專(zhuān)利名稱(chēng)：利用顆粒體蛋白前體(pgrn)治療神經(jīng)變性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)變性疾病的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明涉及使用 顆粒體蛋白前體(progranulin)治療神經(jīng)變性疾病的方法，和使用修飾顆粒體蛋白前體表 達(dá)的效應(yīng)物或效應(yīng)物組合治療神經(jīng)變性疾病的方法。背景和概述顆粒體蛋白前體(PGRN)是一種參與多種過(guò)程的調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)因子樣蛋白，所述過(guò) 程包括發(fā)育、傷口愈合、血管發(fā)生、神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持以及炎癥。已經(jīng)將PGRN表達(dá)的 增加與腫瘤促進(jìn)相關(guān)聯(lián)。另外，已經(jīng)在多種神經(jīng)變性疾病中證實(shí)改變的PGRN表達(dá)，包括克 雅氏病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病和阿爾茨海默氏病。例如，最近對(duì)神經(jīng)變性疾病的遺傳病因?qū)W的研究 已經(jīng)證實(shí)，PGRN基因中可遺傳的突變可能導(dǎo)致由減少的神經(jīng)元存活引起的成年發(fā)病的神經(jīng) 變性疾病。選擇性的神經(jīng)元細(xì)胞死亡是多種神經(jīng)變性病癥共同標(biāo)志。已經(jīng)將散發(fā)形式的阿爾 茨海默氏病、帕金森病和Lou Gehrig氏病(肌萎縮側(cè)索硬化(ALS))與通過(guò)興奮性中毒、氧 化應(yīng)激、電子傳遞鏈部分的抑制、細(xì)胞和線(xiàn)粒體膜破裂、細(xì)胞器的改變、染色質(zhì)的改變、一般 的和特異性的遺傳毒性作用、和細(xì)胞表面蛋白受體和效應(yīng)物的抑制和/或活動(dòng)過(guò)度造成神 經(jīng)元細(xì)胞死亡的環(huán)境因素相關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)和臨床文獻(xiàn)支持興奮性毒素在有些形式的神經(jīng)變性 (特別地，ALS和阿爾茨海默氏病)中的潛在作用。具體地，已經(jīng)將谷氨酸鹽處理/運(yùn)輸中 的異常與ALS相關(guān)聯(lián)，軟骨藻酸是一種紅藻氨酸鹽受體(即離子型(ionotrophic)谷氨酸 受體)激動(dòng)劑，已經(jīng)證實(shí)它是有些形式的記憶喪失(很象在阿爾茨海默氏病中報(bào)道的那些) 的成因。也已經(jīng)將氧化應(yīng)激與相同的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。存在于環(huán)境中的毒素可能在多種神經(jīng)變性疾病的病理學(xué)中起作用。例如，已經(jīng)將 β-谷甾醇β-D-葡糖苷(BSSG)鑒定為存在于蘇鐵棕櫚(Cycas circinalis)的種子中的 毒素，所述種子在歷史上是關(guān)島查摩洛人飲食的原料。已經(jīng)將蘇鐵種子消費(fèi)與ALS-帕金 森綜合征癡呆復(fù)合病(ALS-PDC)相關(guān)聯(lián)，后者是關(guān)島特有的神經(jīng)障礙。其中成年雄性小鼠 消費(fèi)洗過(guò)的蘇鐵種子粉作為它們飲食的一部分的體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)，處理的動(dòng)物具有深遠(yuǎn) 的且漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和嗅覺(jué)行為缺陷，且在各個(gè)神經(jīng)子集中的每一個(gè)中伴有神經(jīng)元損失。 這些結(jié)果的出現(xiàn)，反映了 ALS-PDC中的行為和病理缺陷。使用分離的蘇鐵級(jí)分的體外實(shí)驗(yàn) 已經(jīng)將可能的神經(jīng)毒素鑒定為在洗過(guò)的蘇鐵粉中含有的變型留醇葡糖苷分子，特別是BSSG 和有關(guān)的留醇葡糖苷分子。目前，ALS、阿爾茨海默氏病(AD)或帕金森病沒(méi)有治愈方法?，F(xiàn)有的治療通常包含 醫(yī)師的減慢癥狀進(jìn)展和使患者更舒適的努力。盡管有許多藥物處于開(kāi)發(fā)中，且有限的數(shù)目 經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療(利魯唑用于A(yíng)LS ；左旋多巴用于帕金森?。徽J(rèn)知增強(qiáng)劑例如安理申用 于A(yíng)D)，這些治療僅僅掩蓋神經(jīng)疾病的進(jìn)展，可能起很少地延長(zhǎng)有些患者的生命的作用。因 而，迫切需要用于治療神經(jīng)變性疾病的方法和組合物。在一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了治療神經(jīng)變性疾病患者的方法，該方法包含 下述步驟給患者施用包含顆粒體蛋白前體多肽的組合物，并減輕患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀。在上述的實(shí)施方案中，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量可以在約lng/kg 患者體重至約lmg/kg患者體重的范圍內(nèi)，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量可以在 約lng/kg患者體重至約500ng/kg患者體重的范圍內(nèi)，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽 的量可以在約lng/kg患者體重至約lOOng/kg患者體重的范圍內(nèi)，包含顆粒體蛋白前體多 肽的組合物可以適合腸胃外給藥，腸胃外給藥途徑可以選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、 腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地(intracordalIy)，神經(jīng)變性 疾病狀態(tài)可以由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由興奮性毒素介導(dǎo)，所述 興奮性毒素可以是甾醇糖苷，所述甾醇糖苷可以選自β _谷甾醇-D-葡糖苷和膽固醇 葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金森病、阿爾茨海默氏病和肌 萎縮側(cè)索硬化，所述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng)變性疾病可以是阿爾茨海默 氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，且所述顆粒體蛋白前體多肽可以與SEQ ID NO 2具有至少95%同源性。在另一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了藥物組合物，其包含治療有效量的顆粒體 蛋白前體多肽和用于其的藥學(xué)上可接受的載體，其中所述治療有效量包含減輕或預(yù)防患者 中神經(jīng)變性疾病的癥狀的量。在上述的實(shí)施方案中，所述組合物可以適合腸胃外給藥，腸胃外給藥途徑可以選 自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索 內(nèi)地，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由興奮性 毒素介導(dǎo)，所述興奮性毒素可以是留醇糖苷，所述留醇糖苷可以選自β-谷留醇-β-D-葡 糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金森病、阿爾茨 海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化，所述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng)變性疾病可以 是阿爾茨海默氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，所述藥物組合物可以是腸 胃外劑型，該劑型可以適合選自下述途徑的腸胃外給藥真皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜 內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和脊索內(nèi)的，且所述顆粒體蛋白前體多肽可以 與SEQ IDNO 2具有至少95%同源性。在另一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了用于減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法， 該方法包含下述步驟給患者施用治療有效量的顆粒體蛋白前體多肽，其中所述肽的量可 以有效地增加神經(jīng)變性疾病患者中的神經(jīng)元細(xì)胞存活，并減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡。在上述的實(shí)施方案中，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量可以在約lng/kg 患者體重至約lmg/kg患者體重的范圍內(nèi)，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量可以在 約lng/kg患者體重至約500ng/kg患者體重的范圍內(nèi)，給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽 的量可以在約lng/kg患者體重至約lOOng/kg患者體重的范圍內(nèi)，包含顆粒體蛋白前體多 肽的組合物可以適合腸胃外給藥，腸胃外給藥途徑可以選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、 腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由環(huán) 境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由興奮性毒素介導(dǎo)，所述興奮性毒素可以是 甾醇糖苷，所述留醇糖苷可以選自β _谷留醇-D-葡糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物 或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金森病、阿爾茨海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化，所 述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng)變性疾病可以是阿爾茨海默氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，且所述顆粒體蛋白前體多肽可以是這樣的多肽，其中所述 多肽與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性。在另一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了用于治療神經(jīng)變性疾病患者的方法，該方 法包含下述步驟給患者施用包含修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物的組合物，并減輕患 者中神經(jīng)變性疾病的癥狀。在上述的實(shí)施方案中，所述包含效應(yīng)物的組合物可以適合腸胃外給藥，腸胃外給 藥途徑可以選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大 腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地，神經(jīng)變性疾病可以由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以 由興奮性毒素介導(dǎo)，所述興奮性毒素可以是留醇糖苷，所述留醇糖苷可以選自β_谷甾 醇-β -D-葡糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金 森病、阿爾茨海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化，所述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng)變 性疾病可以是阿爾茨海默氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，該方法可以另 外包含增加神經(jīng)元中顆粒體蛋白前體的表達(dá)的步驟，該方法可以另外包含減少非神經(jīng)元細(xì) 胞中顆粒體蛋白前體的表達(dá)的步驟，且所述效應(yīng)物可以是載體，其包含與SEQ ID Ν0:1具有 至少95%同源性的核酸。在另一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了藥物組合物，其包含治療有效量的修飾顆 粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物和用于其的藥學(xué)上可接受的載體，其中所述治療有效量包含能 減輕或預(yù)防患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀的量。在上述的實(shí)施方案中，所述治療有效量可以包含能增加神經(jīng)元中顆粒體蛋白前體 表達(dá)的量，所述治療有效量可以包含能減少非神經(jīng)元細(xì)胞中顆粒體蛋白前體表達(dá)的量，所 述藥物組合物可以是腸胃外劑型，該劑型可以適合選自下述途徑的腸胃外給藥真皮內(nèi)的、 皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和脊索內(nèi)的，神經(jīng)變性 疾病狀態(tài)可以由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由興奮性毒素介導(dǎo)，所述 興奮性毒素可以是留醇糖苷，所述留醇糖苷可以選自β _谷留醇-D-葡糖苷和膽固醇 葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金森病、阿爾茨海默氏病和肌 萎縮側(cè)索硬化，所述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng)變性疾病可以是阿爾茨海默 氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，所述藥物組合物可以是腸胃外劑型，該劑 型可以適合選自下述途徑的腸胃外給藥真皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi) 的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和脊索內(nèi)的，且所述效應(yīng)物可以是載體，其包含與SEQ ID NO 1具有至少95%同源性的核酸。在另一個(gè)例證性的實(shí)施方案中，提供了用于減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法， 該方法包含下述步驟給患者施用治療有效量的修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物，其中 所述效應(yīng)物的量可以有效地增加由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)的神經(jīng)變性疾病的患者中的神 經(jīng)元細(xì)胞存活，并減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡。在上述的實(shí)施方案中，所述包含效應(yīng)物的組合物可以適合腸胃外給藥，腸胃外給 藥途徑可以選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)地、大 腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地，神經(jīng)變性疾病狀態(tài)可以由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)，神經(jīng)變性疾病狀態(tài) 可以由興奮性毒素介導(dǎo)，所述興奮性毒素可以是留醇糖苷，所述留醇糖苷可以選自β_谷 甾醇-β-D-葡糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物，所述神經(jīng)變性疾病可以選自帕金森病、阿爾茨海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化，所述神經(jīng)變性疾病可以是帕金森病，所述神經(jīng) 變性疾病可以是阿爾茨海默氏病，所述神經(jīng)變性疾病可以是肌萎縮側(cè)索硬化，且所述效應(yīng) 物可以是載體，其包含與SEQ ID NO :1具有至少95%同源性的核酸。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的圖指示合成的留基葡糖苷(BSSG)暴露后小鼠腿伸反射的漸進(jìn)性減退。圖2顯示的圖指示合成的留基葡糖苷(BSSG)暴露后小鼠開(kāi)放場(chǎng)地運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的漸 進(jìn)性減少。圖3A-D顯示的圖指示暴露于合成的留基葡糖苷(BSSG) 10周后小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的 漸進(jìn)性喪失。BSSG暴露后，使小鼠存活1個(gè)月(圖A-C)或5個(gè)月(圖D)，飼喂正常食物， 然后處死。圖A顯示了在Nissl染色和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶免疫組織化學(xué)(ChAT)后，腰索中 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的定量。圖B顯示了免疫組織化學(xué)(腹角)檢測(cè)后，腰脊髓中激活的胱天蛋白 酶-3的定量。圖C顯示了針對(duì)CTIP2(在皮質(zhì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中高度表達(dá))進(jìn)行免疫組織 化學(xué)檢測(cè)后，運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中的神經(jīng)元定量。圖D顯示了 Nissl染色后腰索中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的定 量。圖4顯示了用于檢測(cè)正常小鼠腦干中顆粒體蛋白前體表達(dá)的原位雜交(ISH)(起 始放大率10X)。圖A 使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針(riboprobe)的 ISH0圖B 使用有義的核糖核酸探針的ISH。圖5顯示了在高倍放大(起始放大率40X)下用于檢測(cè)正常小鼠腦干中顆粒體蛋 白前體表達(dá)的原位雜交(ISH)。圖A 使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針 的ISH。圖B 使用有義的核糖核酸探針的ISH。圖6顯示了用于檢測(cè)正常小鼠脊髓前角細(xì)胞中顆粒體蛋白前體表達(dá)的原位雜交 (ISH)(起始放大率40X)。圖A 使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。 圖B 使用有義的核糖核酸探針的ISH。圖7顯示的原位雜交(ISH)指示洗過(guò)的蘇鐵粉飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中減少的顆 粒體蛋白前體表達(dá)(起始放大率10X)。圖A 在正常食物飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上使用反 義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖B 在蘇鐵粉飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮 質(zhì)上使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖C 在蘇鐵粉飼喂的小 鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上使用有義的核糖核酸探針的ISH。圖8顯示的原位雜交(ISH)指示洗過(guò)的蘇鐵粉飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中減少的顆 粒體蛋白前體表達(dá)(起始放大率40X)。圖A 在正常食物飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上使用反 義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖B 在蘇鐵粉飼喂的小鼠的運(yùn)動(dòng)皮 質(zhì)上使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖C 在蘇鐵粉飼喂的小 鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)上使用有義的核糖核酸探針的ISH。圖9顯示的原位雜交(ISH)表明，暴露于合成的BSSG會(huì)導(dǎo)致小鼠頸脊髓的前角細(xì) 胞中減少的顆粒體蛋白前體表達(dá)。圖A 在正常食物飼喂的小鼠的頸脊髓上使用反義的、顆 粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖B 在飼喂1000 μ g/天BSSG的小鼠的頸脊 髓上使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探針的ISH。圖C 在正常食物飼喂的 小鼠的頸脊髓上使用有義的核糖核酸探針的ISH(起始放大率10X)。圖10顯示的原位雜交(ISH)表明，增加小鼠的BSSG暴露會(huì)導(dǎo)致更明顯的神經(jīng)病理學(xué)和頸脊髓前角細(xì)胞中顆粒體蛋白前體表達(dá)的喪失。圖A、B和C分別顯示在飼喂10、100 和1000 μ g/天BSSG的小鼠的頸脊髓上使用反義的、顆粒體蛋白前體特異性的核糖核酸探 針的13!1(起始放大率40幻。圖11表明，斑馬魚(yú)中顆粒體蛋白前體表達(dá)的敲低(knockdown)導(dǎo)致顱面畸形發(fā) 生、心包水腫和內(nèi)臟腸膨脹的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象。圖12顯示了異源神經(jīng)元體外表達(dá)的顆粒體蛋白前體。初始神經(jīng)元培養(yǎng)物源自E13 小鼠胚胎脊髓。細(xì)胞核的免疫定位(DAPI ；圖A)，使用SMI32(圖B)和小鼠顆粒體蛋白前體 (圖C)的未磷酸化神經(jīng)絲?；诩?xì)胞體大小和SMI32免疫反應(yīng)性，鑒別表達(dá)顆粒體蛋白前 體的初始運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(圖B-D)。除了細(xì)胞核以外，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中到處發(fā)現(xiàn)顆粒體蛋白前 體。(圖D)來(lái)自所有3個(gè)熒光團(tuán)的合并通道。標(biāo)尺條代表20um。圖13顯示了小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體內(nèi)表達(dá)的顆粒體蛋白前體。檢查了 8周齡⑶-1小 鼠的腰脊髓內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。腰脊髓的背角部分的DAPI免疫熒光(圖A)，使用SMI32抗體 (圖B)和顆粒體蛋白前體(圖C)的未磷酸化神經(jīng)絲。(圖D)來(lái)自所有3個(gè)熒光團(tuán)的合并 通道。標(biāo)尺條代表30um。圖14顯示了導(dǎo)致無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞存活的顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)。在無(wú) 血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的NSC34細(xì)胞(第一個(gè)條)、僅穩(wěn)定載體的轉(zhuǎn)染子 (NSC34-pcDNA ；中間的條)和穩(wěn)定的顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)細(xì)胞(NSC34-pcDNA-Pgrn ；最后 的條)(圖A)。每隔3天，通過(guò)相差顯微鏡術(shù)測(cè)定每個(gè)視野(IOx放大率)的平均細(xì)胞數(shù)，持續(xù) 15天。顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出與對(duì)照相比增加的存活(星號(hào)表示P < 0.005)。 (圖B)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后基于12小時(shí)BrdU摻合的細(xì)胞增殖試驗(yàn)。血清剝奪期 間顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)(第二個(gè)條)不會(huì)顯著增加細(xì)胞增殖速率(P > 0. 1)。(圖C)在 無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后基于TUNEL標(biāo)記方法的細(xì)胞凋亡試驗(yàn)。血清剝奪期間顆粒體蛋 白前體過(guò)表達(dá)(第二個(gè)條)保護(hù)對(duì)抗細(xì)胞凋亡(星號(hào)表示P < 0. 0001，雙尾Student’ s T 檢驗(yàn))。圖15表明，顆粒體蛋白前體是長(zhǎng)期低氧期間細(xì)胞存活的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子。用僅載體 (pcDNA ；第一個(gè)條)或人顆粒體蛋白前體(pcDNA-Pgrn ；第二個(gè)條)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NSC34細(xì)胞系。 在由氧(80%減少的氧張力)組成的氣氛中，在無(wú)血清培養(yǎng)基或5%血清中培養(yǎng)細(xì)胞72 小時(shí)，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)剩余的細(xì)胞(星號(hào)表示P < 0. 0001)。圖16表明，顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致NSC34細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)神經(jīng)元領(lǐng)航 (pathfinding)和細(xì)胞存活。(圖A-C)用pcDNA3. 1/Pgrn穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NSC34細(xì)胞的相差顯 微鏡術(shù)。(圖A和B)在無(wú)血清培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)物20天后，單個(gè)3小時(shí)階段的時(shí)間推移相 差顯微照片，顯示了主動(dòng)伸展(箭)、收縮(箭頭)和神經(jīng)炎過(guò)程的全體重排(星號(hào))。(圖 C)在無(wú)血清培養(yǎng)基中57天后，持續(xù)的存活和神經(jīng)樣形態(tài)學(xué)的維持。圖17表明，顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致NSC-34細(xì)胞中神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的發(fā)育。細(xì) 胞核[DAPI](圖A，EjP I)、F-肌動(dòng)蛋白[鬼筆環(huán)肽染色](圖B，F(xiàn)，和J)、顆粒體蛋白前 體-IHC(圖C，GJPH)和合并的[細(xì)胞核/肌動(dòng)蛋白/顆粒體蛋白前體](圖D，H，和L) 的免疫熒光圖像。描繪了未轉(zhuǎn)染的對(duì)照NSC-34細(xì)胞(圖A-D)、假轉(zhuǎn)染的NSC-34細(xì)胞(圖 E-H)和顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)細(xì)胞(圖I-H)。注意到顆粒體蛋白前體過(guò)表達(dá)細(xì)胞中具有 伸展過(guò)程的更廣泛的細(xì)胞質(zhì)(圖J-L)。起始放大率43x。
圖18顯示了急性神經(jīng)元應(yīng)激后的顆粒體蛋白前體表達(dá)。在軸突切斷術(shù)后第3天， 在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)觀(guān)察到豐富的顆粒體蛋白前體免疫反應(yīng)性，非神經(jīng)元染色的證據(jù)非常少 (圖A)。免疫染色的圖像是有斑點(diǎn)的，在胞質(zhì)中擴(kuò)散性地分布(圖C)。相反，在第7天，現(xiàn) 在在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)烈觀(guān)察到免疫染色(圖B)，同時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺乏顆粒體蛋白前體 染色(圖D)。圖19顯示了 PC-12細(xì)胞中顆粒體蛋白前體抗神經(jīng)毒素MPTP的保護(hù)作用。圖20顯示了在老齡Tg2576小鼠大腦內(nèi)病毒載體遞送GFP或PGRN后淀粉狀蛋白 負(fù)荷的免疫組織化學(xué)分析。圖A顯示的代表性顯微照片描繪了慢病毒的-GFP或慢病毒 的-PGRN治療后穿過(guò)針對(duì)β-淀粉狀蛋白(AB)免疫染色的海馬的冠狀物切片。圖B顯示 了 Αβ負(fù)荷變化的定量評(píng)價(jià)。在接受慢病毒的-PGRN動(dòng)物中，在同側(cè)海馬中觀(guān)察到淀粉狀 蛋白負(fù)荷的顯著下降(F2,47 = 5. 86621,ρ < 0. 0095，治療主作用)。每個(gè)條代表被淀粉狀蛋 白免疫標(biāo)記占據(jù)的平均(±S.E.M.)(n = 8)面積(ym2)，在穿過(guò)海馬的3個(gè)切片中測(cè)量廣 顯著不同于慢病毒的-GFP對(duì)照，ρ < 0. 001) (+顯著不同于對(duì)側(cè)半球，ρ < 0. 05)。圖21顯示了大腦內(nèi)病毒載體遞送慢病毒(LV) -GFP或慢病毒-PGRN后MPTP對(duì)TH+ 細(xì)胞計(jì)數(shù)的效應(yīng)的免疫組織化學(xué)分析。圖A顯示了代表性熒光顯微照片，其描繪了 MPTP中 毒后穿過(guò)針對(duì)TH免疫染色的SNc的冠狀物切片。圖B顯示了 SNc中TH+細(xì)胞計(jì)數(shù)的定量 評(píng)價(jià)。在接受LV-GFP的動(dòng)物中，MPTP暴露導(dǎo)致TH+細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯著減少(Student t檢驗(yàn)， P = O. 0041)，同時(shí)在接受LV-PGRN的那些動(dòng)物中沒(méi)有觀(guān)察到細(xì)胞的顯著喪失(ρ = 0. 64)。 每個(gè)條代表在穿過(guò)SNc的3個(gè)切片中測(cè)量的TH+細(xì)胞的平均(士 S. Ε. Μ.) (η = 4-6)數(shù)目廣 顯著不同于載體治療的對(duì)照組，P < 0. 001)。圖22顯示了用grn F和grn D溫育的永生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞系(NSC-34)，增殖/ 存活(grn F)或無(wú)影響(grn D)。圖23顯示了大腦內(nèi)遞送表達(dá)GFP或PGRN的慢病毒后Tg2576的存活率。圖24顯示了 PGRN慢病毒治療的小鼠中的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 活性。圖(A)顯示了通過(guò)Nissl染色評(píng)判的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。圖B顯示了與所有其它治療 組相比，鹽水治療的BSSG暴露的小鼠的前角細(xì)胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性的免疫組 織化學(xué)評(píng)判((B)的右上角圖)。(B)中的圖像是代表性的，取自左和右前角(起始放大率 IOOx)。圖C顯示了對(duì)照(鹽水治療的)和BSSG暴露的小鼠中ChAT陽(yáng)性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。圖25顯示了為正常的NSC-34細(xì)胞和過(guò)表達(dá)人顆粒體蛋白前體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子 (NSC-34 hPGRN)繪制的β-谷甾醇葡糖苷(ng/ml)相對(duì)于MTT吸光度的關(guān)系圖。以8，000 細(xì)胞/孔涂布細(xì)胞，在有不同濃度的BSSG存在下，在DMEM 5% FCS中維持72小時(shí)。作為 細(xì)胞增殖/存活的陰性對(duì)照，在沒(méi)有BSSG或血清的情況下培養(yǎng)一系列孔。畫(huà)出了標(biāo)準(zhǔn)誤差 棒，P 值< 0. 05 C)或< 0. 001 O。圖26顯示了相對(duì)于吸光度繪制的hPRRN(100ng/ml)。加入培養(yǎng)的NSC-34細(xì)胞中 的人重組顆粒體蛋白前體(PGRN)蛋白導(dǎo)致血清饑餓后細(xì)胞存活增加至2. 5倍(第4天)。 誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在570nM測(cè)量吸光度。圖27顯示了在27hpf用znpl mAb免疫標(biāo)記的全固定的胚胎的側(cè)視圖(在左側(cè)前 面；背朝上)(圖A-F)。圖A，B，C:給胚胎注射顆粒體蛋白前體M0。圖D，E 給胚胎注射顆 粒體蛋白前體-A-MO+lOOpg顆粒體蛋白前體-A mRNA。圖F:野生型。截短的或完全喪失運(yùn)動(dòng)軸突神經(jīng)(圖A和B ；黑色箭頭，和圖C)、分枝的運(yùn)動(dòng)軸突/神經(jīng)(圖B ；黑色箭頭)、運(yùn)動(dòng) 軸突的部分挽救(圖D ；白色箭頭)和分枝的軸突/神經(jīng)的增加(圖E ；白色箭頭)發(fā)生。圖28顯示了在注射以下的胚胎中在27hpf用znpl mAb標(biāo)記的全固定的胚胎的側(cè) 視圖(在左側(cè)前面；背朝上)(圖A-F) :smnl MO(圖A和B)，smnl M0+100pg顆粒體蛋白前 體-A mRNA共注射(圖C)，IOOpg顆粒體蛋白前體-A mRNA (圖D和E)或野生型(圖F)。截 短的運(yùn)動(dòng)軸突神經(jīng)(圖A ；黑色箭頭)、分枝的運(yùn)動(dòng)軸突/神經(jīng)(圖B ；黑色箭頭)、運(yùn)動(dòng)軸突 /神經(jīng)的挽救(圖C ；白色箭頭)和分枝的軸突/神經(jīng)的增加(圖C ；白色箭頭)、分枝的軸 突/神經(jīng)(圖D，E ；白色箭頭)和正常的運(yùn)動(dòng)軸突(圖F;雙箭頭)發(fā)生。標(biāo)尺條=50 μ m。發(fā)明詳述提供了用于治療由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)的神經(jīng)變性疾病的方法和組合物。在一 個(gè)例證性的實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用包含顆粒體蛋白前體的組合物，可以治療神經(jīng)變 性疾病患者，其中用包含顆粒體蛋白前體的組合物治療患者會(huì)減輕患者中神經(jīng)學(xué)疾病的癥 狀。在上述的例證性的實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可以由環(huán)境損傷介導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法。該方法包 含下述步驟給神經(jīng)變性疾病患者施用治療有效量的顆粒體蛋白前體，其中顆粒體蛋白前 體的量可以有效地增加患者中的神經(jīng)元細(xì)胞存活或增殖。在上述的例證性的實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可以由環(huán)境損傷介導(dǎo)。本文使用的“顆粒體蛋白前體”或“顆粒體蛋白前體多肽”是指選自下述的多肽: SEQ ID NO. 2的多肽，與SEQ ID NO. 2具有約95 %同源性、約96 %、約97 %、約98 %、約 99%同源性的多肽；SEQ ID N0. 12的多肽，與SEQ ID N0. 12具有約95%同源性、約96%、 約97%、約98%、約99%同源性的多肽；SEQ ID N0. 3的多肽，與SEQ ID N0. 3具有約95% 同源性、約96%、約97%、約98%、約99%同源性的多肽；SEQ ID N0. 4的多肽，與SEQ ID N0. 4具有約95 %同源性、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %同源性的多肽；SEQ ID N0. 5的 多肽，與SEQ ID N0. 5具有約95%同源性、約96%、約97%、約98%、約99%同源性的多肽； SEQ ID N0. 6的多肽，與SEQ ID N0. 6具有約95%同源性、約96%、約97%、約98%、約99% 同源性的多肽；SEQID N0. 7的多肽，與SEQ ID N0. 7具有約95%同源性、約96%、約97%、 約98%、約99%同源性的多肽；SEQ ID N0. 8的多肽，與SEQID N0. 8具有約95%同源性、約 96%、約97%、約98%、約99%同源性的多肽；或SEQ ID N0. 9的多肽，與SEQ ID N0. 9具 有約95 %同源性、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %同源性的多肽。人顆粒體蛋白前體SEQ ID NO 2MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTV⑶VKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSC
PVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRffDAPLRDPALRQLL人顆粒體蛋白前體DNA SEQ ID NO 11ggcgagaggaagcagggaggagagtgatttgagtagaaaagaaacacagcattccaggct
61ggccccacctctatattgataagtagccaatgggagcgggtagccctgatccctggccaa
121tggaaactgaggtaggcgggtcatcgcgctggggtctgtagtctgagcgctacccggttg
181ctgctgcccaaggaccgcggagtcggacgcaggcagaccatgtggaccctggtgagctgg
241gtggccttaacagcagggctggtggctggaacgcggtgcccagatggtcagttctgccct
301gtggcctgctgcctggaccccggaggagccagctacagctgctgccgtccccttctggac
361aaatggcccacaacactgagcaggcatctgggtggcccctgccaggttgatgcccactgc
421tctgccggccactcctgcatctttaccgtctcagggacttccagttgctgccccttccca
481gaggccgtggcatgcggggatggccarcactgctgcccacggggcttccactgcagtgca
541gacgggcgatcctgcttccaaagatcaggtaacaactccgtgggtgccatccagtgccct
601gatagtcagttcgaatgcccggacttctccacgtgctgtgttatggtcgatggctcctgg
661gggtgctgccccatgccccaggcttcctgctgtgaagacagggtgcactgctgtccgcac
721ggtgccttctgcgacctggttcacacccgctgcatcacacccacgggcacccaccccctg
781gcaaagaagctccctgcccagaggactaacagggcagtggccrtgtccagctcggtcatg
841tgtccggacgcacggtcccggtgccctgatggttctacctgctgtgagctgcccagtggg
901aagtatggctgctgcccaatgcccaacgccacctgctgctccgatcacctgcactgctgc
961ccccaagacactgtgtgtgacctgatccagagtaagtgcctctccaaggagaacgctacc
1021acggacctcctcactaagctgcctgcgcacacagtgggggatgtgaaatgtgacatggag
1081gtgagctgcccagatggctatacctgctgccgtctacagtcgggggcctggggctgctgc
1141ccttttacccaggctgtgtgctgtgaggaccacatacactgctgtcccgcggggtttacg
1201tgtgacacgcagaagggtacctgtgaacaggggccccaccaggtgccctggatggagaag
1261gccccagctcacctcagcctgccagacccacaagccttgaagagagatgtcccctgtgat
1321aatgtcagcagctgtccctcctccgatacctgctgccaactcacgtctggggagtggggc
1381tgctgtccaatcccagaggctgtctgctgctcggaccaccagcactgctgcccccagggc
1441tacacgtgtgtagctgaggggcagtgtcagcgaggaagcgagatcgtggctggactggag
1501aagatgcctgCCCgCCgggCttccttatcccaccccagagacatcggctgtgaccagcac
1561accagctgcccggtggggcagacctgctgcccgagcctgggtgggagctgggcctgctgc
1621cagttgccccatgctgtgtgctgcgaggatcgccagcactgctgcccggctggctacacc
1681tgcaacgtgaaggctcgatcctgcgagaaggaagtggtctctgcccagcctgccaccttc
1741ctggcccgtagccctcacgtgggtgtgaaggacgtggagtgtggggaaggacacttctgc
1801catgataaccagacctgctgccgagacaaccgacagggctgggcctgctgtccctaccgc
1861cagggcgtctgttgtgctgatcggcgccactgctgtcctgctggcttccgctgcgcagcc
1921aggggtaccaagtgtttgcgcagggaggccCCgCgCtgggacgcccctttgagggaccca
1981gccttgagacagctgctgtgagggacagtactgaagactctgcagccctcgggaccccac
2041tcggagggtgccctctgctcaggcctccctagcacctccccctaaccaaattctccctgg0102]2101 accccattct gagctcccca tcaccatggg aggtggggcc tcaatctaag gccttccctg
0103]2161 tcagaagggg gttgtggcaa aagccacatt acaagctgcc atcccctccc cgtttcagtg
0104]2221 gaccctgtgg ccaggtgctt ttccctatcc acaggggtgt ttgtgtgtgt gcgcgtgtgc
0105]2281 gtttcaataa agtttgtaca ctttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa
0106]小鼠顆粒體蛋白前體SEQ ID NO 12
0107]MWVLMSWLAFAAGLVAGTQCPDGQFCPVACCLDQGGANYSCCNP
0108]LLDTWPRITSHHLDGSCQTHGHCPAGYSCLLTVSGTSSCCPFSKGVSCGDGYHCCPQG
0109]FHCSADGKSCFQMSDNPLGAVQCPGSQFECPDSATCCIMVDGSWGCCPMPQASCCEDR
0110]VHCCPHGASCDLVHTRCVSPTGTHTLLKKFPAQKTNRAVSLPFSVVCPDAKTQCPDDS
0111]TCCELPTGKYGCCPMPNAICCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKNYTTDLLTKLPGYP
0112]VKEVKCDMEVSCPEGYTCCRLNTGAWGCCPFAKAVCCEDHIHCCPAGFQCHTEKGTCE
0113]MGILQVPWMKKVIAPLRLPDPQILKSDTPCDDFTRCPTNNTCCKLNS⑶WGCCPIPEA
0114]VCCSDNQHCCPQGFTCLAQGYCQKGDTMVAGLEKIPARQTTPLQI⑶IGCDQHTSCPV
0115]GQTCCPSLKGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARTCEKDVDFIQPPVLLTL
0116]GPKVGNVECGEGHFCHDNQTCCKDSAGVWACCPYLKGVCCRDGRHCCPGGFHCSARGT
0117]KCLRKKIPRWDMFLRDPVPRPLL
0118]小鼠顆粒體蛋白前體DNA SEQ ID NO 13
0119]1 gagatgcctc ccagggagcc cggaccccga cgcaggcaga ccatgtgggt cctgatgagc
0120]61 tggctggcct tcgcggcagg gctggtagcc ggaacacagt gtccagatgg gcagttctgc
0121]121 cctgttgcct gctgccttga ccagggagga gccaactaca gctgctgtaa ccctcttctg
0122]181 gacacatggc ctagaataac gagccatcat ctagatggct cctgccagac ccatggccac
0123]241 tgtcctgctg gctattcttg tcttctcact gtgtctggga cttccagctg ctgcccgttc
0124]301 tctaagggtg tgtcttgtgg tgatggctac cactgctgcc cccagggctt ccactgtagt
0125]361 gcagatggga aatcctgctt ccagatgtca gataacccct tgggtgctgt ccagtgtcct
0126]421 gggagccagt ttgaatgtcc tgactctgcc acctgctgca ttatggttga tggttcgtgg
0127]481 ggatgttgtc ccatgcccca ggcctcttgc tgtgaagaca gagtgcattg ctgtccccat
0128]541 ggggcctcct gtgacctggt tcacacacga tgcgtttcac ccacgggcac ccacacccta
0129]601 ctaaagaagt tccctgcaca aaagaccaac agggcagtgt ctttgccttt ttctgtcgtg
0130]661 tgccctgatg ctaagaccca gtgtcccgat gattctacct gctgtgagct acccactggg
0131]721 aagtatggct gctgtccaat gcccaatgcc atctgctgtt ccgaccacct gcactgctgc
0132]781 ccccaggaca ctgtatgtga cctgatccag agtaagtgcc tatccaagaa ctacaccacg
0133]841 gatctcctga ccaagctgcc tggataccca gtgaaggagg tgaagtgcga catggaggtg
0134]901 agctgccctg aaggatatac ctgctgccgc ctcaacactg gggcctgggg ctgctgtcca
0135]961 tttgccaagg ccgtgtgttg tgaggatcac attcattgct gcccggcagg gtttcagtgt
0136]1021 cacacagaga aaggaacctg cgaaatgggt atcctccaag taccctggat gaagaaggtc
0137]1081 atagcccccc tccgcctgcc agacccacag atcttgaaga gtgatacacc ttgtgatgac
0138]1141 ttcactaggt gtcctacaaa caatacctgc tgcaaactca attctgggga ctggggctgc
0139]1201 tgtcccatcc cagaggctgt ctgctgctca gacaaccagc attgctgccc tcagggcttc
0140]1261 acatgtctgg ctcaggggta ctgtcagaag ggagacacaa tggtggctgg cctggagaag
1321atacctgcccgccagacaaccccgctccaaattggagatatcggttgtgaccagcatacc
1381agctgcccagtagggcaaacctgctgcccaagcctcaagggaagttgggcctgctgccag
1441ctgccccatgctgtgtgctgtgaggaccggcagcactgttgcccggccgggtacacctgc
1501aatgtgaaggcgaggacctgtgagaaggatgtcgattttatccagcctcccgtgctcctg
1561accctcggccctaaggttgggaatgtggagtgtggagaagggcatttctgccatgataac
1621cagacctgttgtaaagacagtgcaggagtctgggcctgctgtccctacctaaagggtgtc
1681tgctgtagagatggacgtcaCtgttgCCCCggtggcttccactgttcagccaggggaacc
1741aagtgtttgcgaaagaagattcctcgctgggacatgtttttgagggatccggtcccaaga
1801ccgctactgtaaggaagggctacagacttaaggaactccacagtcctgggaaccctgttc
1861cgagggtacccactactcaggcctccctagcgcctcctcccctaacgtctccccggccta
1921ctcatcctgagtcaccctatcaccatgggaggtggagcctC 3.3.3. C 3.3.3.3.ccttctttta
1981tggaaagaaggctgtggccaaaagccccgtatcaaactgccatttcttccggtttctgtg
2041gaccttgtggccaggtgctcttcccgagccacaggtgttctgtgagcttgCttgtgtgtg
2101tgtgcgcgtgtgcgtgtgttgctccaataaagtttgtacactttc
SEQ [D NO :3hGrnADVKCDMEVS-CPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQSEQ ID NO :4hGrnB-VMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSSEQ ID NO :5hGrnC-VPCDNVSS-CPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQ-CQSEQ ID NO: 6hGrnDDIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCESEQ ID NO :7hGrnEDVECGEGHF-CHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLSEQ ID NO :8hGrnFAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCISEQ ID NO: 9hGrnGGGPCQVDAH-CSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVAC⑶GHHCCPRGFHCSADGRSCFSEQ ID NO: IOgrn DAMDIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCE-KLAAALEHH HHHHSEQ ID NO : llgrn FAMAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCI-KLAAALEHH HHHH本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，通過(guò)保守置換改變蛋白的任意非關(guān)鍵氨基酸，不會(huì)顯著改 變蛋白的活性，因?yàn)橛糜谔鎿Q天然氨基酸的氨基酸的側(cè)鏈應(yīng)當(dāng)能形成與已經(jīng)被替換的氨基 酸的側(cè)鏈類(lèi)似的鍵和接觸。非保守置換是可行的，只要它們不會(huì)過(guò)度地影響多肽的神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)再生活性 和/或減少它在治療神經(jīng)變性疾病中的有效性。
本領(lǐng)域眾所周知，氨基酸的“保守置換”或多肽的“保守置換變體”是指氨基酸置 換，其維持1)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)(例如β折疊或α-螺旋結(jié)構(gòu))；2)氨基酸的電荷或疏水 性；和3)側(cè)鏈的龐大性(bulkiness)，或這些特征中的任意一項(xiàng)或更多項(xiàng)。更具體地，眾所 周知的術(shù)語(yǔ)“親水的殘基”涉及絲氨酸或蘇氨酸?！笆杷臍埢鄙婕傲涟彼帷惲涟彼?、苯 丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸?！皫д姾傻臍埢鄙婕百?lài)氨酸、精氨酸或組氨酸?！皫ж?fù)電荷的 殘基”涉及天冬氨酸或谷氨酸。具有“大側(cè)鏈”的殘基涉及苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。術(shù)語(yǔ)“保守的氨基酸置換”是本領(lǐng)域眾所周知的，它涉及用具有類(lèi)似特征的氨基酸 (例如，類(lèi)似的電荷或疏水性，類(lèi)似的龐大性)置換特定氨基酸。實(shí)例包括用天冬氨酸置換 谷氨酸，或用異亮氨酸置換亮氨酸。在表1中給出了例證性的保守氨基酸置換的列表。保守 置換變體1)相對(duì)于母本序列僅具有保守的氨基酸置換，2)相對(duì)于母本序列具有至少90% 序列同一性，優(yōu)選至少95 %同一性、96 %同一性、97 %同一性、98 %同一性或99 %或更高的 同一性；和3)保留神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)恢復(fù)活性。在這方面，根據(jù)本發(fā)明預(yù)見(jiàn)到上述多肽序列 的任意保守置換變體。這樣的變體被視作“顆粒體蛋白前體”。表權(quán)利要求
1.治療神經(jīng)變性疾病患者的方法，所述方法包含下述步驟給患者施用包含顆粒體蛋白前體多肽的組合物；和減輕患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患者 體重至約lmg/kg患者體重的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患者 體重至約500ng/kg患者體重的范圍內(nèi)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患者 體重至約lOOng/kg患者體重的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中包含顆粒體蛋白前體多肽的組合物適合腸胃外 給藥。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中腸胃外給藥途徑選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉 內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒素介導(dǎo)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述留醇糖苷選自谷留醇-D-葡糖苷 和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、阿爾茨海 默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述顆粒體蛋白前體多肽與SEQID NO :2具 有至少95%同源性。
16.藥物組合物，其包含治療有效量的顆粒體蛋白前體多肽和用于其的藥學(xué)上可接受 的載體，其中所述治療有效量包含能減輕或預(yù)防患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀的量。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述組合物適合腸胃外給藥。
18.權(quán)利要求16或17的藥物組合物，其中腸胃外給藥途徑選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌 肉內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地。
19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由環(huán)境對(duì)患 者的損傷介導(dǎo)。
20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒 素介導(dǎo)。
21.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
22.權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述留醇糖苷選自β_谷甾 醇- β -D-葡糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
23.權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、阿爾茨海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
25.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
26.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
27.腸胃外劑型的權(quán)利要求16-26中任一項(xiàng)的藥物組合物。
28.權(quán)利要求16-27中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述劑型適合選自下述途徑的腸胃 外給藥真皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和 脊索內(nèi)的。
29.權(quán)利要求16-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述顆粒體蛋白前體多肽與SEQID NO: 2具有至少95%同源性。
30.減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，所述方法包含下述步驟給患者施用治療有效量的顆粒體蛋白前體多肽，其中所述肽的量可以有效地增加神經(jīng) 變性疾病患者中的神經(jīng)元細(xì)胞存活；和減少患者中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
31.權(quán)利要求30的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患 者體重至約lmg/kg患者體重的范圍內(nèi)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患 者體重至約500ng/kg患者體重的范圍內(nèi)。
33.權(quán)利要求30的方法，其中給患者施用的顆粒體蛋白前體多肽的量是在約lng/kg患 者體重至約lOOng/kg患者體重的范圍內(nèi)。
34.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的方法，其中包含顆粒體蛋白前體多肽的組合物適合腸 胃外給藥。
35.權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的方法，其中腸胃外給藥途徑選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌 肉內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地。
36.權(quán)利要求30-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由環(huán)境對(duì)患者的損 傷介導(dǎo)。
37.權(quán)利要求30-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒素介導(dǎo)。
38.權(quán)利要求30-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
39.權(quán)利要求30-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述留醇糖苷選自β_谷留醇-β-D-葡糖 苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
40.權(quán)利要求30-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、阿爾茨 海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
44.權(quán)利要求30-43中任一項(xiàng)的方法，其中所述顆粒體蛋白前體多肽是這樣的多肽，其 中所述多肽與SEQ ID NO :2具有至少95%同源性。
45.治療神經(jīng)變性疾病患者的方法，所述方法包含下述步驟給患者施用包含修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物的組合物；和減輕患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述包含效應(yīng)物的組合物適合腸胃外給藥。
47.權(quán)利要求45或46的方法，其中腸胃外給藥途徑選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi) 地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)地、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地。
48.權(quán)利要求45-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)。
49.權(quán)利要求45-48中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒素介導(dǎo)。
50.權(quán)利要求45-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
51.權(quán)利要求45-50中任一項(xiàng)的方法，其中所述留醇糖苷選自β-谷留醇-β-D-葡糖 苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
52.權(quán)利要求45-51中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、阿爾茨 海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
55.權(quán)利要求52的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
56.權(quán)利要求45-55中任一項(xiàng)的方法，另外包含增加神經(jīng)元中顆粒體蛋白前體的表達(dá) 的步驟。
57.權(quán)利要求45-56中任一項(xiàng)的方法，另外包含減少非神經(jīng)元細(xì)胞中顆粒體蛋白前體 的表達(dá)的步驟。
58.權(quán)利要求45-57中任一項(xiàng)的方法，其中所述效應(yīng)物是載體，其包含與SEQID NO=I 具有至少95%同源性的核酸。
59.藥物組合物，其包含治療有效量的修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物和用于其的 藥學(xué)上可接受的載體，其中所述治療有效量包含能減輕或預(yù)防患者中神經(jīng)變性疾病的癥狀的量。
60.權(quán)利要求59的藥物組合物，其中所述治療有效量包含能增加神經(jīng)元中顆粒體蛋白 前體表達(dá)的量。
61.權(quán)利要求59或60的藥物組合物，其中所述治療有效量包含能減少非神經(jīng)元細(xì)胞中 顆粒體蛋白前體表達(dá)的量。
62.腸胃外劑型的權(quán)利要求59-61中任一項(xiàng)的藥物組合物。
63.權(quán)利要求59-62中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述劑型適合選自下述途徑的腸胃 外給藥真皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和 脊索內(nèi)的。
64.權(quán)利要求59-63中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由環(huán)境對(duì)患 者的損傷介導(dǎo)。
65.權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒 素介導(dǎo)。
66.權(quán)利要求59-65中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
67.權(quán)利要求59-66中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述留醇糖苷選自β_谷甾 醇- β -D-葡糖苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
68.權(quán)利要求59-67中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、 阿爾茨海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
69.權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
70.權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
71.權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
72.腸胃外劑型的權(quán)利要求59-71中任一項(xiàng)的藥物組合物。
73.權(quán)利要求59-72中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述劑型適合選自下述途徑的腸胃 外給藥真皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的、大腦內(nèi)的和 脊索內(nèi)的。
74.權(quán)利要求59-73中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述效應(yīng)物是載體，其包含與SEQID NO 1具有至少95%同源性的核酸。
75.減少患者中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，所述方法包含下述步驟給患者施用治療有效量的修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物，其中所述效應(yīng)物的量可 以有效地增加由環(huán)境對(duì)患者的損傷介導(dǎo)的神經(jīng)變性疾病的患者中的神經(jīng)元細(xì)胞存活；和減少患者中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述包含效應(yīng)物的組合物適合腸胃外給藥。
77.權(quán)利要求75或76的方法，其中腸胃外給藥途徑選自真皮內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi) 地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)地、大腦內(nèi)地和脊索內(nèi)地。
78.權(quán)利要求75-77中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由環(huán)境對(duì)患者的損 傷介導(dǎo)。
79.權(quán)利要求75-78中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)由興奮性毒素介導(dǎo)。
80.權(quán)利要求75-79中任一項(xiàng)的方法，其中所述興奮性毒素是留醇糖苷。
81.權(quán)利要求75-80中任一項(xiàng)的方法，其中所述留醇糖苷選自β_谷留醇-β-D-葡糖 苷和膽固醇葡糖苷或其類(lèi)似物或衍生物。
82.權(quán)利要求75-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森病、阿爾茨 海默氏病和肌萎縮側(cè)索硬化。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病。
85.權(quán)利要求82的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病是肌萎縮側(cè)索硬化。
86.權(quán)利要求75-85中任一項(xiàng)的方法，其中所述效應(yīng)物是載體，其包含與SEQID NO=I 具有至少95%同源性的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)變性疾病的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明涉及使用顆粒體蛋白前體和顆粒體蛋白前體多肽治療神經(jīng)變性疾病的方法，和使用修飾顆粒體蛋白前體表達(dá)的效應(yīng)物或效應(yīng)物組合治療神經(jīng)變性疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102006882SQ200980107222
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日
發(fā)明者D·G·凱 申請(qǐng)人:神經(jīng)動(dòng)力公司