專利名稱：多孔狀膠原蛋白基質(zhì)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)于一種自結(jié)締組織制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白基質(zhì)可用以制造特別是人造組織、人造器官及藥劑輸送載體。膠原蛋白 基質(zhì)一般都是由膠原蛋白纖維重組而成，膠原蛋白纖維是由富含膠質(zhì)的結(jié)締組織萃取出 來?，F(xiàn)有習知用以萃取出膠原蛋白纖維的方法需要嚴苛的物理或化學處理，例如研磨、均質(zhì) 化或酸/堿降解，其都會損壞膠原蛋白纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于下列不可預(yù)期的發(fā)現(xiàn)以一種實質(zhì)上不包含鹽類的弱酸溶液處理結(jié) 締組織時，可使結(jié)締組織膨脹至極大的限度而不會破壞膠原蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明一方面的特征為一種直接自結(jié)締組織制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的方 法。此方法包含(i)提供一結(jié)締組織，其表面積為20平方毫米(mm2)至2平方米(m2)(例 如25平方毫米至900平方米)；(ii)以一酸液使該結(jié)締組織的體積至少膨脹百分之五十 (例如為100%至500%)而形成一膨脹結(jié)締組織；以及(iii)清洗該膨脹結(jié)締組織以除去 非膠原蛋白物質(zhì)借此形成一多孔狀膠原蛋白基質(zhì)。上述的結(jié)締組織是源自真皮組織或筋 腱。上述用于膨脹的酸液的酸堿值(PH值)介于1至6(例如2至4)，且酸液實質(zhì)上不包含 鹽類，也就是說溶液中沒有鹽類成分，或者是鹽類濃度非常低，使得溶液的離子強度不大于 0. 005M。在一些實施例中，上述的酸液可由甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷 酸或其混合物來制備。較佳的是，上述酸液為0. 1-6M的醋酸溶液。在膨脹步驟之前，可用一溶劑潤洗上述的結(jié)締組織，所述溶劑包含一有機溶劑以 及選擇性的包含水。當溶劑包含有機溶劑以及水時，溶劑與水的體積比為1 4至9 1。 在一些實施例中，有機溶劑包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、 二甲亞砜及其混合物。當結(jié)締組織是源自表皮且含有毛發(fā)或毛根時，較佳的是以蛋白水 解酶預(yù)先處理含有毛發(fā)或毛根的表皮以移除毛發(fā)或毛根，蛋白水解酶可為，例如分散酶 (dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶(ficin)或其混合物。上述的膨脹步驟可借由將結(jié)締組織浸泡于酸液而達成?？蛇x擇地，上述的浸泡步 驟是借由同時以一超音波處理結(jié)締組織或同時將一液體噴射至結(jié)締組織而達成。在上述的膨脹步驟之后，可清洗膨脹后的結(jié)締組織以除去非膠原蛋白物質(zhì)，借此 制備出一多孔狀膠原蛋白基質(zhì)。上述的清洗步驟可借由將該膨脹結(jié)締組織浸泡于一清洗液 而達成，該清洗液可進一步包含一清潔劑、蛋白酶或其混合物?？蛇x擇地，上述浸泡步驟可 一起將一液體噴射至該膨脹結(jié)締組織而達成或一起以一超音波處理該結(jié)締組織而達成，或 結(jié)合二種物理力量而達成。一種由前述方法所制備的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)也屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)。
為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、和優(yōu)點能更明顯，并視后附的申請專利范 圍所界定者為準，下文特舉本發(fā)明一些實施例并配合所附圖示，作詳細說明如下。


圖1是根據(jù)實施例1所描述的方法制備的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的掃描式電子顯微 圖(放大倍率100倍)。圖2是根據(jù)實施例1所描述的方法制備的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的掃描式電子顯微 圖(放大倍率400倍)。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種方法，是直接自結(jié)締組織制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)，其中膠原蛋 白為結(jié)締組織中的主要蛋白質(zhì)。膠原蛋白是一種三股螺旋(triple-helix)桿狀分子，此分 子具有約300納米(nm)的長度及約1. 5納米(nm)的直徑。大量的膠原蛋白分子形成膠原 蛋白纖維絲，而一束膠原蛋白纖維絲形成一膠原蛋白纖維。膠原蛋白分子之間以及膠原蛋 白分子內(nèi)部存在著共價的交聯(lián)，借此在結(jié)締組織內(nèi)形成了纖維狀的網(wǎng)絡(luò)。在本發(fā)明的方法中，起始材料即為結(jié)締組織，可取自于動物，例如牛、豬、馬、羊、 雞、鴨、火雞、鵝、鯨魚或者鯊魚等畜類或魚類。適用于本發(fā)明方法的結(jié)締組織包含，但不限 于，真皮組織、皮下組織、韌帶、筋腱、腱膜、軟骨、骨頭組織。假如需要的話，先用人工(例 如借由粗略的切開(gross dissection))或機械清理結(jié)締組織以除去不需要的材料，例如 脂肪及脂質(zhì)。在一實施例中，真皮組織是取自新鮮的動物皮，將動物皮除去脂質(zhì)、以鹽水 (saline)清洗皮數(shù)次后，以一植皮刀(dermatome)除去動物皮的表面層即可獲得真皮組 織。所得的真皮組織可用磷酸鹽緩沖溶液進一步清洗。假如需要，結(jié)締組織可以先用一適合的有機溶劑或者是一有機溶劑與水的混合液 進行處理，使有機溶劑可以滲透入結(jié)締組織。有機溶劑包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯 仿、N，N- 二甲基甲酰胺、二甲亞砜或其混合物。當使用有機溶劑與水的混合液時，有機溶劑 與水的比例高于1 5(例如1 4、1 1或4 1)。當結(jié)締組織含有毛發(fā)或毛根時，可先以蛋白水解酶處理以除去毛發(fā)或毛根，蛋 白酶可為，例如分散酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白 酶(P印sin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶 (ficin)或其混合物。接著，將上述任一結(jié)締組織浸泡于適量酸液中，經(jīng)過適當?shù)臅r間后，使得結(jié)締組織 膨脹到所需的標準，亦即比原厚度至少增加50%的厚度(較佳為原厚度的2-10倍)。上述 的酸液可以一有機酸來制備，有機酸可為，例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼 酸、磷酸或其混合物。在一實施例中，酸液可為濃度0. 1-6M(較佳為0. 1-2M或0. 5-1. 25M) 的醋酸。為了獲得較佳的膨脹效果，本發(fā)明所使用的酸液實質(zhì)上不包含鹽類。在上述的膨脹步驟中，結(jié)締組織是懸浮于以上所述的酸液中。假如需要的話，可利 用一或數(shù)道液體來處理結(jié)締組織，促使酸液滲透入結(jié)締組織并縮短膨脹結(jié)締組織所需的時 間。上述的液體可以由一容器的噴嘴或噴孔來噴出，上述的酸液及結(jié)締組織是置放于該容 器內(nèi)。
或者，或此外，可將一超音波震動裝置產(chǎn)生一超音波或借由一電磁場或一凸輪 (cam)所產(chǎn)生的高頻率水波施加于浸泡于酸液中的結(jié)締組織，以促使酸液滲透入結(jié)締組織。使用一清洗液來清洗上述膨脹步驟所制備的膨脹結(jié)締組織，以實質(zhì)上除去上述膨 脹結(jié)締組織中的非膠原蛋白物質(zhì)，借此以制備一多孔狀膠原蛋白基質(zhì)。所述的清洗液可含 有清潔劑、螯合劑、蛋白酶或其混合物。用以制備清洗液的范例清潔劑包含，但不限于十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulphate, SDS)、Tego化合物(例如介面活性劑Tween-80、非離子清潔劑TffR(Triton W. R. 1339)、對-異辛烷基聚氧-乙烯苯酚聚合物(p-isooctylpolyoxy-ethylene phenol polymer)與四丁酚醛(Triton A20)表面活性劑)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、溴化十六燒基三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide)、二辛燒鈉磺基 琥珀酸酯(dioctyl sodium sulphosuccinate)、品名為“Emasol 4130”的聚氧基乙烯山梨 糖醇油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monoleate)介面活性劑、品名為 “Lubrol W” 的 非離子介面活性劑、品名為“Nonidet P40”的非離子介面活性劑)。在一實施例中，使用一 含有SDS濃度0. 01 %至10%的清洗液，在4°C至45°C溫度下處理所述膨脹結(jié)締組織1小時 至150小時。 所述清潔液所含的螯合劑包含，但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十 二燒基 _1，4，7，10，-四乙酸(1， 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraaceticacid, D0TA)>1,4,7,10-四 氮雜環(huán)十 二燒基_1，4，7，10，-四亞甲基磷酸[1，4，7，10-tetraazacyclododecane-l， 4, 7,10-tetrakis (methylene phosphonicacid)，D0TP]、環(huán)己二胺四醋酸(trans-1， 2-diaminocyclohexantetra-aceticacid, CDTA)、4,5_ 二 輕基苯-1,3- 二石黃酸(4,
5-dihydroxybenzene-l,3-disulphonicacid, Tiron)> 硫月尿(thiourea)>8- ψ 基
啉-5-石黃酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonicacid)、3,6- 二石黃基-1,8- 二輕基萘(3,
6-disulpho-l,8-dihydroxy-naphthalene)>Eriochromeschwarz T[l_(l_ 15 ~2~ 蔡基f禹 M ) -2- 15 -5-石肖基 _4_ 蔡石黃酸]{Eriochromeschwarz T [1- (l-hydroxy-2-naphthylazo )-2-hydroxy-5-nitro-4-naphthalene sulphoriicacid]、紅紫酸I安(ammonium purpurate) 等。較佳的螯合劑為0. OlmM至IOOmM的EDTA?；蛘撸虼送?，清洗液可包含一或多種蛋白水解酶，例如無花果蛋白酶(ficin)、胃 蛋白酶(ρ印sin)、胰蛋白酶(trypsin)、分散酶(dispase)、溶血素(hermolysin)或其混合 物，以除去連接于細胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)、其它非膠原蛋白的蛋白質(zhì)與膠原蛋白分子的末端 肽(telopeptide)。在此技術(shù)領(lǐng)域中，有限度的酵素切割(亦即使非膠原蛋白的蛋白質(zhì)降解 但仍保持膠原蛋白纖維的完整性)的條件是眾所皆知的。在清洗步驟中，可將所述膨脹的結(jié)締組織浸泡于前面所提到酸液之中的任一種一 段適當?shù)臅r間。在一實施例中，將一或多道液體自一噴嘴或噴孔噴射至所述的結(jié)締組織，以 促進非膠原蛋白物質(zhì)的移除。所述液體可為水、包含清潔劑的溶液或包含酵素的溶液。在 另一實施例中，使用超音波處理浸泡于清洗液中的膨脹結(jié)締組織，可改善清洗效率。可將已經(jīng)進行過上述清洗步驟的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)冷凍并控制冷凍速率以使 基質(zhì)含有所需的冰晶尺寸。然后可用冷凍干燥法進行保存?；蛘撸嗫谞钅z原蛋白基質(zhì)可 浸泡于一磷酸鹽緩沖溶液中并儲存于4°C的溫度環(huán)境。當有需要時，可借由一般的化學或物理方法使上述的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)交聯(lián)化。用于使上述多孔狀膠原蛋白基質(zhì)交聯(lián)化 的交聯(lián)劑包含戊二醛(glutaraldehyde)、甲醛(formaldehyde)、碳二酰胺(carbodiimide) 或其它聚環(huán)氧樹脂化合物(poly印oxy compound)，例如乙二醇二縮水甘油醚(glycol diglycidyl ether)、聚醚多縮水甘油醚(polyol polyglycidylether)、二羧酸二縮水甘油 酉旨(dicarboxylic acid diglycidyl ester)。前述用以制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的方法在至少兩個方面上不同于現(xiàn)有習知的 方法。第一，本發(fā)明的方法不需要嚴苛的物理或化學處理法(例如研磨、均質(zhì)化或酸/堿降 解)，這些方法都會破壞結(jié)締組織中膠原蛋白纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。第二，用以膨脹結(jié)締組織的 酸液實質(zhì)上不包含鹽類，而一般現(xiàn)有習知方法是利用鹽類來穩(wěn)定膠原蛋白纖維。在此也揭露一種多孔狀膠原蛋白基質(zhì)，其是以前述任一種制備方法所制備。所述 的多孔狀膠原蛋白基質(zhì)可以用來制造人造組織、人造器官、植入物，以及藥劑輸送載體系 統(tǒng)，或者作為細胞生長的支架。相信在此技術(shù)領(lǐng)域中的熟悉技藝者基于前述的描述，都可將 本發(fā)明充分的利用而不需進一步的詳細描述。因此，下文所舉實施例僅僅只是作為范例，并 非用以在任何方面限制本發(fā)明。在此引用的所有文獻并入本案以作為參照。實施例1 由豬皮制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)自豬身上取得皮膚組織，除去脂質(zhì)后，以鹽水(saline)清洗皮數(shù)次，以植皮刀 (dermatome)除去皮的表皮層以獲得一厚度為0. 3毫米(mm)的真皮組織。進一步以磷酸鹽 緩沖溶液清洗所述的真皮組織。在清洗過后，將所有緩沖溶液殘余物自真皮組織的表面完 全的除去。將真皮組織置入一裝有濃度0. 5M醋酸溶液的容器內(nèi)，并在37°C定溫放置不同的 時間來膨脹真皮組織。在定溫放置期間，容器是放置于一震動器上，以使真皮組織懸浮。經(jīng) 由不同時間膨脹后真皮組織的厚度列于下表一表一經(jīng)過不同時間的醋酸處理后膨脹真皮組織的厚度
權(quán)利要求
1.一種自結(jié)締組織制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的方法，其特征在于該方法包含提供一結(jié)締組織，其表面積為20平方毫米至2平方米；以一酸液使該結(jié)締組織的體積至少膨脹百分之五十而形成一膨脹結(jié)締組織，其中該酸 液的酸堿值(PH值)介于1至6且該酸液實質(zhì)上不包含鹽類；以及清洗該膨脹結(jié)締組織以除去非膠原蛋白物質(zhì)，借此形成一多孔狀膠原蛋白基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該結(jié)締組織的尺寸為25平方毫米至 900平方厘米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該弱酸液包含由甲酸、羧酸、草酸、醋 酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于其中該酸液的酸堿值(pH值)介于2至4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中該酸液包含濃度0.1-6M的醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中在該膨脹步驟中，該結(jié)締組織膨脹后 體積為 100% -500% O
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該膨脹步驟包含將該結(jié)締組織浸泡于 該酸液，且同時將一液體噴射至該結(jié)締組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該膨脹結(jié)締組織浸 泡于一清洗液，該清洗液包含一清潔劑、一蛋白酶或其混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該膨脹結(jié)締組織浸 泡于該清洗液中，且同時將一液體噴射至該膨脹結(jié)締組織中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該膨脹步驟包含將該結(jié)締組織浸泡 于該酸液中，且同時以超音波處理該結(jié)締組織。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該膨脹結(jié)締組織 浸泡于該清洗液中，且同時以超音波處理該結(jié)締組織。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于更包含在膨脹步驟之前，以一溶劑處理 該結(jié)締組織，該溶劑包含一有機溶劑以及可選擇性的包含水，其中該有機溶劑是選自由醇、 酮、丙酮、乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜及其混合物所組成的群組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于其中該溶劑包含有機溶劑以及水且有機 溶劑與水之間的體積比為1 4至9 1。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該結(jié)締組織包含多根毛發(fā)或毛根， 且該方法更包含，在該膨脹步驟之前，以微堿溶液或蛋白水解酶處理該結(jié)締組織以松弛 (loosen)該些毛發(fā)或毛根。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于其中該蛋白水解酶是選自分散酶 (dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶(ficin)及其混合物所組成的群 組。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該結(jié)締組織是源自于真皮組織或筋腱。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于更包含在該清洗步驟之后，干燥該多孔狀 膠原蛋白基質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中該清洗步驟包含以一第一清洗液以 及一第二清洗液處理該膨脹結(jié)締組織，該第一清洗液包含一清潔劑、一螯合劑或其混合物， 而該第二清洗液包含一蛋白酶。
19.一種多孔狀膠原蛋白基質(zhì)，其特征在于是根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。
20.一種多孔狀膠原蛋白基質(zhì)，其特征在于是根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法制備。
全文摘要
一種使用實質(zhì)上不包含鹽類的酸液，直接由結(jié)締組織制備多孔狀膠原蛋白基質(zhì)的方法。
文檔編號A61L27/50GK102099063SQ200980101281
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者黃玲惠 申請人:惠合再生醫(yī)學生技股份有限公司, 成功大學