fā)牡蠣抗腫瘤活性藥物和功能性食品奠定了一定的試驗基 礎(chǔ)。
分組NK細(xì)胞活性(y。)脾淋巴細(xì)胞增殖 光吸收570 nm
空白對照組42,22 ± 12.600.6800 ±0.0735'
陽性對照CTX20.70 ± 6.76*0.1589 ±0.0868**
陰性對照組29.37 ± 8.830.5070 ±0.0558
低劑量(250mg/kg)43.64 ±9.7(f0.7084 ±0.1807
中劑量(500mg/kg)承承 51.65 ±9.690.8219 ±0.0256***
高劑量(1000mg/kg)58.35 ± 12.5(T*0.8640 ± 0.0456***
粗品組44.30 ± 12.10*0.7536 ±0.1196' *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與 陰性對照組相比顯著性P < 0. 001。
權(quán)利要求
一種酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis SM98011)依次經(jīng)種子培養(yǎng)基、三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基、罐發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，離心，取上清液，得粗酶液；(2)取海洋貝類，去殼后，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿，得貝類糜；(3)向步驟(2)制得的貝類糜中加入步驟(1)制得的粗酶液，添加量為每千克貝類糜添加450,000～550,000活力單位的粗酶液，45～55℃酶解4～6h，然后升溫至90℃，保溫15min滅酶活，然后降溫至70℃，取酶解液，離心機(jī)離心，濃縮，干燥，得酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中 的海洋貝類，選自扇貝、四角蛤或牡蠣之一或其組合。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的種子培養(yǎng)基組份如下蛋白胨1 % ，酵母粉0. 3% ，葡萄糖1 % ，瓊脂1. 6% ，余量水， pH 7. 2-7. 5 ;培養(yǎng)條件28 30°C， 120rpm，搖床培養(yǎng)36小時。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%，Na2HP04 0. 1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0. 1%， Na2C03 0. 1%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量5wt^液體種子， 培養(yǎng)條件28 30°C， 180rpm，搖床培養(yǎng)36小時。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的罐發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2 % ，麩皮1 % ，豆粕2 % ， Na2HP04 0. 1 % ， KH2P04 0. 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0. 1X，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量5wt^液體種子，培養(yǎng)條 件溶氧DO維持在20%以上，28 30。C，培養(yǎng)36小時。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強(qiáng)肽的制備方法，其特征在于，步驟 (3)中的活力單位定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生成l微克酪氨酸的 酶量為l個活力單位。
7. 由上述權(quán)利要求1制備方法制得的海洋貝類免疫增強(qiáng)肽。
8. 權(quán)利要求7所述的海洋貝類免疫增強(qiáng)肽在抗腫瘤活性與免疫增強(qiáng)活性治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶工程技術(shù)酶解海洋扇貝、四角蛤、牡蠣等海洋貝類，制備免疫增強(qiáng)肽的技術(shù)方法，屬于應(yīng)用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過利用枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis SM98011)產(chǎn)生的蛋白酶對海洋貝類進(jìn)行酶解，得到了具有抗腫瘤活性與免疫增強(qiáng)活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其特殊性和豐富性，因此為人類研究腫瘤發(fā)病機(jī)理，研制抗腫瘤藥物，提高免疫機(jī)能提供了新的途徑。
文檔編號A61P35/00GK101736064SQ20101001189
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者何海倫, 周百成, 張玉忠, 王昱凱, 陳秀蘭 申請人:山東大學(xué)