專利名稱：用于治療骨丟失的方法和組合物的制作方法
用于治療骨丟失的方法和組合物相關(guān)申請本申請要求于2008年3月M日提交的美國臨時申請?zhí)?1/039028，和于2009年 1月四日提交的美國臨時申請?zhí)?1/148313的優(yōu)先權(quán)利益。所有上文提及的優(yōu)先權(quán)申請的內(nèi)容在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
骨丟失的特征在于骨組織的結(jié)構(gòu)退化，這可以導(dǎo)致骨脆性和對骨折的易感性增加。骨丟失與許多疾病相關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，例如在放射照片上的骨傷害不僅呈現(xiàn)為侵蝕，而且還呈現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)疏松癥。[1]存在關(guān)于抑制炎癥以避免RA中骨傷害的重要性的數(shù)據(jù)。通過幾個隨機化對照臨床試驗的結(jié)果，有效抗炎治療已顯示減少關(guān)節(jié)侵蝕的進展。[4-6]破骨細(xì)胞的炎性活化與兩個特征都有關(guān)，[2，3]并且使用唑來膦酸二膦酸鹽 (bisphosphonatezoledronic acid)抑制破骨細(xì)胞活性已顯示減少侵蝕的進展[3]。少數(shù)研究已提示抗TNF療法可能具有預(yù)防一般骨丟失的能力。例如，抗腫瘤壞死因子(抗TNF)療法的抗炎作用已顯示顯著減少RA患者中的放射照相的關(guān)節(jié)傷害進展。 [4-6]還存在抗炎治療減少泛化的骨質(zhì)疏松癥的證據(jù)。[7-9]由于其在評估早期RA中的炎性骨累及中的靈敏性，已推薦定量手骨測量。[10] 然而，僅少數(shù)研究已檢查抗炎治療(包括抗TNF療法)對RA中的手骨丟失的作用。[9，11， 12]在采用定量超聲(QUS)的一項研究中，抗TNF療法的使用對關(guān)節(jié)周圍的骨具有正面作用。[11]然而，僅執(zhí)行了一個隨機化對照試驗，其中與安慰劑相比較潑尼松龍(每日7. 5mg) 的抗炎作用顯示不僅顯著減小放射照相的關(guān)節(jié)傷害的速率，還顯著減小手骨丟失的速率。 [12]然而，除其抗炎作用外，潑尼松龍還已知引起骨質(zhì)疏松癥。[12]同樣，仍需要用于治療骨丟失特別是手骨丟失的治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療受試者中的骨丟失例如減少和/或預(yù)防骨丟失的方法，其包括給受試者施用TNFa抑制劑，例如抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，治療受試者手中的骨丟失。在一個實施方案中，治療皮質(zhì)手骨丟失。在一個實施方案中，受試者具有與骨丟失相關(guān)的病癥。在一個實施方案中，受試者具有骨質(zhì)疏松癥。在一個實施方案中，受試者具有骨關(guān)節(jié)炎。在另外一個實施方案中，受試者具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。在一個實施方案中，受試者具有骨質(zhì)疏松癥和RA。在本發(fā)明的一個實施方案中，TNFCI抑制劑與另外試劑組合施用。在一個實施方案中，TNFa抑制劑與氨甲蝶呤組合施用。在另一個實施方案中，TNF α抑制劑與抗再吸收試劑(antiresorptive agent)組合施用，所述抗再吸收試劑例如阿侖特羅、阿侖特羅加上維生素D3、伊本膦酸鈉、利塞膦酸鈉、含鈣的利塞膦酸鈉、唑來膦酸、降鈣素、雌激素和雷洛昔芬。在另外一個實施方案中，TNF α抑制劑與骨形成試劑組合施用，所述骨形成試劑例如甲狀旁腺激素例如特立帕肽。在一個實施方案中，施用TNFa抑制劑用于治療骨丟失的受試者可以就具有骨丟失和/或處于具有骨丟失危險中進行選擇。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療受試者中的手骨丟失的方法，其包括選擇具有手骨丟失或處于具有手骨丟失危險中的受試者，并且給受試者施用TNFa抑制劑，從而治療手骨丟失。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法對先前選擇為具有骨丟失或處于具有骨丟失危險中的受試者執(zhí)行。本發(fā)明還提供了用于預(yù)測骨丟失包括但不限于手骨丟失的方法。本發(fā)明提供了可以用于預(yù)測受試者中的骨丟失例如手骨丟失的指標(biāo)。例如，受試者的年齡和/或CRP水平可以用于預(yù)測受試者中的手骨丟失。在本發(fā)明的一個實施方案中，TNFa抑制劑是TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個實施方案中，TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫單抗(inliximab)或戈利木單抗 &01加11111￡113)。在一個實施方案中，人1順(1抗體或其抗原結(jié)合部分以IX 10_1或更少的Kd 和IX KT3iT1或更少的Koff速率常數(shù)與人TNF α解離，兩者都通過表面等離振子共振進行測定，并且在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 X 10_7M或更少的IC5tl中和人TNF α細(xì)胞毒性。在另一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分具有下述特征如通過表面等離振子共振測定的，以1 X ΙΟ、—1或更少的K。ff速率常數(shù)與人TNF α解離；具有輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域， 其包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通過在位置1、4、5、7或8上的單個丙氨酸取代，或通過在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO :3修飾的氨基酸序列；并且具有重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過在位置2、3、4、 5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5個保守氨基酸取代由SEQID NO 4修飾的氨基酸序列。在一個實施方案中，人TNF a 抗體或其抗原結(jié)合部分包括具有CDR3結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)(LCVR)，所述CDR3結(jié)構(gòu)域包括 SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通過在位置1、4、5、7或8上的單個丙氨酸取代由SEQ ID NO: 3修飾的氨基酸序列，并且包括具有CDR3結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)(HCVI )，所述CDR3結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代由SEQ ID NO :4修飾的氨基酸序列。在一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分包括包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)，和包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)。在一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達木單抗(adalimumab)。在另一個實施方案中，人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分是戈利木單抗。附圖簡述

圖1是在本發(fā)明分析中檢查的具有早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的流程圖。與原始研究J相比較丟失X射線數(shù)目在括號中提供。MTX=氨甲蝶呤；MR=數(shù)字X射線放射照片測量術(shù)(radiogrammetry) ；MCI =掌骨皮質(zhì)指數(shù)；BMD =骨量(bone mass)密度。圖2顯示在研究J的3個治療組中隨著時間過去在DXR-MCI (百分比)和改良的 Sharp得分(單位)中的改變(A =中值，B =平均值)。Mod. Sharp得分=改良的總Siarp 得分；MTX =氨甲蝶呤；D)(R =數(shù)字X射線放射照片測量術(shù)；MCI =掌骨皮質(zhì)指數(shù)。圖3是累積概率圖-在研究J中在104周時DXR-MCI和放射照相得分中的改變。 Mod. Sharp得分=改良的總Siarp得分；MTX =氨甲蝶呤；D)(R =數(shù)字X射線放射照片測量術(shù);MCI =掌骨皮質(zhì)指數(shù)。
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發(fā)明詳述I.定義如本文使用的，術(shù)語“人TNFa ”(本文縮寫為hTNFa，或簡單地hTNF)意指作為17kD分泌形式和^kD膜結(jié)合形式存在的人細(xì)胞因子，其生物活性形式由非共價結(jié)合的17kD分子的三聚體組成。hTNF α的結(jié)構(gòu)在例如Pennica，D.，等人(1984) Nature 312 :724-729 ；Davis, J. Μ.，等人(1987) Biochemistry 26 :1322-1326 ；和 Jones, Ε. Y.，等人(1989)Nature 338 :225-2 中進一步描述。術(shù)語人TNFβ意欲包括重組人 TNFa (rhTNF a )，其可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組表達法進行制備或進行商業(yè)購買(R&D Systems,目錄號 210-TA, Minneapolis, Minn.)。TNF α 在本文中也稱為 TNF。術(shù)語“TNFa抑制劑”包括干擾TNFa活性的試劑。該術(shù)語還包括本文描述的抗 TNFa人抗體和抗體部分中的每一種以及美國專利號6，090，382 ；6, 258, 562 ；6，509，015以及美國專利申請系列號09/801，185和10/302，356中描述的那些，所述專利文獻各自引入本文作為參考。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的TNFa抑制劑是抗TNFa抗體或其片段，包括英夫單抗(Remicade , Johnson和Johnson ；在引入本文作為參考的美國專利號 5，656，272 中描述)、CDP571 (人源化單克隆抗 TNF α IgG4 抗體)、CDP 870 ( CIMZIA , 人源化單克隆抗TNF α抗體片段)、抗TNF dAb (Peptech)XNTO 148 (戈利木單抗；Medarex 和 Centocor，參見 WO 02/12502)、和阿達木單抗(HUMIRA Abbott Laboratories,人抗TNF mAb，在美國專利號6，090，382中描述為D2E7)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的另外TNF抗體在美國專利號6，593，458 ；6, 498, 237 ；6, 451, 983 ；和6，448，380中描述，所述專利各自引入本文作為參考。在另一個實施方案中，TNFa抑制劑是TNF融合蛋白，例如依那西普 (Enbrel ,Amgen ；在引入本文作為參考的WO 91/0；3553和WO 09/406，476中描述)。在另一個實施方案中，TNFa抑制劑是重組TNF結(jié)合蛋白(r_TBP_I) (Serono)。如本文使用的，術(shù)語“抗體”意指由4條多肽鏈——通過二硫鍵互聯(lián)的2條重(H) 鏈和2條輕(L)鏈——組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域——CHU CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個結(jié)構(gòu)域 CL組成。VH和VL區(qū)可以進一步再分成稱為互補性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，由稱為構(gòu)架區(qū) (FR)的更保守區(qū)域點綴。每個VH和VL由3個CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發(fā)明的抗體在美國專利號 6，090，382 ；6, 258，562 ；和6，509,015中進一步詳細(xì)描述，所述專利各自整體引入本文作為參考。如本文使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”或“抗原結(jié)合片段”(或簡單地“抗體部分”)指保留與抗原(例如，hTNFa )特異性結(jié)合的能力的一個或多個抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體的片段來執(zhí)行。結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F(ab' )2、 Fabc, Fv、單鏈和單鏈抗體。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包括的結(jié)合片段的例子包括 (i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab ‘ )2片段，包括在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段； (iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(ν)由VH或VL結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外， 盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成接頭進行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988) Science242 :423-426 ； 和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879-5883))。此種單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。還包括其他形式的單鏈抗體例如雙抗體。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達，但使用太短而不允許相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并且生成2個抗原結(jié)合部位(參見例如，Holliger等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ;Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。本發(fā)明的抗體部分在美國專利號6，090，382,6, 258，562,6, 509，015中進一步詳細(xì)描述，所述專利各自整體引入本文作為參考。再進一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結(jié)合形成的，較大的免疫粘附分子的部分。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.， 等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6 :93-101)，以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端聚組氨酸標(biāo)記，以制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人 (1994)Mol. Immunol. 31 :1047-1058)?？贵w部分例如Fab和F(ab‘ )2片段可以使用常規(guī)技術(shù)由完整抗體進行制備，例如分別地完整抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本文描述的，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得。如本文使用的，“保守氨基酸取代”是其中一個氨基酸殘基由具有相似側(cè)鏈的另一個氨基酸殘基替換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域中進行定義，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、非荷電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β 分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?！扒逗峡贵w”指這樣的抗體，其中重和輕鏈的氨基酸序列各自的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟悇e的抗體中的相應(yīng)序列同源，而鏈的剩余區(qū)段與來自另一個物種的相應(yīng)序列同源。在一個實施方案中，本發(fā)明的特征在于嵌合抗體或抗原結(jié)合片段，其中輕和重鏈的可變區(qū)模擬衍生自哺乳動物的一個物種的抗體可變區(qū)，而恒定部分與衍生自另一個物種的抗體中的序列同源。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，嵌合抗體通過將來自小鼠抗體的 CDRs嫁接到人抗體的構(gòu)架區(qū)上進行制備?！叭嗽椿贵w”指包括至少一條這樣的鏈的抗體，所述鏈包括基本上來自人抗體鏈 (被稱為受體免疫球蛋白或抗體)的可變區(qū)構(gòu)架殘基和基本上來自非人抗體(例如，小鼠) 的至少一個互補性決定區(qū)(OTR)。除⑶Rs嫁接外，人源化抗體一般經(jīng)歷進一步改變，以改善親和力和/或免疫原性。術(shù)語“多價抗體”指包括超過一個抗原識別位點的抗體。例如，“二價”抗體具有 2個抗原識別位點，而“四價”抗體具有4個抗原識別位點。術(shù)語“單特異性”、“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等指多價抗體中存在的不同抗原識別位點特異性數(shù)目(與抗原識別位點數(shù)目不同)。例如，“單特異性”抗體的抗原識別位點全部結(jié)合相同表位。“雙特異性” 或“雙重特異性”抗體具有結(jié)合第一種表位的至少一個抗原識別位點和結(jié)合與第一種表位不同的第二種表位的至少一個抗原識別位點?！岸鄡r單特異性”抗體具有全部結(jié)合相同表位的多個抗原識別位點?！岸鄡r雙特異性”抗體具有多個抗原識別位點，其中一些數(shù)目結(jié)合第一種表位，并且其中一些數(shù)目結(jié)合與第一種表位不同的第二種表位。如本文使用的，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基 (例如，通過體外隨機或位點專一誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在CDRs 且特別是CDR3中。然而，如本文使用的，術(shù)語“人抗體”不意欲包括這樣的抗體，其中衍生自另一個哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列已嫁接到人構(gòu)架序列上。如本文使用的，術(shù)語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達、生成或分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達載體表達的抗體(下文進一步描述)，從重組、組合人抗體文庫分離的抗體(下文進一步描述)，從對于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動物(例如，小鼠)分離的抗體(參見例如，Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 :6287)，或通過任何其他方法制備、表達、生成或分離的抗體，所述其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列的剪接。此種重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而，在特定實施方案中，對此種重組人抗體實施體外誘變(或， 當(dāng)使用對于人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動物時，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此，重組抗體的VH和VL 區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其盡管衍生自人種系VH和VL序列且與人種系VH和VL序列相關(guān)，但可能在體內(nèi)人抗體種系譜(repertoire)內(nèi)不天然存在。此種嵌合、人源化、人和雙重特異性抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如使用下述專利文獻中描述的方法PCT國際申請?zhí)朠CT/US86/02269 ；歐洲專利申請?zhí)?84，187 ；歐洲專利申請?zhí)?71，496 ；歐洲專利申請?zhí)?73，494 ；PCT國際公開號WO 86/01533 ；美國專利號4,816, 567 ；歐洲專利申請?zhí)?25,023 ；Better等人(1988) Science240 :1041-1043 ；Liu 等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :3439-3443 ；Liu 等人(1987) J. Immunol. 139 :3521-3526 ；Sun 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 214-218 ；Nishimura ^ 人(1987)Cancer Res. 47 :999-1005 ；Wood ^ 人(1985)Nature 314:446-449 ;Shaw 等人(1988)J. Natl. Cancer Inst. 80 :1553-1559) ；Morrison(1985) Science229 :1202-1207 ；Oi 等人(1986)BioTechniques 4 :214 ；美國專利號 5，225，539 ； Jones 等人(1986)Nature 321 :552-525 ;Verhoeyan 等人(1988)kience 239:1534; 和 Beidler 等人(1988) J. Immunol. 141 :4053-4060, Queen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033(1989)，美國專利號 5，530，101，美國專利號 5，585，089，美國專利號 5，693，761，美國專利號 5，693，762，Selick 等人，WO 90/07861，和 Winter，美國專利號 5^ 225，539 ο如本文使用的，“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合hTNFa的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合除hTNF α外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合hTNFa的分離的抗體與其他抗原例如來自其他物種的TNFa 分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)制品。
如本文使用的，“中和抗體”(或“中和hTNFa活性的抗體”)意指其與hTNFa的結(jié)合導(dǎo)致hTNFa的生物活性抑制的抗體。hTNFa的生物活性的這種抑制可以通過測量 hTNFa生物活性的一種或多種指示物進行評估，例如hTNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(在體外或在體內(nèi))、hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞活化和hTNFa與hTNF α受體的結(jié)合。hTNFa生物活性的這些指示物可以通過本領(lǐng)域已知的幾種標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測定中的一種或多種進行評估(參見，美國專利號6，090，382)。優(yōu)選地，抗體中和hTNF α活性的能力通過抑制hTNF α誘導(dǎo)的
細(xì)胞的細(xì)胞毒性進行評估。作為hTNFa活性的另外或可替代參數(shù)，可以評估抗體抑制 hTNF α誘導(dǎo)的在HUVEC上的ELAM-1表達的能力，作為hTNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞活化的量度。如本文使用的，術(shù)語“表面等離振子共振”指允許通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度中的改變來分析實時生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAcore系統(tǒng) (Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典禾口 Piscataway,N. J.)。關(guān)于進一步描述，參見美國專利號 6，258，562 的實施例 1 和Jijnsson等人(1993)Ann. Biol. Clin. 51 :19 ；JonSSOn 等人(1991)Biotechniques 11 :620-627 Johnsson 等人(1995) J. Mol. Recognit. 8 :125 ； 和 Johnnson 等人(1991)Anal. Biochem. 198 :268。如本文使用的，術(shù)語“KofT”意指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。如本文使用的，術(shù)語“Kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。如本文使用的，術(shù)語“IC50”意指抑制目的生物終點例如中和細(xì)胞毒性活性所需的抑制劑濃度。如本文使用的，術(shù)語“劑量”指施用于受試者的TNFa抑制劑的量。如本文使用的，術(shù)語“給藥”指施用物質(zhì)(例如，抗TNFa抗體)以達到治療目的 (例如，治療骨丟失)。“給藥方案”描述用于TNF α抑制劑的治療時間表，例如在延長的時間段期間和/ 或治療過程自始至終的治療時間表，例如在第O周時施用TNF α抑制劑的第一劑，隨后為在每兩周一次給藥方案上的TNFa抑制劑的第二劑。在一個實施方案中，給藥方案包括每月一次或每4周一次施用TNF α抑制劑，例如人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分。如本文使用的，術(shù)語“每兩周一次給藥方案”、“每兩周一次給藥”和“每兩周一次施用”指給受試者施用物質(zhì)(例如，抗TNFa抗體)以達到治療目的的時間過程(time course)，例如治療過程自始至終。每兩周一次給藥方案不意欲包括每周一次給藥方案?？梢岳缑?-19天、更優(yōu)選每11-17天、更加優(yōu)選每13-15天、并且最優(yōu)選每14天施用物質(zhì)。 在一個實施方案中，每兩周一次給藥方案在治療第O周時在受試者中起始。在另一個實施方案中，維持劑量在每兩周一次給藥方案上施用。在一個實施方案中，起始和維持劑量根據(jù)每兩周一次給藥方案施用。在一個實施方案中，每兩周一次給藥包括這樣的給藥方案，其中在第O周時開始將TNFa抑制劑的劑量每隔一周施用于受試者。在一個實施方案中，每兩周一次給藥包括這樣的給藥方案，其中對于給定時間段連續(xù)每隔一周將TNFa抑制劑的劑量施用于受試者，例如4周、8周、16周、24周、26周、32周、36周、42周、48周、52周、56周等。每兩周一次給藥方法也在引入本文作為參考的US 20030235585中描述。如在短語“與第二種試劑組合的第一種試劑”中的術(shù)語“組合”包括第一種試劑和第二種試劑的共施用，其例如可以在相同藥學(xué)上可接受的載體中溶解或混合，或施用第一種試劑，隨后為第二種試劑，或施用第二種試劑，隨后為第一種試劑。因此，本發(fā)明包括組合治療性治療的方法和組合藥物組合物。如在短語“伴隨治療方案”中的術(shù)語“伴隨”包括在第二種試劑的存在下施用試劑。伴隨治療性治療方法包括其中共施用第一種、第二種、第三種或另外試劑的方法。伴隨治療性治療方法還包括其中第一種或另外試劑在第二種或另外試劑的存在下施用的方法， 其中第二種或另外試劑例如可以先前已施用。伴隨治療性治療方法可以通過不同行動者 (actor)逐步執(zhí)行。例如，一個行動者可以給受試者施用第一種試劑，并且第二個行動者可以給受試者施用第二種試劑，并且施用步驟可以同時、或幾乎同時或在遠隔的時間執(zhí)行，只要第一種試劑(和另外試劑)在第二種試劑(和另外試劑)的存在下后施用。行動者和受試者可以是相同實體(例如，人)。如本文使用的，術(shù)語“聯(lián)合治療”指施用2種或更多種治療物質(zhì)，例如抗TNFa抗體和另一種藥物。一種或多種其他藥物可以在抗TNF α抗體的施用同時、之前或之后施用。如在本發(fā)明的背景中使用的，術(shù)語“治療”意欲包括用于治療骨丟失例如手骨丟失例如皮質(zhì)手骨丟失的治療性治療，以及預(yù)防或抑制措施。例如，術(shù)語治療可以包括在骨丟失例如手骨丟失發(fā)作前或后施用TNFa抑制劑，從而預(yù)防或去除疾病或病癥的癥征。作為另一個例子，在骨丟失的臨床表現(xiàn)后施用TNFa抑制劑以對抗與骨丟失相關(guān)的癥狀和/或并發(fā)癥和病癥構(gòu)成疾病的“治療”。此外，在發(fā)作后和在臨床癥狀和/或并發(fā)癥已發(fā)展后施用試劑構(gòu)成骨丟失的“治療”，其中施用影響疾病或病癥的臨床參數(shù)和可能疾病的改善。在一個實施方案中，治療受試者中的骨丟失包括減少病征和癥狀?！靶枰委煹摹蹦切┌ㄒ丫哂泄莵G失的哺乳動物例如人，包括其中待預(yù)防疾病或病癥的那些?？偟膩碚f，本發(fā)明提供了關(guān)于用TNFa抑制劑如人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分治療骨丟失例如手骨丟失例如皮質(zhì)手骨丟失的改進的用途和組合物。涉及用于治療骨丟失的方法和用途的組合物和制造物品包括試劑盒也預(yù)期作為本發(fā)明的部分。本發(fā)明的各個方面在本文中進一步詳細(xì)描述。II.用于治療骨丟失的用途和組合物本發(fā)明提供了通過給有此需要的受試者施用TNF α抑制劑例如TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分，治療骨丟失包括手骨丟失的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于治療具有與另一種病癥相關(guān)的骨丟失的受試者，所述另一種病癥包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和/或骨質(zhì)疏松癥?？梢允芤嬗诒景l(fā)明的方法的受試者包括已診斷有骨丟失 (或與骨丟失相關(guān)的病癥)的那些受試者，以及鑒定為處于關(guān)于骨丟失危險中的受試者(包括診斷有與骨丟失相關(guān)的病癥的受試者)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方對于治療手的骨丟失有用。在一個實施方案中，將TNF α抑制劑例如TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分施用于具有骨丟失(或與骨丟失相關(guān)的病癥)的受試者，從而阻止骨丟失的進展，或相當(dāng)于無治療的骨丟失減慢骨丟失的進展。因此，本發(fā)明的方法可以用于減少受試者中的骨丟失，以及預(yù)防進一步的骨丟失。本發(fā)明的一個方面涉及出乎意料的發(fā)現(xiàn)TNFci抑制劑例如人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分可以用于治療手骨丟失。在這個發(fā)現(xiàn)之前，使用嵌合TNF α抗體英夫單抗的研究顯示，即使治療的受試者的髖和脊柱中的骨丟失被阻止，但手骨丟失不停止。[9]因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療手骨丟失，包括與RA、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的手骨丟失。本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療具有手骨丟失或可能發(fā)展手骨丟失的受試者中的手骨丟失。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法對于治療皮質(zhì)骨丟失有用。與骨小梁或松質(zhì)骨形成對比，骨皮質(zhì)或骨密質(zhì)是致密的且形成骨的表面，促成人骨骼的80%重量。它是極硬的，由具有很少空隙的多個堆積層形成。它的主要功能是支持身體，保護器官，提供用于運動的杠桿，和(與松質(zhì)骨共同分擔(dān))貯存礦物質(zhì)。如本文描述的，下文提供的實施例的一個發(fā)現(xiàn)是TNFa抑制劑可以用于治療皮質(zhì)骨丟失。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于治療手的皮質(zhì)骨丟失。骨丟失例如皮質(zhì)骨丟失或手骨丟失例如皮質(zhì)手骨丟失的治療可以使用本領(lǐng)域已知的方法進行評估，包括但不限于，數(shù)字X射線放射照片測量術(shù)(DXR) (Sectra, Linkiiping,瑞典)。MR測量在相同數(shù)字化的手上的骨礦物質(zhì)密度(bmd)和掌骨皮質(zhì)指數(shù) (MCI)，用于評估放射照相的關(guān)節(jié)傷害。D)(R是傳統(tǒng)放射照片測量技術(shù)的計算機形式。在手放射照片上，計算機自動識別在第二、第三和第四掌骨的最狹窄部分周圍的目標(biāo)區(qū)(ROI)， 并且測量皮質(zhì)厚度、骨寬度和孔隙率118次/cm。DXR-BMD定義為c X VPAcomb X(l-p), 其中c是常數(shù)(通過平均起來DXR-BMD等于Hologic QDR-2000設(shè)備的中-遠側(cè)前臂區(qū)的結(jié)果決定)；VPA是體積/面積；并且ρ是孔隙率。DXR-MCI定義為組合皮質(zhì)厚度除以外部皮質(zhì)直徑，并且是不依賴于骨大小、骨長度和圖像捕獲設(shè)置的相對骨量度。通過其可以測定骨丟失的其他方法的例子在 Haugeberg(2008)Best Pract Res Clin Rheumatol 22(6) 1127-39中描述。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改善具有骨丟失的受試者的DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分的方法，其包括給有此需要的受試者施用TNF α抑制劑，例如TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，受試者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善是在用TNFa抑制劑治療前受試者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分的維持。DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分的此種維持指示骨丟失不是進行性的?？商娲?，在一個實施方案中，就骨丟失進行治療的受試者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以通過DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分喪失降低的速率進行測量。受試者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以相對于在治療前測定的起始基線得分進行測量。例如，在TNFa抑制劑治療約沈周或約13次TNFa抑制劑治療后，受試者可以具有DXR-MCI得分中1.4或更少的減少(例如，相對于基線得分—I. 4,-1. 3,-1. 2,-1. 1.、-1. 0,-0. 9,-0. 8,-0. 7,-0. 6,-0. 5,-0. 4,-0. 3,-0. 2 、-0. 1或0.0)。在另一個例子中，相對于基線得分，受試者的DXR-MCI得分中小于0.44(例如，-0· 43、_0· 42、_0· 41、-0· 40、_0· 39、_0· 38、_0· 37、_0· 36、_0· 35、_0· 34、_0· 33、_0· 32、_0 .31、-0. 30、-0. 29、-0. 28、-0. 27,-0. 26,-0. 25,-0. 24,-0. 23,-0. 22、_0. 21、_0. 20,-0. 19、_0 18,-0. 17,-0. 16,-0. 15,-0. 14,-0. 13,-0. 12,-0. 11,-0. 10,-0. 09,-0. 08,-0. 07,-0. 06,-0. 05、 -0. 04、-0. 03、-0. 02、-0. 01)的減少指示受試者中骨丟失的治療。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者中的骨丟失的方法，其包括在每兩周一次給藥方案上在第0周時給受試者施用人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分，例如人TNF a 抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，根據(jù)每兩周一次給藥方案，給具有骨丟失(或處于具有骨丟失危險中)的受試者皮下施用人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分?？商娲?，根據(jù)每月一次給藥方案，或由此抗體或其抗原結(jié)合部分每4周施用一次的給藥方案，給具有骨丟失(或處于具有骨丟失危險中)的受試者施用人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，通過在每兩周一次給藥方案上施用人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分治療骨丟失，進行至少約2周、至少約6周、至少約12周、至少約16周、至少約18周、 至少約20周、至少約22周、至少約M周、至少約30周、至少約36周、至少約52周至少約 72周、至少約96周、至少約104周等。任何上述值之間的值范圍也預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如23周、60周、64周等。在一個實施方案中，TNFa抑制劑例如抗體或其抗原結(jié)合部分也可以施用于受試者用于治療骨丟失，進行以月限定的時間段，例如3個月、6個月、12個月、18個月、M個月、 30個月、36個月、42個月、48個月、M個月、60個月等。任何上述值之間的值范圍也預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如38個月、50個月、52個月。在一個實施方案中，TNFa抑制劑例如抗體或其抗原結(jié)合部分也可以施用于受試者用于治療骨丟失，進行以年限定的時間段，例如1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年等。任何上述值之間的值范圍也預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如1. 5年、2. 2年、3. 5年。在本發(fā)明的方法中使用的TNFa抑制劑也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的給藥決定進行施用。例如，在一個實施方案中，根據(jù)基于重量的給藥方案，即mg/kg，將TNFa抑制劑施用于受試者用于治療骨丟失，由此TNF α抑制劑的量由受試者的重量決定。可替代地，TNFa 抑制劑可以根據(jù)固定劑量或總?cè)韯┝窟M行施用，由此對于每次施用遞送恒定固定量的 TNFa抑制劑。在一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分以IO-IOOmg的固定劑量施用于受試者。在一個實施方案中，人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分以40mg、50mg、60mg、 70mg、80mg、90mg、100mg等的固定劑量施用于受試者。任何上述值之間的值范圍也預(yù)期包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如85mg、95mg，基于上述劑量的范圍也一樣，例如20_80mg。在一個實施方案中，TNFa抑制劑的施用是腸胃外的(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在一個實施方案中，TNFa抑制劑通過靜脈內(nèi)輸注或注射進行施用。在另一個實施方案中，TNFa抑制劑通過肌內(nèi)注射或通過皮下注射(例如，每兩周一次，皮下注射)進行施用。在一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分根據(jù)肺技術(shù)施用于受試者?？紤]到本文的教導(dǎo)，本文描述的給藥方案可以進行調(diào)整，以提供最佳所需應(yīng)答，例如治療骨丟失。應(yīng)當(dāng)指出劑量值可以隨著骨丟失的類型和嚴(yán)重程度而改變。應(yīng)進一步理解對于任何具體受試者，根據(jù)規(guī)格的教導(dǎo)和個體需要以及施用組合物或監(jiān)督組合物施用的個人的職業(yè)判斷，隨著時間過去可以調(diào)整特定給藥方案，并且本文所述的劑量的量和范圍僅是示例性的，并且不意欲限制請求保護的本發(fā)明的范圍或?qū)嵺`。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括選擇具有骨丟失(或與骨丟失相關(guān)的病癥)或處于具有骨丟失(或與骨丟失相關(guān)的病癥)危險中的受試者。在另一個實施方案中， 本發(fā)明的方法包括給受試者施用TNFa抑制劑，所述受試者先前選擇為具有骨丟失(或與骨丟失相關(guān)的病癥)或選擇為處于具有骨丟失(或與骨丟失相關(guān)的病癥)危險中。在一個實施方案中，手骨丟失的預(yù)測值(predictor)在本文描述的實施例中描述，并且包括年齡和/或CRP水平。本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療與另一種病癥相關(guān)的骨丟失。在一個實施方案中，TNFa抑制劑用于減少具有與骨丟失相關(guān)的病癥的受試者中的骨丟失，例如手骨丟
13失。本文描述的方法可以用于預(yù)防具有與骨丟失相關(guān)的病癥或處于具有與骨丟失相關(guān)的病癥危險中的受試者中的骨丟失也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。關(guān)于與骨丟失相關(guān)的病癥的另外細(xì)節(jié)在下文描述。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎腫瘤壞死因子(TNF)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機理中的關(guān)鍵細(xì)胞因子。 TNFa已牽涉于激活組織炎癥且引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)破壞(參見例如，Moeller， Α.，等人(1990) Cytokine 2 :162-169 ；授予 Moeller 等人的美國專利號 5，231，024 ； Moeller, A.的歐洲專利公開號 260610 Bl ；Tracey 和 Cerami,同上；Arend, W. P.和 Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38 :151-160 ；Fava, R. Α.,等人(1993) Clin. Exp. Immunol. 94 261-266)。除關(guān)節(jié)破壞外，具有RA的受試者還具有局部和全身骨丟失。近年來，抑制TNF活性的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物已變成用于RA的確定的療法。阿達木單抗、依那西普和英夫單抗已證實在RA患者中的疾病控制以及放射照相的傷害的延遲和預(yù)防中的顯著改善(Breedveld 等人，Arthritis Rheum 2006 ；54 26-37 ；Genovese 等人 J Rheumatol 2005 ；32 :1232-42 ；Keystone φ A, Arthritis Rheum 2004 ；50 :1400-11 ； Navarro-Sarabia 等人’ Cochrane Database Syst Rev 2005 Jul. 20 ； (3) :CD005113 ； Smolen 等人，Arthritis Rheum 2006 ;54 :702-10 ;St. Clair 等人 Arthritis Rheum 2004 ； 50 :3432-43 ；van der Heijde 等人，ArthritisRheum 2006 ；54 :1063-74)。就抗TNF療法對具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的受試者中的手骨丟失的作用而言，僅進行了少數(shù)研究。一個開放群組(open-cohort)研究考察在接受英夫單抗的RA患者中的手BMD改變。在這個群組中，關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是即使髖和脊柱中的骨丟失被阻止，但手骨丟失不停止。[9]。因此，盡管用TNFa抑制劑英夫單抗的治療阻止具有RA的受試者中的全身骨丟失，但英夫單抗未能阻止手中的骨丟失。本發(fā)明提供了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)TNF α抑制劑例如人TNFa抗體可以用于治療具有RA的受試者中的骨丟失，包括手骨丟失。TNFa抑制劑可以用于治療處于具有骨丟失危險中的受試者中的骨丟失也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述受試者包括例如診斷有RA的受試者。在一個實施方案中，處于發(fā)展骨丟失危險中的受試者是具有早期RA或診斷有RA小于3年的受試者。在一個實施方案中，骨丟失的治療通過給具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者施用人 TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分來達到，其中人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分在每兩周一次給藥方案上施用。在一個實施方案中，人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分以約IO-IOOmg的劑量施用，包括但不限于，約40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或IOOmg的劑量。在一個實施方案中，人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達木單抗或戈利木單抗。令人驚訝的是，如本文所示，已發(fā)現(xiàn)人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分減少具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的受試者中的骨丟失，例如皮質(zhì)骨丟失，例如手的皮質(zhì)骨丟失，這不依賴于其對臨床評估的疾病活動性的作用。同樣，TNFa抑制劑療法的利益可以在具有RA的受試者中獲得，所述受試者不顯示臨床改善，因為骨丟失可以不依賴于臨床參數(shù)進行治療。骨質(zhì)疏松癥本發(fā)明的方法可以用于治療具有骨質(zhì)疏松癥或處于具有骨質(zhì)疏松癥危險中的受試者中的骨丟失，例如手骨丟失。骨質(zhì)疏松癥是特征在于低骨量和骨組織的結(jié)構(gòu)退化的疾病。骨質(zhì)疏松癥可以導(dǎo)致骨脆性和對骨折的易感性增加，特別是髖、脊柱和腕，盡管任何骨都可以受影響。骨質(zhì)疏松癥的例子包括但不限于，特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和髖關(guān)節(jié)一過性骨質(zhì)疏松癥(transient osteoporosis of the hip)。骨量減少是其中骨礦物質(zhì)密度低于正常的狀況，并且也可以根據(jù)本發(fā)明的方法進行治療。骨量減少通常被視為骨質(zhì)疏松癥的前身。同樣，TNFa抑制劑可以用于減少或預(yù)防具有骨量減少的受試者中的骨丟失，包括手骨丟失。骨質(zhì)疏松癥和骨量減少不僅可以起因于衰老和生殖狀態(tài)，還可以繼發(fā)于眾多疾病和病癥，以及由于眾多藥物的延長使用，例如抗驚厥劑(例如，用于癲癇)、皮質(zhì)類固醇(例如，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘)和/或免疫抑制劑(例如，用于癌癥)。例如，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥是通過服用糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨質(zhì)疏松癥形式，所述糖皮質(zhì)激素藥物例如潑尼松(強的松、Orasone等)、潑尼松龍O^relone)、地塞米松(氟美松、甲氟烯索) 和可的松(Cortone Acetate)。這些藥物經(jīng)常用于幫助控制許多風(fēng)濕性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、炎性腸病和風(fēng)濕性多肌痛。其中骨質(zhì)疏松癥可以是繼發(fā)性的其他疾病包括但不限于，青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、成骨作用不全、甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺機能亢進、Cushing氏綜合征、吸收不良綜合征、神經(jīng)性厭食和/或腎臟疾病。此外，眾多行為已與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)，例如長時間不活動或不動、營養(yǎng)不足(特別是鈣，維生素D)、 導(dǎo)致閉經(jīng)(不存在月經(jīng)期)的鍛煉過度、吸煙和/或酗酒。值得注意的是，具有風(fēng)濕性病學(xué)病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、全身性紅斑狼瘡和多關(guān)節(jié)青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的患者處于骨質(zhì)疏松癥增加的危險中，作為其疾病的部分或由于其他危險因素(特別是皮質(zhì)類固醇療法)。同樣，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于治療具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者中的骨質(zhì)疏松癥。骨關(guān)節(jié)炎本發(fā)明的方法可以用于治療具有骨關(guān)節(jié)炎或處于具有骨關(guān)節(jié)炎危險中的受試者中的骨丟失，例如手骨丟失。腫瘤壞死因子已牽涉于骨關(guān)節(jié)炎的病理生理學(xué)(Verm等人 (1993) Arthritis Rheum. 36 :819 ；Westacott 等人(1994) J Rheumatol. 21 :1710)。骨關(guān)節(jié)炎(OA)也被稱為肥大性骨關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)病和退行性關(guān)節(jié)病。OA是骨骼關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病，其影響所有年齡成年人中的特定關(guān)節(jié)，通常是膝、髖、手關(guān)節(jié)和脊柱。OA的特征在于許多下述表現(xiàn)包括關(guān)節(jié)軟骨的退化和變薄伴隨“潰瘍”或缺損(craters)的相關(guān)發(fā)展、骨贅形成、在邊緣處的骨肥大、以及滑膜中的改變和受累關(guān)節(jié)的膨大。此外，骨關(guān)節(jié)炎伴隨疼痛和僵硬，特別是在長時間活動后。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以用于治療骨關(guān)節(jié)炎。 骨關(guān)節(jié)炎的特征性放射照相的特征包括關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下硬化、骨贅病、軟骨下囊腫形成、骨游離體(loose osseous body)(或“關(guān)節(jié)鼠”)。用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物包括多種非類固醇消炎藥(NSAIDs)。此外，COX 2抑制劑包括西樂葆、洛芬昔布和伐地考昔(Bextra)以及依托考昔(Etoricoxib)也用于治療0A。 可以直接注射到關(guān)節(jié)內(nèi)的類固醇也可以用于減少炎癥和疼痛。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的TNF α抗體與NSAID、C0X2抑制劑和/或類固醇組合施用。與骨丟失相關(guān)的其他病癥在另一個實施方案中，可以治療在具有與骨丟失相關(guān)的病癥或處于具有與骨丟失相關(guān)的病癥危險中的受試者中的骨丟失，即其中存在骨密度進行性丟失和骨組織變薄的病癥。此種狀況包括但不限于侵蝕性關(guān)節(jié)炎、骨惡性腫瘤、骨軟化、甲狀旁腺機能亢進的骨骼變化、慢性腎衰竭(腎性骨營養(yǎng)不良癥)、畸形性骨炎(骨的I^get氏病)和溶骨性轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于治療具有TNFa相關(guān)病癥的受試者(參見例如， US20040126372和US6，090, 382中描述的病癥，所述專利文獻各自的內(nèi)容特別引入本文作為參考)。在一個實施方案中，施用TNFa抑制劑用于治療骨丟失的受試者可以就具有骨丟失和/或處于具有骨丟失危險中進行選擇。例如，絕經(jīng)后的受試者可能處于發(fā)展骨丟失危險中。在另一個例子中，診斷有骨關(guān)節(jié)炎的受試者可能具有骨丟失，包括手骨丟失，并且因此，可以受益于本發(fā)明的方法。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括鑒定可能受益于本發(fā)明的方法的受試者，即骨丟失例如手骨丟失的治療，并且隨后給受試者施用TNFa抑制劑用于治療。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了用于治療受試者中的手骨丟失的方法，其包括選擇具有手骨丟失或處于具有手骨丟失危險中的受試者，并且給受試者施用TNFa抑制劑，從而使得手骨丟失得到治療?？商娲?，本發(fā)明的方法可以對先前選擇為具有骨丟失或處于具有骨丟失危險中的受試者執(zhí)行，所述骨丟失包括手骨丟失。III. TNF 抑制劑在本發(fā)明的方法和組合物中使用的TNF α抑制劑包括干擾TNF α活性的任何試劑。在優(yōu)選實施方案中，TNFa抑制劑可以中和TNFa活性，特別是有害的TNF α活性。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的TNFa抑制劑是TNF α抗體(在本文中也稱為TNFa抗體)或其抗原結(jié)合片段，包括嵌合、人源化和人抗體?？梢栽诒景l(fā)明中使用的 TNFa抗體的例子包括但不限于，英夫單抗(Remicade ，Johnson和Johnson ；在引入本文作為參考的美國專利號5，656，272中描述)、CDP571 (人源化單克隆抗TNF α IgG4抗體)、 CDP 870(人源化單克隆抗TNF α抗體片段)、抗TNF dAb (Peptech)XNTO 148(戈利木單抗； Medarex和Centocor，參見引入本文作為參考的WO 02/12502和US 7,250，165)、和阿達木單抗(HUMIRA AbbottLaboratories,人抗 TNF mAb，在美國專利號 6，090，382 中描述為D2E7)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的另外TNF抗體(及其序列)在美國專利號6，593，458 ； 6，498，237 ；6，451，983 ；7, 250，165 ；和6，448，380中描述，所述專利各自特別引入本文作為參考?？梢栽诒景l(fā)明的方法和組合物中使用的TNFa抑制劑的其他例子包括依那西普 (Enbrel，在WO 91/0；3553和WO 09/406，476中描述)、可溶性TNF受體I型、加入聚乙二醇的可溶性TNF受體I型(PEGsTNF-Rl)、p55TNFRlgG (來那西普(Lenerc^pt))和重組TNF結(jié)合蛋白(r-TBP-I) (Serono)。在一個實施方案中，術(shù)語“ TNF α抑制劑”排除英夫單抗。在一個實施方案中，術(shù)語 "TNFa抑制劑”排除阿達木單抗。在另一個實施方案中，術(shù)語“TNF α抑制劑”排除阿達木單抗和英夫單抗。在一個實施方案中，術(shù)語“TNF α抑制劑”排除依那西普，和任選地阿達木單抗、英夫單抗、以及阿達木單抗和英夫單抗。在一個實施方案中，術(shù)語“TNFa抗體”排除英夫單抗。在一個實施方案中，術(shù)語 "TNF^抗體”排除阿達木單抗。在另一個實施方案中，術(shù)語“TNF α抗體”排除阿達木單抗和英夫單抗。在一個實施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或測定TNFa抑制劑用于治療骨丟失的功效的用途和組合物，其中TNFa抗體是分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，其以高親和力和低解離速率與人TNF α結(jié)合，并且還具有高中和能力。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的人抗體是重組、中和人抗hTNF α抗體。本發(fā)明最優(yōu)選的重組、中和抗體在本文中被稱為D2E7，也稱為HUMIRA 或阿達木單抗(D2E7 VL區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO=I 中；D2E7 VH區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :2中)。D2E7 (阿達木單抗/ HUMIRA )的性質(zhì)已在Salfeld等人，美國專利號6，090，382,6, 258，562和6，509，015中描述，所述專利各自引入本文作為參考。本發(fā)明的方法還可以使用嵌合和人源化鼠類抗hTNFa抗體執(zhí)行，所述抗體已經(jīng)歷用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床測試(參見例如，Elliott, Μ. J.， 等人(1994)Lancet 344 :1125-1127 ；Elliot, Μ. J.，等人(1994)Lancet 344 :1105-1110 ； Rankin, Ε. C.，等人(1995)Br. J. Rheumatol. 34 :334-342)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括測定D2E7抗體和抗體部分、D2E7相關(guān)抗體和抗體部分、或具有與D2E7等價性質(zhì)的其他人抗體和抗體部分用于治療骨丟失的功效，所述性質(zhì)例如與hTNFa的高親和力結(jié)合伴隨低解離動力學(xué)和高中和能力。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的治療，其以IX 10-8M或更少的Kd和 1乂10-38-1或更少的1(#€速率常數(shù)與人1順(1解離，兩者都通過表面等離振子共振進行測定，并且在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 X 10-7M或更少的IC50中和人TNF α細(xì)胞毒性。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以5 X 10-4S-1或更少的KofT與人TNF α解離，或甚至更加優(yōu)選地，以1 X 10-4s-l或更少的Koff。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 X 10-8M或更少的IC50中和人TNF α細(xì)胞毒性，甚至更加優(yōu)選以1Χ10-9Μ或更少的IC50，和更加優(yōu)選以1 Χ10-10Μ或更少的IC50。在優(yōu)選實施方案中， 抗體是分離的人重組抗體或其抗原結(jié)合部分。本領(lǐng)域眾所周知的是抗體重和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對于抗原的結(jié)合特異性/ 親和力中起重要作用。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及通過施用人抗體治療骨丟失，所述人抗體對于與hTNFa結(jié)合具有緩慢的解離動力學(xué)，并且具有在結(jié)構(gòu)上與D2E7的那些等同或相關(guān)的輕和重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。D2E7 VL⑶R3的位置9可以由Ala或Thr占據(jù)，而基本上不影響Koff。因此，關(guān)于D2E7 VL⑶R3的共有基序包括氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/ A) (SEQ ID NO :3)。此外，D2E7 VH CDR3的位置12可以由Tyr或Asn占據(jù)，而基本上不影響 Koff0因此，關(guān)于D2E7 VH CDR3的共有基序包括氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L_D-(Y/ N) (SEQ ID NO 4)。此外，如美國專利號6，090，382的實施例2中證實的，D2E7重和輕鏈的 ⑶R3結(jié)構(gòu)域適合于由單個丙氨酸殘基的取代(在VL⑶R3內(nèi)的位置1、4、5、7或8上，或在 VH CDR3內(nèi)的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)，而基本上不影響Koff。再進一步地，技術(shù)人員將認(rèn)識到，給定D2E7 VL和VH CDR3對由丙氨酸取代的適應(yīng)性，在CDR3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的其他氨基酸取代可以是可能的，同時仍保留抗體的低解離速率常數(shù)，特別是用保守氨基酸取代。 優(yōu)選地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)進行不超過1_5個保守氨基酸取代。更優(yōu)選地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)進行不超過1_3個保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不應(yīng)在對于與hTNF α結(jié)合關(guān)鍵的氨基酸位置上進行。D2E7 VL⑶R3的位置2和 5以及D2E7 VHCDR3的位置1和7看起來對于與hTNF α相互作用是關(guān)鍵的，并且因此，保守氨基酸取代優(yōu)選不在這些位置上進行(盡管如上所述在D2E7 VIXDR3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的)(參見美國專利號6，090, 382)。
因此，在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含下述特征a)如通過表面等離振子共振測定的，以IX 10-3s-l或更少的Koff速率常數(shù)與人 TNF α解離；b)具有輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通過在位置1、4、
5、7或8上的單個丙氨酸取代，或通過在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1-5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO 3修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過在位置2、3、 4、5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12 上的1-5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO 4修飾的氨基酸序列。更優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合部分以5X 10-4S-1或更少的Koff與人TNF α解離。 甚至更加優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合部分以1\10-48-1或更少的1(0 與人1順(1解離。在另外一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含具有CDR3結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)(LCVI )，所述⑶R3結(jié)構(gòu)域包括SEQ IDNO 3的氨基酸序列，或通過在位置1、4、5、7 或8上的單個丙氨酸取代由SEQ ID NO 3修飾的氨基酸序列，以及具有⑶R3結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)(HCVI )，所述⑶R3結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :4的氨基酸序列，或通過在位置2、3、4、5、
6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代由SEQID NO :4修飾的氨基酸序列。優(yōu)選地，LCVR進一步具有包括SEQ ID NO 5的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域(S卩，D2E7 VL⑶R2)，并且HCVR 進一步具有包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域(即，D2E7 VH⑶R2)。甚至更加優(yōu)選地，LCVR進一步具有包括SEQ ID NO 7的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域(即，D2E7 VL CDR1)，并且HCVR具有包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域(即，D2E7 VH CDR1)。 關(guān)于VL的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自V κ I人種系家族，更優(yōu)選來自Α20人種系Vk基因，并且最優(yōu)選來自美國專利號6，090，382的圖IA和IB中所示的D2E7 VL構(gòu)架序列。關(guān)于VH的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自VH3人種系家族，更優(yōu)選來自DP-31人種系VH基因，并且最優(yōu)選來自美國專利號 6，090, 382的圖2Α和2Β中所示的D2E7 VH構(gòu)架序列。因此，在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含輕鏈可變區(qū)(LCVR) 和重鏈可變區(qū)(HCVI )，所述LCVR包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列(S卩，D2E7 VUJy^iHCVR 包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列(S卩，D2E7 VH)。在特定實施方案中，抗體包括重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgGl 重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)。此外，抗體可以包括輕鏈恒定區(qū)，κ輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體包括κ輕鏈恒定區(qū)?？商娲?，抗體部分可以是例如Fab片段或單鏈Fv片段。在另外其他的實施方案中，本發(fā)明包括包含D2E7相關(guān)VL和VHCDR3結(jié)構(gòu)域的分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的用途。例如，抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR) 或重鏈可變區(qū)(HCVR)，所述LCVR具有包括選自下述的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO :3,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :14,SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :18,SEQ ID NO :19,SEQ ID NO :20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 禾口 SEQ ID NO :26，所述 HCVR 具有包括選自下述的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域SEQID NO :4、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、 SEQ ID NO29,SEQ IDNO30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32,SEQ ID NO33,SEQ IDNO 34和 SEQ ID NO :35ο在本發(fā)明的方法和組合物中使用的TNFa抗體可以進行修飾用于骨丟失的改善治療。在一些實施方案中，TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段進行化學(xué)修飾以提供所需作用。 例如，本發(fā)明的抗體和抗體片段的加入聚乙二醇可以通過本領(lǐng)域已知的任何加入聚乙二醇反應(yīng)進行，如例如在下述參考文獻中描述的Focus on Growth Factors 3:4-10(1992)； EP 01M316;和EP 0401384(所述文獻各自整體引入本文作為參考)。優(yōu)選地，加入聚乙二醇經(jīng)由與反應(yīng)性聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)執(zhí)行。用于本發(fā)明抗體和抗體片段的加入聚乙二醇的優(yōu)選水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG)。如本文使用的，“聚乙二醇”意欲包括已用于衍生其他蛋白質(zhì)的任何形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。用于制備本發(fā)明加入聚乙二醇的抗體和抗體片段的方法一般將包括步驟(a)在由此抗體或抗體片段變得與一個或多個PEG基團附著的條件下，使抗體或抗體片段與聚乙二醇例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。基于已知參數(shù)和所需結(jié)果選擇最佳反應(yīng)條件或?；磻?yīng)，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。通過施用本文描述的TNFa抗體和抗體片段，加入聚乙二醇的抗體和抗體片段一般可以用于離析(educe)或預(yù)防骨丟失。一般地，與非加入聚乙二醇的抗體和抗體片段相比較，加入聚乙二醇的抗體和抗體片段具有增加的半衰期。加入聚乙二醇的抗體和抗體片段可以單獨、一起或與其他藥物組合物組合采用。在本發(fā)明的另外一個實施方案中，可以改變TNFa抗體或其片段，其中修飾抗體的恒定區(qū)，以相對于未經(jīng)修飾的抗體，減少至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)子功能。為了修飾本發(fā)明的抗體從而使得它顯示出與Fc受體減少的結(jié)合，抗體的免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段可以在對于Fc受體(FcR)相互作用所需的特定區(qū)域上進行突變(參見例如，Canfield, S. M.禾口 S. L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173 1483-1491 ；禾口 Lund, J.等人(1991) J. of Immunol. 147 :2657-2662) 抗體的FcR結(jié)合能力中的減少也可以減少依賴于FcR相互作用的其他效應(yīng)子功能，例如調(diào)理作用和吞噬作用以及抗原依賴性細(xì)胞毒性。在本發(fā)明的方法中使用的抗體或抗體部分可以與另一種功能分子(例如，另一種肽或蛋白質(zhì))衍生或連接。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分預(yù)期包括衍生和以其他方式修飾形式的本文描述的人抗hTNF α抗體，包括免疫粘附分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以與一種或多種其他分子實體在功能上連接(通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其他方式)，所述分子實體例如另一種抗體(例如，雙特異性抗體或雙抗體)、可檢測試劑、細(xì)胞毒劑、藥學(xué)試劑和/或可以介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一種分子(例如，鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)或聚組氨酸標(biāo)記)的結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。一種類型的衍生抗體通過使2種或更多種抗體(相同類型或不同類型，例如以生成雙特異性抗體)交聯(lián)而產(chǎn)生。合適交聯(lián)劑包括其為異雙功能(例如，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能(例如，二琥珀酰亞胺辛二酸酯)的那些，所述異雙功能的交聯(lián)劑具有通過合適間隔臂分開的2種不同的反應(yīng)基團。此種接頭可從 PierceChemical Company, Rockford，111 獲得。本發(fā)明的抗體或抗體部分可以由其衍生的有用可檢測試劑包括熒光化合物。示例性熒光可檢測試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。抗體也可以用可檢測酶進行衍生，所述可檢測酶例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、 葡糖氧化酶等。當(dāng)抗體由可檢測酶進行衍生時，它通過加入酶用于產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的另外試劑進行檢測。例如，當(dāng)存在可檢測試劑辣根過氧化物酶時，過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺的添加導(dǎo)致可檢測的有色反應(yīng)產(chǎn)物?？贵w也可以由生物素進行衍生，并且通過間接測量抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合進行檢測。在本發(fā)明的方法和組合物中使用的抗體或抗體部分可以通過在宿主細(xì)胞中重組表達免疫球蛋白輕和重鏈基因進行制備。為了重組表達抗體，用攜帶DNA片段的一種或多種重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述DNA片段編碼抗體的免疫球蛋白輕和重鏈，從而使得輕和重鏈在宿主細(xì)胞中表達，并且優(yōu)選地分泌到其中培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，從所述培養(yǎng)基中可以回收抗體。標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法用于獲得抗體重和輕鏈基因，將這些基因整合入重組表達載體內(nèi)，并且將載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，例如下述中描述的那些=Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis (編輯)，MolecularCloning ；A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel, F. Μ.等人(編輯)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和在 Boss 等人的美國專利號 4，816，397 中。為了表達阿達木單抗(D2E7)或阿達木單抗(D2E7)相關(guān)抗體，首先獲得編碼輕和重鏈可變區(qū)的DNA片段。這些DNAs可以通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增和修飾種系輕和重鏈可變序列獲得。關(guān)于人重和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列是本領(lǐng)域已知的 (參見例如，“Vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫；還參見Kabat，Ε. Α.，等人(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Healthand Human Services，NIH
發(fā)明者A·埃爾登, G·海于格伯格 申請人:艾博特生物技術(shù)有限公司