專利名稱：快速制備和使用工程化組織和支架作為個(gè)體的植入物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及方法、技術(shù)裝置和組合物以實(shí)現(xiàn)短期加工而用于制造支架形式的“靈活”植入物或移植物，所述植入物或移植物可用于治療或愈合人或動(dòng)物體中心或周邊位置中各種組織和器官的損傷和創(chuàng)傷。本發(fā)明特別涉及介由干細(xì)胞和不同的特定組織和器官修復(fù)促進(jìn)因子進(jìn)行的組織再生，所述修復(fù)促進(jìn)因子活化所述內(nèi)源或外源干細(xì)胞以分化為特定的組織細(xì)胞，從而重構(gòu)被損傷破壞的細(xì)胞的原始微環(huán)境。本發(fā)明還涉及加工的時(shí)間尺度，其如此之短以至于包括干細(xì)胞的制備及干細(xì)胞整合、干細(xì)胞的活化和定型可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成。取決于缺陷的尺寸，將加入干細(xì)胞用于大的缺陷，但其在較小的缺陷中也在局部被充分地募集?？赡芙Y(jié)合兩種細(xì)胞募集的選擇以確保數(shù)周時(shí)期內(nèi)身體內(nèi)持續(xù)的再生，直到引起組織形態(tài)和功能的完全恢復(fù)。特別地，本發(fā)明涉及新的方法，其能夠啟動(dòng)卓越的干細(xì)胞制備過程，所述過程如此之短以至于其適用于幾秒至數(shù)分鐘的時(shí)間范圍。本方法是基于體外引發(fā)小生境形成的概念，所述小生境的形成允許干細(xì)胞被引導(dǎo)用于離體/體內(nèi)和原位重構(gòu)而無需任何體外增殖或延長的培養(yǎng)過程。此新方法允許在完成體外過程后，產(chǎn)生將自發(fā)重構(gòu)為所選擇的靶組織的模板。本發(fā)明針對幾乎所有種類的人或動(dòng)物組織。本發(fā)明最后還涉及組合物和制劑、或以所述組合物涂覆的支架，所述組合物或制劑包含(i)干細(xì)胞制備物，(ii)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和(ii)促進(jìn)干細(xì)胞分化的因子， (iv)增加干細(xì)胞可獲得性的因子，和任選地(ν)通常存在于局部創(chuàng)傷環(huán)境中的因子。本發(fā)明可用于快速和安全地制備個(gè)體工程化的移植體、移植物或植入物(優(yōu)選是支架形式的)，用于快速、高質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)的組織再生。
背景技術(shù)：
植入物的組織工程化就保持無菌性而言是長而有風(fēng)險(xiǎn)的過程，這意味著從供體獲得細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，和操作這些細(xì)胞以啟動(dòng)增殖和/或分化。在增殖期后，經(jīng)常通過例如胰蛋白酶消化將細(xì)胞從臨時(shí)的附著基質(zhì)上除去，然后將其轉(zhuǎn)移到支架上，并再在此支架上培養(yǎng)。因而，此過程需要的經(jīng)常不只是數(shù)天，而是數(shù)周才有效?？焖俸驼_地制造復(fù)合3D移植體是目前本領(lǐng)域中未知的。這是基礎(chǔ)性的并且確實(shí)與現(xiàn)有的教導(dǎo)矛盾，現(xiàn)有的教導(dǎo)著重于下述細(xì)胞技術(shù)其用于增殖和分化細(xì)胞以在體外引發(fā)定型并且通過隨后將它們接種在支架上或使它們直接在這些支架上生長。預(yù)期那些細(xì)胞在體外分化。此過程經(jīng)常需要平均至少1-2周或甚至更長。第二類的教導(dǎo)使用下列方法作為細(xì)胞療法的形式將來自骨髓或血液或粗制骨髓的未分化干細(xì)胞手術(shù)中直接注射到組織中，所述組織包括例如心肌。對于修復(fù)脊髓損傷，細(xì)胞被培養(yǎng)用于增殖或者細(xì)胞來自特定的來源，例如鼻子或胚胎起源。后者具有進(jìn)入轉(zhuǎn)化或形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。源于鼻子的細(xì)胞代表相當(dāng)有感染性的收獲環(huán)境，并且在臨床上不能作為通用的解決方案而使人信服。骨髓起源的細(xì)胞正在研究中。另外的備選方案從新組織再生。預(yù)期局部的環(huán)境將最終幫助分化這些細(xì)胞。更仔細(xì)地檢查接受環(huán)境，發(fā)現(xiàn)了所述細(xì)胞在被注射到心臟中后，不分化為例如心肌細(xì)胞。在這些情況中，完全沒有報(bào)道肌肉細(xì)胞的形成。而是假設(shè)了來自經(jīng)移植干細(xì)胞的分泌活性的相當(dāng)積極的影響用于支持恢復(fù)。在此種研究中總體的效果僅僅是心臟功能4%的改善。這意味著這種微環(huán)境假說沒有實(shí)現(xiàn)組織從新形成的目標(biāo)，而只是具有輔助作用。在另一個(gè)研究中，將經(jīng)繁殖的MSC在體外繁殖后注射到去細(xì)胞的瓣膜支架中。在體外培養(yǎng)中，細(xì)胞經(jīng)歷選擇過程，實(shí)現(xiàn)了選擇具有顯著的干細(xì)胞特征(更強(qiáng)的復(fù)制)和可引起降低的體外炎癥的細(xì)胞。至今還不清楚細(xì)胞因子在此情境中可能起什么作用。然而，現(xiàn)有技術(shù)中公知，體外的分子可被用于控制多能性及誘導(dǎo)分化和定型為特定的組織。傷口愈合與炎癥應(yīng)答緊密相關(guān)。在外科手術(shù)植入人工氣管后，局部愈合的速度和質(zhì)量，存活和整合對于植入物攝入和植入的長期成功是關(guān)鍵的。在炎癥過程中，釋放細(xì)胞因子，例如維持炎癥應(yīng)答的IL-6，IL-I和TNF。然而，炎癥可以是雙刃劍，如果由于植入支架的不充分重構(gòu)使得炎癥沒有適時(shí)終止的話。組織工程中的支架重構(gòu)被設(shè)想為是相當(dāng)未知的過程，而且其引發(fā)機(jī)制或者是含糊的，或者是臨床上不可行的。常規(guī)地，細(xì)胞將被接種到所選擇的材料上，而整合到此材料中是歸因于理想的細(xì)胞增殖時(shí)間和遷移性滲透的過程。根本地，炎癥作為愈合的前提有積極的一面，對于生物植入工程而言，這需要被考
^^ ο現(xiàn)有技術(shù)沒有提供關(guān)于下列的適當(dāng)教導(dǎo)移植植入物后控制微環(huán)境用于可持續(xù)的重構(gòu)，移植后分化未分化的細(xì)胞和感應(yīng)傷口區(qū)的干細(xì)胞，而且沒有適當(dāng)?shù)亟虒?dǎo)體外增殖后經(jīng)移植的細(xì)胞的分化以實(shí)現(xiàn)真正的無疤痕愈合。已顯示此類預(yù)增殖活化癌基因。這是由下述引起的暴露于人工環(huán)境以及也可能暴露于不成為傷口修復(fù)和重構(gòu)的正?？刂茩C(jī)制的基礎(chǔ)的繁殖循環(huán)的重復(fù)。這種人工情形當(dāng)然與受傷和損傷后身體的再生能力不一致。在人中活化干細(xì)胞和干細(xì)胞的定型要求完全控制增殖而同時(shí)防止癌基因的活化時(shí)。這些要求被認(rèn)為是強(qiáng)制性的，而且常規(guī)教導(dǎo)中對它們的忽視可引起體外細(xì)胞過程當(dāng)前技術(shù)的最嚴(yán)重和有害的缺點(diǎn)，所述當(dāng)前技術(shù)由于這些原因不可避免地不僅相當(dāng)復(fù)雜而且是危險(xiǎn)的。其它的備選方案代表了僅注射干細(xì)胞，這在另一方面不是解決方案，因?yàn)榧?xì)胞的接受位點(diǎn)是高度可變的并且從細(xì)胞和支架移植者的方面來看不是完全可控制的。在至今所報(bào)道的所有情形中，當(dāng)更仔細(xì)地觀察時(shí)，干細(xì)胞沒有完全實(shí)現(xiàn)其引起適當(dāng)?shù)膹男陆M織形成的原始目標(biāo)。因此，需要在移植后和在移植時(shí)控制干細(xì)胞的多能性。過去的教導(dǎo)而是著重于在移植之前對多能性的控制。還存在對于避免細(xì)胞培養(yǎng)過程的需要，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程可能試圖控制細(xì)胞分化，但是顯示出對細(xì)胞有害的人工副條件并且也是不經(jīng)濟(jì)的。關(guān)于移植物的質(zhì)量和功能性方面，在實(shí)施以前的方法時(shí)是很大的問題。因此，需要取消所有這些限制的方法。進(jìn)行本發(fā)明正是為了克服所述的問題，以及為了提供快速工程化動(dòng)物或人體的氣道組織和瓣膜以及一般而言所有組織的實(shí)用方法。
發(fā)明概要
為了解決細(xì)胞培養(yǎng)或“盲目”細(xì)胞移植的問題，本發(fā)明提供了新的方法和途徑用于同時(shí)控制干細(xì)胞分化，植入物的離體快速制備過程和由外科醫(yī)生在體內(nèi)植入這些經(jīng)預(yù)處理的植入物。這全部可通過選擇特定的靶(根據(jù)本發(fā)明經(jīng)特定處理的干細(xì)胞)而實(shí)現(xiàn)。已發(fā)現(xiàn)通過使內(nèi)源或外源的干細(xì)胞或其祖細(xì)胞暴露于天然微環(huán)境的條件下，可以在受傷組織和人工或天然支架中將它們活化。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)較大的損傷發(fā)生時(shí)，所述微環(huán)境被破壞。在這種情況中，必需的細(xì)胞和因子在受損傷組織的局部環(huán)境中缺失，或喪失了其活性或效力。根據(jù)本發(fā)明，如果將待再生或修復(fù)的組織或各組織支架或基質(zhì)暴露于必需的細(xì)胞和組織修復(fù)支持因子，所述微環(huán)境可被保持。在此情況中，通常被分泌到傷口中的內(nèi)源性因子(例如細(xì)胞因子或其它炎癥因子)可輔助和促進(jìn)這一組織修復(fù)過程。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)， 干細(xì)胞、優(yōu)選CD90陽性干細(xì)胞，在這里起重要的作用。然而，這些干細(xì)胞需要就其特異性分化能力被活化，從而生成新的特定組織而沒有形成疤痕或其它不希望的效果。可根據(jù)本發(fā)明用數(shù)個(gè)不同的因子原位活化干細(xì)胞，所述因子支持受傷組織最佳微環(huán)境的實(shí)現(xiàn)和保持，因而促進(jìn)局部再生的特定組織的改善的分化和生長。如本發(fā)明中所定義的第一組支持因子是干細(xì)胞或其祖細(xì)胞，其具有分化成為任何類型的組織細(xì)胞(包括神經(jīng)和淋巴組織的細(xì)胞)的能力。這些因子被稱為“細(xì)胞因子”。根據(jù)本發(fā)明，這些干細(xì)胞或其祖細(xì)胞可受到外周血單核細(xì)胞(PBMC)、CD90陽性細(xì)胞，或CD45 陽性細(xì)胞的輔助。第二組以此方式起作用的支持因子是刺激干細(xì)胞和加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子。這些因子被稱為“加強(qiáng)因子”。這些因子不是技術(shù)人員通常所理解的生長因子。本發(fā)明優(yōu)選的加強(qiáng)因子是促紅細(xì)胞生成素(EPO)。第三組根據(jù)本發(fā)明的支持因子被命名為“定型因子”，其支持干細(xì)胞的分化。用于本發(fā)明的軟骨分化的優(yōu)選的定型因子是TGFii的組合使用。第四組根據(jù)本發(fā)明的支持因子增加干細(xì)胞的可獲得性，這意味著在組織損傷的周邊和局部環(huán)境中均增加干細(xì)胞的數(shù)目，所述因子被稱為“募集因子”。本發(fā)明優(yōu)選的募集因子是G-CSF。第五組根據(jù)本發(fā)明的支持因子被命名為“許可因子”。這些因子(例如細(xì)胞因子) 通常已經(jīng)存在于具有局部創(chuàng)傷的組織中，或者在伴隨局部組織損傷的炎癥過程中被內(nèi)源性地分泌。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，第一，第二，第三和第四組的因子根據(jù)本發(fā)明中是強(qiáng)制性的， 并且必須通過外源應(yīng)用被遞送至組織損傷的位置或被遞送至為了移植到受傷的組織中而提供的支架處。所述許可因子可任選地被施用。根據(jù)本發(fā)明，干細(xì)胞的移植或?qū)?nèi)源干細(xì)胞活化的誘導(dǎo)伴隨著暴露于一系列因子。這些因子中沒有一個(gè)單獨(dú)允許完成引起無疤痕愈合和重構(gòu)的一系列事件。然而，它們是重要的加成物，彼此之間協(xié)調(diào)作用，以控制細(xì)胞的多能性。那些因子的獲得可以至少三種變化方式進(jìn)行A)在細(xì)胞施用期或細(xì)胞活化期中加入(例如，作為凍干物以避免稀釋干細(xì)胞骨髓濃縮物)B)在生產(chǎn)期中加入到支架上。優(yōu)選的方式是在生產(chǎn)支架的過程中整合及整合到材料中。這可以通過例如，在所述因子的凍干程序中與支架基質(zhì)(例如膠原，脫乙酰殼多糖，血液和血液成分)一起加入到生物支架中，或在電紡過程中加入到生物支架中，優(yōu)點(diǎn)是復(fù)雜的形成和結(jié)合、以及非損傷性的使用方式、 良好的存儲能力C)使用理想的自體取代物。許多這些因子，特別是定型因子存在于健康組織中。優(yōu)選的是將小的活檢組織粉碎并將它們分布在干細(xì)胞濃縮物中的干細(xì)胞涂覆中的技術(shù)。與血小板的濃度相結(jié)合，粉碎的結(jié)果(例如來自軟骨，半月板，腱，皮膚，心臟，括約肌組織，瓣膜或主動(dòng)脈組織及實(shí)際上任何其它組織的片段)代表了重要的引發(fā)事件，并且對于分離地使用單獨(dú)的因子而言，是有價(jià)值的備選和/或附加?，F(xiàn)在，它們并不全都是臨床上可用的，為了臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步的開發(fā)。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，使用了模擬受傷的特定組織的天然或合成的支架。所述支架材料作為催化最終產(chǎn)生待生成組織的基質(zhì)的過程的拷貝。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，此支架材料含有待生成的個(gè)體特異性組織，所述組織是通過活組織檢查而取自經(jīng)受損傷或組織缺陷的患者的。用上述因子(包括“細(xì)胞因子”)在體外或離體對所述支架進(jìn)行涂覆，或部分地或選擇性地加載支架。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，用這些因子和任選地來自患者的個(gè)體特異性組織對支架的處理發(fā)生在手術(shù)中，這意味著與患者的外科手術(shù)在時(shí)間上是相接的。優(yōu)選地，在將所述因子和支架相組合之前，所述因子和/或支架根據(jù)本發(fā)明被預(yù)處理過。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，將上述因子直接帶到患者中受傷或有缺陷的組織處，而不用經(jīng)特定因子組合預(yù)處理的單獨(dú)的人工或天然支架。在此情形中，所述因子優(yōu)選地被配制為凝膠或膠組合物，所述凝膠或膠組合物被填充到組織缺陷或傷口中以將其密封。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是，完全消除了對干細(xì)胞增殖和移植之前的預(yù)分化的需要。此外，達(dá)到了植入物的最佳質(zhì)量，正如由重構(gòu)后的形態(tài)和功能所衡量的。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是定型因子的位點(diǎn)特異性作用模式，這避免了全身性的副作用。根據(jù)此教導(dǎo)，是許可因子的局部存在與加強(qiáng)因子的外源性施用一起允許了進(jìn)行極其快速的移植物制備。本發(fā)明的其它結(jié)果是所使用的支架的重構(gòu)比以常規(guī)方式制備的對照更快和更有效40-50 %。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，在用于植入的相同期間或手術(shù)中獲得干細(xì)胞。本發(fā)明如此根本，以至于它允許了克服關(guān)于缺陷修復(fù)和組織替代的速度、質(zhì)量和尺寸的發(fā)展障礙。它允許在不能被身體修復(fù)的情況下形成新組織和修復(fù)，且允許實(shí)現(xiàn)在人或動(dòng)物體中通常不發(fā)生的現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的根本性對于所有種類的所有人和動(dòng)物組織開放所有必要的應(yīng)用，因?yàn)樗赜谕ㄟ^在否則不能被正常或人工修復(fù)的疾病狀態(tài)中誘導(dǎo)有利的傷口愈合條件而對所有組織有效的基礎(chǔ)平臺技術(shù)。應(yīng)用領(lǐng)域包括所有下述疾病狀態(tài)伴有局部缺血，炎癥和尺寸使得其不能自發(fā)愈合或?qū)a(chǎn)生疤痕組織(如果將發(fā)生閉合的話)的缺陷。疤痕組織是不能再承擔(dān)正?；蛟冀M織功能的低質(zhì)量缺陷愈合的象征。這對于身體內(nèi)的任何組織都是重要的。本發(fā)明可用于治療例如，脊髓損傷，或?qū)⒈徊迦胍杂先嘶騽?dòng)物體的中央或周邊位置中斷開的，受傷的或受創(chuàng)傷的神經(jīng)組織。它涉及自體植入物的制備，干細(xì)胞信號傳導(dǎo)以誘導(dǎo)特定移植物的組織重構(gòu)，但不限于這些組織，因?yàn)樗部梢詰?yīng)用于其它神經(jīng)組織(神經(jīng)，脊髓，腦中風(fēng)，腦創(chuàng)傷)，皮膚，眼睛，角膜，肌肉(心臟，括約肌組織，骨骼肌，血管組織肌肉)，血管系統(tǒng)(靜脈，動(dòng)脈，毛細(xì)血管)，皮膚，淋巴組織，膀胱，尿道，陰莖，卵巢，以及氣管， 心臟瓣膜，泌尿組織，骨或軟骨取代物或人體的所有其它組織。此可應(yīng)用性的原因是它作為干細(xì)胞處理的協(xié)同行動(dòng)起作用，這允許作為細(xì)胞、材料和信號傳導(dǎo)的協(xié)調(diào)互動(dòng)而實(shí)現(xiàn)修復(fù)。
根據(jù)本發(fā)明，下面的通用方案形成了利用支架實(shí)現(xiàn)完全重構(gòu)的基礎(chǔ)。此方案不限制本發(fā)明如果需要，單一的步驟可被重復(fù)，修改，省略，附加，替代或以不同的順序進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，順序步驟與裝置(自包含的生產(chǎn)移動(dòng)單元，MU)相結(jié)合。(i)以無菌的方式制備支架。該材料作為用于啟動(dòng)最終產(chǎn)生待生成的所需組織的基質(zhì)的拷貝過程的材料。所述支架可以是合成的(例如膠原織網(wǎng)(collagen fleece))或來自天然起源(例如，豬瓣膜)。(ii)通過濃縮或血沉棕黃層制備，無菌收集和制備來自適當(dāng)來源(例如外周血或骨髓)的成人/間質(zhì)干細(xì)胞(“細(xì)胞因子”)；(iii)通過濃縮或血沉棕黃層制備無菌收集源自外周血的單核細(xì)胞(PBMC)；(iv)用根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)因子(優(yōu)選ΕΡ0)孵育干細(xì)胞濃縮物，從而獲得經(jīng)預(yù)處理的干細(xì)胞。(ν)用根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)因子(優(yōu)選ΕΡ0)孵育天然或人工支架；(vi)取決于待生成的所需結(jié)構(gòu)(例如軟骨，骨，瓣膜或其它)，以擴(kuò)散或模式化的形式在體外/離體地將所收集的經(jīng)預(yù)處理的(或者任選地未處理的)干細(xì)胞整合或注射到經(jīng)預(yù)處理的(或任選地未處理的)支架內(nèi)/上。在管狀系統(tǒng)中，注射經(jīng)預(yù)處理的干細(xì)胞發(fā)生在淺表下面的區(qū)域內(nèi)/上；(vii)另外將通過個(gè)體活組織檢查從受傷的或有缺陷的患者的待再生特定組織獲得的組織細(xì)胞(例如表皮細(xì)胞)整合或注射(如(vi)中所述)到所述支架內(nèi)/上；(viii)用加強(qiáng)因子(優(yōu)選ΕΡ0)和定型因子(優(yōu)選TGFi3)和募集因子(優(yōu)選 G-CSF)，或備選地只用定型因子和募集因子，任選地介由包含所述因子的凝膠樣或膠樣組合物/制劑，孵育所述經(jīng)預(yù)處理或任選地未處理的支架；(ix)任選地，還用PBMC制備物如(viii)中所述進(jìn)行孵育；(χ)制備組織特異性片段(例如，來自接受者的粉碎的軟骨，上皮或其它)用于共涂覆植入物。(xi)如果需要，為了 GMP和自動(dòng)化需要，使用生物反應(yīng)器或閉合的設(shè)備用于以植入物支架(例如，骨，瓣膜，膠原織網(wǎng))接種和放置或混合細(xì)胞。(xii)向外科醫(yī)生提供如此制備的支架，用于植入患者受傷的或有缺陷的組織位置。(xiii)從易達(dá)到的位點(diǎn)手術(shù)中和原位涂覆植入物，以減少細(xì)胞的流失。在干細(xì)胞骨髓濃縮物中誘導(dǎo)凝結(jié)后，局部應(yīng)用細(xì)胞-凝膠。細(xì)胞凝膠含有一種或多種加強(qiáng)，定型和募集因子。步驟(i)-(ix)是根據(jù)本發(fā)明，在層流柜或各生物反應(yīng)器或閉合的設(shè)備中進(jìn)行的， 優(yōu)選與外科手術(shù)在10-30分鐘內(nèi)的時(shí)間連接中而無需細(xì)胞復(fù)制或中間轉(zhuǎn)運(yùn)(所有的都在同一手術(shù)室完成)。植入后，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，優(yōu)選用包含所有因子(根據(jù)本發(fā)明所定義的細(xì)胞因子(干細(xì)胞)，定型因子，加強(qiáng)因子，募集因子和任選地許可因子)的凝膠樣或膠樣組合物處理植入的支架。如上，在所有易達(dá)到的位點(diǎn)原位應(yīng)用所述組合物以減少細(xì)胞的流失。上述方法產(chǎn)生了再生級聯(lián)，其允許重構(gòu)原位基質(zhì)或共施用的支架。用包含所述細(xì)胞和因子的所述凝膠或膠組合物進(jìn)行的注射/整合產(chǎn)生了在體內(nèi)愈合過程中有效的、儲存的緩釋效果。注射(例如，也沒有向關(guān)節(jié)內(nèi)共施用細(xì)胞)產(chǎn)生再生級聯(lián)，其允許重構(gòu)原位基質(zhì)或共施用的支架。在本發(fā)明另外的和全新的方面，是完全尊重社會學(xué)和監(jiān)管前提的方法，所述方法是通過提供顯著加速植入物制備速度的技術(shù)，欲用于向患者進(jìn)行外科手術(shù)植入。此概念遵循人體的生物工程學(xué)原則(圖1)。植入物的制造應(yīng)當(dāng)不需要根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的2-3周， 而是可在小于1小時(shí)的若干分鐘內(nèi)進(jìn)行，以制造不同種類的所需組織。整個(gè)過程理想地在手術(shù)中進(jìn)行，并因而消除了將各細(xì)胞送到實(shí)驗(yàn)室的需要。這解決了下述限制物流，不必要的麻醉和通過此手術(shù)中植入物工程化過程可被節(jié)省的包括時(shí)間的成本。在治療患者且不離開手術(shù)室的醫(yī)生手中，該過程完全符合目前的監(jiān)管和質(zhì)量要求。因此，所述植入物不是被單獨(dú)處理的特殊產(chǎn)品，而制造植入物的過程是治療的一部分。在避免轉(zhuǎn)化和感染的風(fēng)險(xiǎn)從而提供增加的質(zhì)量方面，這是現(xiàn)存最安全的方法。待使用的根據(jù)本發(fā)明的支架能夠與重構(gòu)刺激物反應(yīng)，并且優(yōu)選地，如本領(lǐng)域內(nèi)主要已知并使用的，通過使用完全封閉的符合GMP的單次設(shè)備而制備所述支架。首先，此技術(shù)由下述事實(shí)表征通過利用和應(yīng)用上述因子而完全避免了體外細(xì)胞復(fù)制，所述因子是細(xì)胞因子(“細(xì)胞”)，加強(qiáng)因子(優(yōu)選天然存在的生物分子，例如EPO或GH)，定型因子(優(yōu)選天然存在的生物分子，例如TGFii，VEGF，激素或維生素)，募集因子(優(yōu)選天然存在的生物分子，例如G-CSF，GM-CSF)和任選地許可因子(優(yōu)選天然存在的生物分子，例如創(chuàng)傷細(xì)胞因子)。此方法的結(jié)果是快速、有效和完善地重構(gòu)缺陷性或受傷的組織，其與不使用所述刺激支持因子的各方法相比，快40-50%。本申請所呈現(xiàn)的新的生物工程技術(shù)概念得益于利用其作為共引發(fā)事件的特異性傷口修復(fù)的先天機(jī)制，以及身體形成位點(diǎn)特異性應(yīng)答的的能力，與組織的類型和位置無關(guān)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將EPO應(yīng)用于所述支架引起來自周圍區(qū)域的內(nèi)皮和平滑肌祖細(xì)胞更快速地增殖以填入支架。備選采用的技術(shù)指將正常的靶細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織片段混合到干細(xì)胞制備物中以增強(qiáng)旁分泌信號傳導(dǎo)。本發(fā)明的主題還是用于在患者中愈合受傷的，經(jīng)創(chuàng)傷的或缺陷性組織從而實(shí)現(xiàn)恢復(fù)原狀(restitutio ad integrum)的方法，其中來自待治療組織的健康細(xì)胞作為拷貝細(xì)胞，所述方法包括步驟(i)通過抽取骨髓，血液或其它組織而募集獲得自待治療患者的自體干細(xì)胞；(ii)募集圍繞或存活細(xì)胞作為共分化細(xì)胞，其獲得自缺陷性的，經(jīng)創(chuàng)傷的或受傷的組織或其環(huán)境；(iii)通過靜脈內(nèi)，皮下或局部施用向患者應(yīng)用組合物或制劑，所述組合物或制劑包含(A)步驟⑴的干細(xì)胞，(B)步驟(ii)的健康組織細(xì)胞和(C)制備物，所述制備物包含(a)至少一種刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子，(b)至少一種能夠控制和指導(dǎo)所述干細(xì)胞的分化的因子，和(c)至少一種在原位和在外周循環(huán)中均增加干細(xì)胞數(shù)目的因子?？傊?，本發(fā)明涉及下面的主題 制造個(gè)體工程化植入物的離體手術(shù)中方法，所述植入物基于作為由于患者中的組織缺陷或組織損傷而待生成的組織的拷貝基質(zhì)的天然或合成支架，所述方法包括步驟(i)提供天然或合成的支架作為組織細(xì)胞生長的支持基質(zhì)；(ii)提供從待治療患者獲得的自體干細(xì)胞；(iii)提供通過活組織檢查而從待治療的患者的缺陷性或受傷組織獲得的健康細(xì)胞作為拷貝細(xì)胞；(iv)用包含刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子的組合物孵育步驟(ii)的干細(xì)胞制備物；(ν)將步驟(iii)的細(xì)胞制備物加載或注射到支架基質(zhì)上或支架基質(zhì)內(nèi)；(vi)在步驟(iv)的經(jīng)預(yù)處理的干細(xì)胞制備物的存在下，將步驟(ν)的經(jīng)預(yù)處理的支架基質(zhì)與組合物一起孵育，所述組合物包含(a)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的天然因子，(b)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的天然因子，和(c)步驟(iv)的因子；和(vii)提供經(jīng)如此處理的支架用于由外科醫(yī)生植入到待治療的患者中，其中步驟(iv)-(vi)是在無菌條件下、在生物反應(yīng)器室或?qū)恿鞴裰小⒃?0至30分鐘的期間進(jìn)行的。 上述方法，其中用包含(a)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子，(b)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子，和任選地(C)刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子的組合物預(yù)處理步驟(ii)的自體干細(xì)胞和/或步驟(iii)的組織拷貝細(xì)胞制備物。 所述方法，其中所述刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子選自EPO和hGH，并且其中所述募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子選自G-CSF和GM-CSF，和其中所述促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子選自TGFii，VEGF，維生素C和維生素E。 所述方法，其中所述募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子是G-CSF，所述促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子是TGFii，所述刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子是 EPO。 所述方法，其中所述干細(xì)胞獲得自待治療的患者的骨髓或外周血，并且優(yōu)選地， 之前未通過單獨(dú)的過程步驟被增殖。 相應(yīng)的方法，其中步驟(Vi)的孵育步驟包括加入源自自體外周血的單核細(xì)胞 (PBMC)。 所述方法，其中步驟(iv)-(vi)與預(yù)安排患者而將支架植入到缺陷性或受傷的組織之內(nèi)或之上同時(shí)進(jìn)行。 權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的不同的因子和/或不同的細(xì)胞是通過粘性凝膠樣或膠樣制劑或組合物被提供給支架的。 通過所述方法獲得的支架用于制造植入物的用途，所述植入物用于愈合受傷的或缺陷性的組織，從而實(shí)現(xiàn)恢復(fù)原狀。 相關(guān)的用途，其中前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的不同因子和/或細(xì)胞的粘性凝膠樣或膠樣制劑或組合物被提供用于在缺陷性或受傷組織的所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處手術(shù)中原位處理新鮮植入的支架。 制備物或組合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有或沒有經(jīng)植入的特定細(xì)胞生長支持支架時(shí)治療患者中受傷的或缺陷性的組織從而實(shí)現(xiàn)恢復(fù)原狀，所述制備物或組合物包含
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(i)新鮮制備的非增殖性自體干細(xì)胞，(ii)刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子，其選自EPO和hGH，(iii)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子，其選自G-CSF和GM-CSF，*(iv)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子，其選自TGFii，VEGF，維生素C和維生
素E ο 所述用途，其中所述制備物或組合物或支架還包含來自待治療的患者的缺陷性或受傷組織的健康細(xì)胞作為拷貝細(xì)胞，以及任選地自體PBMC，優(yōu)選地用EPO和/或G-CSF和 /或TGF β預(yù)處理所述細(xì)胞。 所述用途，其中以粘性凝膠樣或膠樣制劑提供所述組合物或制備物，在所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處將所述制劑施用于或注射到缺陷性或受傷組織中；其中優(yōu)選地，所述制劑由血液，血漿或骨髓，骨髓濃縮物組成，在所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處將其施用于或注射到缺陷性或受傷組織中并通過加入Ca++或凝血酶或其它適當(dāng)?shù)木酆匣衔镎T導(dǎo)其
壞入水口 ο 相應(yīng)的用途，其中用來自待治療的患者的缺陷性或受傷組織的健康細(xì)胞并任選地用自體PBMC預(yù)處理支架，和/或其中用EPO和/或hGH預(yù)處理干細(xì)胞。 所述用途，其中在應(yīng)用支架的情形中，各細(xì)胞的制備、處理和預(yù)處理在小于1小時(shí)的若干分鐘之內(nèi)的快速過程中與外科手術(shù)同時(shí)地在手術(shù)中完成。 所述用途，其中在沒有應(yīng)用支架的情形中，各細(xì)胞和因子的組合物或制劑通過靜脈內(nèi)或皮下施用而被提供用于全身性施用；或者如果待治療的組織是可達(dá)到的，則通過直接局部施用而提供。 介由天然或合成的支架在患者中手術(shù)中制備自體細(xì)胞的方法，所述自體細(xì)胞在缺陷性或受傷的組織中誘導(dǎo)、刺激和促進(jìn)組織細(xì)胞的分化和生長，同時(shí)為了在所述患者中植入所述支架而預(yù)安排和處理所述患者，其中所述細(xì)胞是(a)來自經(jīng)受組織缺陷，組織創(chuàng)傷或組織損傷的患者的骨髓，組織或血液的自體干細(xì)胞，和(b)作為拷貝細(xì)胞的健康組織細(xì)胞，其用于涂覆待植入患者中的支架基質(zhì)，所述方法包括步驟(i)鑒定患者中的損傷位點(diǎn)；(ii)通過抽取骨髓，血液或其它組織而募集來自待治療的患者的自體干細(xì)胞；(iii)通過對來自缺陷性或受傷組織的、健康的周圍或存活細(xì)胞的活組織檢查而募集來自待治療的患者的自體組織細(xì)胞；這些細(xì)胞作為支架基質(zhì)上的模板細(xì)胞；(iv)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰?，用EPO或hGH或刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的其它因子離體處理步驟(ii)的干細(xì)胞濃縮物10-30分鐘而沒有使它們增殖，(ν)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰?，用選自ΕΡ0，hGH, GM-CSF, G-CSF和TGFi^的至少一種因子離體處理步驟(iii)的模板細(xì)胞10-30分鐘；(vi)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰?，用步驟(iv)和 (ν)的經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞離體涂覆或注射所述支架10-30分鐘；(vii)在進(jìn)行步驟(iv)至(vi)時(shí)，預(yù)安排患者進(jìn)行植入；(viii)將經(jīng)部分或完全涂覆的步驟(ν)的支架植入組織缺陷或傷口中；和任選地(ix)通過局部施用將凝膠樣或膠樣組合物或制劑應(yīng)用于所植入的支架上和植入物環(huán)境中的組織上，其中所述組合物或制劑包含步驟(ii)和(iii)的細(xì)胞及一種或多種步驟(ν)的因子。 上述方法，其中包含至少一種選自ΕΡ0，hGH，GM-CSF, G-CSF和TGF^的因子的組合物或制劑，在開始手術(shù)之前以步驟(i)全身性施用，而以藥學(xué)有效量被應(yīng)用于患者。發(fā)明詳述(A)定義如在本申請中所使用的，術(shù)語“支持因子”包含一組由下列組成的因子“細(xì)胞因子”，“加強(qiáng)因子”，“定型因子”，“募集因子”和“許可因子”。術(shù)語“細(xì)胞因子”特別地不真正涉及像生長因子等的因子，而是涉及特定的細(xì)胞， 所述細(xì)胞引起或保持了其分化為特定表型的組織細(xì)胞的能力并具有特定的生物學(xué)功能。根據(jù)本發(fā)明，非常優(yōu)選的細(xì)胞因子或細(xì)胞是所有種類的干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞或成人干細(xì)胞(例如，間質(zhì)干細(xì)胞，其例如是從外周血或骨髓細(xì)胞獲得的)。干細(xì)胞存在于所有CD90陽性的組織中。這些細(xì)胞可以通過膠原酶消化，而從皮膚，肝和心臟組織，以及大部分其它組織中分離。這些細(xì)胞不僅表達(dá)CD90，而且還表達(dá)典型地在骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的其它標(biāo)記物。然而，這些細(xì)胞不僅表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的受體，而且還表達(dá)其亞單位β-cR。 β -cR是EPO及其在⑶90+細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中重構(gòu)活性的靶標(biāo)。這表明，β -cR的共表達(dá)存在于組織(例如皮膚，脾和腎)中，其平行于生長激素受體GHR的表達(dá)。的確在所有的組織中發(fā)現(xiàn)了 β-cR的表達(dá)與GHR在一起。因此，所有表達(dá)β-cR的細(xì)胞都是根據(jù)本發(fā)明的合適的“細(xì)胞因子”。的確在所有的組織中發(fā)現(xiàn)了 β-cR的表達(dá)與GHR在一起。在圖1中， β-cR和生長激素的表達(dá)顯示在皮膚，脾和腎中，這是以舉例的方式，因?yàn)槠洳痪窒抻谶@些組織而是普通地共表達(dá)。術(shù)語“靈活的移植物”或“靈活的支架”是指高度特異性的組織模板，它感應(yīng)其被植入其中的傷口環(huán)境并相應(yīng)地利用此環(huán)境進(jìn)行反應(yīng)，以通過干細(xì)胞活化實(shí)現(xiàn)將其自身重構(gòu)為特異性的靶組織，引起高質(zhì)量的無疤痕組織的特異性結(jié)果。如在本申請中所使用的，術(shù)語“加強(qiáng)因子”描述了刺激CD90陽性細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞)上的上述受體的各(優(yōu)選天然的)生物學(xué)分子。這些“加強(qiáng)因子”的目的是增強(qiáng)重構(gòu)、 減少炎癥和活化干細(xì)胞繁殖以及防御局部缺血及其它組織損傷。除了促紅細(xì)胞生成素外， 此組因子還包括血小板生成素和HGH。這也包括下述促紅細(xì)胞生成素的衍生物和肽序列，其例如刺激促紅細(xì)胞生成素受體的β-CR亞單位、TPO的受體或生長激素受體。當(dāng)在促紅細(xì)胞生成素的存在下受到共刺激時(shí)，炎性細(xì)胞因子顯示對間質(zhì)干細(xì)胞的刺激性效應(yīng)。在此情形中，CD90陽性干細(xì)胞(成纖維細(xì)胞樣祖細(xì)胞)可以被引發(fā)而在體外被活化。單獨(dú)的促紅細(xì)胞生成素對完全分化的細(xì)胞沒有引發(fā)效應(yīng)，這意味著它不像生長因子通常所做的那樣起作用，而是根據(jù)本發(fā)明具有感應(yīng)功能，所述感應(yīng)功能將依賴于創(chuàng)傷的干細(xì)胞活化與再生性生長應(yīng)答相聯(lián)系。這意味著，在移植的時(shí)候，通過局部的傷口環(huán)境提供了位點(diǎn)特異性活化過程。人體顯然能通過引發(fā)導(dǎo)致修復(fù)的位點(diǎn)特異性應(yīng)答而對局部的創(chuàng)傷作出反應(yīng)。關(guān)于位點(diǎn)特異性修復(fù)的知識必須與創(chuàng)傷細(xì)胞因子和加強(qiáng)因子的組合活性模式相聯(lián)系。根據(jù)本發(fā)明， “加強(qiáng)因子”理想地被共移植，這是通過在制備期中預(yù)孵育細(xì)胞或通過將它們與其它支持因子一起整合(全厚度，微模式化(micro-patterning))和/或放置于用于移植的支架中。由此，所述支架成為了下述材料其可在接種時(shí)以及理想地在其存在的整個(gè)或部分時(shí)期中將信號因子釋放到細(xì)胞中。這代表了延長的釋放機(jī)制。根據(jù)本發(fā)明的合適的加強(qiáng)因子的實(shí)例是EP0，TPO和人生長激素(HGH)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“募集因子”優(yōu)選地但不限為指，在原位和外周循環(huán)中均能夠增加干細(xì)胞數(shù)目的天然生物學(xué)分子。除以手術(shù)中制備的干細(xì)胞原位加載移植物外，可額外地或備選地加入募集因子。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“定型因子”優(yōu)選地但不限為指，能夠控制和指導(dǎo)(優(yōu)選地在原位而不是體外)干細(xì)胞，其祖細(xì)胞及未完全分化的細(xì)胞的分化的天然生物學(xué)分子。根據(jù)本發(fā)明，此類因子的實(shí)例是某些激素，維生素(例如維生素C，A和E)，TGFβ和VEGF。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“許可因子”優(yōu)選地但不限為指，通常在傷口的發(fā)炎過程中存在或被產(chǎn)生的天然生物學(xué)分子，例如典型的創(chuàng)傷細(xì)胞因子。在體外，這些創(chuàng)傷分子通常是不存在的，并且可被額外地加入到由本發(fā)明的教導(dǎo)所獲得和處理過的細(xì)胞中。另一個(gè)許可因子是由局部缺血本身構(gòu)成的。這些分子和情況表明了位點(diǎn)特異性，以及在同時(shí)存在支持和定型因子時(shí)，需要并且貢獻(xiàn)許可因子用于活化干細(xì)胞。這表明了為什么此過程如此快速地誘導(dǎo)移植物的重構(gòu)，并且代表了用于實(shí)現(xiàn)移植物重構(gòu)的有力的工具盒(如果根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)同時(shí)應(yīng)用的話)。在缺乏炎性病況的慢性或退行性病況的情況中或者在沒有任何創(chuàng)傷或損傷時(shí)，根據(jù)本發(fā)明至少有兩種方式被用于實(shí)現(xiàn)全面的干細(xì)胞刺激:Α)以非常低的和優(yōu)選局部限制的方式共施用創(chuàng)傷細(xì)胞因子例如IL-1，TNF α，IL_6。這包括例如，在所用的支架中涂覆或整合。B)在不嚴(yán)重的情形(關(guān)于待再生的缺陷的尺寸)中，使用例如針、表面摩擦變紅、UV暴露、激光暴露、刀切的機(jī)械刺激引起此類許可因子的內(nèi)源性釋放。因此，此過程必須與其它因子的應(yīng)用同時(shí)進(jìn)行(在有和沒有干細(xì)胞時(shí))。根據(jù)本發(fā)明的因子的可獲得性的可能的問題可通過利用從同一患者的待生成或待愈合的組織中獲得的新鮮收獲的自體組織細(xì)胞來解決。這些組織細(xì)胞可以混合的組織片的形式被應(yīng)用，所述組織片可被加入到干細(xì)胞濃縮物或組合物中，所述干細(xì)胞濃縮物或組合物被提供用于植入，涂覆支架，或者全身性施用(單獨(dú)地或與植入一起)。每一個(gè)及所有的這些因子和它們根據(jù)本發(fā)明的用途可克服“盲目”移植到組織環(huán)境或者合成的或生物學(xué)/天然支架中的限制的問題。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“手術(shù)中”或“手術(shù)中過程”或“手術(shù)中植入物工程化過程”指下述過程其中植入物/支架的離體制備和在組織有缺陷、被創(chuàng)傷或損傷的位點(diǎn)對人或動(dòng)物體進(jìn)行的外科手術(shù)基本上平行地完成，包括為了以及時(shí)的連接離體加載所述支架而對各細(xì)胞進(jìn)行活組織檢查。那意味著關(guān)于干細(xì)胞或其它細(xì)胞的制備及其預(yù)處理的離體活動(dòng)(包括孵育支持基質(zhì)(支架))是在對有疾病的組織、器官、關(guān)節(jié)等進(jìn)行外科手術(shù)之前不久或與之同時(shí)地開始的，且最晚在植入了用如上所述的細(xì)胞和因子加載的支架后結(jié)束。此術(shù)語也包括以適當(dāng)?shù)慕M合物或制劑的形式(優(yōu)選作為凝膠或膠制劑)應(yīng)用如此獲得的或經(jīng)如此處理的細(xì)胞和因子，用于處理植入的支架和圍繞植入物的組織環(huán)境以及圍繞新鮮植入的支架的缺陷性或受傷的組織。(B)關(guān)于細(xì)節(jié)和特定實(shí)施方式的描述本發(fā)明的特征在于下列事實(shí)細(xì)胞與各種如上所述的不同因子一起被共移植。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，這些因子在原位起作用并且也在原位控制和誘導(dǎo)分化和生長。根據(jù)本發(fā)明，所述因子與支架相結(jié)合而離體和/或體內(nèi)地優(yōu)選被局部施用，并且
14同時(shí)存在或不存在外源施用的(干)細(xì)胞。也可能只應(yīng)用所述因子中的一些。此外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述因子以及各細(xì)胞(干細(xì)胞，患者的組織細(xì)胞)可被單獨(dú)地、或與優(yōu)選地經(jīng)預(yù)處理的支架/植入物一起通過全身性施用而被施用，所述全身性施用是在外科手術(shù)之前被及時(shí)地(1-5天)應(yīng)用于待治療的患者的，并開始根據(jù)本發(fā)明的過程。本發(fā)明的特征還在于，通過施用根據(jù)本發(fā)明的因子，其完全避免了進(jìn)行體外培養(yǎng)， 所述體外培養(yǎng)包括細(xì)胞(包括干細(xì)胞)的任何增殖。此實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞制備期所需的時(shí)間范圍可被縮短至數(shù)分鐘，因而消除了體外細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的缺點(diǎn)。例如果沒有體外細(xì)胞復(fù)制，風(fēng)險(xiǎn)就顯著降低和/或被消除。另一方面，此實(shí)施方式允許與暴露于加強(qiáng)因子(例如ΕΡ0)相結(jié)合，而在創(chuàng)傷(植入物位點(diǎn))處原位控制分化。本發(fā)明所述的單個(gè)因子彼此之間、以及與細(xì)胞(優(yōu)選干細(xì)胞)在創(chuàng)傷位點(diǎn)原位地相互作用這些因子被用于在移植時(shí)與祖細(xì)胞共孵育，或可被用于直接涂覆支架。因此，本發(fā)明所述的“定型因子”也可以模式化的方式被應(yīng)用于支架。在膠原或透明質(zhì)/或脫乙酰殼多糖海綿中，TGFii 1，2，或3被用于在植入位點(diǎn)引發(fā)間質(zhì)干細(xì)胞的分化。因此，促進(jìn)了加強(qiáng)和定型機(jī)制間的相互作用，引起顯著更快和質(zhì)量更高的組織再生形式。所述區(qū)別通過下列事實(shí)得到了解釋常規(guī)分化的細(xì)胞(在源自MSC (間質(zhì)干細(xì)胞)的軟骨細(xì)胞的情形中)在植入前需要2-4周來被制備。那之后，細(xì)胞松散開，植入后不必然在體內(nèi)維持其分化。本領(lǐng)域公知，通常在體外或體內(nèi)生成的軟骨在數(shù)月中去分化而成為纖維化的組織。根據(jù)本發(fā)明，高質(zhì)量的透明軟骨結(jié)果在動(dòng)物中維持至少1年(在人中相當(dāng)于5-7年)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)引起更快的制備期(完全取消了整周長的培養(yǎng))，從質(zhì)量的角度來看這是更好的(無纖維化 /疤痕)并且從生產(chǎn)的角度來看，這是更經(jīng)濟(jì)的。細(xì)胞生產(chǎn)符合GMP(良好制造產(chǎn)品條件)。在氣管支架中，例如，具有圓周形排布及寬度為3_4mm的軟骨環(huán)。在此，每幾微米就可標(biāo)記另一個(gè)分化區(qū)。因此，根據(jù)本發(fā)明的因子的組合(例如定型因子)可被用于使支架模式化。一個(gè)定型因子是例如維生素C，其可在軟骨環(huán)之間的區(qū)域中被模式化以支持基質(zhì)的合成和發(fā)展。定型因子的另一個(gè)例子是IL-15，其支持支氣管上皮的發(fā)育并且可被置于氣管支架的腔內(nèi)。正如上面概括的，加強(qiáng)因子(例如EPO或GH)根據(jù)定義是與局部的創(chuàng)傷情況協(xié)同作用的，并且以有響應(yīng)的方式向著它們反應(yīng)。為了完整性，這通過創(chuàng)傷細(xì)胞因子的表達(dá)得到了解釋，這是本領(lǐng)域已知的(J Trauma, 2008, vol. 65，n°6, pp. 1374-1378)。包括創(chuàng)傷細(xì)胞因子的這些因子在生理上存在。在患者和健康的對照中，利用酶聯(lián)免疫吸收檢測技術(shù)測定了 IL-12(p70)，和IL-18和TH2型細(xì)胞因子IL-4，IL-10和IL-11。IL-2和干擾素γ很少可檢測到。與對照相比，所有其它的介導(dǎo)因子都顯著增加了(ρ <0.05)。所有的細(xì)胞因子在創(chuàng)傷后1至2周中升高得最明顯，然后下降。其它的細(xì)胞因子包括IL-1，IL-6和TNFa， 并且支持ΕΡ0/ΤΡ0和生長激素的加強(qiáng)效應(yīng)。許可因子允許CD90細(xì)胞在EPO (加強(qiáng)因子)刺激時(shí)，在創(chuàng)傷區(qū)域產(chǎn)生無疤痕愈合。這對于，例如心臟局部缺血、脊髓損傷、軟骨修復(fù)、腱再生和所有其它組織而言是相關(guān)的，因?yàn)槠湟馕吨盎謴?fù)原狀”而不是缺陷(疤痕樣愈合)。根據(jù)本發(fā)明的因子(例如加強(qiáng)因子)的重要功能是在存在創(chuàng)傷時(shí)增加干細(xì)胞(例如⑶90陽性細(xì)胞)的表達(dá)。圖2中顯示了，⑶90+CThyl)通常存在于血管叢中。A和B在嚙齒動(dòng)物模型中顯示正常的肝實(shí)質(zhì)。如果所述組織暴露于EPCK250單位/kg體重)，⑶90+細(xì)胞的表達(dá)在對-48小時(shí)內(nèi)在所述實(shí)質(zhì)中的各處被開啟，在5-10個(gè)⑶90+細(xì)胞中達(dá)到1的峰高度。圖2(C)中還顯示了關(guān)于⑶90+，單獨(dú)的創(chuàng)傷作為病理生理病況與非創(chuàng)傷病況沒有任何差異，即所述實(shí)質(zhì)是無CD90+細(xì)胞的。B也顯示了此效應(yīng)不依賴于ΕΡ0，因?yàn)樵跊]有創(chuàng)傷時(shí)，⑶90+細(xì)胞不經(jīng)刺激而出現(xiàn)。在創(chuàng)傷的情況中，刺激結(jié)果依賴于EPO刺激⑶90+細(xì)胞表達(dá)的感應(yīng)和響應(yīng)功能(D)。此感應(yīng)功能顯示在圖2中。僅在伴隨創(chuàng)傷的病況中，使用EPO 引起CD90+細(xì)胞的表達(dá)。在所有的損傷情形中，這些細(xì)胞在輔助無疤痕或無纖維化的愈合中承擔(dān)了關(guān)鍵的作用(圖2)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)帶來了下述可能性通過共施用分子(例如GM-CSF或GSF)以增加所需位點(diǎn)處來自骨髓的MSC的可獲得性，而進(jìn)行對干細(xì)胞的同時(shí)募集。重要的是，這些細(xì)胞募集活動(dòng)是在時(shí)間上相同或重疊的條件下進(jìn)行的。局部整合再次提供了緩釋組分和使用小于200 μ g/m2身體表面的非常低的濃度的可能性。同樣在應(yīng)用外源獲得(例如收獲自骨髓或體內(nèi)的任何其它位點(diǎn))的干細(xì)胞的情況下，共施用此類募集因子確保了再生信號的維持，這在生理上不再發(fā)生于嚴(yán)重?fù)p傷病況中。根據(jù)本發(fā)明，為了完成同時(shí)相互作用和啟動(dòng)再生的網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)選地加入“募集因子” 以增加外周循環(huán)中干細(xì)胞的數(shù)目并進(jìn)行干細(xì)胞的局部募集。本發(fā)明的新穎性在于其在再生中同時(shí)的時(shí)機(jī)和功能，這與例如支架本身(植入時(shí)無細(xì)胞)和備選地植入時(shí)接種了干細(xì)胞的支架相結(jié)合。第三種備選方案是不使用支架。這在神經(jīng)疾病中是特別有利的，所述神經(jīng)疾病包括多發(fā)性硬化，中風(fēng)，阿爾茨海默病，精神病和不以完整和可持續(xù)的方式響應(yīng)單個(gè)因子(例如，ΕΡ0)的單獨(dú)刺激的神經(jīng)退行性病癥。圖3顯示了本發(fā)明的概要和起作用組分的相互作用以實(shí)現(xiàn)最大的愈合應(yīng)答。為了此目的，可將支持因子涂覆(但優(yōu)選地整合)到(進(jìn))支架材料中。這允許在對經(jīng)移植的支架的重構(gòu)過程中實(shí)現(xiàn)相伴的釋放，以在重構(gòu)過程中刺激發(fā)展中的細(xì)胞。這意味著，在移植時(shí)，由局部的創(chuàng)傷環(huán)境提供了位點(diǎn)特異性的活化過程。人體顯然能通過引發(fā)導(dǎo)致修復(fù)的位點(diǎn)特異性應(yīng)答而對局部的創(chuàng)傷作出反應(yīng)。關(guān)于位點(diǎn)特異性修復(fù)的知識必須與創(chuàng)傷細(xì)胞因子和加強(qiáng)因子的組合活性模式相聯(lián)系。本方法由取得約100至200ml的外周血(成人，兒童中為10_50ml)和離心獲得所謂的含有CD45+祖細(xì)胞的血沉棕黃層開始。備選地，可通過抽吸骨髓獲得干細(xì)胞。通過加入肝素或螯合劑，以防止抽吸物凝結(jié)的方式制備這些干細(xì)胞。可使細(xì)胞抽吸物濃縮或在誘導(dǎo)聚合后直接使用并作為生物聚合物涂覆應(yīng)用于移植物。在這種情況下，通過加入凝血酶或 Ca++誘導(dǎo)干細(xì)胞抽吸物的血液或血漿組分凝結(jié)。此外，可將基于膠原的海綿、海綿片段或膠原粉末混合到此制備物中，以增強(qiáng)聚合結(jié)果的聚合強(qiáng)度和粘力。同時(shí)，需要將此凝膠樣制備物施用到支架材料(例如氣管基質(zhì))的表面。在此情形中，干細(xì)胞凝膠大部分被施用在植入物的外側(cè)。在那之前，用TGFβ 3和促紅細(xì)胞生成素孵育干細(xì)胞。在圓周形和環(huán)樣的制備物中，將這些細(xì)胞施用于支架上。腔側(cè)和周邊位置也經(jīng)過EPO和TGF β 3的預(yù)處理(氣管)。 以此方式加入干細(xì)胞也促成了通過干細(xì)胞活化而實(shí)現(xiàn)同時(shí)增強(qiáng)移植物的血管形成。局部施用所述的各種因子產(chǎn)生相當(dāng)高的局部濃度但產(chǎn)生非常低的全身可獲得性。隨后可以常規(guī)的方式進(jìn)行全身性應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，任何移植物支架(例如，去細(xì)胞的或天然心臟瓣膜或去細(xì)胞的或天然氣管)可作為模板開始以進(jìn)行快速重構(gòu)。整個(gè)過程只需要若干分鐘或只要30-45分鐘來制備。在這個(gè)意義上，待重構(gòu)的材料變成了為結(jié)果提供拷貝信息的材料而不成為完全形成的移植物。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是，完全消除了移植之前對干細(xì)胞增殖和預(yù)分化的需要。此外， 達(dá)到了植入物的最佳質(zhì)量，正如由重構(gòu)后的形態(tài)和功能所衡量的。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是定型因子的位點(diǎn)特異性作用模式，這避免了全身性的副作用。根據(jù)此教導(dǎo)，是許可因子的局部存在與加強(qiáng)因子的外源性施用一起允許了進(jìn)行極其快速的移植物制備。備選地，可通過抽吸骨髓獲得干細(xì)胞。通過加入肝素或螯合劑，以防止抽吸物凝結(jié)的方式制備這些干細(xì)胞?？墒辜?xì)胞抽吸物濃縮或在誘導(dǎo)聚合后直接使用并作為生物聚合物涂覆應(yīng)用于移植物。在這種情況下，通過加入凝血酶或Ca++誘導(dǎo)干細(xì)胞抽吸物的血液或血漿組分凝結(jié)。此外，可將基于膠原的海綿、海綿片段或膠原粉末混合到此制備物中，以增強(qiáng)聚合結(jié)果的聚合強(qiáng)度和粘力。同時(shí)，需要將此凝膠樣制備物施用到支架材料(例如氣管基質(zhì))的表面。在此情形中，干細(xì)胞凝膠大部分被施用在植入物的外側(cè)。在那之前，用TGF3 3 和促紅細(xì)胞生成素孵育干細(xì)胞。在圓周形和環(huán)樣的制備物中，將這些細(xì)胞施用于支架上。腔側(cè)和周邊位置也經(jīng)過EPO和TGF β 3的預(yù)處理(氣管)。以此方式加入干細(xì)胞也促成了通過干細(xì)胞活化而實(shí)現(xiàn)同時(shí)增強(qiáng)移植物的血管形成。局部施用所述的各種因子產(chǎn)生相當(dāng)高的局部濃度但產(chǎn)生非常低的全身可獲得性。隨后可以常規(guī)的方式進(jìn)行全身性應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，任何移植物支架(例如，去細(xì)胞的或天然心臟瓣膜或去細(xì)胞的或天然氣管)可作為模板開始以進(jìn)行快速重構(gòu)。開發(fā)了下列示例性而非局限性的方案用于支架重構(gòu)1)以無菌方式制備支架2)將促紅細(xì)胞生成素作為無菌粉末整合到支架厚度中，以達(dá)到存儲的效果，注射3)用EP0(250IU/Kg體重)孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，時(shí)間4)用EP0(250IU/Kg體重)孵育新鮮收獲的外周血單核細(xì)胞5)推薦的是源自血液的PBMC在里面，骨髓在外面，優(yōu)選地與局部上皮島及來自健康組織的組織活檢片段相混合。6)用TGFii，副甲狀腺激素，胰島素，dex(備選地，緩釋制劑形式的納米載體，例如透明質(zhì)酸)孵育/涂覆支架7)在無菌設(shè)備中手術(shù)中接種這些細(xì)胞用于播種(旋轉(zhuǎn)或涂覆方法)。8)約45分鐘后植入。圖4圖解描述了本方法的流程以在患者中實(shí)現(xiàn)無疤痕愈合和“恢復(fù)原狀”。本技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是如果與現(xiàn)有技術(shù)相比，在無菌性、安全性、可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)性、結(jié)果的質(zhì)量和大量應(yīng)用性方面，本技術(shù)形成了目前可達(dá)到的最高標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。在無菌條件下獲得干細(xì)胞及其制備物后，直接在患者方或手術(shù)中過程中與正在進(jìn)行的醫(yī)療或手術(shù)治療平行地立即繼續(xù)所有的過程。主要的優(yōu)勢來自事件的時(shí)間順序，其避免了外部加工(extramural processing)、離開手術(shù)室、離開醫(yī)院、細(xì)胞增殖、復(fù)雜的運(yùn)輸物流(汽車，火車，飛機(jī)和其它快遞服務(wù))以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌基因活化、由人工體外培養(yǎng)條件和不需要的操作引起的細(xì)胞選擇或克隆，以及細(xì)胞去分化和感染的風(fēng)險(xiǎn)。處理可立即在潔凈房間的情況下進(jìn)行，這受益于不必離開即刻治療的區(qū)域，而在所有的手術(shù)情況中手術(shù)室都是首要的潔凈房間。這已經(jīng)提供了許多安全性和GMP優(yōu)勢。然
17后在裝備了生物反應(yīng)器、無菌容器、無菌冰、試管支架，無菌布面和預(yù)先滅菌的工具的《A類》 環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞的加工。從收獲容器中轉(zhuǎn)移干細(xì)胞濃縮物以接種已在無菌包裝中被制備的支架(例如心臟瓣膜支架，膠原海綿)。生物反應(yīng)器可已經(jīng)含有支架和各加強(qiáng)、定型或募集分子的凍干物。在第一個(gè)設(shè)備中，將以血液或骨髓或其它形式(特別是脂肪干細(xì)胞)的濃縮物提供的干細(xì)胞暴露于這些因子并儲存在冰上。同時(shí)，通過在層流下注射加強(qiáng)、定型和/ 或募集因子而制備支架。將裝有支架的生物反應(yīng)器或裝置放置在重量測定儀器上以記錄重量的增加。利用特定的軟件在線記錄此儀器。此軟件也記錄當(dāng)在后面的步驟中將干細(xì)胞濃縮物施用于支架時(shí)重量的增加。在線記錄罩內(nèi)的溫度和空氣粒子濃度，并顯示在罩旁的屏幕上。所述軟件也記錄從空氣過濾開始到方案開始的時(shí)間以確保無菌。由于清潔濾器需要最短的時(shí)間，適當(dāng)?shù)卮蜷_所述裝置。處理細(xì)胞加工的人員使用例如與服務(wù)器相連的可足控的儀器(PC，或避免對手的污染)以證實(shí)特定步驟的完成，從而允許進(jìn)行加工細(xì)胞和支架的下面的步驟。因此，所述軟件除了記錄所述過程外，還具有控制和釋放功能。這將根據(jù)圖10 的裝置轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜诟杉?xì)胞加工的自主自我控制的GMP生產(chǎn)裝置。整個(gè)過程由也將數(shù)據(jù)輸入所述軟件中的集成相機(jī)錄像記錄。對于文當(dāng)編制而言，重要的是所述過程是根據(jù)GMP規(guī)程而被遵守的。結(jié)束準(zhǔn)備過程并由從事它的特定的工作人員證實(shí)允許了釋放生物反應(yīng)器并轉(zhuǎn)運(yùn)至手術(shù)臺。在轉(zhuǎn)運(yùn)之前，所述生物反應(yīng)器/設(shè)備是關(guān)閉的或被覆蓋的，以排除來自手術(shù)室 (通常是B類或C類質(zhì)量)內(nèi)空氣的污染物進(jìn)入。當(dāng)使用離心機(jī)來制備干細(xì)胞時(shí)，所述離心機(jī)可被置于生產(chǎn)裝置之外，如果封閉的加工是可能的話。離心機(jī)和它的操作步驟同樣由所述特定的軟件記錄。在除去植入物后，清潔并凈化生產(chǎn)裝置，以為下一名患者作準(zhǔn)備。二者均同樣地由所述軟件記錄并經(jīng)過執(zhí)行的工作人員證實(shí)。所有收集的信息盡可能被在線傳輸?shù)郊械牡怯浱?。在此登記處，患者的?shù)據(jù)(包括診斷，疾病狀態(tài)和治療后過程)由醫(yī)生/ 治療人員輸入。這確保了完整的質(zhì)量控制和第三方獨(dú)立質(zhì)量控制的可獲得性。此手術(shù)中加工、技術(shù)提供和軟件指導(dǎo)以及控制的方法聯(lián)合第三方質(zhì)量控制允許了世界上最高標(biāo)準(zhǔn)的干細(xì)胞植入物生產(chǎn)，而同時(shí)與常規(guī)方法相比，以10-100倍降低制造成本。這些流程優(yōu)點(diǎn)的組合代表了個(gè)體化植入物/基于個(gè)性化干細(xì)胞的植入物的大量生產(chǎn)和大量可獲得性的關(guān)鍵。 因此，本科學(xué)發(fā)明為關(guān)鍵性工業(yè)化技術(shù)開創(chuàng)了道路，這充分補(bǔ)充了本發(fā)明的過程和方法的科學(xué)、技術(shù)和愈合的優(yōu)勢。圖11總結(jié)了用于根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量控制部件的流程整合。質(zhì)量控制包括移動(dòng)生產(chǎn)裝置內(nèi)的干細(xì)胞收獲，干細(xì)胞制備，接種步驟。所有的步驟均通過自動(dòng)化數(shù)據(jù)收集實(shí)時(shí)在線記錄，并且獨(dú)立于工作人員(進(jìn)行干細(xì)胞處理)的操縱干預(yù)。參數(shù)控制在釋放植入物之前。在轉(zhuǎn)移給手術(shù)者之前，生物反應(yīng)器/遞送設(shè)備是密封的/封閉的。打開被再次記錄。由記錄患者的情況而結(jié)束所述過程。圖10的裝置被定義為生產(chǎn)裝置，其以模塊化的方式含有下列部件以根據(jù)本發(fā)明正常運(yùn)行軟件，其掌控所有操作并因而形成具有傳感、測量和控制功能的操作裝置，并掌控整體的文檔編制目的。完整裝配的儀器部件包括A級的層流條件，生物反應(yīng)器或細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，錄相機(jī)，溫度感應(yīng)儀。雖然關(guān)于不同的細(xì)胞培養(yǎng)物接種、加工儀器(生物反應(yīng)器) 或培養(yǎng)皿存在可變性，所述生產(chǎn)裝置的基本優(yōu)點(diǎn)是其在與同樣靈活的控制腦部件相連的模塊設(shè)計(jì)中的靈活性，所述腦部件使它在任何手術(shù)或治療環(huán)境中作為自主生產(chǎn)裝置起作用， 以實(shí)現(xiàn)定制大量生產(chǎn)質(zhì)量最好的專屬個(gè)體植入物。
此外且根據(jù)本發(fā)明，之前所述的儀器(例如旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器)被用于直接在手術(shù)室內(nèi)的無菌環(huán)境中進(jìn)行接種過程。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)將最佳地得到體現(xiàn)，如果在提供A類清潔空間接種柜的層流系統(tǒng)內(nèi)使用此類儀器的話。安置在這些系統(tǒng)內(nèi)的生物反應(yīng)器可在手術(shù)室內(nèi)作為可移動(dòng)裝置被運(yùn)行，一次僅用于一名患者。在此意義上，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生了完全閉合的生產(chǎn)環(huán)境，所述生產(chǎn)環(huán)境由下述組成可移動(dòng)層流系統(tǒng)或內(nèi)部含有與患者細(xì)胞或血液接觸的加工裝置的隔離器。理想地，這些內(nèi)部設(shè)備(生物反應(yīng)器)是被置于可再利用的裝載架上的一次性的(單次)系統(tǒng)。正是一次性設(shè)備、移動(dòng)性，A類接種和加工以及減小的尺寸的組合，允許使用整個(gè)系統(tǒng)作為手術(shù)中用于根據(jù)上述方法加工干細(xì)胞的生產(chǎn)室。根據(jù)本發(fā)明，EPO例如作為溶液，或作為凍干物被加入干細(xì)胞濃縮物中，優(yōu)選地作為凍干物以150-300單位/kg體重，優(yōu)選200-250單位/kg體重的濃度。對于局部施用，劑量可以更高。根據(jù)待再生組織的類型，在體積上調(diào)整所述干細(xì)胞濃縮物。在局部應(yīng)用中其為 0.5-lml，對于經(jīng)皮定位(例如在心臟中梗死區(qū)域的頂上)是2-;3ml。對于下頌骨中的骨再生可以是10-30ml。這種靈活性是通過以允許包含在原始體積中的所有細(xì)胞沉降的速度離心所獲得的全部骨髓，脂肪組織，血液體積而實(shí)現(xiàn)的。也產(chǎn)生了血漿分離(無細(xì)胞的)。雖然最底部含有成堆的細(xì)胞，利用此技術(shù)整合更多的體積總是可能的，因此可獲得帶有血小板和紅血細(xì)胞的富集的骨髓濃縮物。以前，這些其它的組分是打算被丟棄的。本方法的優(yōu)點(diǎn)得益于那些細(xì)胞的相互作用潛力，與單獨(dú)使用例如免疫分離的CD133+細(xì)胞相比，遞送了更好的結(jié)果，造成了無疤痕和疤痕樣愈合之間的差異。如果與標(biāo)準(zhǔn)的全身性施用相比，局部施用G-CSF或GM-CSF結(jié)合干細(xì)胞允許使用非常低的濃度。在標(biāo)準(zhǔn)的方法中，將200 μ g例如在10-20個(gè)注射位點(diǎn)處涂覆到待重構(gòu)的支架上。EPO可以同時(shí)地或在全身施用之前或之后不久被共施用。注射使用干細(xì)胞濃縮物。在之后的1-2周時(shí)期，注射所述化合物，例如，s. c.以相同的量注射。對于軟骨再生，在向支架內(nèi)的這些注射中加入TGFii，以對于IOcm2的小塊為 100-500ng。特別為了神經(jīng)元芽生，以500 μ g將維生素C加入支架中。特別為了神經(jīng)元分化， 以30 000IU加入將維生素E。含有生物因子或組織細(xì)胞的粘性凝膠或水凝膠是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，可使用基于例如羧甲基纖維素的聚合組合物(例如聚合纖維素凝膠)來制造各制劑。


圖1 =EpoR, β-cR和生長激素受體在組織和干細(xì)胞中的平行表達(dá)。圖2 此示例顯示了本發(fā)明在肝實(shí)質(zhì)中誘導(dǎo)干細(xì)胞的表達(dá)的用途A和B代表非創(chuàng)傷組，C和D創(chuàng)傷組。加入rhEPO只在創(chuàng)傷組中在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生⑶90+細(xì)胞的表達(dá)。圖3 這總結(jié)了在許可情況(例如，創(chuàng)傷)的存在下，募集，加強(qiáng)和定型因子的用途的相互作用。相應(yīng)地調(diào)節(jié)干細(xì)胞制備過程，并可因而是特別快的(只需要若干分鐘)且在手術(shù)中進(jìn)行。取決于待修復(fù)的缺陷的尺寸，使用重構(gòu)模板。圖4:此實(shí)例顯示了將本發(fā)明與II期中被分開的事件的手術(shù)中順序相連接的流程。I期是細(xì)胞制備和刺激的體外期。II期包括在原位定位后在移植物上施用干細(xì)胞，例如心臟瓣膜可以從外周側(cè)涂覆，降低操作壓力和植入時(shí)細(xì)胞脫離的風(fēng)險(xiǎn)。圖5a(頂部)和b(底部)此實(shí)例顯示了在用從骼嵴和外周血中收獲的祖細(xì)胞 (干細(xì)胞)接種后的合成移植物的表面。將細(xì)胞混合到自體的血漿(3ml)中。通過加入凝血酶(0. 1單位/ml)使此血漿聚合和并施用在移植物的外側(cè)。根據(jù)本發(fā)明的此過程的優(yōu)點(diǎn)是，形成了凝塊，這允許起始如正常傷口愈合中的過程。凝結(jié)動(dòng)力學(xué)，凝塊結(jié)構(gòu)和凝塊纖維蛋白溶解作用產(chǎn)生了微小生境，從而如果與根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)因子，定型因子和募集因子相結(jié)合，對于啟動(dòng)無疤痕愈合過程是理想的。然后在1-2周內(nèi)，在接受者身體內(nèi)制造移植物。在內(nèi)側(cè)(b)，使用針筒在腔表面上滴加細(xì)胞。在b中，顯示了 14天的體外連續(xù)使用。在標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。圖5c (頂部)和d(底部)此實(shí)例顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的移棺物。它被縱向切開，顯示出非常好和有光澤的(無凝血酶原的)腔。在此大型動(dòng)物模型中，在4周時(shí)，對照總是(d)凝結(jié)。這將是完全的臨床失敗。熒光細(xì)胞表明在腔內(nèi)和在外側(cè)均為幾乎100%的存活率。骨髓/血漿凝膠代表形成3D生長區(qū)的3D營養(yǎng)微環(huán)境，即使起初移植物材料上存在不利條件(見后面以相同方式涂覆的同種或異種心臟瓣膜)。圖5e (頂部)和f (底部)此圖重申了在4周時(shí)棺入和根據(jù)本發(fā)明制備的移棺物的結(jié)果，察看組織學(xué)。在5e中，顯示移植物聚合物核心具有朝著腔和外周側(cè)生成的新組織。 未播種的移植物顯示朝向腔的血栓。在圖5f中，顯示出所生成的新組織圍繞著合成核(非可降解)纖維材料。圖5g(頂部)和h(底部)圖5g顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的移植物的腔側(cè)的 ⑶31 (內(nèi)皮標(biāo)記)染色。出現(xiàn)了新形成的防止血栓形成的血管內(nèi)皮。證顯示生物學(xué)支架， 表明利用生物基質(zhì)(異種移植)也可發(fā)生從祖細(xì)胞再內(nèi)皮化。圖6:脫細(xì)胞化后制備心臟瓣膜。顯示了根據(jù)本發(fā)明，達(dá)到了與正常的瓣膜在生理上不可分辨。將瓣膜植入大動(dòng)脈位置。沒有產(chǎn)生來自高壓區(qū)的失敗。圖7a和b 圖7a(頂部)顯示了在血漿凝膠中制備的干細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)后的植入。體外培養(yǎng)進(jìn)行了 1周。X-射線結(jié)果對應(yīng)于7b的組D (底部)并顯示骨髓強(qiáng)度在 2，4和6周的觀察期中有良好的進(jìn)展。在底側(cè)(圖7b)，圖A是對照缺陷(在豬模型中建立了臨界尺寸的缺陷)，圖B 以血液接種磷酸三鈣只引起若的骨小梁形成，圖C 骨替代材料與來自接受者的骨髓的手術(shù)中混合(如現(xiàn)有技術(shù)而進(jìn)行的，不是根據(jù)本發(fā)明)。圖D對比顯示此實(shí)驗(yàn)中，骨缺陷的臨界尺寸模型中完整骨再生的最好結(jié)果。這證明，僅使用骨髓接種材料不足以實(shí)現(xiàn)與使用各干細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)將能夠?qū)崿F(xiàn)的相同的再生進(jìn)展?，F(xiàn)有技術(shù)的這種低質(zhì)量是手術(shù)中骨髓用于骨支持常規(guī)形式。如下圖中所顯示的，根據(jù)本發(fā)明的方法和技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)變得清楚明了。圖8a (頂部，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，植入后6和16周)和b (底部，利用本發(fā)明的例子，植入后6周)圖汕顯示生物反應(yīng)器培養(yǎng)(7天/1周生物反應(yīng)器培養(yǎng))相對于對照A的結(jié)果。對照A 結(jié)合EPO的根據(jù)本發(fā)明的手術(shù)中技術(shù)的材料(TCP+血液)。D是沒有填充的對照缺陷。
20所有的都是在6周時(shí)顯示的。很明顯根據(jù)本發(fā)明的手術(shù)中過程(IO)現(xiàn)在與整周長的細(xì)胞培養(yǎng)過程一樣有效。從圖8a也是明顯的，通過只加入骨髓而以現(xiàn)有技術(shù)的方式進(jìn)行的手術(shù)中播種不引起適當(dāng)?shù)墓切纬?16周時(shí)在骨中仍然存在大洞，8a手術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))。因此， 8b相對于8a清楚地顯示了根據(jù)本發(fā)明的組合方法的優(yōu)勢，因?yàn)?周時(shí)愈合已經(jīng)在所有組中完成。8a的手術(shù)中技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)有技術(shù)相反地在6周和16周時(shí)都留下了大的缺陷(8a)。然而，在較大的缺陷中，根據(jù)本發(fā)明制備的骨髓細(xì)胞相比于僅使用血液將是有優(yōu)勢的。圖9a(頂部)b (底部)此圖顯示了接受了根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞治療的患者，具有的缺陷尺寸比圖8中所使用的臨界尺寸缺陷大100倍。愈合過程是快速的(b)，并且顯示具有極好質(zhì)量的小梁骨形成的新骨的長期持續(xù)性。通常，此種植入物將在6-8周塌陷(使用骨干細(xì)胞培養(yǎng)物的現(xiàn)有技術(shù))，或者將完全不能重構(gòu)為此類質(zhì)量的骨。通常，所使用的材料許多年保留很少的重構(gòu)或者被纖維化組織替代。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，不需要細(xì)胞增殖，不產(chǎn)生疤痕或纖維化并且骨數(shù)年是穩(wěn)定的。ai^l. 5年后的最終結(jié)果，顯示良好的骨形態(tài)，沒有塌陷，而是結(jié)果的持續(xù)性。圖10 =顯示了理想的可移動(dòng)裝置，其由下列組成安置在?？空?docking station)或架(如前面所述)上的單次生物反應(yīng)器(可閉合的設(shè)備)(1)，離心機(jī)(3，可備選地在外面)和滅菌設(shè)備(例如UV光)。4代表無菌空氣過濾系統(tǒng)。此組合設(shè)備的特點(diǎn)是它代表了手術(shù)室內(nèi)的微型實(shí)驗(yàn)室。此設(shè)備可被用于根據(jù)本發(fā)明的方法在不到1小時(shí)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程(過去需要2-3周)。重要的特征是，象征著任何用于組織工程化的生物反應(yīng)器的1理想地是單次裝置。該系統(tǒng)可帶著關(guān)閉的前窗移動(dòng)，并完全通過增加內(nèi)部的空氣壓超過環(huán)境空氣壓以在內(nèi)部維持無菌空氣流(37°可控制溫度)而維持無菌性。為此目的，通過2個(gè)單向閥(6a和6b)從外部去除空氣，當(dāng)前窗板關(guān)閉時(shí)所述單向閥被活化。此外，還包括了監(jiān)測系統(tǒng)，其完全地記錄所有的生物反應(yīng)器活動(dòng)(位置，溫度，離心，關(guān)于壓力、速度和體積的泵壓活動(dòng)，打開和閉合的窗)。該系統(tǒng)也測量內(nèi)部的空氣粒子濃度，并且一旦違反官方要求的A類閾值就引起報(bào)警。所有的這些技術(shù)在本領(lǐng)域中是單獨(dú)已知的，但是如果結(jié)合起來就對于手術(shù)室內(nèi)的移動(dòng)干細(xì)胞工程化移植物生產(chǎn)產(chǎn)生顯著增加的價(jià)值和可應(yīng)用性。所述設(shè)備是完全獨(dú)立的并且?guī)в衅渥陨淼碾娫?電池操控的)。所述系統(tǒng)可用氣體或過氧化氫在內(nèi)部滅菌。此外，所述系統(tǒng)具有抗微生物表面，在一個(gè)實(shí)施方式中所述表面含有在等離子離子化中實(shí)現(xiàn)的銀涂層。SII^伴隨和完成生產(chǎn)要求的質(zhì)量控制和文檔編制的整合。
實(shí)施例下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明。在此強(qiáng)調(diào)的是，這些實(shí)施例中所示的對細(xì)胞、因子、條件、濃度、方法、支架、制劑等的選擇并不限制本發(fā)明并且如果不另外說明可被各相似的、適當(dāng)?shù)幕虻韧募?xì)胞、因子、條件、濃度、方法、支架、制劑等替代，條件是技術(shù)人員將無需創(chuàng)造性而應(yīng)用這些修飾或備選方案。實(shí)施例1 手術(shù)開始前M小時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，10，000單位)和GM-CSF(根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，250單位/m2，1小瓶)用于以 EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。 開始麻醉有待修復(fù)的氣管缺陷的患者 收集IOOml血液以獲得自體血漿(用低量的肝素抗凝血) 從患者骼嵴收獲30_60ml的骨髓抽取物 將血液/骨髓放置于冰上)，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 準(zhǔn)備手術(shù)部位并回收直徑l_2mm的其它活組織檢查樣品(如果相當(dāng)?shù)陌薪M織仍然是可獲得的)。于無菌容器中、在無菌普通鹽水中儲存于冰上。 將骨髓抽吸物和活組織檢查組織轉(zhuǎn)移到理想地直接位于手術(shù)室內(nèi)或距手術(shù)室很近的層流中。眷制備骨髓和/或血液抽吸物或其它干細(xì)胞源以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮和/或獲得。用所有但不限于本領(lǐng)域已知的所有可能的程序制備干細(xì)胞，包括密度梯度制備，免疫學(xué)分離， 濃縮，過濾，基質(zhì)消化或粉碎和洗滌。 通過等分干細(xì)胞濃縮物或備選地血漿而制備注射溶液，并用作加強(qiáng)、定型和/ 或募集因子的溶劑。 用EP0/TGFi3 3混合物(500 μ 1)過渡性孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無菌冰上/室溫(取決于可獲得的間隔和平行手術(shù)的進(jìn)展)并用那些因子進(jìn)行體外調(diào)節(jié)。 向支架中規(guī)則分布的不同位點(diǎn)注射特定溶液用于植入后的原位延遲釋放和通過之后的位點(diǎn)特異性定型誘導(dǎo)而進(jìn)行的干細(xì)胞模式化(如果細(xì)胞準(zhǔn)確地在那些預(yù)定位置遇到那些因子的話)。 將有或沒有組織粉碎結(jié)果的干細(xì)胞注射到合適的位置(例如，在管狀植入物 (例如瓣膜、血管、導(dǎo)管)的腔中)并且略微在淺表之下進(jìn)行管腔內(nèi)注射，用于形成細(xì)胞島。 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)并植入 用自體血漿或纖維膠手術(shù)中將干細(xì)胞混合物涂覆到壁上，以允許溫和的定位并避免在植入操作中被去除。45分鐘后植入。 用加強(qiáng)和/或募集因子對患者進(jìn)行手術(shù)后處理直到模擬傷口愈合期的結(jié)束(通常2周，如有必要的話(例如在脊髓損傷中)更長)。實(shí)施例2 心血管工程化在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，在羊主動(dòng)脈瓣替換模型中，收集6個(gè)同種異型和4個(gè)異種的瓣膜。 2個(gè)瓣膜經(jīng)歷利用本領(lǐng)域已知的去污劑(鵝脫氧膽酸)進(jìn)行的去細(xì)胞化過程。然后，將這些瓣膜儲存在4°并在無菌條件下送到手術(shù)室中。為了減少損傷，用非常小直徑(0. 5mm)的針筒向這些瓣膜腔內(nèi)注射促紅細(xì)胞生成素(5，000單位)和G-CSF (白細(xì)胞素，Sargramostim) 和生長激素。同時(shí)以30ml的總體積收集骨髓。以1500xg離心骨髓7分鐘。用肝素化的血液進(jìn)行離心。將Icc余下的沉淀物注射到腔側(cè)的淺表基質(zhì)之下，引起干細(xì)胞的塊狀分布。這是為了保護(hù)細(xì)胞不在導(dǎo)入血流后脫離。植入后，用5ml所制備的骨髓濃縮物涂覆瓣膜。實(shí)施例3 合成的移植物實(shí)驗(yàn)過程在此情況下，使用合成的移植物。此類移植物可以是PTFE，聚酯移植物，與硅酮結(jié)合的聚酯移植物，膠原管，膠原-彈性蛋白移植物，經(jīng)過或未經(jīng)脫細(xì)胞化的生物移植物。通過加入拮抗骨髓或血液收集過程所用的凝結(jié)防止劑的聚合劑(例如凝血酶(0. 1單位/ml) 或Ca++)實(shí)現(xiàn)對干細(xì)胞涂覆聚合過程的誘導(dǎo)。凝結(jié)動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致對隨后的愈合過程的引發(fā)效應(yīng)，凝塊結(jié)構(gòu)和凝塊纖維蛋白溶解產(chǎn)生微小生境，如果所述微小生境與根據(jù)本發(fā)明的加強(qiáng)因子、定型因子及募集因子相結(jié)合，對于提供無疤痕愈合過程是理想的。細(xì)胞不生長成洞或空的間隔。從凝結(jié)過程獲得的凝膠優(yōu)選地是人工成型的聚合物以實(shí)現(xiàn)特定的幾何形狀。 細(xì)胞的捕集有利于在干細(xì)胞、血小板、纖維、紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和所有被捕集的包括CD90， ⑶133，⑶106和⑶45的干細(xì)胞之間建立溝通通路。然后，移植物在1-2周內(nèi)在接受者身體內(nèi)產(chǎn)生。緩釋機(jī)制引起移植物涂覆與從內(nèi)部啟動(dòng)重構(gòu)過程的細(xì)胞之間的受控相互作用。此過程繼續(xù)直至源自傷口區(qū)域和被捕集的炎性細(xì)胞的細(xì)胞因子刺激與愈合結(jié)果平行地(同時(shí)地)完成。已發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-I和TNF是活化干細(xì)胞的重要的創(chuàng)傷細(xì)胞因子(許可因子)。聚合過程和免疫活性細(xì)胞的捕集對于相互作用級聯(lián)的完成是支持性的(根據(jù)本發(fā)明的圖幻。甚至在異質(zhì)的合成表面上，所形成的新移植物具有完全生物學(xué)的腔和外周側(cè)。分化的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞(CD31+)。由于血栓形成被大大減少，本技術(shù)提供了顯著更好的應(yīng)用潛力。沒有發(fā)生增生。因此，重要的應(yīng)用是處理腔內(nèi)(心臟)血管支架，所述支架大多數(shù)由于增生(特別是端區(qū))而失敗。血管內(nèi)皮新形成的發(fā)生防止了血栓形成?？梢杂没谝鹊鞍酌傅姆椒ɑ蚴褂萌ノ蹌?鵝脫氧膽酸)來使支架去細(xì)胞化。可使用下面的方案 使用聚酯，膠原，脫乙酰殼多糖，聚酯+硅酮涂覆的移植物，或例如但不限于 PTFE移植物用于將合成植入物個(gè)體化的手術(shù)中過程 手術(shù)開始前M小時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量， 10，000單位)和GM-CSF(根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，1小瓶)用于以EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。 開始麻醉有待修復(fù)的氣管缺陷的患者 收集50ml血液以獲得自體血漿(用低量的肝素抗凝血) 從患者骼嵴收獲30ml的骨髓抽取物 將此30ml放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 準(zhǔn)備氣管部位并回收5個(gè)直徑l_2mm的支氣管上皮活組織檢查樣品并在無菌容器中、在無菌普通鹽水中儲存于冰上 將骨髓抽吸物和上皮活組織檢查樣品轉(zhuǎn)移到層流柜中用于進(jìn)一步加工。 將骨髓抽吸物在4°C離心7分鐘以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 通過在冰上轉(zhuǎn)移到無菌管中，將血漿與干細(xì)胞濃縮物分離 使用Iml從離心過程獲得的血漿上清液制備促紅細(xì)胞生成素溶液(50，000單位，Neorecormone，Roche) 局部特異性地將無菌TGF β 3加入EPO血漿溶液中 用EP0/TGFi3 3混合物(500 μ 1)孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無菌冰上 在氣管支架的10個(gè)不同位點(diǎn)中注射EP0/TGF溶液用于植入后的原位延遲釋放。 在氣管支架的腔中孵育Iml干細(xì)胞、上皮細(xì)胞混合物，并且進(jìn)行管腔內(nèi)注射，用于形成細(xì)胞島 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)和植入 用自體血漿或纖維膠手術(shù)中將干細(xì)胞混合物涂覆到壁上，以允許溫和的定位并避免在植入操作中被去除。45分鐘后植入實(shí)施例4 瓣膜工稈化在去細(xì)胞化組織的使用中，目前主要的組織工程化限制特別是缺乏穩(wěn)定性和壓力抗性，這使得在高壓環(huán)境中使用此類瓣膜復(fù)雜化。同樣，兒科環(huán)境中假定的生長被判斷是膨脹反應(yīng)而不是真正的生長。用下面的方案解決了這些問題。備選地，同樣快速地引起去細(xì)胞化的血管或瓣膜在體內(nèi)進(jìn)行快速重構(gòu)。因此根據(jù)本發(fā)明的方法還可以改善去細(xì)胞化基質(zhì)。瓣膜方案用于同種異型瓣移植物個(gè)體化的手術(shù)中加工 手術(shù)開始前M小時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量， 10，000單位)和GM-CSF(根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，1小瓶)用于EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。 開始麻醉有待修復(fù)的心臟瓣膜缺陷的患者 收集200ml的血液以獲得自體血漿(用低量的肝素抗凝血)和血沉棕黃層 從患者骼嵴收獲IOml的骨髓抽取物 將此IOml放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 準(zhǔn)備瓣膜部位并回收5個(gè)直徑l_2mm的瓣膜活組織檢查樣品并在無菌容器中、 在無菌普通鹽水中儲存于冰上 將骨髓抽吸物和上皮活組織檢查樣品轉(zhuǎn)移到層流臺中用于進(jìn)一步加工 將骨髓抽吸物在4°C離心5分鐘以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 通過在無菌冰上轉(zhuǎn)移到無菌管中，將血漿與干細(xì)胞濃縮物分離 使用Iml從離心過程獲得的血漿上清液制備促紅細(xì)胞生成素溶液(50，000單位，Neorecormone，Roche)·向EPO-血漿溶液中加入HGF和/或VEGF 用EPO孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無菌冰上 在氣管支架的10個(gè)不同位點(diǎn)中注射EP0/HGF溶液用于植入后的原位延遲釋放 在氣管支架的腔中孵育Iml干細(xì)胞、內(nèi)皮/干細(xì)胞混合物，并且進(jìn)行管腔內(nèi)注射用于形成細(xì)胞島，使用未增殖而新鮮制備的細(xì)胞 播種源自血沉棕黃層的細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)和植入 用自體血漿或纖維膠手術(shù)中將干細(xì)胞混合物涂覆到壁上，以允許溫和的定位并避免在植入操作中被去除。45分鐘后植入實(shí)施例5 氣道工程化“氣管方案”用于同種異型氣管移植物個(gè)體化的手術(shù)中過程 手術(shù)開始前M小時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量， 10，000單位)和GM-CSF(根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，1小瓶)用于以EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。 開始麻醉有待修復(fù)的氣管缺陷的患者
收集50ml血液以獲得自體血漿(用低量的肝素抗凝血) 從患者的骼嵴收集IOcc的骨髓抽吸物 將此IOcc放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 準(zhǔn)備氣管部位并回收5個(gè)直徑l_2mm的支氣管上皮活組織檢查樣品并在無菌容器中、在無菌普通鹽水中儲存于冰上 將骨髓抽吸物和上皮活組織檢查樣品轉(zhuǎn)移到層流實(shí)驗(yàn)室中用于進(jìn)一步加工 (cryolab)0 將骨髓抽吸物在4°C離心5分鐘以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 通過在無菌冰上轉(zhuǎn)移到無菌管中，將血漿與干細(xì)胞濃縮物分離 使用Iml從離心過程獲得的血漿上清液制備促紅細(xì)胞生成素溶液(50，000單位，Neorecormone，Roche)
向EPO-血漿溶液中加入無菌TGF β 3
用EP0/TGFi3 3混合物(500 μ 1)孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無丨在氣管支架的10個(gè)不同位點(diǎn)中注射EP0/TGFi3溶液用于植入后的原位延遲釋
菌冰上放。 在氣管支架的腔中孵育Icc干細(xì)胞、上皮細(xì)胞混合物，并且進(jìn)行管腔內(nèi)注射，用于形成細(xì)胞島 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)和植入 用自體血漿或纖維膠手術(shù)中將干細(xì)胞混合物涂覆到壁上，以允許溫和的定位并避免在植入操作中被去除。45分鐘后植入實(shí)施例6 肝工程化 手術(shù)開始前M小時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量， 10，000單位)和GM-CSF(根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，1小瓶)用于以EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。 開始麻醉有待修復(fù)的肝缺陷的患者。這典型地包括患有慢性肝硬化，急性或慢性肝功能衰竭，廣泛的肝切除(包括肝器官捐贈(zèng)和肝器官移植)的患者。 收集200ml血液以獲得富含血小板的血漿(用低量的肝素抗凝血)和/或PBMC， 或它們所有的濃縮物(經(jīng)組合為了更好的效果和容易制備) 從患者骼嵴收獲IOOml的骨髓抽取物 將此IOOml放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 與內(nèi)窺鏡手術(shù)同時(shí)，準(zhǔn)備肝部位并回收5個(gè)直徑l_2mm的肝片段活組織檢查樣品(在肝切除時(shí)從肝的邊緣獲得)并在無菌容器中、在無菌普通鹽水中儲存于4°C的冰上 將骨髓抽吸物和肝活組織檢查樣品轉(zhuǎn)移到層流臺中用于進(jìn)一步加工。 將骨髓抽吸物在4°C離心5分鐘以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 通過在無菌冰上轉(zhuǎn)移到無菌管中，將血漿與干細(xì)胞濃縮物分離 使用Iml從離心過程獲得的血漿上清液制備促紅細(xì)胞生成素溶液(10，000單位，Neorecormone，Roche)·向EPO-血漿溶液中加入HGF
用EPO孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無菌冰上 在膠原海綿的支架的10個(gè)不同位點(diǎn)中注射EP0/G-CSF/HGF溶液用于植入后的原位延遲釋放 在支架表面上孵育最后5ml干細(xì)胞濃縮物、肝組織片段/干細(xì)胞混合物，并且進(jìn)行管腔內(nèi)注射，用于形成細(xì)胞島 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)并植入，通過粘結(jié)在切除表面的上面或硬化的肝上面而附著于肝。在表面上進(jìn)行10-20次小的顯微穿刺以實(shí)現(xiàn)與海綿的血液通路連續(xù)。 用自體血漿或纖維膠將干細(xì)胞混合物涂覆到壁上，以允許溫和的定位并避免在植入操作中被去除。30分鐘后植入實(shí)施例7 皮膚工稈^用于褥瘡，糖尿病性潰瘍，局部缺血腿，任何區(qū)域中被感染的傷口的方案眷在手術(shù)開始時(shí)促紅細(xì)胞生成素sc (根據(jù)制造商推薦的正常單一劑量，10，000 單位)和GM-CSFQOO μ g/m2對于70kg的患者/低劑量)用于以EPO活化骨髓中的干細(xì)胞生產(chǎn)和靶向自體干細(xì)胞。由于病況在嚴(yán)重性上通常不可比，可省略GM-CSF或G-CSF。 開始麻醉患者 收集200ml血液以獲得富含血小板的血漿(用低量的肝素抗凝血)和/或PBMC， 或它們所有的濃縮物(經(jīng)組合為了更好的效果和容易制備) 從患者骼嵴收集30_60ml的骨髓抽取物 將收集結(jié)果放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 對被感染的傷口進(jìn)行外科清創(chuàng)。正常地去除壞死的組織。 特別是在燒傷或慢性傷口(如果存在肉芽組織)中，準(zhǔn)備10個(gè)直徑l_2mm的皮膚活組織檢查樣品(從健康區(qū)域獲得)以支持上皮形成。并在無菌容器中、在無菌普通鹽水或自體血漿中將樣本儲存于4°C的冰上。 將骨髓抽吸物和皮膚活組織檢查樣品轉(zhuǎn)移到層流臺中用于進(jìn)一步加工。 將骨髓抽吸物在4°C離心以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 通過在無菌冰上轉(zhuǎn)移到無菌管中，將血漿與干細(xì)胞濃縮物分離 使用Iml從離心過程獲得的血漿上清液制備促紅細(xì)胞生成素溶液(10000單位， Neorecormone, Roche) 加入到EPO-血漿溶液中 用EPO孵育從骨髓新鮮收獲的間質(zhì)干細(xì)胞，儲存在無菌冰上 在膠原海綿的支架的10個(gè)不同位點(diǎn)中注射EP0/G-CSF溶液用于植入后的原位延遲釋放。備選地與干細(xì)胞濃縮物混合并誘導(dǎo)聚合。 在支架表面上孵育最后5ml干細(xì)胞濃縮物，皮膚組織片段/干細(xì)胞混合物。通過加入凝血酶實(shí)現(xiàn)聚合。如果不能獲得支架，在塑料表面(例如培養(yǎng)皿，生物反應(yīng)器)上使骨髓濃縮物聚合。這形成了凝膠樣的膜，可在凝膠化后將其轉(zhuǎn)移以覆蓋傷口。 轉(zhuǎn)移到手術(shù)位點(diǎn)并植入，放置于傷口(30分鐘后植入) 備選地或此外，將細(xì)胞/因子混合物注射到傷口邊緣內(nèi)(在10個(gè)不同位點(diǎn)共 5ml) ο 用膠原海綿覆蓋并用透明薄膜完全覆蓋該區(qū)域
實(shí)施例8 心臟工稈^心臟局部缺血，心臟病發(fā)作，心肌病的方案。目標(biāo)是根據(jù)本發(fā)明將干細(xì)胞凝膠通過經(jīng)皮的方式置于心包囊下面 在手術(shù)開始時(shí)，或者甚至在急性心臟病發(fā)作的診斷后當(dāng)患者可用時(shí)。EPO 10000 單位和/G-CSF以250單位/kg體重，G-CSF以250 μ g/70kg患者作為急性藥品給予。在不是那么嚴(yán)重的情況中，單獨(dú)的EPO就足夠了。 收集200ml血液以獲得富含血小板的血漿(用低量的肝素抗凝血)和/或PBMC， 或它們所有的濃縮物(經(jīng)組合為了更好的效果和容易制備) 在局部麻醉中，從患者骼嵴收集30_60ml的骨髓抽取物 將收集結(jié)果放置于冰上，伴以在肝素化管中的無菌次級包裝 在胸部開始局部麻醉患者 在X射線的控制下放置導(dǎo)管，穿過胸部到達(dá)心包膜并將開口置于心包膜下梗死區(qū)域的上面。 將骨髓抽吸物轉(zhuǎn)移到層流臺用于進(jìn)一步加工。 將骨髓抽吸物在4°C離心以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的濃縮 使用Iml從離心過程獲得的干細(xì)胞濃縮物制備促紅細(xì)胞生成素、G-CSF溶液 (10，000 單位，Neorecormone，Roche)，儲存于無菌冰上。 可加入高度保守的血清應(yīng)答因子(SRF)和肌形成蛋白以支持心肌分化。 誘導(dǎo)聚合并通過導(dǎo)管在梗死區(qū)域上注射 關(guān)閉心包膜 需要的時(shí)間10-20分鐘
實(shí)施例9 角膜工稈^角膜的修復(fù)(特別是當(dāng)不能獲得具有完整角膜緣干細(xì)胞的健康對側(cè)眼時(shí))是不可能的。在常規(guī)方法中，干細(xì)胞也將需要被增殖。其它的眼部應(yīng)用包括黃斑變性，失明，視神經(jīng)炎，干眼。對于黃斑變性可選擇更深的注射。根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行三重的快速過程· A)在急性損傷中，清洗后直接用作為與人工淚混合的凍干物被施用的加強(qiáng)因子EPO刺激· B)從對側(cè)眼制備角膜活組織檢查樣品，粉碎以實(shí)現(xiàn)非常小的樣本，或溫和消化以獲得分離的細(xì)胞并清洗。用EPO孵育細(xì)胞樣本并置于眼睛上面。備選地，可將細(xì)胞注射到受損傷的角膜下或受損傷的角膜內(nèi)。在一些區(qū)域，可外科手術(shù)除去角膜。在非常嚴(yán)重的情況中，GCSF與EPO —起sc給予直到傷口愈合完成(1-2周)· C)如果根本不能獲得角膜活組織檢查樣本，從PBMC或骨髓濃縮物獲得的干細(xì)胞可被加入人工淚或血漿中，并與EPO和/或GCSF —起被置于受損傷的角膜上或角膜內(nèi)。實(shí)施例10 乳房重構(gòu)或乳房植入通過系列注射本發(fā)明的干細(xì)胞凝膠以構(gòu)建切除后失去的組織而實(shí)現(xiàn)乳房的修復(fù)。 這還被用于制備乳房植入物的表面，以避免疤痕和纖維化形成。作為定型因子，性激素被用于引發(fā)干細(xì)胞成熟而成為乳房組織譜系。根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行兩-三重的快速過程A)直接用作為混合了干細(xì)胞濃縮物的凍干物被施用的加強(qiáng)因子EPO刺激植入物B)從對側(cè)乳房制備乳房活組織檢查樣品，粉碎以獲得實(shí)現(xiàn)小的樣本，或溫和消化
27以獲得分離的細(xì)胞并清洗。用EPO孵育細(xì)胞樣本并與干細(xì)胞濃縮物一起注射。備選地，可在重復(fù)的程序中注射細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)構(gòu)建。將GCSF與EPO—起sc給予直到傷口愈合完成(1-2 周)。使用的激素包括雌激素，F(xiàn)SH(促卵泡激素)，生長激素，孕酮和催乳素。實(shí)施例11 脊髓再牛或外周神經(jīng)再生通過減壓后將干細(xì)胞凝膠置于局部缺血區(qū)域的上面或通過使用膠原引導(dǎo) (collagen guide)作為管子進(jìn)行替代來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的再生。使用根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞凝膠，缺失神經(jīng)組織的再生是可能的。其還被用于制備植入物以避免疤痕和纖維化的形成。作為定型因子，使用了神經(jīng)生長因子，與維生素C (或單獨(dú)用于芽殖)和維生素D (用于神經(jīng)元分化)相組合以引發(fā)干細(xì)胞成熟成為神經(jīng)元譜系。根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行兩重的快速過程A)直接用作為混合了干細(xì)胞濃縮物的凍干物被施用的加強(qiáng)因子EPO刺激受傷的神經(jīng)組織B)如果外科手術(shù)途徑不可能，在最多4-6周的期間內(nèi)sc注射GCSF，EP0，維生素C 和維生素DC)插入具有上述因子的干細(xì)胞凝膠，誘導(dǎo)聚合。為了增強(qiáng)凝膠的穩(wěn)定性，將膠原粉末與所述因子一起混合到聚合中的骨髓干細(xì)胞濃縮物中。實(shí)施例12 腱,韌帶,椎間盤，半月板,軟骨再生通過將干細(xì)胞凝膠置于受傷區(qū)域上或注射到受傷區(qū)域中而實(shí)現(xiàn)此類結(jié)締組織的再生。為了獲得材料用于定型，從斷裂或受損傷的區(qū)域(常常來自創(chuàng)傷)獲得粉碎的原始組織。在變性的情況中，通過用針人工穿刺而產(chǎn)生傷口細(xì)胞因子，以根據(jù)本發(fā)明支持干細(xì)胞凝膠/因子的混合。在椎間盤的情形中，還施用了 TGFii以支持核質(zhì)的再形成。如果片段是可獲得的，將它們一起混合到干細(xì)胞凝膠中。用根據(jù)本發(fā)明的此干細(xì)胞凝膠，避免疤痕和纖維化形成的再生是可能的。作為定型因子，可加入成纖維細(xì)胞生長因子用于加速達(dá)到快速的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行三重的快速過程 直接用作為混合了干細(xì)胞濃縮物的凍干物被施用的加強(qiáng)因子EPO刺激受傷的組織 如果沒有外科途徑是可能的，在最多1-2周的時(shí)期中注射GCSF，EPO(特別是作為預(yù)防措施)注射具有上述因子的干細(xì)胞凝膠，誘導(dǎo)聚合。為了增強(qiáng)凝膠的穩(wěn)定性，將膠原粉末與所述因子一起混合到聚合中的骨髓干細(xì)胞濃縮物中。在軟骨再生的情形中，使用了支架/脫乙酰殼多糖制備的凝膠，并且在植入時(shí)接種了包括TGFi3 (20ng)的干細(xì)胞/因子凝膠。通過粘結(jié)到受傷的表面實(shí)現(xiàn)對凝膠的固定。 理想地，可使用脫乙酰殼多糖凝膠或纖維蛋白原凝膠。在愈合期中，可使用因子(EPO，GCSF)的支持性s. c。TGF也可以被再施用。實(shí)施例12 括約肌工程化以與心臟工程化相當(dāng)?shù)姆绞绞中g(shù)中修復(fù)括約肌。將干細(xì)胞/因子凝膠注射到余留的括約肌組織中。此外，圍繞舊的括約肌可形成新組織環(huán)。重構(gòu)在2周內(nèi)發(fā)生。實(shí)施例13 靜脈瓣膜工程化
為了再生靜脈瓣膜，在手術(shù)中，用包括EPO和/或GCSF的干細(xì)胞膠原海綿包裹靜脈。其長度為2-3cm，并且可被縫合以接近不足的瓣膜。還可使用FGF，但不總是需要的。實(shí)施例14 脊椎骨的工稈化在將脊椎復(fù)位回其原始尺寸后，將干細(xì)胞凝膠注射到塌陷的脊椎中。凝膠在內(nèi)部聚合。其可與膠原粉末及任何形式的骨替代材料混合。支持性的定型因子是維生素D。無需使用BMP或衍生物，但是其它因子與干細(xì)胞方法的共施用是可能的。
權(quán)利要求
1.制造個(gè)體工程化植入物的離體手術(shù)中方法，所述植入物基于作為由于患者中的組織缺陷或組織損傷而待生成的組織的拷貝基質(zhì)的天然或合成支架，所述方法包括步驟(i)提供天然或合成的支架作為組織細(xì)胞生長的支持基質(zhì)；( )提供從待治療患者獲得的自體干細(xì)胞；(iii)提供通過活組織檢查而從待治療的患者的缺陷性或受傷組織獲得的健康細(xì)胞作為拷貝細(xì)胞；(iv)用包含刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子的組合物孵育步驟(ii)的干細(xì)胞制備物；(ν)將步驟(iii)的細(xì)胞制備物加載或注射到支架基質(zhì)上或支架基質(zhì)內(nèi)；(vi)在步驟(iv)的經(jīng)預(yù)處理的干細(xì)胞制備物的存在下，將步驟(ν)的經(jīng)預(yù)處理的支架基質(zhì)與組合物一起孵育，所述組合物包含(a)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的天然因子， (b)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的天然因子，和(c)步驟(iv)的因子；和(vii)提供經(jīng)如此處理的支架用于由外科醫(yī)生植入到待治療的患者中，其中步驟(iv)-(vi)是在無菌條件下、在生物反應(yīng)器室或?qū)恿鞴裰小⒃?0至30分鐘的期間進(jìn)行的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中用包含(a)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子，(b)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子，和任選地(c)刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子的組合物預(yù)處理步驟(ii)的自體干細(xì)胞和/或步驟(iii)的組織拷貝細(xì)胞制備物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子選自EPO 禾口 hGH。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子選自 G-CSF 和 GM-CSF。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子選自 TGF β，VEGF,維生素C和維生素E0
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子是 G-CSF，所述促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子是TGFii，并且所述刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子是ΕΡ0。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述干細(xì)胞獲得自待治療的患者的骨髓或外周血。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述干細(xì)胞是間質(zhì)干細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中權(quán)利要求1的步驟(vi)的孵育步驟包括加入源自自體外周血的單核細(xì)胞(PBMC)。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中權(quán)利要求1的步驟(iv)-(vi)與預(yù)安排患者而將支架植入到缺陷性或受傷的組織之內(nèi)或之上同時(shí)進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述自體干細(xì)胞之前未通過單獨(dú)的過程步驟被增殖。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的不同的因子和/或不同的細(xì)胞是通過粘性凝膠樣或膠樣制劑或組合物被提供給支架的。
13.通過權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法獲得的支架用于制造植入物的用途，所述植入物用于愈合受傷的或缺陷性的組織，從而實(shí)現(xiàn)恢復(fù)原狀。
14.權(quán)利要求13的用途，其中前述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的不同因子和/或細(xì)胞的粘性凝膠樣或膠樣制劑或組合物被提供用于在缺陷性或受傷組織的所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處手術(shù)中原位處理新鮮植入的支架。
15.制備物或組合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有或沒有經(jīng)植入的特定細(xì)胞生長支持支架時(shí)治療患者中受傷的或缺陷性的組織從而實(shí)現(xiàn)恢復(fù)原狀，所述制備物或組合物包含(i)新鮮制備的非增殖性自體干細(xì)胞，( )刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的因子，其選自EPO和hGH，(iii)募集和增加干細(xì)胞的可獲得性的因子，其選自G-CSF和GM-CSF，*(iv)促進(jìn)干細(xì)胞或其祖細(xì)胞的分化的因子，其選自TGFii，VEGF，維生素C和維生素E。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述制備物或組合物或支架還包含來自待治療的患者的缺陷性或受傷組織的健康細(xì)胞作為拷貝細(xì)胞，以及任選地自體PBMC。
17.權(quán)利要求16的用途，其中用EPO和/或G-CSF和/或TGFβ預(yù)處理所述健康細(xì)胞和所述PBMC。
18.權(quán)利要求15、16或17的用途，其中以粘性凝膠樣或膠樣制劑提供所述組合物或制備物，在所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處將所述制劑施用于或注射到缺陷性或受傷組織中。
19.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的用途，其中以粘性凝膠樣或膠樣制劑提供所述組合物或制備物，所述制劑由血液，血漿或骨髓，骨髓濃縮物組成，在所有的或某些所選擇的位點(diǎn)處將其施用于或注射到缺陷性或受傷組織中并通過加入Ca++或凝血酶誘導(dǎo)其聚合。
20.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的用途，其中用來自待治療的患者的缺陷性或受傷組織的健康細(xì)胞并任選地用自體PBMC預(yù)處理所述支架。
21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的用途，其中用EPO和/或hGH預(yù)處理所述干細(xì)胞。
22.權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的用途，其中在應(yīng)用支架的情形中，各細(xì)胞的制備、處理和預(yù)處理在小于1小時(shí)的若干分鐘之內(nèi)的快速過程中與外科手術(shù)同時(shí)地在手術(shù)中完成。
23.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的用途，其中在沒有應(yīng)用支架的情形中，各細(xì)胞和因子的組合物或制劑通過靜脈內(nèi)或皮下施用而被提供用于全身性施用；或者如果待治療的組織是可達(dá)到的，則通過直接局部施用而提供。
24.介由天然或合成的支架在患者中手術(shù)中制備自體細(xì)胞的方法，所述自體細(xì)胞在缺陷性或受傷的組織中誘導(dǎo)、刺激和促進(jìn)組織細(xì)胞的分化和生長，同時(shí)為了在所述患者中植入所述支架而預(yù)安排和處理所述患者，其中所述細(xì)胞是(a)來自經(jīng)受組織缺陷，組織創(chuàng)傷或組織損傷的患者的骨髓，組織或血液的自體干細(xì)胞，和(b)作為拷貝細(xì)胞的健康組織細(xì)胞，其用于涂覆待植入患者中的支架基質(zhì)，所述方法包括步驟(i)鑒定患者中的損傷位點(diǎn)；( )通過抽取骨髓，血液或其它組織而募集來自待治療的患者的自體干細(xì)胞；(iii)通過對來自缺陷性或受傷組織的、健康的周圍或存活細(xì)胞的活組織檢查而募集來自待治療的患者的自體組織細(xì)胞；這些細(xì)胞作為支架基質(zhì)上的模板細(xì)胞；(iv)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰校肊PO或hGH或刺激干細(xì)胞并加速組織細(xì)胞重構(gòu)的其它因子離體處理步驟(ii)的干細(xì)胞濃縮物10-30分鐘而沒有使它們增殖，(ν)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰?，用選自ΕΡ0，hGH， GM-CSF, G-CSF和TGFi^的至少一種因子離體處理步驟(iii)的模板細(xì)胞10-30分鐘；(vi)在無菌條件下，在位于手術(shù)室中的生物反應(yīng)器或?qū)恿鞴裰?，用步驟(iv)和(ν)的經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞離體涂覆或注射所述支架10-30分鐘；(vii)在進(jìn)行步驟(iv)至(vi)時(shí)，預(yù)安排患者進(jìn)行植入；(viii)將經(jīng)部分或完全涂覆的步驟(ν)的支架植入組織缺陷或傷口中；和任選地(ix)通過局部施用將凝膠樣或膠樣組合物或制劑應(yīng)用于所植入的支架上和植入物環(huán)境中的組織上，其中所述組合物或制劑包含步驟(ii)和(iii)的細(xì)胞及一種或多種步驟 (ν)的因子。
25.權(quán)利要求M的方法，其中包含至少一種選自ΕΡ0，hGH,GM-CSF, G-CSF和TGF β的因子的組合物或制劑，在開始手術(shù)之前以步驟(i)全身性施用而以藥學(xué)有效量被應(yīng)用于患者ο
26.權(quán)利要求25或沈的方法，其中所述組合物或制劑包含EPO，G-CSF和TGFβ。
全文摘要
本發(fā)明涉及方法、技術(shù)裝置和組合物以實(shí)現(xiàn)短期加工而用于制造支架形式的移植物或移植物，所述移植物或移植物可用于治療或愈合人或動(dòng)物體中心或周邊位置中各種組織和器官的損傷和創(chuàng)傷。本發(fā)明特別涉及介由干細(xì)胞和不同的特定組織和器官修復(fù)促進(jìn)因子進(jìn)行的組織再生，所述修復(fù)促進(jìn)因子活化所述內(nèi)源或外源干細(xì)胞以分化為特定的組織細(xì)胞，從而重構(gòu)被損傷破壞的細(xì)胞的原始微環(huán)境。
文檔編號A61L27/38GK102387824SQ200980152642
公開日2012年3月21日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者奧古斯蒂努斯·巴德 申請人:奧古斯蒂努斯·巴德