專利名稱：Il-20拮抗劑在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IL-20拮抗劑在預(yù)防、延緩骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，rheumatoid arthritis)發(fā)病或治療骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的用途。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥的病征在于低骨骼質(zhì)量及骨骼組織的流失，導(dǎo)致骨骼的衰弱與易碎性。凈骨質(zhì)的流失可由各種因素所引起，如低量的雌激素、鈣質(zhì)與維生素D攝取不正常及炎癥等。就停經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥而言，其主要的病因?yàn)楣趋赖脑傥?。骨質(zhì)疏松癥為一種骨骼強(qiáng)度受損的疾病，該疾病會(huì)形成脆弱的骨骼并且提高骨折的風(fēng)險(xiǎn)性(Theill，LE，et al., (2002)Annu Rev Immunol 20 :795-823 ；Boyle, WJ, et al. , (2003)Nature 423 ;337_342)。 更年期雌激素及雄激素的缺乏，將使骨骼的再吸收作用大于骨骼的形成，使骨骼代謝的失衡提高，因而導(dǎo)致骨質(zhì)的流失相對(duì)較快，并且隨之帶來骨骼微架構(gòu)的損壞(Simonet，WS, et al.，(1997)Cell 89 :309-319 ；McClung，M，(2007)Arthritis Res Ther 9 Suppl 1 :S3)。在大多數(shù)的例子中，破骨細(xì)胞數(shù)目的增加或過高的破骨細(xì)胞活性，將使骨骼質(zhì)量變低(Walsh， NC, et al.，(2005) Immunol Rev 208 =228-251) 破骨細(xì)胞為一種表達(dá)耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)及降鈣素受體的多核巨細(xì)胞，其破骨細(xì)胞的形成需具備下列兩種因素巨噬細(xì)胞群落刺激因子(M-CSF)及NF-κ B受體活化子配體(RANKL) (Takayanagi, H，et al.， (2005) Immunol Rev 208 :181-193 ；Ross, FP & Teitelbaum，SL, (2005) Immunol Rev 208 88-105)。其中，M-CSF主要可由基質(zhì)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、活化T細(xì)胞所產(chǎn)生，其與介導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞前體的存活與增殖有關(guān)。RANK為RANKL的單一信號(hào)受體，且RANK能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的發(fā)育與活化作用(Suda，T，et al.，(1999) Endpcr Rev 20 :345-357)。透過觀察具嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥(增加骨骼質(zhì)量)與缺乏破骨細(xì)胞的小鼠中，其小鼠體內(nèi)的基因缺陷， 已確定與生物體內(nèi)的RANK-RANKL的信號(hào)遞送極度相關(guān)(Kong，YY, et al.，(1999) Nature 397 :315-323 ；Li, J, et al.，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 :1566-1571)。此外，幾種前炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-I β、IL-15、IL-17及IL-23，可協(xié)同RANKL作為誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞的表型進(jìn)行多核作用的細(xì)胞因子(Feldmann，M，et al.，(2001) Curr Dir Autoimmun 3 :188-199 ；0’ Gradaigh, D, et al. ， (2004)Ann Rheum Dis 63 :354-359 ； Sato，K，et al.，(2006)J Exp Med 203 :2673-2682 ;Ju，JH，et al.，(2008)J Immunol 181 1507-1518)。IL-20為一種表達(dá)于單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的多效性炎性細(xì)胞因子， 且 IL-20 屬于 IL-10 家族(即 IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL—24 及 IL-26)的成員之一(Blumberg，H，et al. “2001) Cell 104 :9-19 ;Pestka，S，et al. , (2004) Annu Rev Immunol 22 :929-979)。透過活化 IL-20R1/IL-20R2 或 IL-22R1/IL-20R2 等異質(zhì)二聚物受體復(fù)合體(heterodimer receptor complex), IL—20 可與多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生作用(Dumoutier, L.，et al.，(2001) J Immunol 167 =3545-3549)。此外，IL-20 也涉及各種炎性疾病的形成 (Wei, CC, et al.，(2006) J Biomed Sci 13 :601-612)，如銀屑病(Blumberg, H, et al.， (2001)Cell 104 :9-19 ;Sa，SM，et al. ,(2007) J Immunol 178 :2229-2240 ；Wei,CC,et al.， (2005)Clin Immunol 117 :65-72)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Hsu，YH et al.，(2006)Arthritis Rheum 54 :2722-2733)、動(dòng)脈硬化癥(Caligiuri，G，et al. , (2006)Arterioscler Thomb Vasc Biol 26 :1929-1930 ；Chen, WY, et al. ， (2006)Arterioscler Thomb Vasc Biol 26 2090-2095)、缺血性中風(fēng)(Chen，WY & Chang, MS, (2009) J Immunol 182 :5003-5012)、及腎衰竭(Li，HH, et al.，(2008)Genes Immnu 9:395-404)等。通過缺氧及發(fā)炎性刺激反應(yīng)(如 IL-I β 及 LPS)可調(diào)控 IL-20 的作用(Chen, WY & Chang, MS, (2009) J Immunol 182 :5003-5012 ；Otkjaer, K, et al.，(2007)J Invest Dermatol)。近來有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo) (Heuze-Vourc' h, N, et al. , (2005) Biochem Biophys Res Commun 333 :470-475 ；Hsieh, MY，et al. ， (2006)Genes Immun 7 :234-242 ；Tritsaris,K,et al. ， (2007)Proc Natl Acad Sci USA 104 :15363-15369)指出，IL-20會(huì)調(diào)控血管的新生作用(aniogensis)。于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)中，IL-20可作為一種前炎性細(xì)胞因子，其會(huì)誘導(dǎo)滑液膜成纖維母細(xì)胞分泌 MCP-I、IL-6 及 IL-8(Hsu，YH, et al.，(2006)Arthritis Rheum 54 :2722-2733)。近年來，也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)指出IL-20與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)，利用IL-20的可溶性受體可達(dá)到阻斷IL-20的作用，進(jìn)而降低膠原蛋白引發(fā)性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性(HsU，YH，et al. , (2006) Arthritis Rheum 54 :2722-2733) 因此，IL-20于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中扮演一種促進(jìn)因子的角色。然而，現(xiàn)今對(duì)于IL-20在骨質(zhì)再吸收的作用，或是對(duì)于IL-20 在RANKL-RANK信號(hào)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞新生作用(osteoclastogenesis)中所扮演的功能的了解卻是少之又少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種在個(gè)體中治療、延緩骨質(zhì)疏松癥發(fā)病或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的方法， 其包含向該個(gè)體給予一有效劑量的IL-20拮抗劑。本發(fā)明也提供一種在個(gè)體中治療、延緩類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包含向該個(gè)體給予一有效劑量的IL-20拮抗劑及TNFa拮抗劑(如依那西普多月太(etanercept polypeptide))。本發(fā)明中描述的任一種IL-20拮抗劑可用于治療、延緩骨質(zhì)疏松癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑是諸如mAb 7E或其功能等效物的抗IL-20抗體。于一些方面，本發(fā)明提供通過向需要治療的主體給予有效量的抗-IL-20抗體7E 來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)疏松癥的方法。在一個(gè)實(shí)例中，抗-IL-20抗體7E是含有mAb 7E的重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體，mAb 7E是由以保藏在美國(guó)菌種保存中心編號(hào)PTA-8687的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的。這一抗體的實(shí)例包括mAb 7E、其功能片段(例如F(ab’)2、Fab)、 單鏈抗體或嵌合抗體。在其它實(shí)例中，抗-IL-20抗體7E是mAb 7E的人化抗體。
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在上述方法中，優(yōu)選地向主體進(jìn)一步給予有效量的依那西普多肽。在一個(gè)實(shí)例中， 依那西普多肽是含有人可溶性TNF受體(下示SEQ ID NO 5)和人IgGl的Fc部分(即依那西普)的融合蛋白。本發(fā)明的范圍中也包括抗-IL-20抗體7E在治療骨質(zhì)疏松癥或制造用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的范圍也包括抗-IL-20抗體7E，優(yōu)選與依那西普多肽一起在治療骨質(zhì)疏松癥或制造用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容將更詳盡地描述于以下一種以上實(shí)施例中。本發(fā)明其它的特征或優(yōu)點(diǎn)也將以下列圖示、多項(xiàng)實(shí)施例的詳細(xì)說明及權(quán)利要求中，更加清楚地闡明本發(fā)明的內(nèi)容。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1是顯示健康的大鼠與分別以PBS、mlgG、mAb 7E、依那西普、或同時(shí)以mAb 7E 及依那西普處理患有膠原蛋白引發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠，其后腳掌嚴(yán)重腫脹發(fā)生率的數(shù)據(jù)圖。圖2是顯示健康的大鼠與分別以mlgG、mAb 7E、依那西普、或同時(shí)以mAb 7E及依那西普處理患有膠原蛋白引發(fā)性關(guān)節(jié)炎的大鼠，其TNF-α表達(dá)量(圖2A)、IL-Ιβ表達(dá)量 (圖2B)及IL-20表達(dá)量(圖2C)的數(shù)據(jù)圖。圖3a是小鼠體內(nèi)IL-20的血清表達(dá)量的數(shù)據(jù)圖，顯示OVX-組小鼠IL-20的血清表達(dá)量增加，而以mAb 7E治療OVX-小鼠體內(nèi)IL-20的血清表達(dá)量減少，其中，*代表與對(duì)照組比較，P < 0. 05，#代表與OVX-mlgG組比較，P < 0. 05。圖3b是顯示經(jīng)過下列方式處理的小鼠假手術(shù)對(duì)照組(Siam control)(健康的小鼠)、卵巢移除后未經(jīng)其它處理的小鼠 (OVX)、以及以 17 β -雌二醇、OVX+mlgG、0VX+7E(3mg/kg)、或 0VX+7E(6mg/kg)處理的小鼠， 于兩個(gè)月過后小鼠右脛骨的微斷層掃描(micro-CT)分析圖。圖3c是顯示每個(gè)實(shí)驗(yàn)組別中膝關(guān)節(jié)的骨骼礦物密度的數(shù)據(jù)圖，其中該數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖如是代表破骨細(xì)胞分化過程的培養(yǎng)系統(tǒng)分析圖。圖4b顯示以腫瘤壞死因子 (TNF)-a、mIgG或mAb 7E結(jié)合巨噬細(xì)胞群落刺激因子(M-CSF)及可溶性細(xì)胞核因子受體活化子配體(sRANKL)進(jìn)行處理，利用耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)進(jìn)行染色，其破骨細(xì)胞的分析圖。圖如是顯示每孔TRAP+破骨細(xì)胞的數(shù)量分析圖。圖4d是代表早期培養(yǎng)時(shí)以mAb 7E處理破骨細(xì)胞，其破骨細(xì)胞分化過程的培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。圖如顯示利用耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染色破骨細(xì)胞的分析圖。圖4f是顯示每孔TRAP+破骨細(xì)胞的數(shù)量分析圖， 其結(jié)果由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果。圖fe是顯示具有M-CSF或不具有M-CSF的骨髓源造血干細(xì)胞(HSCs)中IL-20表達(dá)的數(shù)據(jù)圖。圖恥是顯示以流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)中，IL-20處理造血干細(xì)胞(HSCs)的RANK 蛋白質(zhì)表面表達(dá)分析圖，其中同工型表示以同工型抗體的陰性對(duì)照染色的細(xì)胞。圖5c是顯示經(jīng)過IL-20處理的HSCs，其RANK mRNA的表達(dá)量增加的數(shù)據(jù)圖。圖5d是顯示透過實(shí)時(shí) PCR測(cè)量，mAb 7E會(huì)抑制IL-20誘導(dǎo)蝕骨(OC)前體細(xì)胞中RANK mRNA的表達(dá)量的數(shù)據(jù)圖。圖6a是以RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)IL-20及其受體于MC3T3-E1成骨細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖。圖6b是顯示IL-20及其受體于MC3T3-E1細(xì)胞中的染色細(xì)胞紅色(IL-20及受體，AEC)、藍(lán)色(細(xì)胞核)。圖6c是顯示以Western印跡分析法，分別使用下列的特異抗體，將細(xì)胞與IL-20 —起持續(xù)培養(yǎng)特定時(shí)間長(zhǎng)度的結(jié)果圖磷酸化(phospho-JNK，JNK)、磷酸化(phospho-ERK，ERK)、磷酸化(phospho-AKT，AKT)、磷酸化(phospho_p38，p38)、磷酸化(phospho-STAT3，STAT3)、β -肌動(dòng)蛋白。圖6d是顯示RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，以IL-20處理MC3T3-E1細(xì)胞中IL-17 mRNA的表達(dá)的分析結(jié)果圖。圖6e是以實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行測(cè)量，在IL-20 處理的MC3T3-E1細(xì)胞中RANKL mRNA的表達(dá)量的數(shù)據(jù)圖。圖6f是顯示在IL-20處理的 MC3T3-E1細(xì)胞中RANKL蛋白質(zhì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)圖。圖7是顯示mAb 7E在MC3T3-E1成骨細(xì)胞中，抑制IL-20誘導(dǎo)RANKL表達(dá)的數(shù)據(jù)圖，其中，其代表的結(jié)果是顯示由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)IL-20為一種新的破骨細(xì)胞新生細(xì)胞因子(osteoclastogenic cytokines)，其能引發(fā)破骨前體細(xì)胞上RANK的表達(dá)與成骨細(xì)胞上RANKL的表達(dá)。而IL-20 拮抗劑，例如IL_20特異單克隆抗體mAb 7E，將抑制IL-20誘導(dǎo)RANK及RANKL的表達(dá)。此結(jié)果顯示，IL-20拮抗劑可抑制破骨細(xì)胞的分化，并且可于生物體內(nèi)保護(hù)個(gè)體免于受到骨質(zhì)流失等骨質(zhì)疏松的問題。本發(fā)明也基于發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用IL-20的特異單克隆抗體、或結(jié)合依那西普與IL-20的特異單克隆抗體一起使用，于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中，能顯著減少后腳掌厚度及腫脹，并達(dá)到防止軟骨的損傷與骨質(zhì)流失的功效。本發(fā)明提供一種向個(gè)體給予有效劑量的IL-20拮抗劑(如抗IL-20抗體或其抗原-結(jié)合片段)，以達(dá)到治療、延緩骨質(zhì)疏松癥發(fā)病或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的方法。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑結(jié)合其它用于骨質(zhì)疏松癥的醫(yī)療用藥一起給予。于某些實(shí)施例中，骨質(zhì)疏松癥為停經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。于某些實(shí)施例中，骨質(zhì)疏松癥與荷爾蒙缺乏有關(guān)。例如，在某些例子中，骨質(zhì)疏松癥是經(jīng)過荷爾蒙去除處理而發(fā)生。荷爾蒙去除處理的例子包含乳癌治療及前列腺癌治療。此外，于某些實(shí)例中，骨質(zhì)疏松癥為類固醇引發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或與類固醇相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥。于某些實(shí)例中，骨質(zhì)疏松癥也與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。本發(fā)明也提供一種向有此需要的個(gè)體給予有效劑量的IL-20拮抗劑(如一抗 IL-20抗體或其抗原-結(jié)合片段)以及有效劑量的TNF α拮抗劑(如依那西普多肽)，以治療、延緩類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。通用技術(shù)透過本技術(shù)領(lǐng)域中常用的技術(shù)，如分子生物學(xué)(包含重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與免疫學(xué)等領(lǐng)域中使用的一般技術(shù)，除非特別指明，均可用以實(shí)行本發(fā)明的內(nèi)容。各種技術(shù)的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參閱下列參考文獻(xiàn)Molecular Cloning =A Laboratory Manual, Second edition (Sambrook, et al. , 1989)Cold Spring Harbor Press ； Oligonucleotide Synthesis (M. 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Capra, eds. , Harwood Academic Publishers,1995)。定義“抗體”(通用于復(fù)數(shù)形)一詞意指一免疫球蛋白分子，能透過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)中的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，特異地結(jié)合一靶標(biāo)，如糖類、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等。本發(fā)明中“抗體”一詞不僅包含完整的單克隆或多克隆抗體，也包含其片段(如 Fab、Fab，、F (ab，)2、Fv)、單鏈(kFv)、其突變體、dAb (結(jié)構(gòu)域抗體；參見 Ward，et al.， 1989，Nature, 341 :541-546)、包含抗體部分的融合蛋白、人化抗體、二價(jià)抗體(diabody)、 嵌合抗體、線性抗體、單鏈抗體、如雙重特異抗體(bispecific antibody的多重特異抗體 (multispecific antibody)及其它任何一種免疫球蛋白分子的修飾構(gòu)型，其中，此種免疫球蛋白分子的修飾構(gòu)型包含抗原識(shí)別時(shí)所需的特異位點(diǎn)。此抗體包含任一類別的抗體，如 免IgG、IgA或IgM(或其亞型)，且其抗體無需為任一特定的類別。依據(jù)抗體重鏈的恒定域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的主類，其中免疫球有五種主要的主類IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM，且上述的幾種主類可更劃分為幾種亞型(同型)，如IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl及IgA2。不同主類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域，分別稱之為α、δ、ε、Y 和μ，且不同免疫球蛋白類別的亞基結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)型都是公知的?！皢慰寺】贵w”一詞意指同源性抗體群(homogeneous antibody population)，其中，單克隆抗體包含參與抗原選擇性結(jié)合的氨基酸(自然存在及非自然存在)。這群?jiǎn)慰寺】贵w具有高度的特異性，并且直接針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合。“單克隆抗體”一詞不僅包含完整的單克隆抗體與全長(zhǎng)的單克隆抗體，也包含其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、FV)、 單鏈GcFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人化抗體、嵌合單克隆抗體及其它任何一種免疫球蛋白分子的修飾構(gòu)型，且此種免疫球蛋白分子的修飾構(gòu)型具備結(jié)合至一抗原時(shí)所需的特異性及結(jié)合能力的抗原識(shí)別位點(diǎn)。本發(fā)明的抗體并不限制于其來源或制備的方法 (如雜交瘤、噬菌體篩選、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)，且“抗體”一詞的定義包含以上所述的所有免疫球蛋白及其片段。單克隆抗體可以源自多種物種，例如，鼠和人。人化抗體意指由一非人類(如鼠)所形成的抗體，其抗體可為特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其包含源自非人類免疫球蛋白的最小序列的片段(如Fv、Fab、 Fab’、F(ab’)2或是抗體的其它抗原-結(jié)合子序列)。大部分的人化抗體為人類免疫球蛋白 (接受抗體者)，其接受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基是由一非人類物種(提供抗體者)CDR 中的殘基所取代，且此非人類的物種(如大白鼠、倉鼠或兔子)的互補(bǔ)決定區(qū)中的殘基是具備所需的特異性、親和性及特性(capacity)的抗體。于某些實(shí)例中，人類免疫球蛋白的 Fv框架區(qū)(FR)是由對(duì)應(yīng)的非人類物種上的殘基所取代。此外，人化抗體也可包含不存在于接受者抗體中的殘基，也可包含不存在于嵌入互補(bǔ)決定區(qū)或框架序列的殘基，但這些殘基卻能更佳化或最佳化其抗體性能。通常，人化抗體大致上包含至少一段且通常為兩段的可變域，其中，全部或大多數(shù)的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)至非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且全部或大多數(shù)的FR區(qū)為人類免疫球蛋白一致序列。最佳化的人化抗體也包含至少一部分的人類免疫球蛋白固定區(qū)或區(qū)段(Fe)，通常為一人類的免疫球蛋白。此抗體可具有Fc區(qū)域，其修飾的部分請(qǐng)參閱WO 99/58572的內(nèi)容。其它形式的人化抗體則具有對(duì)應(yīng)至原始抗體的一種或以上的⑶R(—、二、三、四、五、六)，也即，一種或以上的⑶R是“源自”原始抗體中一種或以上的 CDR?！扒逗稀笨贵w意指具有由第一物種的可變區(qū)或部分可變區(qū)，并且具有源自第二物種的恒定區(qū)的抗體。通常，在嵌合抗體中不論輕鏈或重鏈可變區(qū)皆模擬源自一種哺乳動(dòng)物物種抗體的可變區(qū)，而其固定部分則源自于另一物種的抗體中的同型序列。于某些實(shí)施例中， 可變區(qū)及/或恒定區(qū)皆可經(jīng)過氨基酸的修飾。一種抗體或多肽以“特異地結(jié)合”或“結(jié)合”(于此可交換使用)至一目標(biāo)或抗原表位，而此為本技術(shù)領(lǐng)域中所熟知的用詞，且決定特異結(jié)合的方法也為此技術(shù)領(lǐng)域中熟知。 當(dāng)上述分子與特定的目標(biāo)反應(yīng)或結(jié)合時(shí)，相較于與其它目標(biāo)可具有更頻繁、更快并且持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間及/或更強(qiáng)的親合性時(shí)，代表該分子具有“特異地結(jié)合”能力。相較于抗體或多肽結(jié)合至其它物質(zhì)，當(dāng)抗體或多肽“特異地結(jié)合”至一目標(biāo)時(shí)可展現(xiàn)較強(qiáng)的親合性、結(jié)合性、 更容易、和/或結(jié)合更長(zhǎng)的時(shí)間。例如，當(dāng)抗體特異地或偏好結(jié)合至IL-20的抗原表位時(shí)，也即抗體結(jié)合至IL-20抗原表位時(shí)，相較于結(jié)合至其它IL-20抗原表位或非IL-20抗原表位， 將具有較強(qiáng)的親合性、結(jié)合性、更容易、及/或結(jié)合更長(zhǎng)的時(shí)間。也就是說，當(dāng)抗體(或部分 (moiety))特異地結(jié)合至第一目標(biāo)時(shí)，可能可特異地或偏好結(jié)合至第二目標(biāo)，也可能無法特異地或偏好結(jié)合至第二目標(biāo)。因此，“特異地結(jié)合”或“偏好性結(jié)合”并非一定需要(雖然可能包含)單一的結(jié)合，一般而言(但非絕對(duì))，此結(jié)合意指偏好性的結(jié)合。本發(fā)明中“IL-20”意指白介素-20及其變體，其變體包含至少部分的IL-20活性。 于此，IL-20包含所有哺乳類物種(包含人、犬、貓、馬或牛)本身的IL-20序列。"IL-20受體”意指結(jié)合或活化IL-20的一種或以上多肽。于某些實(shí)例中，IL-20 是結(jié)合至由IL-20R1及IL-20R2所形成的復(fù)合體。于其它實(shí)例中，IL-20是結(jié)合至由 IL-20R2及IL-22R1所形成的復(fù)合體。因此，IL-20受體包含任一哺乳類物種的IL-20R1、 IL-20R2及IL-22R1，其哺乳類物種包含人、犬、貓、馬、猿或牛，但并非僅限于此。人類 IL-20 受體的例子包含 hIL-20Rl (Genebank 登錄號(hào) No. ΝΜ_014432. 2)、hIL_20R2 (Genebank 登錄號(hào)No. NM_144717. 2)及hIL_22Rl (NM_181309. 1)，而人類IL-20受體的序列已于美國(guó)專禾Ij No. 6，610，286,7, 122，632,7, 393，684 及 7，537，761，以及美國(guó)專利公開號(hào) No. 2006/0263850AU2006/0263851AU2008/0247945A1 及 2009/0074661A1 中描述。"IL-20拮抗劑”意指任何一種可阻斷、抑制或降低(包含顯著地影響)IL-20生物活性的分子，其生物活性包含IL-20下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如IL-20結(jié)合及/或抽離受體對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)?！稗卓箘币辉~并未暗示特異的生物作用機(jī)制，其明確地包含及包括IL-20所有可能的直接或間接的藥理作用、生理作用與生化作用。IL-20拮抗劑的示范例包括抗IL-20 抗體或其片段、對(duì)應(yīng)IL-20的反義分子(包含對(duì)應(yīng)IL-20核酸編碼的反義分子)、對(duì)應(yīng)IL-20 核酸的小干擾核糖核酸(siRNA)、對(duì)應(yīng)IL-20核酸的microRNA、以及IL-20抑制性化合物， 但本發(fā)明的IL-20拮抗劑并非僅限于此。為了更詳盡地說明本發(fā)明的目的，“拮抗劑”包含所有先前提及的用詞、標(biāo)題、及功能敘述與特征，拮抗劑用以大略破壞、減少或中和IL-20 本身、IL-20的生物活性(包含介導(dǎo)任一方面的骨質(zhì)疏松癥的能力，但并非僅限于此)、或IL-20生物活性相關(guān)反應(yīng)至一定的程度。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑透過與IL-20進(jìn)行結(jié)合，達(dá)到防止形成IL-20受體復(fù)合體的功效。于其它實(shí)施例中，IL-20拮抗劑則會(huì)抑制或減少IL-20的合成和/或產(chǎn)生(釋放)。于本說明書中將提供IL-20拮抗劑類型的實(shí)例。本發(fā)明中“抗IL-20抗體”意指一種可結(jié)合至IL-20的抗體，以及可以抑制IL-20 生物活性和/或IL-20介導(dǎo)的下游信號(hào)途徑的抗體。“抗IL-20抗體7E” 一詞意指單克隆抗體mAb 7E及其功能變體。mAb 7E是由保藏于美國(guó)菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209，U. S. A.)編號(hào) PTA-8687 的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗體。此雜交瘤細(xì)胞株將會(huì)在美國(guó)專利申請(qǐng)后自行無限制/條件地公開，并且將其保存于 ATCC，其保存期限是自即日起的五年內(nèi)，而在維持本專利有效性的前提下，其保存期限是自寄存當(dāng)日起算至少三十年。mAb 7E的“功能等效物”是這樣的抗體⑴特異地結(jié)合至人類IL-20 ；⑵包括一個(gè)至少70% (例如80%、90%或95% )禾Π mAb 7E的重鏈可變區(qū)(VH)(如SEQ ID NO 2所示，其中，SEQ ID NO 2序列由SEQ ID NO 1的核苷酸序列所編碼)相同的重鏈可變區(qū)，以及一個(gè)至少70% (例如80%、90%或95% )和mAb 7E的輕鏈可變區(qū)(VL)(如SEQ ID NO: 4所示，其中，SEQ ID NO :4由SEQ ID NO :3的核苷酸序列所編碼)相同的輕鏈可變區(qū)的抗體。請(qǐng)參閱美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/763,812。本發(fā)明中兩個(gè)氨基酸序列的“同源性百分比”是依照文獻(xiàn)(Karlin and Altschul， Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268,1990)中的算法所測(cè)定，并且依照文獻(xiàn)(Karlin and Altschul,Proc,Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877,1993)中所述方式進(jìn)行修飾。此算法是合并文獻(xiàn)(Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)中 NBLAST 及 XBLAST 兩程序。BLAST蛋白質(zhì)的檢索是以XBLAST程序在分?jǐn)?shù)=50、字長(zhǎng)=30的設(shè)定條件下執(zhí)行，以得到相關(guān)的多肽同源氨基酸序列。使用文獻(xiàn)(Altschul et al. , Nucleic Acids Res. 25 3389-3402，1997)中所述的空位BLAST程序進(jìn)行演算，是為了比較并且得到空位比對(duì)的演算結(jié)果。當(dāng)利用BLAST及空位BLAST的程序演算時(shí)，是分別使用程序(如XBLAST及NBLAST) 中預(yù)設(shè)的參數(shù)進(jìn)行演算。請(qǐng)參閱網(wǎng)站(www, ncbi. nlm. nih. rov)。mAb 7E的功能性等效物可以是其通過酶切產(chǎn)生的片段，例如Fab或F(ab' )2。它也可以是含有mAb 7E的VH和VL區(qū)的基因工程抗體。這類抗體的實(shí)例包括但不限于單鏈抗體，其中mAb 7E的VH和VL是經(jīng)由接頭(例如肽接頭)共價(jià)地融合；鼠_人嵌合抗體，其中mAb 7E的VH和VL分別與人IgG的重鏈和輕鏈恒定區(qū)連接。功能性等效物也可以是人化抗體。術(shù)語“人化”抗體指非人抗體，其中它的VH和 VL的框架區(qū)(FR)與恒定區(qū)，如果有的話，被人抗體的FR和恒定區(qū)代替。此外，mAb 7E功能性等效物也可以通過在VH或VL的FR中引入突變來產(chǎn)生。熟知的是，抗體的互補(bǔ)決定區(qū) (⑶R)決定它的抗原特異性。相應(yīng)地，F(xiàn)R的突變通常不影響抗體特異性?？贵w的⑶R和FR 可以基于它的VH和VL的氨基酸序列來確定。見www. bioinf. org. uk/abs。本文所述的功能性等效物的結(jié)合-特異性可以用本領(lǐng)域已知的方法檢驗(yàn)，例如ELISA或western印跡分析。單克隆抗體mAb 7E及其動(dòng)能性等效物可以通過常規(guī)方法，例如通過純化上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，或者通過基因工程來制備。
本發(fā)明中“治療”意指采用或給予包含一種或以上活性劑的組合物至主體，且該主體是患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、上述兩種疾病病癥、或具有罹患上述兩種疾病傾向的主體，以針對(duì)這兩種疾病及其病癥、或這兩種疾病傾向，達(dá)到治療、治愈、減輕、舒緩、改變、補(bǔ)救、改善、改進(jìn)或影響的目的。本發(fā)明中“有效劑量”意指為達(dá)到治療功效的目的，每種活性劑(不論是單獨(dú)使用或與其它一種或以上的活性劑共同使用)給予個(gè)體所需的劑量。有效劑量為本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)給藥方式、使用的賦形劑及合并使用其它活性劑的不同而改變有效劑量的多寡。本發(fā)明中“延緩”如骨質(zhì)疏松癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)生，意指緩發(fā)、阻止、減慢、延遲、安定和/或順延此類疾病的進(jìn)展。此種延緩可依處理的疾病和/或個(gè)體改變延緩的時(shí)間長(zhǎng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可推知足夠或顯著的延緩也包含預(yù)防的涵義，因而可以避免發(fā)病。相較于使用其它方法，此方法“延緩”病征發(fā)病是指于一設(shè)定時(shí)間內(nèi)降低病征發(fā)病的機(jī)率，和/或于一設(shè)定時(shí)間內(nèi)降低此病征的程度。此比較通常是利用臨床試驗(yàn)，透過足夠的數(shù)據(jù)得到統(tǒng)計(jì)上顯著的結(jié)果。疾病(如骨質(zhì)疏松癥或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的“發(fā)生”或“進(jìn)展”意指疾病開始的表現(xiàn)和/或疾病確切的進(jìn)展。使用此技術(shù)領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)，可檢測(cè)或評(píng)估疾病的發(fā)生。然而，疾病的發(fā)生或進(jìn)展也可能無法偵測(cè)。本發(fā)明中，發(fā)生或進(jìn)展是指此病征的生理過程。于此，“發(fā)生”包含形成、復(fù)發(fā)以及開始。于本發(fā)明中，骨質(zhì)疏松癥的“開始”或“形成” 包含起始的開始和/或復(fù)發(fā)。本發(fā)明中“試劑”意指生物、藥學(xué)、或化學(xué)化合物，非限制性的舉例可包含單一或復(fù)合的有機(jī)或無機(jī)化合物、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、糖類、毒素或化療化合物?？山?jīng)由合成形成各種化合物，如小分子、寡聚物(如寡肽與寡核苷酸)及以各種核心結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的合成有機(jī)化合物。此外，各種如植物或動(dòng)物的提取物天然源料等皆可用以篩選化合物。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解本發(fā)明對(duì)試劑結(jié)構(gòu)并無任何限制。本發(fā)明中“共同-給予，，或“一起給予，，包含同時(shí)給予及/或于不同時(shí)間給予。共同-給予也包括共同制劑(即IL-20拮抗劑與試劑所組成的組合物)給予或分開組成的給予。于此，共同-給予可指將試劑與IL-20拮抗劑同時(shí)和/或分開給予至一個(gè)體的情形。 此外，共同-給予更可解讀為以不同給藥頻率或給藥間隔進(jìn)行IL-20拮抗劑與試劑的給予。 舉例來說，抗IL-20抗體可以周期性給予，或者可更頻繁地給予此試劑，也可解讀為可使用相同的給藥路徑或不同給藥路徑給予IL-20拮抗劑與試劑?！皞€(gè)體”或“主體”指哺乳類動(dòng)物，較佳為人類。哺乳動(dòng)物包含飼養(yǎng)動(dòng)物、突變動(dòng)物 (sport animal)、寵物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、馬、狗、貓、小鼠與倉鼠。關(guān)于本發(fā)明中提及所有方法中所指IL-20拮抗劑，也包含具有一種或以上試劑的組合物。此組合物更包含此技術(shù)領(lǐng)域中熟知的適當(dāng)賦形劑，例如一種包含緩沖液的醫(yī)藥可接受的賦形劑(載體)。本發(fā)明可單獨(dú)使用或與其它傳統(tǒng)治療方法一起使用。于發(fā)明內(nèi)容與申請(qǐng)專利范圍項(xiàng)中，單數(shù)型的一 /此包含其復(fù)數(shù)型，除非于說明書中有特別強(qiáng)調(diào)其它涵意。例如，“抗體”包含一個(gè)或多個(gè)(摩爾量)抗體，也包含此領(lǐng)域中熟知的其等效涵意等。于本發(fā)明所述的方面及其變化，應(yīng)解讀為包含方面及其變化的“組成”和/或“基本組成”。IL-20 拮抗劑本發(fā)明可用于在有需要的個(gè)體中治療、延緩骨質(zhì)疏松癥及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生和/或預(yù)防罹患骨質(zhì)疏松癥及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病，且上述個(gè)體包含人類或非人類的哺乳類動(dòng)物。本發(fā)明提供的方法使用IL-20拮抗劑，其為任何可阻斷、抑制或降低(包含顯著地影響)IL-20的生物活性的分子。其中，生物活性包含由IL-20信號(hào)介導(dǎo)的下游途徑，如 IL-20結(jié)合和/或引出受體對(duì)細(xì)胞的應(yīng)答。IL-20的實(shí)例為人類IL-20。在一些實(shí)施方式中，IL-20包括IL-20的天然變體。人IL-20的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)如下所示MKASSLAFSLLSAAFYLLffTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTE SLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQIL SHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE(下劃線部分為信號(hào)肽)IL-20拮抗劑的范例包含抗IL-20抗體或其片段、對(duì)應(yīng)IL-20的反義分子(包含對(duì)應(yīng)IL-20核酸編碼的反義分子)、對(duì)應(yīng)IL-20核酸的小干擾核糖核酸(siRNA)、對(duì)應(yīng) IL-20核酸microRNA、IL-20抑制性化合物、及包含IL-20受體的胞外部分的多肽，但本發(fā)明的IL-20拮抗劑并非僅限于此。為了更詳盡地說明本發(fā)明的目的，“拮抗劑”包含所有先前提及的用詞、標(biāo)題、及功能敘述與特征，拮抗劑用以大略移除、減少或中和IL-20本身、 IL-20的生物活性(包含介導(dǎo)任一方面的骨質(zhì)疏松癥、發(fā)炎疾病的能力，但并非僅限于此)、 或IL-20生物活性相關(guān)反應(yīng)至一定的程度。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑將與IL-20結(jié)合，并且防止IL-20與一種或以上的IL-20受體形成復(fù)合體。于其它實(shí)施例中，IL-20拮抗劑將抑制或減少IL-20的合成和/或產(chǎn)生(釋放)。據(jù)此，于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑將與IL-20結(jié)合(物理性相互作用)。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑為與IL-20結(jié)合的多肽。于某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑為肽或經(jīng)過修飾的肽(如IL-20結(jié)合肽，包含融合至 Fc域的可溶性受體IL-20R1、IL-20R2和/或IL-22R1)。請(qǐng)參閱美國(guó)專利號(hào)6，610，286、 7，189，394,7, 364，732,7, 393，684 及 7，537，761，以及美國(guó)專利公開號(hào) 2006/0263850A1、 2006/(^63851Α1、2008/0171041Α1 及 2008/0233115A1。于其它實(shí)施例中，IL-20 拮抗劑為抗 IL-20抗體。同樣于其它實(shí)施例中，IL-20拮抗劑為人化抗體。于某些實(shí)施例中，抗IL-20抗體為抗體mAb 7E或與mAb 7E的功能等效物。于其它實(shí)施例中，抗IL-20抗體包含抗體mAb 7E—種或以上的⑶R(S)(如一、二、三、四、五，或于某些實(shí)施例中，所有六個(gè)⑶Rs皆源自 mAb 7E)。于其它實(shí)施例中，抗IL-20抗體為人化的抗體。同樣于其它實(shí)施例中，抗IL-20抗體包含重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)的氨基酸序列和/或輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 4)的氨基酸序列。同樣于其它實(shí)施例中，抗體包含修飾的恒定區(qū)，如免疫惰性的恒定區(qū)(如不會(huì)誘發(fā)互補(bǔ)介導(dǎo)裂解或不會(huì)刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC))。于其它實(shí)施例中，恒定區(qū)的修飾請(qǐng)參閱 Eur. J. Immunol. (1999)29 J613-2624、國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?PCT/GB99/01441 和/或英國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?809951. 8。于其它實(shí)施例中，IL-20拮抗劑將抑制(減少)IL-20 的合成和/或釋放。mAb 7E重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)及氨基酸序列(SEQ ID NO 2)gaa ttg aag ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg cag cct gga 45ELKLEESGGGLVQPG15
ggatccatgctctcttgtgetgcctctggattcacttttagt90
GSMκLSCAASGFTFS30
gacgcctggatggactgggtcCgCcagtctccagagaaggggCtt135
DAWMDWVRQSPEKGL45
gagtggattgetgaaattagaagegetaataattatgcaaca180
EWIAEIRSKANNYAT60
tactttgetgagtctgtggggaggttcaccateteaagagat215
YFAESVKGRFTISRD75
gattccagtggtgtctacCtgcaaatgaacaacttaagaget270
DSκSGVYLQMNNLRA90
gaggacactggcatttatttctgtaccaagttateactaCgttac315
EDTGIYFCTKLSLRY105
tggttcttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcc360
WFFDVWGAGTTVTVS120
tea363
S121
mAb7E輕鏈可變區(qū)的核苷酉I序列(SEQ ID NO3)及氨基酸序列(SEQID
gattttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccatt45
DFVMTQTPLTLSVTI15
ggacaaccagcctccatetcttgcaagteaagtcagagectcttg90
GQPASISCKSSQSLL30
gatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggcca135
DSDGKTYLNWLLQRP45
ggccagtctccaaagcacctcatetatCtggtgtctCtggac180
GQSPKHLIYLVSKLD60
tctggagtccctgacaggttcactggcagtggateagggaccgat215
SGVPDRFTGSGSGTD75
ttcacaCtgagaateageagagtggaggetgaggatttgggagtt270
FTLRISRVEAEDLGV90
tattattgctggcaaagtacacattttCCgtggacgttcggtgga315
YYCWQSTHFPWTFGG105
ggcaccaagCtggaaateegg339
GTKLEIKR113
抗 IL-20抗體
本發(fā)明某些實(shí)施例中，IL-20拮抗劑包含抗IL--20抗體，抗IL-20抗體為此
已知的知識(shí)，請(qǐng)參閱美國(guó)專利號(hào)7，435，800,7, 115，714,7, 119，175及7，393，684，以及PCT
發(fā)明者張明熙 申請(qǐng)人:成功大學(xué)