專(zhuān)利名稱(chēng)：由來(lái)源于原核細(xì)胞的重組n-糖基化蛋白制備生物共軛物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物共軛物，尤其是生物共軛疫苗，由重組糖蛋白制備，命名為N-糖 基化蛋白。該發(fā)明包括一種或多種誘導(dǎo)N-糖基化蛋白，含有最優(yōu)化的氨基酸共識(shí)序列，編 碼這些蛋白的核酸序列以及相應(yīng)的載體和宿主細(xì)胞。另外，本發(fā)明還針對(duì)于使用所述蛋白、 核酸、載體及宿主細(xì)胞用于制備生物共軛疫苗。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了制備生物共軛疫苗的 方法。
背景技術(shù)：
糖基化蛋白是含有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合糖聚合物的蛋白質(zhì)。N-連接的蛋白糖 基化是存在于真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)必要及保守的過(guò)程。它對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、齊聚、 穩(wěn)定性、質(zhì)量控制、分泌蛋白和膜蛋白的分類(lèi)及運(yùn)輸都很重要(Helenius，Α.，and Aebi, Μ. (2004).Roles of N-Iinked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73，1019-1049)。蛋白糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)的抗原性、穩(wěn)定性及半衰期有深刻的影響。另外，糖基化還 可以輔助色譜法純化蛋白，例如，結(jié)合于固相的凝集素配體親和色譜可與蛋白的糖基化基 團(tuán)反應(yīng)。因此，已經(jīng)建立實(shí)踐用于在真核細(xì)胞中生產(chǎn)重組糖基化蛋白，從而提供生物及醫(yī)藥 上有用的糖基化標(biāo)品。已經(jīng)證實(shí)食源性致病菌空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)也能夠N-糖基化其 自身白勺蛋白質(zhì)(Szymanski, et al. (1999). Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Mol· Microbiol· 32，1022—1030) 。 M ■胃白勺 糖基化系統(tǒng)由12個(gè)基因編碼，位于所謂的pgl基因簇中。破壞N-糖基化會(huì)影響空腸彎 曲菌的入侵及致病性，但不會(huì)像大部分真核生物那樣致命(Burda P. and Μ. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-Iinked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426(2) 239-57)。在大腸桿菌中同時(shí)重組表達(dá)pgl基因簇和糖蛋白受體有可能重建空腸彎曲菌蛋 白白勺 N—H-Uil禾呈(ffacker et al. (2002). N-Iinked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli.Science 298,1790-1793)。腹瀉是一種主要的健康疾病，它與頻繁的國(guó)際旅行以及經(jīng)濟(jì)影響有關(guān)。旅行者的 腹瀉主要?dú)w因于獲得性腸道疾病，例如當(dāng)一個(gè)人從一個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家到發(fā)展中國(guó)家旅行時(shí)。如 今，每年有超過(guò)5千萬(wàn)的人從發(fā)達(dá)國(guó)家到發(fā)展中國(guó)家旅行，而這些旅行者中有將近50%的 人報(bào)告他們會(huì)在逗留時(shí)間的前兩周內(nèi)腹瀉。自從二十世紀(jì)七十年代以來(lái)，盡管各地的旅游 業(yè)努力改善當(dāng)?shù)氐幕A(chǔ)設(shè)施，但旅行者腹瀉的發(fā)病率沒(méi)有明顯的下降。旅行者是通過(guò)攝取受污染的食物以及較少的自來(lái)水而得了腹瀉。細(xì)菌是旅行者腹 瀉的主要原因，至少80%的感染者是由于這個(gè)原因。在全世界與旅行者腹瀉相關(guān)的細(xì)菌中， 最常分離到的是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)，然后是痢疾桿菌和空腸彎曲菌。桿菌性痢疾仍然是一種嚴(yán)重且常見(jiàn)的疾病。除了造成水樣腹瀉，志賀氏菌還是痢 疾(發(fā)燒、腹痛、便中含血和粘液)的主要原因。男子是這種細(xì)菌的天然宿主。每年感染痢 疾的人數(shù)大約超過(guò)2億。其中大約5百萬(wàn)需要住院治療，1百萬(wàn)人會(huì)死亡。這種桿菌性痢疾病主要源于三種血清型S. dysenteriae, S. flexneri以及S. sonnei。S. dysenteriae和S. flexneri是熱帶地區(qū)感染的主要原因，死亡率可達(dá)20 %。 桿菌性痢疾既以地方性又以流行性疾病存在。在很多熱帶國(guó)家中，地方性感染主要源于 S. flexneri,而主要的S. dysenteriae流行病存在于中美洲、中非以及東南亞。這些流 行病是很大的公共健康危害。在工業(yè)化國(guó)家中，主要來(lái)自于S. sonnei而少部分來(lái)自于 S. flexneri的感染仍然存在。在抵抗細(xì)菌性痢疾方面，共軛疫苗已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果。I型S. dysenteriae 的0-特異性多糖已被用于合成一種共軛疫苗，該疫苗在小鼠體內(nèi)已引起免疫反應(yīng)。這樣的 疫苗或已通過(guò)化學(xué)法合成并偶聯(lián)于人血清白蛋白，或者開(kāi)發(fā)用于志賀氏菌中0-多糖已被 純化的地方。S. sonnei和S. flexneri的0-特異性多糖也已經(jīng)通過(guò)化學(xué)法偶聯(lián)于綠膿桿菌 外毒素，并且在小鼠體內(nèi)引起明顯的免疫反應(yīng)。另外，它們?cè)谌梭w中已顯示出免疫原性和安 全性。然而，化學(xué)偶聯(lián)是昂貴且耗時(shí)的過(guò)程，不能總產(chǎn)生可靠且重復(fù)性好的疫苗。當(dāng)在商業(yè) 規(guī)模上尋求開(kāi)發(fā)這樣的生物共軛疫苗時(shí)，這會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)問(wèn)題
發(fā)明內(nèi)容

-
-方面，本發(fā)明涉及一種生物共軛疫苗，包括一種插入共識(shí)序列的蛋白載體，共
識(shí)序列為D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以為除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；來(lái)源于 至少一種病原細(xì)菌的至少一種抗原多糖，鏈接于蛋白載體上，其中，至少一種抗原多糖是至 少一種細(xì)菌性0-抗原，這些抗原來(lái)自于志賀氏菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌其中的一種或多 種；并且可選一種佐劑。 另一方面，本發(fā)明涉及一種志賀氏菌痢疾生物共軛疫苗，包括一種包含綠膿桿菌 外毒素(EPA)的蛋白載體，且被修飾為含有至少一種共識(shí)序列D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和
Z可以為除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少-
以下結(jié)構(gòu)并且可選一種佐劑。
-條多糖鏈連接于蛋白載體上并且含有
權(quán)利要求
一種生物共軛疫苗，包括一種蛋白載體，包含插入的共識(shí)序列，D/E X N Z S/T，其中X和Z可以為除脯氨酸外的任何天然氨基酸；來(lái)源于至少一種細(xì)菌的至少一種抗原多糖，鏈接于蛋白載體上，其中，至少一種抗原多糖是至少一種細(xì)菌性O(shè) 抗原，這些抗原來(lái)自于志賀氏菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌其中的一種或多種；并且任選一種佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中蛋白載體是一種被修飾的綠膿桿菌外毒素 (EPA)，含有至少一個(gè)共識(shí)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物共軛疫苗，其中EPA含有兩個(gè)共識(shí)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中，至少一種細(xì)菌性0-抗原來(lái)源于志賀氏痢疾 桿菌01。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中至少一種細(xì)菌性0-抗原來(lái)源于腸外致病大腸 桿菌(ExPEC)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的生物共軛疫苗，其中被修飾的EPA含有SEQID NO 7所提供的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中至少一種細(xì)菌性0-抗原來(lái)源于志賀式痢疾桿 菌01，福氏志賀氏菌2a、福氏志賀氏菌3a、福氏志賀氏菌3b、福氏志賀氏菌6、宋內(nèi)氏志賀氏 菌中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中至少一種細(xì)菌性0-抗原來(lái)源于大腸桿菌04 K52 (ExPEC)，大腸桿菌 04 :K6 (ExPEC)，大腸桿菌 06 :K2 (ExPEC)，大腸桿菌 06 :K54 (ExPEC)， 大腸桿菌022 (ExPEC)，大腸桿菌075 (ExPEC)，大腸桿菌083 (ExPEC)，大腸桿菌07，大腸桿菌 09，大腸桿菌016，大腸桿菌0121，大腸桿菌0157 (EHEC)中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的生物共軛疫苗，其中至少一種細(xì)菌性0-抗原來(lái)源于綠膿桿菌011。
10.一種志賀氏生物共軛疫苗，包括一種包含綠膿桿菌外毒素(EPA)的蛋白載體，且被修飾為含有至少一種共識(shí)序列D/ E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以為除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少一條多糖鏈連接 于蛋白載體上并且含有以下結(jié)構(gòu)
11.根據(jù)權(quán)利要求10的志賀氏生物共軛疫苗，其中蛋白載體為被修飾的ΕΡΑ，含有兩個(gè) 共識(shí)序列。
12.—種志賀式痢疾桿菌01生物共軛疫苗，包括 一種蛋白載體，具有SEQ ID NO 7所提供的序列； 至少一條多糖鏈連接于蛋白載體上，并且含有如下結(jié)構(gòu)
13.一個(gè)包含SEQ ID NO 5序列的質(zhì)粒。
14. 一段包含SEQ ID NO 5的基因序列。
15. 一段包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
16. 一段包括SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
17. 載體 PGVXN64。
18.一種表達(dá)系統(tǒng)，用于生產(chǎn)至少抵抗一種細(xì)菌的生物共軛疫苗，包括 一段編碼一種寡糖轉(zhuǎn)移酶(OST/OTase)的核酸序列； 一段編碼蛋白載體的核酸序列；來(lái)自于至少一種細(xì)菌的至少一個(gè)抗原多糖合成基因簇，該抗原多糖為細(xì)菌0-抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其中寡糖轉(zhuǎn)移酶(OST/OTase)具有SEQID NO :2所 提供的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其中蛋白載體已被修飾為含有至少一個(gè)共識(shí)序列， D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以為除脯氨酸外的任何天然氨基酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其中所選的蛋白載體由AcrA和EPA組成，已被修飾 為含有至少一個(gè)共識(shí)序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以為除脯氨酸外的任何天然氨基酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼蛋白載體的核酸序列包含SEQID NO :6。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其中的細(xì)菌選自于致病菌集合，志賀氏菌、大腸桿 菌、綠膿桿菌011或土拉弗朗西斯菌。
24.一種表達(dá)系統(tǒng)，用于生產(chǎn)抵抗志賀式痢疾桿菌01的生物共軛疫苗，包括 一段含有SEQ ID NO 2的PgIB的核酸編碼序列；一段含有SEQ ID NO 6的修飾EPA編碼序列；以及 含有SEQ ID NO 5的一個(gè)多糖合成基因簇。
25.—種工程細(xì)菌，含有權(quán)利要求24的表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼PgIB的核酸序列以及編 碼修飾的EPA的核酸序列穩(wěn)定的整合于大腸桿菌基因組中，多糖合成基因簇以質(zhì)粒形式引 入。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的細(xì)菌，其中細(xì)菌為大腸桿菌。
27.一種在生物反應(yīng)器重生產(chǎn)01-生物共軛疫苗的方法，包括以下步驟在細(xì)菌中表達(dá)修飾后的EPA，含有至少一種共識(shí)序列，D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z 可以為除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，或者是AcrA ；PgIB ；以及一條或多條01-多糖； 培養(yǎng)細(xì)菌一段時(shí)間來(lái)生產(chǎn)一定量的01-生物共軛疫苗，含有連接于一條或多條01-多 糖上的AcrA或者修飾的EPA ； 提取周質(zhì)蛋白；以及從提取到的周質(zhì)蛋白中分離01-生物共軛疫苗。
28.—種生產(chǎn)志賀式痢疾桿菌生物共軛疫苗的方法，所述方法包括 通過(guò)在一個(gè)重組生物中使用糖基轉(zhuǎn)移酶組裝痢疾桿菌多糖；將上述多糖連接至所述重組生物中的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白的一個(gè)天冬酰胺殘基上，其 中所述的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白包含至少一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞抗原決定簇。
29.—種生產(chǎn)志賀式痢疾桿菌生物共軛疫苗的方法，所述方法包括在一種原核生物中引入一種編碼代謝機(jī)制的遺傳信息，該代謝機(jī)制執(zhí)行目標(biāo)蛋白的 N-糖基化，從而得到一種修飾的原核生物，其中，表達(dá)一個(gè)或多個(gè)重組目的蛋白所需的遺傳 信息被引入所述的原核生物中，代謝機(jī)制包括特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶用于把痢疾桿菌的一 種多糖組裝至一種脂載體上，以及一種寡糖轉(zhuǎn)移酶，該寡糖轉(zhuǎn)移酶將多糖共價(jià)結(jié)合于目標(biāo) 蛋白的天冬酰胺殘基上，目標(biāo)蛋白含有至少一種T-細(xì)胞抗原決定簇； 將修飾的原核生物進(jìn)行培養(yǎng)；以及 從培養(yǎng)基中得到糖基化的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)于生物共軛疫苗，例如O1-生物共軛疫苗，內(nèi)容包括含有至少一種共識(shí)序列的蛋白載體，共識(shí)序列為D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以為除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；來(lái)源于至少一種病原細(xì)菌的至少一種抗原多糖，鏈接于蛋白載體上，而且，任選一種佐劑。另一方面，本發(fā)明還針對(duì)于一種在生物反應(yīng)器中使用一些步驟生產(chǎn)O1-生物共軛疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61K39/385GK101983070SQ200980110137
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者F·弗爾南德茲, M·威特, M·瓦克, M·科沃瑞克 申請(qǐng)人:格林考瓦因有限公司