專(zhuān)利名稱(chēng)：抗神經(jīng)元和腦腫瘤等幾種腫瘤的新型免疫療法的制作方法
抗神經(jīng)元和腦腫瘤等幾種腫瘤的新型免疫療法本發(fā)明涉及用于免疫治療方法的肽、核酸和細(xì)胞。特別是，本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及腫瘤相關(guān)細(xì)胞毒性τ輔助細(xì)胞(CTL)肽表位，為單獨(dú)或與其他腫瘤相關(guān)肽(刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)疫苗復(fù)合物的活性藥物成分)聯(lián)合。本發(fā)明涉及30種肽序列及其變體，它們?cè)醋钥捎糜谝l(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)的疫苗組合物中的人腫瘤HLAI類(lèi)和 II類(lèi)分子。
背景技術(shù)：
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的腦腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Glial cell)，通常稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)(neuroglia)或簡(jiǎn)單地稱(chēng)為膠質(zhì)(glia)，是提供支持和營(yíng)養(yǎng)、保持動(dòng)態(tài)平衡、形成髓鞘和參與神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳輸?shù)姆巧窠?jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的兩個(gè)最重要的亞群為星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，根據(jù)其來(lái)源的正常膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型(分別為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)而得名。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(以下簡(jiǎn)稱(chēng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)屬于星形細(xì)胞瘤的亞群，是成人中最常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，約占所有惡性腦腫瘤的40 %，約占膠質(zhì)瘤的 50%。它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有很強(qiáng)的侵襲性，是所有膠質(zhì)瘤中惡性水平最高(IV級(jí))的腫瘤。 由于神經(jīng)影像學(xué)、顯微外科學(xué)、各種治療方案(如替莫唑胺或放射)的進(jìn)步，在該疾病的治療方法上已經(jīng)取得了穩(wěn)步發(fā)展，雖然如此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤仍無(wú)法治愈。該類(lèi)型的腦腫瘤致死率非常高自首次確診后的預(yù)期平均存活時(shí)間為9至12個(gè)月。在1986年到1990年的觀察期，5年存活率為8.0%。截至目前，侵入性治療，包括腫瘤全切除，治療后五年存活率仍然不足10%。因此，醫(yī)學(xué)上強(qiáng)烈需要其它有效治療方法。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞是腦腫瘤中分化最低的腫瘤細(xì)胞，所以，腫瘤細(xì)胞很可能遷移和增殖，并且具有高度的侵襲性，從而導(dǎo)致預(yù)后非常差。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在大腦中呈快速、侵襲性及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，因此會(huì)導(dǎo)致死亡。浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式導(dǎo)致這些腫瘤具有不可切除的特性。同時(shí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)放療、化療也具有相對(duì)的抗性，因此，治療后復(fù)發(fā)率高。此外，在手術(shù)切除和放療后，腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)對(duì)徹底消除腫瘤細(xì)胞無(wú)效。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(新腫瘤)和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，這取決于在未分化星形膠質(zhì)細(xì)胞或膠質(zhì)前體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化期間基因機(jī)制上的差異。繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生在年齡最大為45歲的較年輕的人群中。平均在4到5年期間，繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤從低級(jí)別的星形細(xì)胞瘤發(fā)展為未分化的星形細(xì)胞瘤。相比之下，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤主要發(fā)生在較年長(zhǎng)的人群中，平均年齡為55歲。一般來(lái)說(shuō)，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作為暴發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤而發(fā)生，特點(diǎn)是在3個(gè)月內(nèi)就可從無(wú)任何臨床或病理異常狀態(tài)進(jìn)展為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France,2000))。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤沿有髓神經(jīng)遷移并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛擴(kuò)散。在大多數(shù)情況下， 手術(shù)治療持續(xù)療效有限。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制物、削弱T細(xì)胞的增殖以及免疫刺激因子IL-2的產(chǎn)生，從而逃逸宿主免疫系統(tǒng)的偵測(cè)。顱內(nèi)腫瘤可發(fā)生于CNS的任何結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類(lèi)型，包括腦、腦膜、腦垂體、頭骨、甚至殘留的胚胎組織。在美國(guó)，原發(fā)性腦腫瘤的總體年發(fā)病率是每10萬(wàn)人中有14例。最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤為腦膜瘤，占所有原發(fā)性腦腫瘤的27%，以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，占所有原發(fā)性腦腫瘤的23% (而成人中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤占惡性腦瘤的40%)。這些腫瘤中，很多都具有侵襲性，并且級(jí)別高。原發(fā)性腦腫瘤是兒童中最常見(jiàn)的實(shí)體瘤，在兒童中，是僅次于白血病的第二位最常見(jiàn)癌癥死亡原因。如今，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有效治療方法的探究工作仍在進(jìn)行。已有研究對(duì)抗這些腫瘤細(xì)胞的免疫療法或通過(guò)征募免疫系統(tǒng)的治療方法。首先，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的免疫治療方法中，Norttiwest Biotherapeutics使用“DCVax Brain”獲得了令人鼓舞的成果， "DCVax Brain”是一種基于細(xì)胞的免疫接種方法，使用源自患者的樹(shù)突狀細(xì)胞載以自體腫瘤細(xì)胞裂解物，并通過(guò)Celldex(使用來(lái)自EGFRvIII的肽)誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)，與使用標(biāo)準(zhǔn)治療方法時(shí)的中位生存時(shí)間比較，這種方法延長(zhǎng)了中位生存時(shí)間(Heimberger et al.，2006)。結(jié)直腸癌根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的報(bào)道，在美國(guó)，結(jié)直腸癌(CRC)是排在第三位的最常見(jiàn)癌癥， 受罪的新患者每年超過(guò)175，000名。在美國(guó)、日本、法國(guó)、德國(guó)、意大利、西班牙和英國(guó)，每年有超過(guò)480，000例患者罹患該疾病。它是發(fā)達(dá)國(guó)家癌癥死亡的最常見(jiàn)原因之一。結(jié)直腸癌患者的1年和5年相對(duì)存活率分別為84%和64%。確診5年后存活率繼續(xù)下降，10年時(shí)下降至57%。如果結(jié)直腸癌在早期未擴(kuò)散階段被發(fā)現(xiàn)，則5年存活率為90% ；但是只有 39%的結(jié)直腸癌患者會(huì)在此階段得到確診，主要原因是篩查率低。當(dāng)癌細(xì)胞已發(fā)生區(qū)域擴(kuò)散而累及鄰近器官或淋巴結(jié)后，5年存活率下降至68%。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年存活率僅為 10%。研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果。在大多數(shù)病例中，結(jié)直腸腫瘤似乎由腺瘤息肉演變而來(lái)；但是這個(gè)演變過(guò)程可能需要很多年。結(jié)直腸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素是年齡，90%的病例在50歲之后診斷患有此病。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的報(bào)道，結(jié)直腸癌的其它風(fēng)險(xiǎn)因素包括飲酒、飲食中脂肪和/或紅色肉類(lèi)含量高、水果和蔬菜的攝取量不足。結(jié)直腸癌的發(fā)病率繼續(xù)上升，特別是日本等地區(qū)，這些地區(qū)接受西化飲食， 攝入過(guò)多的脂肪和肉類(lèi)而纖維攝入量減少，這些因素可能是罪魁禍?zhǔn)?。但是發(fā)病率的上升速度不如以前快，這可能是由于進(jìn)行了更多的篩查和息肉切除從而防止了息肉發(fā)展成為癌癥。像大多數(shù)實(shí)體腫瘤的治療，一線治療為手術(shù)治療，然而，手術(shù)受益者仍?xún)H限于早期患者，而很大一部分患者在確診時(shí)已是晚期?；诜蜞奏さ幕煼桨甘峭砥诮Y(jié)直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。這些治療方案的大多數(shù)為所謂的FOLFOX方案(輸注5-FU/亞葉酸+奧沙利鉬) 和F0LFIRI (伊立替康、亞葉酸，團(tuán)注和連續(xù)輸注5-FU)方案。第三代細(xì)胞毒素類(lèi)藥物的引入，如伊立替康和奧沙利鉬，增加了顯著改善療效的希望，但預(yù)后仍較差，轉(zhuǎn)移癌的存活率一般仍只有大約20個(gè)月，因此，治療該疾病的需求仍遠(yuǎn)未滿足。最近出現(xiàn)了新一代藥物，即靶向分子藥物，如Avastin (貝伐單抗)和Erbitux (西妥昔單抗)，而且大約有40種針對(duì)不同階段結(jié)直腸癌的化合物處于后期臨床開(kāi)發(fā)階段。這些化合物中的幾種相結(jié)合可增加未來(lái)潛在治療選擇的數(shù)量。絕大部分藥物都處于2期階段，在結(jié)直腸癌的臨床研究中，與針對(duì)其它靶標(biāo)相比，這些化合物更經(jīng)常地針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，這是由于在約80%的結(jié)直腸癌患者中，EGRF表達(dá)都上調(diào)。對(duì)II期患者采用化療結(jié)合最近批準(zhǔn)的單克隆抗體(mAb)(西妥昔單抗+伊立替康或F0LF0X4;貝伐單抗單藥或與F0LF0X4聯(lián)合)的臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行。經(jīng)過(guò)三至四年的觀察，預(yù)計(jì)這些試驗(yàn)會(huì)得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。目前腫瘤科所用的單克隆抗體(mAb) —般都很可能不會(huì)干擾積極免疫治療。事實(shí)上，有臨床前(GABRIL0VICH 1999)和臨床證據(jù)表明，用貝伐單抗消耗VEGF可導(dǎo)致DC介導(dǎo)的 T 細(xì)胞激活的積極結(jié)果 ^sada T，Chong G，Tansik R，Hong T，Spector N, Kumar R， Hurwitz HI, Dev I， Nixon AB, Lyerly HK, Clay Τ, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2008Jan 10.)。前列腺癌和其它腫瘤據(jù)估計(jì)，2007年有27050人死于前列腺癌，它是男性癌癥死亡的首要原因。雖然自20世紀(jì)90年代初以來(lái)，其死亡率在白人和非裔美國(guó)男性中一直下降，但是，非裔美國(guó)男性的死亡率仍然比白人男性高兩倍以上。前列腺癌是男性中最常見(jiàn)的癌癥。非裔美國(guó)男性的發(fā)病率顯著高于白人男性，其原因不明。在過(guò)去20年里，前列腺癌的發(fā)病率發(fā)生了很大的變化在1988-1992年期間迅速上升、1992-1995年期間急劇下降、自1995年以來(lái)略有增加。這些趨勢(shì)在很大程度上反映了采用前列腺特異抗原(PSA)血液檢查進(jìn)行前列腺癌篩查的增加。過(guò)去10年中發(fā)病率增加趨緩最有可能是由于在65歲以上的男性中普遍開(kāi)展PSA 篩查。在65歲以上的男性中，前列腺癌的發(fā)病率趨于穩(wěn)定。在白人男性中，發(fā)病率于1992 年達(dá)到高峰(每100000人男性中有237. 6人)，而在非裔美國(guó)男性中，于1993年達(dá)到高峰 (每100000人男性中有342. 8人)。前列腺癌的治療包括觀察等待、手術(shù)、放射治療、高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)、化療、冷凍手術(shù)、激素治療、或一些組合療法。哪種方案最佳取決于疾病的階段、Gleason評(píng)分和PSA 水平。其它重要因素是男性的年齡、一般健康狀況、以及對(duì)潛在治療及其可能副作用的感覺(jué)。由于所有的治療均可能有一定的副作用，如勃起功能障礙和尿失禁，因此治療討論往往注重于治療目標(biāo)與生活方式改變風(fēng)險(xiǎn)之間的平衡。如果癌癥已擴(kuò)散出前列腺，治療選擇會(huì)發(fā)生明顯的變化，因此，大多數(shù)治療前列腺癌的醫(yī)生使用各種諾模圖來(lái)預(yù)測(cè)擴(kuò)散概率。觀察等待、HIFU、放射治療、冷凍手術(shù)和外科手術(shù)一般在癌癥仍然局限在前列腺內(nèi)的男性中進(jìn)行。激素療法和化療常常在疾病已經(jīng)擴(kuò)散出前列腺的患者中進(jìn)行。但是，也有特例對(duì)于一些晚期腫瘤，可使用放射治療，對(duì)于一些早期腫瘤，可使用激素治療。如果初始的治療失敗并且癌癥進(jìn)展，也可使用冷凍療法、激素療法、 化療。在因臨床懷疑器官有限生長(zhǎng)而接受前列腺癌根治術(shù)的前列腺癌患者中，很多人的手術(shù)準(zhǔn)備確診性病理檢驗(yàn)顯示，局部擴(kuò)展性腫瘤擴(kuò)展超出器官的邊界。這些患者有早期局部復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)，就生化復(fù)發(fā)而言，由于PSA水平不斷增高，通?？梢詸z測(cè)。在這種情況下的治療性選擇包括外部放療和激素治療；然而，這些治療方法的價(jià)值，特別是延長(zhǎng)患者的長(zhǎng)期存活率方面，不能認(rèn)為已經(jīng)得到證實(shí)。此外，可能的治療相關(guān)并發(fā)癥，如尿道狹窄的發(fā)展 (放療)、性欲喪失和陽(yáng)痿、骨質(zhì)疏松方面的骨骼中鈣鹽降低的風(fēng)險(xiǎn)、以及病理性骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(激素消融)，也必須予以考慮。
在所有前列腺癌中，有90%以上在發(fā)現(xiàn)時(shí)處于局部性和區(qū)域性階段；腫瘤在此階段確診的患者5年相對(duì)存活率接近100%。在過(guò)去25年中，所有階段腫瘤組合在一起的5 年存活率從69 %上升至接近90 %。根據(jù)最新的數(shù)據(jù)，10年相對(duì)存活率為93 %，15年相對(duì)存活率為77%。存活率，特別是5年存活率的巨大提升，部分歸因于早期診斷和治療的改進(jìn)。 但是，在腫瘤擴(kuò)散至其它組織和器官后，患者的存活率顯著下降。肺癌2007年美國(guó)預(yù)計(jì)新發(fā)病例為21萬(wàn)例，約占確診癌癥病例的15%。男性發(fā)病率顯著下降，從1984年的每10萬(wàn)人102例高點(diǎn)，下降到2003年的78. 5例。在女性中，這一發(fā)病率在一段長(zhǎng)期的增長(zhǎng)之后正趨向于平穩(wěn)。為了治療之目的，臨床上肺癌分為小細(xì)胞肺癌 (13% )和非小細(xì)胞肺癌(87% )0在男性和女性中，癌癥相關(guān)死亡的大多數(shù)均為肺癌。據(jù)估計(jì)，2007年有16. 039萬(wàn)人死亡，約占所有癌癥死亡人數(shù)的四％。自1987年以來(lái)，每年死于肺癌的女性多于乳腺癌患者。從1991年至2003年，男性的死亡率持續(xù)下降，每年約下降1.9%。女性肺癌死亡率在連續(xù)增長(zhǎng)幾十年后正趨于平穩(wěn)。肺癌死亡率的這些趨勢(shì)反映了過(guò)去30年吸煙率的下降。治療選擇根據(jù)癌癥的類(lèi)型(小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌)和階段進(jìn)行確定，包括手術(shù)、 放療、化療、靶向生物治療，如貝伐單抗(Avastin )和埃羅替尼(Tarceva )。對(duì)于局部癌，通常選擇外科手術(shù)治療。最近的研究表明，手術(shù)隨后化療可提高早期非小細(xì)胞肺癌的存活率。由于該疾病在發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已經(jīng)擴(kuò)散，因此，常常使用放射和化療，有時(shí)與手術(shù)聯(lián)合使用。單一化療或放化療結(jié)合是治療小細(xì)胞肺癌的通常選擇；采用這一方案，有很大比例的患者獲得緩解，在一些病例中，緩解為持久緩解。肺癌的1年相對(duì)存活率在1975-1979年期間為37 %，至2002年，略上升至42%， 這主要是由于手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)和組合療法的使用。然而，所有階段的肺癌組合在一起，5年存活率僅為16%。對(duì)于疾病在檢出時(shí)仍為局部性的病例，存活率為49% ；但是僅有16%的肺癌在此早期得到確診。因此，對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺腫瘤、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、白血病和髓母細(xì)胞瘤以及表現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)生存素和/或本發(fā)明其它蛋白的其它腫瘤仍然需要有效且安全的新治療方案，從而在不使用化療藥物或其它可能導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的藥物的情況下，增強(qiáng)患者的安康。
發(fā)明摘要本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種肽，包含選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 30 的組之中的一個(gè)序列、或該序列的一種與SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 30具有至少85%同源性的變體、或該序列的一種誘導(dǎo)T細(xì)胞與所述變異肽發(fā)生交叉反應(yīng)的變體；其中所述肽不是人類(lèi)生存素的全長(zhǎng)多肽。優(yōu)選地，所述肽選自一種具有一個(gè)特異性HLA亞型如HLA-A*02 或HLA-DR的肽。本發(fā)明的第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種核酸，編碼根據(jù)本發(fā)明的一種肽或一種能表達(dá)所述核酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞，包括根據(jù)本發(fā)明的核酸或表達(dá)載體，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為抗原提呈細(xì)胞，特別是樹(shù)突狀細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞。本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明涉及一種體外制造激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL) 的方法，包括將CTL與載有抗原的人I或II類(lèi)MHC分子進(jìn)行體外接觸，該等分子在合適的抗原提呈細(xì)胞表面或人工構(gòu)造的模擬抗原提呈細(xì)胞表面上表達(dá)一段足夠的時(shí)間從而可以按抗原特異性方式激活所述的CTL，其中所述的抗原為根據(jù)本發(fā)明的肽。本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的一種肽、根據(jù)本發(fā)明的核酸或表達(dá)載體、根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明制造的一種激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，用以治療癌癥或用以制造抗癌藥物，其中所述的藥物優(yōu)選為一種疫苗。優(yōu)選地，所述的癌癥系選自星形細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、混合型膠質(zhì)瘤、少突星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞瘤、畸胎瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、中央神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET，如髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、管膜母細(xì)胞瘤)、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤(如松果體細(xì)胞瘤、成松果體細(xì)胞瘤)、室管膜細(xì)胞瘤、 脈絡(luò)叢腫瘤、來(lái)源不明的神經(jīng)上皮腫瘤(如大腦膠質(zhì)瘤病、星形母細(xì)胞瘤)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、 前列腺腫瘤、乳腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、白血病和髓母細(xì)胞瘤以及過(guò)度表達(dá)生存素和/或本發(fā)明的其它蛋白的其它腫瘤或癌癥。本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明涉及一種藥盒，包括(a) —個(gè)容器，含有根據(jù)本發(fā)明的一種肽、根據(jù)本發(fā)明的核酸或表達(dá)載體、根據(jù)本發(fā)明的一種細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明的一種激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的溶液或凍干形式的藥物組合物；(b)可選的第二個(gè)容器，含有凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液；(c)可選的至少一種選自由根據(jù)SEQ ID 1至30的肽構(gòu)成的組的肽，以及(d)可選的使用溶液和/或重組和/或使用凍干粉劑型的說(shuō)明書(shū)。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽選自SEQ ID NO 1至SEQ ID 24的組。本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)特異性結(jié)合至與HLA限制性抗原絡(luò)合的I或 II類(lèi)人主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的一種重組抗體的方法，該方法包括用可溶形式的與所述的HLA限制性抗原絡(luò)合的(MHC) I或II類(lèi)分子對(duì)包含表達(dá)所述的主要組織相容性說(shuō)復(fù)合體(MHC)I或II類(lèi)的基因工程非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫；將mRNA分子與產(chǎn)生所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗體分離；產(chǎn)生一個(gè)噬菌體顯示庫(kù)，顯示由所述的mRNA分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個(gè)噬菌體與所述的噬菌體顯示庫(kù)分離，所述的至少一個(gè)噬菌體顯示所述的抗體可特異性地結(jié)合至與HLA限制性抗原絡(luò)合的所述人主要組織相容性說(shuō)復(fù)合體(MHC) I或II類(lèi)。本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明涉及一種抗體，其特異性結(jié)合至與一種HLA限制性抗原絡(luò)合的I或II類(lèi)人主要組織相容性說(shuō)復(fù)合體(MHC)，其中該抗體優(yōu)選為多克隆抗體、單克隆抗體和/或嵌合抗體。發(fā)明摘要附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1展示了 ESI液相色譜質(zhì)譜從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本GB1006中確定了以MHC II類(lèi)限制性方式存在的腫瘤相關(guān)肽(TUMAP) IGF2BP3-001。圖2描述了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中高度過(guò)度表達(dá)的本發(fā)明目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)譜。這些基因在正常組織不表達(dá)或表達(dá)很低，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中大大增加。基因芯片分析法測(cè)定的幾種正常組織和個(gè)體多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)樣本中顯示有mRNA相對(duì)表達(dá)。數(shù)值與正常腎臟中的表達(dá)水平相關(guān)(數(shù)值常任意設(shè)定為1. 0)。正常組織中的表達(dá)值從現(xiàn)有商業(yè)mRNA庫(kù)獲得。根據(jù)分析軟件，括號(hào)內(nèi)的字母表示“檢測(cè)提示”?！皺z測(cè)提示”指明樣本中是否明確有轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)出或是否不能觀察到明顯的檢測(cè)值?？捎谩癙”(有)、"A"(無(wú)) 或"M"(少量檢出)表示。圖3顯示了健康供體外周血中CSP-001和NLGN4X-001特異性⑶8+淋巴細(xì)胞微球促進(jìn)增殖的四聚體技術(shù)分析結(jié)果。與抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/CSP-001 (左板)或抗⑶28+高密度腫瘤抗原A*0201/NLGN4X-001 (右板)耦合的微球每周對(duì)每孔中IxlO6⑶8+ 濃縮PBMC進(jìn)行了刺激。經(jīng)過(guò)三次體外刺激，所有的細(xì)胞用抗體CD8FITC+熒光標(biāo)記的四聚體A*0201/CSP-001和A*0201/NLGN4X-001進(jìn)行染色。細(xì)胞在CD8+淋巴細(xì)胞上得到門(mén)控； 數(shù)字代表CD8+淋巴細(xì)胞指定象限內(nèi)的細(xì)胞百分比。圖4顯示了 HLA_A*0201等位基因編碼的本發(fā)明HLA-I類(lèi)肽對(duì)MHC分子的親和性。 本發(fā)明的IMA950HLA I類(lèi)TUMAP和對(duì)照肽HBV-001 (強(qiáng)力結(jié)合劑)的解離常數(shù)(Kd)用基于 ELISA的MHC重折疊檢測(cè)法測(cè)得。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有術(shù)語(yǔ)具有以下給定的定義。本文所用“肽”這一術(shù)語(yǔ)，系指一系列氨基酸殘基，通常以α -氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。這些肽的長(zhǎng)度通常為9個(gè)氨基酸，但至短可為8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，至長(zhǎng)可為16或10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本文所用“寡肽”這一術(shù)語(yǔ)，系指一系列氨基酸殘基，通常以α -氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。寡肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長(zhǎng)度約小于30個(gè)氨基酸殘基，約長(zhǎng)于14個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“多肽”系指一系列氨基酸殘基，通常通過(guò)α -氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團(tuán)之間的肽鍵相互連接。多肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵，只要保持正確的表位即可。與術(shù)語(yǔ)肽或寡肽相對(duì)，“多肽”這一術(shù)語(yǔ)是指包含多于約30個(gè)氨基酸殘基的分子。肽、寡肽、蛋白質(zhì)或編碼此類(lèi)分子的核苷酸如果能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，則具有“免疫原性”(因此是本發(fā)明中的一種“免疫原”)。在本發(fā)明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的能力。因此，“免疫原”是一種能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的分子，并且在本發(fā)明的情況下，是一種能誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的分子。T細(xì)胞“表位”要求的是一種結(jié)合至MHC I或II類(lèi)受體上的短肽，從而形成一種三元復(fù)合體(MHC I類(lèi)α鏈、β-2-微球蛋白和肽)，其可由載有以相應(yīng)親和力結(jié)合至MHC/ 肽復(fù)合體的匹配T細(xì)胞受體的一種T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。結(jié)合至MHC I類(lèi)分子的肽的典型長(zhǎng)度為8-14個(gè)氨基酸，最典型為9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。與MHC-II類(lèi)分子結(jié)合的T細(xì)胞表位通常長(zhǎng)度為12-30個(gè)氨基酸。對(duì)于表位結(jié)合至MHC II類(lèi)分子的情況，同一個(gè)肽與相應(yīng)的T細(xì)胞表位可共享一個(gè)共同的核心節(jié)段，但是由于核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的側(cè)翼序列分別具有不同的長(zhǎng)度，因而總體長(zhǎng)度不同。MHC II類(lèi)受體具有更開(kāi)放的構(gòu)造， 結(jié)合至MHC II類(lèi)受體上的肽相應(yīng)地不完全埋于MHC II類(lèi)分子的肽結(jié)合槽裂結(jié)構(gòu)中，這是因?yàn)樗鼈兾挥贛HC I類(lèi)分子的肽結(jié)合槽裂之中。出人意料的是，對(duì)于根據(jù)SEQ ID Ν0:1的肽，情況并非如此，因?yàn)殡拈L(zhǎng)度的微小差異會(huì)導(dǎo)致活性的極度降低(見(jiàn)下文)。在人類(lèi)中，有三種編碼MHC I類(lèi)分子的不同基因位點(diǎn)(人MHC分子也是指定的人白細(xì)胞抗原(HLA)) HLA-A、HLA-B 和 HLA-C。HLA-A*01、HLA_A*02 和 HLA_A*11 是可從這些基因位點(diǎn)表達(dá)的不同MHC I類(lèi)等位基因的例子。MHC II類(lèi)基因的人基因組有三種不同基因位點(diǎn)HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHC II類(lèi)受體是異源二聚體，包含一個(gè)α鏈和一個(gè)β鏈，兩者均通過(guò)跨膜區(qū)在細(xì)胞膜中錨定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是兩種不同的MHC II類(lèi)β等位基因的例子，它們已知在這些位點(diǎn)被編碼。II類(lèi)等位基因具有很高的多態(tài)性，例如，已經(jīng)描述的有數(shù)百種不同的HLA-DRBl等位基因。因此，為了治療和診斷目的，與數(shù)種不同的HLA II類(lèi)受體以合適的親和力結(jié)合的肽是非常理想的。與數(shù)種不同的HLA II類(lèi)分子結(jié)合的肽被稱(chēng)為混雜結(jié)合劑。本文提到的DNA序列既包括單鏈DNA也包括雙鏈DNA。因此，除非本文另有所指， 否則具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補(bǔ)序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補(bǔ)序列。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”系指在自然基因組環(huán)境中自然或正常編碼基因表達(dá)產(chǎn)物的那一基因部分，即，體內(nèi)編碼該基因的天然表達(dá)產(chǎn)物的區(qū)域。編碼區(qū)可來(lái)自正?；?、突變基因或異?；?，甚至還可以來(lái)自DNA序列，完全可在實(shí)驗(yàn)室中使用本領(lǐng)域熟知的DNA合成方法合成。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”系指脫氧核苷酸的雜聚物。編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來(lái)說(shuō)，編碼肽、多肽以及本發(fā)明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調(diào)節(jié)元素的重組轉(zhuǎn)錄單元中被表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)產(chǎn)物”系指多肽或蛋白，它是基因序列和任何核酸序列的翻譯產(chǎn)物，這些序列編碼遺傳密碼退化所造成的同等物，從而編碼同樣的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“片段”當(dāng)指的是一種編碼序列時(shí)，表示包含非完整編碼區(qū)的DNA的一部分， 其表達(dá)產(chǎn)物與完整編碼區(qū)表達(dá)產(chǎn)物基本上具有相同的生物學(xué)功能或活性。術(shù)語(yǔ)“DNA片段”系指一種DNA聚合物，以單獨(dú)的片段形式或一種較大DNA結(jié)構(gòu)的組分形式存在，它們至少?gòu)姆蛛x過(guò)一次的DNA中以基本純凈的形式獲得，S卩，未污染內(nèi)源性材料并且其數(shù)量或濃度使得能使用標(biāo)準(zhǔn)生化方法(如，使用克隆載體)識(shí)別、處理和回收片段及其組分核苷酸序列準(zhǔn)。此等片段以開(kāi)放閱讀框架(未被內(nèi)部非翻譯序列打斷)或內(nèi)含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。非翻譯DNA序列可能存在于開(kāi)放閱讀框架的下游，在那里其不會(huì)干預(yù)編碼區(qū)的操縱或表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“引物”表示一種短核酸序列，可配有一個(gè)DNA鏈，并在DNA聚合酶開(kāi)始合成脫氧核糖核酸鏈的地方含有一個(gè)游離的3' OH端。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”表示參與RNA聚合酶的結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域?！伴_(kāi)放閱讀框架(ORF) ”這一術(shù)語(yǔ)是指編碼無(wú)終密碼子的氨基酸的一系列三聯(lián)體， 并且是一種(潛在地)可翻譯成蛋白質(zhì)的序列。術(shù)語(yǔ)“分離”表示一種物質(zhì)從其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果是天然發(fā)生的則是天然環(huán)境)中被移走。例如，活體動(dòng)物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統(tǒng)中一
10些或所有共存物質(zhì)中分離出來(lái)的核苷酸或多肽是分離的。此類(lèi)多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類(lèi)多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，并且由于該載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，因此它仍然是分離的。本發(fā)明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以“純化”的形式存在。術(shù)語(yǔ)“純化”并非要求絕對(duì)的純度；它只是一個(gè)相對(duì)的定義，可以包括高度純化或部分純化的制劑，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員能理解這些術(shù)語(yǔ)。例如，各個(gè)從已用傳統(tǒng)方法純化為具有電泳同質(zhì)性的cDNA庫(kù)中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質(zhì)純化至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選為兩或三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選為四或五個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，明確考慮到所述多肽的純度優(yōu)選為99. 999%，或至少為99. 99%或99. 9% ；甚而適宜為以重量計(jì)99%或更高。根據(jù)本發(fā)明披露的核酸和多肽表達(dá)產(chǎn)物，以及包含此類(lèi)核酸和/或多肽的表達(dá)載體可能以“濃縮的形式”存在。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“濃縮”系指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優(yōu)勢(shì)的是按體重計(jì)0. 01 %，優(yōu)選為按體重計(jì)至少約 0. 1 %。也明確考慮到，按重量計(jì)約為0. 5 %、1 %、5 %、10 %和20 %的濃縮制劑。序列、構(gòu)型、 載體、克隆物以及包含本發(fā)明的其它材料可有優(yōu)勢(shì)地以濃縮或分離的形式存在。術(shù)語(yǔ)“活性片段”是指產(chǎn)生免疫反應(yīng)的片段(即具有免疫原性活性)，不論是單獨(dú)或可選地與合適的佐劑一起給予一種動(dòng)物，比如哺乳動(dòng)物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應(yīng)采用的形式是在接受動(dòng)物(如人)體內(nèi)刺激T細(xì)胞反應(yīng)。或者，“活性片段”也可用于誘導(dǎo)體外T細(xì)胞反應(yīng)。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“部分”、“節(jié)段”、“片段”，如果與多肽相關(guān)，指的是殘基的連續(xù)序列(如氨基酸殘基)，其序列是構(gòu)成較大序列的一部分。例如，如果一個(gè)多肽以任一種肽鏈內(nèi)切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進(jìn)行處理，則該處理獲得的寡肽會(huì)代表起始多肽的部分、節(jié)段或片段。這表示，任何此類(lèi)片段必定包含與SEQ IDNO :1至30序列基本相同 (如果不是完全相同)的一個(gè)節(jié)段、片段或部分作為其氨基酸序列的一部分，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1至30的天然蛋白或“親本”蛋白。當(dāng)與多核苷酸相關(guān)地使用時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)系指用任何共同核酸內(nèi)切酶處理所述多核苷酸產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“百分比同一度”或“百分比同一”，如果指的是序列，則表示在擬對(duì)比序列(“對(duì)比序列”)與所述序列或權(quán)利要求的序列(“參考序列”)排隊(duì)比對(duì)后，把一種序列與所述序列或權(quán)利要求的序列進(jìn)行比較。然后根據(jù)下列公式計(jì)算等同度百分比等同度百分比=100[I_(C/R)]其中C是參考序列與被對(duì)比序列之間對(duì)準(zhǔn)長(zhǎng)度上參考序列與被對(duì)比序列之間的
差異數(shù)量，其中(i)參考序列中每個(gè)堿基或氨基酸序列在被對(duì)比序列中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的對(duì)準(zhǔn)堿基或氨
基酸；(ii)參考序列中每個(gè)空隙，以及(iii)參考序列中每個(gè)對(duì)準(zhǔn)堿基或氨基酸與被比對(duì)比序列中對(duì)準(zhǔn)堿基或氨基酸不同，即構(gòu)成一個(gè)差異；并且R是參考序列與被對(duì)比序列對(duì)準(zhǔn)長(zhǎng)度上在參考序列中產(chǎn)生任何空隙也計(jì)算為一個(gè)堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數(shù)目。如果“被對(duì)比序列”和“參考序列”之間存在的一個(gè)對(duì)準(zhǔn)按上述計(jì)算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，則被對(duì)比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計(jì)算的等同度百分比低于指定等同度百分比的對(duì)準(zhǔn)。如果無(wú)另有說(shuō)明，那么本文公開(kāi)的原始肽可以通過(guò)在肽鏈內(nèi)的不同(可能為選擇性)位點(diǎn)上取代一個(gè)或多個(gè)殘基而被修飾。此取代可能是保守性的，例如，其中一個(gè)氨基酸被具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)的另一個(gè)氨基酸所取代，比如其中一個(gè)疏水性氨基酸被另一個(gè)疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類(lèi)似的大小和化學(xué)性質(zhì)的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質(zhì)家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現(xiàn)出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關(guān)，這是確定“保守取代”的基礎(chǔ)。在本文中，保守取代定義為在以下五種基團(tuán)之一的內(nèi)部進(jìn)行交換基團(tuán)1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala，Ser, Thr, Pro, Gly)；基團(tuán)2-極性、帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基團(tuán)3-極性、 帶正電荷的殘基(His, Arg, Lys)；基團(tuán)4_大脂肪族非極性殘基(Met, Leu, lie, Val, Cys) 以及基團(tuán)5-大芳香殘基(Phe, Tyr, Trp)。較不保守的取代可能涉及一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有類(lèi)似特點(diǎn)但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個(gè)酸性氨基酸被另一個(gè)具有極性或甚至具有堿性性質(zhì)的氨基酸所取代。然而，這種“激進(jìn)的”取代不能認(rèn)為是無(wú)效的而不予考慮，因?yàn)榛瘜W(xué)作用是不完全可預(yù)測(cè)的，激進(jìn)的取代可能會(huì)帶來(lái)其簡(jiǎn)單化學(xué)原理中無(wú)法預(yù)見(jiàn)的偶然效果。當(dāng)然，這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其它結(jié)構(gòu)。因此，D-氨基酸可能被本發(fā)明的抗原肽中常見(jiàn)的L-氨基酸取代，也仍在本公開(kāi)的范圍之內(nèi)。此外，具有非標(biāo)準(zhǔn)R 基團(tuán)的氨基酸(即，除了天然蛋白的20個(gè)常見(jiàn)氨基酸之外的R基團(tuán))也可以用于取代之目的，以生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的免疫原和免疫原性多肽。如果在一個(gè)以上位置上的取代發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定義值，則對(duì)這些取代的組合進(jìn)行測(cè)試，以確定組合的取代是否產(chǎn)生對(duì)肽抗原性的疊加或協(xié)同效應(yīng)。肽內(nèi)被同時(shí)取代的位置最多不能超過(guò)4個(gè)。術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞反應(yīng)”是指由一種肽在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的特異性擴(kuò)散和激活。對(duì)于MHC I類(lèi)限制性CTL，效應(yīng)子功能可能為溶解肽脈沖的、肽前體脈沖的或天然肽提呈的靶細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子，優(yōu)選為肽誘導(dǎo)的干擾素Y、TNF_a或IL-2，分泌效應(yīng)分子、 優(yōu)選為肽或脫顆粒作用誘導(dǎo)的顆粒酶或穿孔素。對(duì)于MHC II類(lèi)限制輔助性T細(xì)胞效應(yīng)子功能可能為肽誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌，優(yōu)選為，IFN- y , TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽誘導(dǎo)的脫顆粒作用。CTL和輔助性T細(xì)胞的可能效應(yīng)子功能不僅限于此列表所述功能。
優(yōu)選情況是，當(dāng)SEQ ID NO 1至30任何序列的肽特異性CTL相比于取代肽受到檢測(cè)時(shí)，如果取代肽在相對(duì)于背景肽溶解度增加達(dá)到最大值的一半，則該肽濃度不超過(guò)約 ImM，優(yōu)選為不超過(guò)約1 μ Μ，更優(yōu)選為不超過(guò)約InM，再而更優(yōu)選為不超過(guò)約ΙΟΟρΜ，最優(yōu)選為不超過(guò)約ΙΟρΜ。也優(yōu)選為，取代肽被一個(gè)以上的CTL識(shí)別，最少為2個(gè)，更優(yōu)選為3個(gè)。因此，本發(fā)明所述的表位可能與天然腫瘤相關(guān)表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來(lái)自參考肽的不超過(guò)4個(gè)殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。是否能刺激免疫反應(yīng)取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的存在增加了運(yùn)用宿主免疫系統(tǒng)促進(jìn)免疫反應(yīng)的可能性，該免疫反應(yīng)具有對(duì)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的靶向抗原的特異性并且通過(guò)該作用機(jī)制能夠誘導(dǎo)腫瘤消退、生長(zhǎng)停止或生長(zhǎng)放緩。對(duì)于癌癥免疫療法，目前正在探索各種利用免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞免疫作用的機(jī)制。細(xì)胞免疫反應(yīng)的特定元素能特異性地識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表明，這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用(Cheever et al. ,1993 ；Zeh, III et al.，1999)。根據(jù)對(duì)415份來(lái)自結(jié)直腸癌患者的樣本的分析結(jié)果，Galon等人證明了腫瘤組織中免疫細(xì)胞的類(lèi)型、密度和位置實(shí)際上是比廣泛采用的腫瘤TNM分期更好的患者存活率預(yù)測(cè)因子(Galon et al.，2006)。MHC I類(lèi)分子提呈主要為內(nèi)源性的蛋白、DRIPS和較大肽裂解生成的肽。MHC II類(lèi)分子主要發(fā)現(xiàn)于專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞(APC)上，并且主要提呈在內(nèi)吞作用過(guò)程中由APC占據(jù)并且隨后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽(Cresswell，1994)。肽和MHC I類(lèi)分子的復(fù)合物由負(fù)載相應(yīng)TCR(T細(xì)胞受體)的CD8陽(yáng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，肽和MHC II類(lèi)分子的復(fù)合物由負(fù)載相應(yīng)TCR的CD4陽(yáng)性輔助T細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。本領(lǐng)域已熟知TCR、肽和MHC 由此按1:1:1的化學(xué)計(jì)算量而存在。⑶4陽(yáng)性輔助T細(xì)胞在誘導(dǎo)和維持⑶8陽(yáng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的有效反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Wang and Livingstone, 2003 ；Sun and Bevan,2003 ；Shedlock and Shen，2003)o 最初，CTL在淋巴結(jié)中的啟動(dòng)和擴(kuò)展由CD4+T細(xì)胞支持(Schoenberger et al.，1998)。 因此，一個(gè)機(jī)制可能引導(dǎo)幼稚⑶8+細(xì)胞至功能性⑶4+T細(xì)胞所在的地方-APC相互作用 (Castellino et al.，2006)。最后，功能性CD8+記憶細(xì)胞的產(chǎn)生在大多數(shù)情況下依賴(lài)于 CD4+T細(xì)胞的協(xié)助(Sun and Bevan，2003 Janssen et al. ,2003) 由于這些原因，腫瘤相關(guān)抗原(TAA)衍生的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞表位的識(shí)別對(duì)開(kāi)發(fā)能引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)的藥物產(chǎn)品可能非常重要(Kobayashi et al. ,2002 ；Qin et al. ,2003 ；Gnjatic et al. ,2003) 在腫瘤部位，T輔助細(xì)胞維持著對(duì)CTL友好的細(xì)胞因子環(huán)境^lin and Blankenstein, 2000 ； Mortaraet al.，2006)并吸引效應(yīng)細(xì)胞，如CTL、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞(Marzo et al.， 2000 ；Hwang et al.，2007)。在沒(méi)有炎癥的情況下，MHC II類(lèi)分子的表達(dá)主要局限于免疫系統(tǒng)細(xì)胞，尤其是專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞(APC)，例如，單核細(xì)胞、單核細(xì)胞源性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞。出人意料的是，在癌癥患者的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有MHC II類(lèi)分子的表達(dá)(Dengjel et al.，2006)。哺乳動(dòng)物(如小鼠)模型顯示，即使沒(méi)有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)效應(yīng)細(xì)胞 (如，⑶8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞)，⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞也能通過(guò)分泌干擾素-Y (IFN y )抑制血管生成從而抑制腫瘤的出現(xiàn)Olin and Blankenstein，2000)。另外，有人提出以細(xì)胞毒性CD4+T 細(xì)胞通過(guò)淋巴毒素和顆粒酶B直接殺死腫瘤細(xì)胞(Penna et al. ,1992 ；Littaua et al.， 1992)。此外，研究還顯示，由于⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞可從由HLA II類(lèi)分子提呈的腫瘤相關(guān)抗原中識(shí)別出肽，因此能夠通過(guò)誘導(dǎo)抗體(Ab)反應(yīng)而阻止腫瘤進(jìn)展(Kennedy et al.，2003)。與結(jié)合至HLA I類(lèi)分子的腫瘤相關(guān)肽相反，迄今只有少量的腫瘤相關(guān)抗原(TAA) 的II類(lèi)配體獲得描述。由于HLA II類(lèi)分子的組成性表達(dá)通常僅限于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(Mach et al.,
131996)，因此，直接從原發(fā)腫瘤中分離II類(lèi)肽被認(rèn)為是不可能的事。然而，Dengjel等人最近成功地在腫瘤中直接識(shí)別了多個(gè)MHC II類(lèi)表位(W0 2007/028574, EP 1 760 088 Bi; (Dengjel et al. ，2006)。腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞所識(shí)別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類(lèi)型的分子，如酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等，它們?cè)谙鄳?yīng)腫瘤的細(xì)胞中被表達(dá)，并且與同源未變的細(xì)胞相比，其表達(dá)上調(diào)。腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的目前分類(lèi)主要包括以下幾組(Novellino et al.，2005)1.癌-睪丸抗原T細(xì)胞能夠識(shí)別的最先確認(rèn)的TAA(van der Bruggen et al.， 1991)屬于這一類(lèi)抗原，由于其成員表達(dá)于組織學(xué)相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睪丸的精母細(xì)胞/精原細(xì)胞中、偶爾在胎盤(pán)中，因此，它最初被稱(chēng)為癌-睪丸(CT)抗原。由于睪丸細(xì)胞不表達(dá)HLA I類(lèi)和II類(lèi)分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細(xì)胞識(shí)別， 因此在免疫學(xué)上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員或 NY-ES0-1。2.分化抗原腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有TAA，大多數(shù)TAA發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤和正常黑色素細(xì)胞中。許多此類(lèi)黑色素細(xì)胞譜系相關(guān)蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用于癌癥的免疫治療。例子包括，但不僅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-Ι或前列腺癌的PSA。3.過(guò)度表達(dá)的TAA 在組織學(xué)相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測(cè)到了基因編碼被廣泛表達(dá)的TAA，一般表達(dá)水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低于T細(xì)胞識(shí)別的閾值水平，而它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)能夠通過(guò)打破先前確立的耐受性而引發(fā)抗癌反應(yīng)。這類(lèi)TAA的典型例子為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。4.腫瘤特異性抗原這些獨(dú)特的TAA產(chǎn)生于正常基因(如β -catenin,⑶K4等) 的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉(zhuǎn)化和/或進(jìn)展相關(guān)。腫瘤特異性抗原一般可在不對(duì)正常組織帶來(lái)自體免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的情況下誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。另一方面，這些TAA 在多數(shù)情況下只與其上確認(rèn)了有TAA的確切腫瘤相關(guān)，并且通常在許多個(gè)體腫瘤之間并不都共享TAA。5.由異常翻譯后修飾產(chǎn)生的TAA 此類(lèi)TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過(guò)度表達(dá)的蛋白產(chǎn)生，但仍然通過(guò)主要對(duì)腫瘤具有活性的翻譯后加工而具有腫瘤相關(guān)性。此類(lèi)TAA產(chǎn)生于變糖基化模式的改變，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生針對(duì)MUCl的新型表位或在降解過(guò)程中導(dǎo)致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性(Hanada et al. ,2004； Vigneron et al. ,2004)。6.腫瘤病毒蛋白這些TTA是病毒蛋白，可在致癌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且由于它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。這類(lèi)蛋白的例子有人乳頭狀瘤 16型病毒蛋白、E6和E7，它們?cè)趯m頸癌中表達(dá)。蛋白要被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別為具有腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原并用于治療，必須具備特殊的條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá)，而不由正常健康組織表達(dá)，或表達(dá)數(shù)量相對(duì)較少。更為適宜的情況是，該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中，而且濃度(即每個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原往往是源自直接參與因細(xì)胞周期控制或凋亡抑制中的一項(xiàng)功能而發(fā)生的正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白。另外，這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化事件的蛋白的下游靶標(biāo)也可能會(huì)被上調(diào)，因此可能與腫瘤間接相關(guān)。這些間接腫瘤相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的靶標(biāo)(Singh-Jasuja et al.，2004)。在這兩種情況中，至關(guān)重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原的肽(“免疫原性肽”)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)?；旧?，任何能與MHC分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個(gè)T細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi) T細(xì)胞反應(yīng)的前提是存在具有相應(yīng)TCR的T細(xì)胞并且不存在對(duì)該特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是開(kāi)發(fā)腫瘤疫苗的起點(diǎn)。識(shí)別和表征TAA的方法基于對(duì)患者或健康受試者CTL的使用情況，或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉(zhuǎn)錄特性或差別表達(dá)模式的產(chǎn)生 (Lemmel et al. ,2004 ；Weinschenk et al. ,2002)。然而，對(duì)腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過(guò)度表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識(shí)別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因?yàn)椋兄鄳?yīng)TCR的T細(xì)胞必須要存在而且對(duì)這個(gè)特定表位的免疫耐受性必須不存在或?yàn)樽畹退?，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此，只選擇那些蛋白過(guò)度表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽，并且這些肽是與可找到對(duì)抗性功能性T細(xì)胞的MHC分子結(jié)合在一起被提呈，這一點(diǎn)非常重要。這種功能性T細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地?cái)U(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能 (“效應(yīng)子T細(xì)胞”)的T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)Tm細(xì)胞反應(yīng)的輔助τ細(xì)胞表位支持CD8陽(yáng)性殺傷T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，其中包括直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能(該類(lèi)腫瘤細(xì)胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/MHC復(fù)合物)。這樣，腫瘤相關(guān)T輔助細(xì)胞表位單獨(dú)使用或與其它腫瘤相關(guān)肽結(jié)合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)的疫苗化合物的活性藥物成分。由于CD8依賴(lài)型和CD4依賴(lài)型這兩種反應(yīng)共同并協(xié)同地促進(jìn)抗腫瘤作用，因此，確定和表征由⑶8+CTL (配體:MHC I類(lèi)分子+肽表位)或⑶4陽(yáng)性T輔助細(xì)胞(配體MHC II 類(lèi)分子)識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原對(duì)開(kāi)發(fā)腫瘤疫苗非常重要。考慮到治療癌癥相關(guān)的嚴(yán)重副作用和費(fèi)用，迫切需要更好的預(yù)后和診斷方法。因此，有必要確定代表癌癥生物標(biāo)志物的其它因子，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。此外，有必要確定可用于治療癌癥的因子，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。此外，還沒(méi)有確立的治療設(shè)計(jì)，可用于根治性前列腺切除術(shù)后生化性復(fù)發(fā)的前列腺患者，復(fù)發(fā)通常是由原發(fā)部位殘留的腫瘤出現(xiàn)局部晚期腫瘤生長(zhǎng)所致。需要會(huì)降低發(fā)病率且療效與現(xiàn)有治療方法相當(dāng)?shù)男滦椭委煼椒?。本發(fā)明提出了有利于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌以及其它過(guò)度表達(dá)生存素和/ 或CSP的腫瘤的肽和/或本發(fā)明的其它肽。這些肽由質(zhì)譜分析法部分直接顯示，由HLA分子在人原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本上自然提呈(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例1和圖1)，或在SEQ ID 26的情況下，根據(jù)SYFPEITHI預(yù)測(cè)算法(Rammensee et al.，1995)預(yù)測(cè)為與HLA-DR等位基因 HLA-DRB 1*0U DRB1*03、DRB 1*04, DRB1*11和DRB1*15結(jié)合的混雜結(jié)合劑?；谠摂?shù)據(jù)和這些常出現(xiàn)的DRBl等位基因的出現(xiàn)頻率，我們可以假設(shè)，92%的A*02陽(yáng)性的白種人表達(dá)至少一種與根據(jù)SEQ ID NO 26的肽結(jié)合的DRBl等位基因。衍生SEQ ID NO 26至30序列的源基因-生存素-顯示，其與正常細(xì)胞相比，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺腫瘤、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、黑色素瘤(Tamm etal. 1998)、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、白血病和髓母細(xì)胞瘤中呈高度過(guò)度表達(dá)(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例2 和圖幻，這表明該肽與腫瘤關(guān)聯(lián)程度高，即這些肽在腫瘤組織上被強(qiáng)勁提呈，但不在正常組織上被提呈。W02004/067023介紹了腫瘤相關(guān)抗原生存素衍生的MHC I類(lèi)限制肽，這些肽能與HLA I類(lèi)分子高親和性結(jié)合。HLA結(jié)合肽能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，特別是T淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞。T細(xì)胞可破壞提呈被識(shí)別的HLA/肽復(fù)合物(如提呈衍生肽的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞)的細(xì)胞。由生存素衍生肽激活的輔助T細(xì)胞能抑制腫瘤血管形成，能吸引免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子細(xì)胞并促進(jìn)CTL的啟動(dòng)、增殖和持續(xù)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明的所有肽已被證明具有刺激T細(xì)胞反應(yīng)的能力(參見(jiàn)實(shí)施例3和圖3)。因此，該等肽可用于在患者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而能夠毀滅腫瘤細(xì)胞?；颊叩拿庖叻磻?yīng)能夠通過(guò)直接給予患者所述肽或前體物質(zhì)(如，加長(zhǎng)肽、蛋白或編碼這些肽的核酸)，較理想是與加強(qiáng)免疫原性的制劑相結(jié)合，而進(jìn)行誘導(dǎo)。源自該治療性疫苗的免疫反應(yīng)預(yù)期能夠高度特異性地對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，因?yàn)楸景l(fā)明的目標(biāo)肽在正常組織上提呈的復(fù)制數(shù)目較少，防止患者發(fā)生對(duì)抗正常細(xì)胞的不良自體免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。藥品組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽。此處使用的“藥用鹽”系指所公開(kāi)的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進(jìn)行改性。例如，酸性鹽采用自由基(通常其中藥物的中性形式具有一種中性-NH2基團(tuán))通過(guò)與合適酸發(fā)生反應(yīng)而制得。適合制備酸鹽的酸包括有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團(tuán)的堿鹽制劑使用藥用堿基進(jìn)行制備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)或鹽酸(氯化物)形式的肽。本發(fā)明的肽除了用于治療癌癥，也可用于診斷。由于肽由膠質(zhì)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生，并且已確定這些肽在正常組織中不存在，因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。組織切片上存在權(quán)利要求的肽可有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質(zhì)譜或其它本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測(cè)某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎癥還是一般病變。肽基團(tuán)的存在使得能對(duì)病變組織進(jìn)行分類(lèi)或子分類(lèi)。對(duì)病變標(biāo)本中肽的檢測(cè)使得能對(duì)免疫系統(tǒng)治療方法的利益進(jìn)行判斷，特別是如果 T淋巴細(xì)胞已知或預(yù)計(jì)與作用機(jī)制有關(guān)。MHC表達(dá)的缺失是一種機(jī)制，充分說(shuō)明了哪些受感染的惡性細(xì)胞逃避了免疫監(jiān)視。因此，肽的存在表明所分析的細(xì)胞并沒(méi)有利用這種機(jī)制。肽可用于分析淋巴細(xì)胞對(duì)肽的反應(yīng)(如T細(xì)胞反應(yīng))，或抗體對(duì)肽或MHC分子絡(luò)合的肽發(fā)生的反應(yīng)。這些淋巴細(xì)胞反應(yīng)可以作為預(yù)后指標(biāo)，決定是否采取進(jìn)一步的治療。這些反應(yīng)也可以用作免疫療法中的替代指標(biāo)，旨在以不同方式誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞反應(yīng)，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移?；蛑委熤?，淋巴細(xì)胞對(duì)肽發(fā)生的反應(yīng)可以在副作用的評(píng)估中考慮。淋巴細(xì)胞反應(yīng)監(jiān)測(cè)也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價(jià)值的工具，如，用于檢測(cè)移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。肽可用于生成和開(kāi)發(fā)出抗MHC/肽復(fù)合物的特異性抗體。這些抗體可用于治療，將毒素或放射性物質(zhì)靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將放射性核素靶向病變組織。這可有助于檢測(cè)小轉(zhuǎn)移灶或確定病變組織的大小和準(zhǔn)確位置。此外，可用這些TUMAP在活檢樣本的基礎(chǔ)上驗(yàn)證病理師對(duì)癌癥的診斷。表1顯示了根據(jù)本發(fā)明的肽、它們各自的SEQ ID NO、各個(gè)肽所結(jié)合的HLA等位基因，以及產(chǎn)生這些肽的源蛋白。需要特別關(guān)注的一個(gè)事實(shí)是，根據(jù)SEQ ID :1所述的肽與 HLA-DR以及HLA-A*02結(jié)合，從而引發(fā)兩種不同的反應(yīng)。表1:本發(fā)明中的肽
權(quán)利要求
1.一種肽，包含一個(gè)選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 30的組的序列、或該序列的一種與SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 30具有85%同源性的變體、或該序列的一種誘導(dǎo)與所述肽發(fā)生T細(xì)胞交叉反應(yīng)的變體，其中所述肽不是基礎(chǔ)全長(zhǎng)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽或其變體，其中所述肽或其變體維持其與人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類(lèi)或II類(lèi)分子結(jié)合的能力，其中所述肽能夠刺激CD4和/或CD8T細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽，其中肽的氨基酸序列包含根據(jù)SEQID No. 1至SEQ ID No. 30的組的氨基酸的一個(gè)連續(xù)伸展段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽選自一種具有根據(jù)表2的特異性 HLA亞型并能夠刺激CD8細(xì)胞的肽，其中所述肽包括表2所示的特異性錨氨基酸基序。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽或其變體的總長(zhǎng)度為8至100個(gè)氨基酸、優(yōu)選為8至30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選為8至16個(gè)氨基酸，其中最優(yōu)選為該肽系由或基本系由根據(jù)SEQ ID No 1至SEQ ID No 30的氨基酸序列構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽為融合蛋白，尤其包含HLA-DR抗原相關(guān)不變鏈(Ii)的N端氨基酸。
8.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的肽的核酸。
9.一種能表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸的表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的肽、根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體用于藥物中。
11.一種宿主細(xì)胞，包括根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸或根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為抗原提成細(xì)胞，特別是樹(shù)突狀細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞。
12.—種制備根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的肽的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11所述的表達(dá)權(quán)利要求8所述核酸的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求9的表達(dá)載體，以及從該宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)基中分離出該肽。
13.—種體外制備激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類(lèi)MHC分子進(jìn)行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細(xì)胞表面或人工模擬的抗原提呈細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面上表達(dá)一段足夠的時(shí)間從而以抗原特異性方式激活CTL，其中所述抗原為根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的一種肽。
14.采用根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法制成的一種激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)， 其會(huì)選擇性地識(shí)別一種細(xì)胞，即異常表達(dá)一種包含權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所給定的一種氨基酸序列的多肽的細(xì)胞。
15.一種殺滅患者體內(nèi)靶標(biāo)細(xì)胞的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞異常表達(dá)一種多肽，即包含權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所給定的一種氨基酸序列的多肽；該方法包括給予患者有效數(shù)量的權(quán)利要求14中定義的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
16.使用根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的一種肽、根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種核酸、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求14 所述的一種激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞治療癌癥或制造抗癌藥劑，其中所述藥劑優(yōu)選為一種疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的使用，其中所述癌癥選自星形細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、混合型膠質(zhì)瘤、少突星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞瘤、畸胎瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、中央神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET，例如髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、管膜母細(xì)胞瘤)、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤(例如松果體細(xì)胞瘤、成松果體細(xì)胞瘤)、室管膜細(xì)胞瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、來(lái)源不明的神經(jīng)上皮腫瘤(例如大腦膠質(zhì)瘤病、星形母細(xì)胞瘤)或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺腫瘤、乳腺癌、食道癌、結(jié)直腸癌、透明腎細(xì)胞癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、白血病、髓母細(xì)胞瘤、結(jié)腸、直腸、胃、腎、肺、胰腺、前列腺、皮膚以及其它顯示過(guò)度表達(dá)生存素和/或CSPG4和/或其它源自SEQ ID 1至SEQ ID 30肽的蛋白的腫瘤。
18.一種藥盒，包括(a)一個(gè)容器，含有根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的一種肽、根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種細(xì)胞，或根據(jù)上述權(quán)利要求14所述的溶液或凍干形式的激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；(b)可選的第二個(gè)容器，其含有凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液；(c)可選的至少另一種肽，其選自由根據(jù)SEQID 1至30的肽構(gòu)成的組，以及(d)可選的(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍干粉劑型的說(shuō)明書(shū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥盒，進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)(iii)緩沖劑、(iv)稀釋劑、 (ν)過(guò)濾液、(Vi)針或(ν)注射器。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的藥盒，其中所述肽系選自由SEQID 1和SEQ ID 20 構(gòu)成的組。
21.一種將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與其它類(lèi)型癌癥區(qū)分的方法，包括分析取自來(lái)自待診斷受試者的腦或其它腫瘤標(biāo)本的一個(gè)樣本中BCA、CLIP2、DTNA、NLGNAX, NR2E1、NRCAM和/或PDPN 的表達(dá)。22.一種測(cè)量 BCA、CLIP2、DTNA, NLGNAX, NR2E1、NRCAM 和 / 或 PDPN 表達(dá)水平的藥盒， 其中(a)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)志物基因，包含至少一種特異性結(jié)合選定的膠質(zhì)母
細(xì)胞瘤標(biāo)志物多肽的抗體，或一種或多種特異性結(jié)合BCA、CLIP2、DTNA、NLGNAX、NR2E1、NRCAM和/或PDPN mRNA的核酸，可選地，一種對(duì)照(例如，指定量的特定膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)志物多肽)、一抗和二抗(適當(dāng)時(shí))、或任何其它試劑，如可檢測(cè)基元、酶底物和/或顯色劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于免疫治療方法的肽、核酸和細(xì)胞。特別是，本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法。本發(fā)明還涉及單獨(dú)使用或與其他腫瘤相關(guān)肽(刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)疫苗復(fù)合物的活性藥物成分)聯(lián)合使用的腫瘤相關(guān)細(xì)胞毒性T輔助細(xì)胞(CTL)肽表位。本發(fā)明涉及30種肽序列及其變體，它們?cè)醋钥捎糜谝l(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)的疫苗組合物中的人腫瘤HLA-I類(lèi)和II類(lèi)分子。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102170900SQ200980139419
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月1日
發(fā)明者克勞迪婭·特勞特魏因, 哈伯利特·辛格, 奧利弗·斯赫爾, 托尼·懷申克, 斯特芬·沃爾特, 諾波特·希爾夫 申請(qǐng)人:伊瑪提克斯生物技術(shù)有限公司