專利名稱：完全人源性流感m2特異性抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合流感Mk抗原的人源性抗體，優(yōu)選涉及特異性結(jié)合流感 M2e抗原的完全人源性抗體。本發(fā)明還涉及這種抗體的獨立輕鏈和/或重鏈，涉及編碼所述抗體或它們的輕鏈和/或重鏈的核酸，以及涉及用于表達所述抗體的表達載體。此外，本發(fā)明涉及所述抗體在治療和/或防止A型流感病毒感染中的應用，優(yōu)選所述抗體在治療和 /或防止人A型流感病毒感染中的應用。相關技術A型流感病毒仍然是人類疾病的主要病因，每年造成三至五百萬例嚴重疾病，以及 250，000-500，000人死亡。可以獲得的有效A型流感疫苗是通過誘導對抗血凝素(HA)的中和抗體而發(fā)揮作用的。因為HA由于突變(抗原漂移)而經(jīng)歷持續(xù)的變化，每年產(chǎn)生新的A 型流感抗原變體，這需要疫苗的持續(xù)更新。節(jié)段病毒基因組的偶然重配導致HA或神經(jīng)氨酸酶(NA)從一種亞型被替換為其他亞型，該過程被稱為抗原轉(zhuǎn)換，這使有效的接種疫苗進一步復雜化。采用以HA為靶點的單克隆抗體(mAbs)的被動免疫非常有效，然而由于抗原轉(zhuǎn)換和漂移，其與當前疫苗一樣具有不足之處。因此，用于主動和被動免疫方案的理想靶點是保守的病毒蛋白?；|(zhì)蛋白2(M2) 符合要求，并在過去數(shù)十年中作為對抗流感感染的有效靶點而受到相當多的關注(Zebedee SL, Lamb RA Influenza A virus M2 protein :monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol 1988,62:2762—2772)。M2 為四聚體離子通道，其參與內(nèi)涵體中的病毒脫殼以及高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構中的病毒成熟。 在過去一百年中，至少部分是由于M2蛋白與基質(zhì)蛋白I(Ml)共轉(zhuǎn)錄的事實，它的23個氨基酸細胞外結(jié)構域在人A型流感病毒分離株中保持高度保守。但是M2大量表達于感染細胞上，只有極少數(shù)M2分子存在于A型流感病毒膜。根據(jù)這些觀察，表明M2特異性抗體保護是通過由ADCC除去感染的細胞，而不是通過經(jīng)過病毒中和來防止感染(Jegerlehner A， Schmitz N,Storni T,Bachmann MF Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2 :weak protection mediated via antibody -dependent NK cell activity. J. Immunol. 2004，172 :5598-5605)。采用單克隆抗體的被動免疫與接種疫苗相比具有幾個優(yōu)勢。具體地，它可以治療對疫苗響應差的人，如老人、幼兒或免疫受損的個體。此外，被動免疫是在快速保護至關緊要的情況下，如用于暴露后治療或用于急性暴露的預防所選擇的治療選項。已報道許多M2 細胞外結(jié)構域(Mk)-特異性mAbs在預防性環(huán)境中保護小鼠對抗致死攻擊。這些mAbs包括源自轉(zhuǎn)染色體小鼠的完全人源性抗體(Wang R et al. ,Antiviral Res. 2008,80 :168-177 ； W02006/061723A2 ；以及W003/078600A》，但至今沒有報道過天然人源性M2e_特異性抗體。 然而為了應用于人類受試者，天然人源性抗體是首選的。與源自噬菌體展示或轉(zhuǎn)染色體小鼠的人源化和完全人源性抗體形成相比，天然人源性抗體兼具免疫原性最小和可能的脫靶 (off-target)反應性和毒性最小的優(yōu)勢。此外，人源抗體具有經(jīng)過親和力成熟處理，獲得高親和力抗體的優(yōu)勢。
發(fā)明概述基于文庫的篩選，完成對A型流感M2蛋白細胞外結(jié)構域顯示出高親和力的53個人源性scFv的鑒定、分離和克隆。從典型的scFv克隆中產(chǎn)生完全人源性單克隆IgGl抗體。人源性抗體，特別是完全人源性抗體是有利的，因為當向人類受試者給藥時，它們顯示出不太嚴重的副作用。不受任何理論限制，這是因為人源性抗體，特別是完全人源性抗體一般且優(yōu)選不被人的免疫系統(tǒng)識別。已令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，所選擇的抗體克隆在它們的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和它們的重鏈可變區(qū)(HCVR)中顯示相同和/或高度相似的CDR序列的不同組合?；贑DR的特定組合，可以區(qū)分出不同類型的LCVR和HCVR(參見表1和幻。然而，所有克隆的LCVR和HCVR是高度相似的，正如可以從表1和2中提供的序列信息中推斷出來的。因此，結(jié)論是本發(fā)明的抗體在克隆上是相關的。表3提供了 LCVR和HCVR類型的不同組合的概況，所述類型根據(jù)在所選擇克隆中發(fā)現(xiàn)的它們的CDR來定義。該表還顯示在53個克隆之間這些組合的每一種的豐度。進一步地，已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體對流感M2e 抗原顯示出特別高的親和力，特別是對A型流感M2蛋白的細胞外結(jié)構域顯示出特別高的親和力。已發(fā)現(xiàn)，抗體和RNAse-A型流感Mk抗原結(jié)合物之間的解離常數(shù)(Kd)低至皮摩爾級。 表位作圖揭示被抗體克隆D005識別的最小表位包括于氨基酸序列LLTEVETP(SEQ ID NO 93)中。大部分已知的A型流感毒株的M2蛋白包括這種表位。因此，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體對源自A型流感病毒不同毒株的A型流感M2蛋白的細胞外結(jié)構域的不同變體顯示相似的高親和力。還證實本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合至在其表面表達重組A型流感M2蛋白的細胞。 此外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合至與細胞相連的A型流感M2蛋白。此外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體在A型流感病毒顆粒環(huán)境中能夠特異性結(jié)合A型流感M2蛋白。最重要地，已證實在用于A型流感病毒感染的小鼠模型中，本發(fā)明的抗體在治療和/或防止A型流感病毒感染中非常有效。與本領域內(nèi)已知的其他A型流感M2特異性人源性抗體不同，本發(fā)明的抗體在感染后第一日或第二日以單劑量給藥時具有治療活性。因此，在此公開的抗體在治療中以及在預防性環(huán)境中作為對抗A型流感病毒感染的藥物是有用的。表1 完全人源性M2特異性單克隆抗體的LCVR的⑶R。根據(jù)它們⑶R序列的組合， 可以區(qū)分出九種類型的LCVR(1A至;3B)。基于LC⑶R序列的相似性，可以區(qū)分3組LCVR IA 至 1E、2A 至 2B 及 3A 至!3B。
權利要求
1.一種分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體特異性結(jié)合流感Mk抗原，并且其中所述單克隆抗體為人源性單克隆抗體，優(yōu)選完全人源性單克隆抗體，并且其中所述抗體包括至少一個抗原結(jié)合位點，其中所述抗原結(jié)合位點包括(a)一個LCVR，其中所述LCVR包括(i) 一個LC CDRl，其中所述LC CDRl由SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6中任何一種表示的肽組成；(ii) 一個LC CDR2，其中所述LC CDR2由SEQ ID NO :7表示的肽組成；禾口 (iii) 一個LC CDR3，其中所述LC CDR3由SEQ ID NO 8、9、10禾口 11 中任何一種表示的肽組成；以及(b)一個HCVR，其中所述HCVR包括(i) 一個HC CDRl，其中所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽組成；(ii) 一個HC CDR2，其中所述HC CDR2由SEQ ID NOs 13和14中任何一種表示的肽組成；和(iii) 一個HC CDR3，其中所述HC CDR3由SEQ ID NOs 15、16、17、 18和19中任何一種表示的肽組成。
2.權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述至少一個抗原結(jié)合位點識別包含于氨基酸序列 LLTEVETP(SEQ ID NO 93)的表位。
3.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述LC⑶Rl由SEQ ID NO 1、4和6中任何一種表示的肽組成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽組成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽組成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽組成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽組成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽組成。
4.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中 所述LC CDRl由SEQ ID NO 1表示的肽組成， 所述LC CDR2由SEQ ID NO 7表示的肽組成， 所述LC CDR3由SEQ ID NO 8表示的肽組成， 所述HC CDRl由SEQ ID NO 12表示的肽組成， 所述HC⑶R2由SEQ ID NO 13表示的肽組成，以及所述HC CDR3由SEQ ID NO 15表示的肽組成。
5.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述LCVR的位點5至113由SEQID NO 20、21和22中任何一種表示的肽組成，并且其中優(yōu)選所述LCVR的位點1至4由SEQ ID N0:24表示的肽組成。
6.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述HCVR的位點7至121由SEQID NO 23表示的肽組成，并且其中優(yōu)選所述HCVR的位點1至6由SEQ ID NO 25表示的肽組成。
7.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述LCVR的位點5至113由SEQ ID NO 20、21和22中任何一種表示的肽組成，并且其中所述HCVR的位點7至121由SEQ ID NO: 23表示的肽組成。
8.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述LCVR的位點5至113由SEQID NO 20表示的肽組成，并且其中所述HCVR的位點7至121由SEQ ID NO 23表示的肽組成， 并且其中優(yōu)選所述LCVR的位點1至4由SEQ ID NO 24表示的肽組成，并且其中進一步優(yōu)選所述HCVR的位點1至6由SEQ ID NO 25表示的肽組成。
9.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體為IgG，優(yōu)選IgGl。
10.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括至少一條輕鏈，并且其中所述單克隆抗體進一步包括至少一條重鏈，其中所述輕鏈包括以下氨基酸序列或優(yōu)選由以下氨基酸序列組成SEQ ID NO 26、27和觀中的任何一種，優(yōu)選SEQ ID NO: 沈，并且其中所述重鏈包括以下氨基酸序列或優(yōu)選由以下氨基酸序列組成SEQ ID N0:29。
11.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述流感Mk抗原為A型流感M2 蛋白的細胞外結(jié)構域，并且其中優(yōu)選所述流感似e抗原為SEQ ID NO 48至83及90至92 中任何一種表示的肽，并且其中進一步優(yōu)選所述流感Mk抗原為SEQ ID NO 48表示的肽。
12.前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體和所述流感M2e 抗原的解離常數(shù)(Kd)最大為ΙΟΟηΜ，優(yōu)選最大為ΙΟηΜ，更優(yōu)選最大為6nM和最優(yōu)選最大為 5nM，并且其中進一步優(yōu)選所述流感Mk抗原為SEQ ID NO :48。
13.—種包括前述權利要求中任一項所述的單克隆抗體的藥物組合物，其中優(yōu)選所述藥物組合物進一步包括藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14.權利要求1至12中任一項所述的單克隆抗體或者權利要求13所述的藥物組合物， 其用于治療和/或預防A型流感病毒感染，優(yōu)選人A型流感病毒感染的方法中。
15.權利要求1至12中任一項所述的單克隆抗體在制備用于治療和/或預防A型流感病毒感染、優(yōu)選人A型流感病毒感染的藥物中的應用。
16.一種治療和/或防止A型流感病毒感染的方法，所述方法包括向受試者給予有效量的權利要求1至12中任一項所述的單克隆抗體，或者有效量的權利要求13所述的藥物組合物，其中優(yōu)選所述受試者為人，并且其中進一步優(yōu)選所述單克隆抗體為IgGl。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合流感M2e抗原的人源性抗體，優(yōu)選完全人源性抗體。本發(fā)明還涉及這種抗體的獨立的輕鏈和/或重鏈，編碼所述抗體或它們的輕鏈和/或重鏈的核酸，以及用于表達所述抗體的表達載體。此外，本發(fā)明涉及所述抗體在治療和/或防止A型流感病毒感染，優(yōu)選人A型流感病毒感染中的應用。
文檔編號A61K31/16GK102238963SQ200980148707
公開日2011年11月9日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權日2008年12月4日
發(fā)明者妮可·史密茨, 羅杰·貝利, 莫妮卡·鮑爾, 馬丁·巴赫曼 申請人:英特塞爾股份公司