專利名稱：乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白復(fù)合物，特別涉及乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù) 合物，還涉及該復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎簡稱乙型肝炎，是 由HBV引起，主要通過血液、體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)的傳染病。目前世界上有 3億多人為慢性HBV感染，我國約占半數(shù)。此種感染容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病 例可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌，是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。為 此，尋求理想的抗HBV藥物一直是亟待解決的研究課題。目前，慢性HBV感染主要采用抗病 毒藥物進(jìn)行治療，應(yīng)用的抗病毒藥物主要有干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等，其中，干擾 素的適應(yīng)癥有限，療效較差，不良反應(yīng)發(fā)生率較高，且價格昂貴；拉米夫定作為逆轉(zhuǎn)錄酶的 強(qiáng)抑制劑，在控制慢性HBV感染方面具有確切的近期療效，且有良好的耐受性，但其不能清 除肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的來源，長期用藥又存在耐藥問題。因此，積極尋求更為有效的抗病毒 藥物仍為當(dāng)務(wù)之急。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在針對病毒、細(xì)菌和真菌等病原性微 生物以及惡性腫瘤等的免疫監(jiān)視、免疫防御以及免疫治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。HBV感染 的慢性化主要是由于機(jī)體對HBV的免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答不能清除病原，從而導(dǎo)致 感染的持續(xù)存在。在急性HBV感染時，機(jī)體存在大量的針對HBV多個抗原表位的多特異性、 多克隆的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而在慢性HBV感染時，這些CTL應(yīng)答非常微弱甚至檢 測不到。因此，采取恰當(dāng)?shù)拿庖叻绞?，打破機(jī)體對HBV的免疫耐受，重建活躍的免疫應(yīng)答，有 望清除病毒，終止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一種結(jié)構(gòu)蛋白， 是機(jī)體CTL識別和攻擊HBV感染細(xì)胞的主要靶抗原。因此，增強(qiáng)HBcAg特異性的CTL應(yīng)答， 有望終止慢性HBV感染。熱休克蛋白(Heat Shock Protein, HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守，廣泛存在 于原核和真核生物中的蛋白質(zhì)，具有“分子伴侶”作用，參與胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn) 等過程。HSP按分子量大小分為以下幾個家族HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小HSP家族。 每個家族又由多個成員組成，如HSP70家族成員有HSP70、熱休克同源蛋白(HSC) 70、糖調(diào)蛋 白(GRP) 78和GRP75等，HSP90家族成員有HSP90和GP (糖蛋白)96等。許多研究結(jié)果證 實(shí)，HSP作為理想的分子佐劑可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在抗病毒等疾病治療中發(fā)揮重要 作用。進(jìn)一步研究表明，HSP可通過以下幾方面誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答(1)抗原肽-HSP復(fù)合 物作為完整抗原，被抗原遞呈細(xì)胞攝取、加工后，與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合并遞 呈到細(xì)胞表面，從而活化T細(xì)胞，包括⑶4+和⑶8+T細(xì)胞，特別是CTL，產(chǎn)生抗病毒的特異 性細(xì)胞免疫；HSP在此處起到載體或佐劑的作用，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的是其結(jié)合的抗原肽；(2) HSP本身具有活化巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的作用，從而增加共刺激因子和MHC的表達(dá)，加強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫；(3)自然殺傷細(xì)胞和Y δ T細(xì)胞是體內(nèi)重要的抗病毒免疫細(xì)胞，對病毒 感染細(xì)胞的殺傷效應(yīng)不受MHC的限制，HSP可直接作為抗原遞呈分子，將抗原肽遞呈至細(xì) 胞表面，從而活化自然殺傷細(xì)胞和Y S T細(xì)胞，產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答。近年來研究發(fā)現(xiàn)， GRP170也是HSP70家族的成員，是一種對較大的抗原肽也具有伴侶作用的高分子量HSP，具 有強(qiáng)大的免疫佐劑效應(yīng)。目前，以抗原肽-HSP復(fù)合物為基礎(chǔ)的疫苗多采用HSP70、HSP90和 GP96進(jìn)行構(gòu)建，并且多用于腫瘤治療的研究，尚未見采用GRP170構(gòu)建乙型肝炎治療性疫苗 的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種HBcAg與HSP的復(fù)合物，能夠激活識別 HBcAg的特異性CTL，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗病毒免疫，且不需要任何佐劑，在同種間應(yīng)用不受MHC 的限制；目的之二在于提供所述HBcAg與HSP的復(fù)合物的制備方法；目的之三在于提供所 述HBcAg與HSP的復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案l、HBcAg與HSP的復(fù)合物，由HBcAg與GRP170以非共價鍵結(jié)合而成，所述HBcAg具 有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列，GRP170具有SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。進(jìn)一步，由HBcAg與GRP170以摩爾比為1 1結(jié)合而成。2、所述PSCA與HSP的復(fù)合物的制備方法，是在濃度為0. 01mol/L、pH為7. 2 7. 4 的PBS中，分別加入HBcAg和GRP170，混合均勻，在43°C孵育30分鐘，再在37°C孵育1小 時，即得HBcAg與HSP的復(fù)合物。進(jìn)一步，按摩爾比為1 1加入HBcAg和GRP170，使HBcAg和GRP170的終濃度為 3 6 μ g/mL03、所述HBcAg與HSP的復(fù)合物在制備乙型肝炎治療性疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于研究結(jié)果顯示，本發(fā)明的HBcAg與HSP的復(fù)合物具有良好 的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌干擾素-γ (IFN-y)；并能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒 效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞，導(dǎo)致HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性明顯升 高；還能夠有效抑制HBV的復(fù)制，顯著降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA載量；因此，本發(fā)明 的復(fù)合物在體內(nèi)能夠激活識別HBcAg的特異性CTL，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗病毒免疫。此外，由于 HSP結(jié)構(gòu)上的高度保守，不具有多態(tài)性，本發(fā)明復(fù)合物在同種內(nèi)相互使用不受MHC的限制； 且HSP自身具有免疫佐劑的作用，省略了常規(guī)蛋白免疫需要免疫佐劑的麻煩。本發(fā)明復(fù)合 物的制備方法簡單，可以用于制備乙型肝炎治療性疫苗，在乙型肝炎免疫治療領(lǐng)域有著良 好的開發(fā)應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為PCR擴(kuò)增HBcAg基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖2為蛋白免疫印跡(Western Blot)鑒定HBcAg ；圖3為PCR擴(kuò)增GRP170基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖 4 為 Western Blot 鑒定 GRP170 ；圖5為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測HBcAg-GRP 170復(fù)合物激發(fā)CTL分泌IFN- γ 的能力；圖6為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測結(jié)果；圖7為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、HBcAg_GRP170 復(fù)合物的制備1、HBcAg 的制備(I)HBcAg基因的克隆根據(jù)GenBank登錄號為NC 003977. 1的HBcAg基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物以 PCR 擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的 HBcAg cDNA 全長F1 :5，-cggaattcggcatggacatcgacccttat -3，(SEQ ID No. 3)，下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)；Rl :5，ccgctcgagagttccccaccttatgag tc-3’ (SEQ ID No. 4)，下劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)；分離HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟細(xì)胞，用 RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X IO7個/mL，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用總 RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA ；將所得細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板、Fl 和Rl為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性1分鐘、 58°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與PGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì) 粒，委托上海生工公司測定質(zhì)粒序列，將插入了 HBcAg cDNA全長序列(SEQ ID No. 1)的陽 性克隆質(zhì)粒命名為PGEM-HBcAg ；PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為 PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約550bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) HBcAg原核表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pGEM-HBcAg和原核表達(dá)載體pET32a (+)分別用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶 切，用凝膠回收試劑盒切膠回收純化雙酶切后的HBcAg cDNA全長和線性載體pET32a(+)， 16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩 選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，并委托上海生工公司 測定質(zhì)粒序列，將插入了 HBcAgcDNA全長序列的陽性克隆質(zhì)粒命名為HBcAg原核表達(dá)載體 pET32-HBcAg。(3) HBcAg工程菌的構(gòu)建將HBcAg原核表達(dá)載體pET32-HBcAg用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢 赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)3 4天，挑取白色酵母菌 落，分別點(diǎn)接于MD和匪平板，30°C培養(yǎng)3 6天(每天向匪平板中添加甲醇100 μ L)，挑 取MD平板上生長明顯快于匪平板的酵母菌落，點(diǎn)接于含有濃度為4mg/mL的G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)7天，所得酵母單菌落為高拷貝HBcAg工程菌；(4) HBcAg的誘導(dǎo)表達(dá)將高拷貝HBcAg工程菌于30°C培養(yǎng)至0D600為2，按10%接種量接入BMGY培養(yǎng)基 中，30°C培養(yǎng)24小時，5000g離心5分鐘，棄上清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于等體積 的BMMY培養(yǎng)基中，30°C誘導(dǎo)表達(dá)3天(每24小時補(bǔ)加誘導(dǎo)劑甲醇至最終體積百分濃度為 0.5% )，4°C、6000g離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使蛋白質(zhì)沉 淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0. 02mol/L、pH為8. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析脫 鹽，再用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)柱進(jìn)行分離純化，用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性 梯度洗脫，收集含有HBcAg的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠(S印hdexG-25)柱脫鹽，即 得純化的HBcAg (氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示)。Western Blot鑒定取純化的HBcAg，加入內(nèi)參β-actin和上樣緩沖液，100°C 加熱3 5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層膠進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂牛奶 封膜，加入鼠抗人HBcAg單克隆抗體和鼠抗人β -actin單克隆抗體，溫度37°C孵育1小時， 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè)置 陰性對照(不加入純化的HBcAg)；結(jié)果見圖2，其中1泳道為純化的HBcAg，2泳道為陰性對 照，可見1泳道除內(nèi)參β -act in條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見相應(yīng)條帶。2、GRP170 的制備(1)GRP170基因的克隆根據(jù)GenBank登錄號為NM 006389. 3的GRP170基因序列和真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成如下PCR引物以擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的GRP170cDNA 全長F2 5 ‘ accggatcctcgcaaataaaatagt-3 ‘ (SEQ ID No. 7)，下劃線部分為 BamH I 酶切位 點(diǎn)；R2 iS'-gtacagtctagattaatggtgatggtgatgatgtgaaggccgcttctgtcc-S' (SEQ ID No. 8), 下劃線部分為Xba I酶切位點(diǎn)；以含有GRP170cDNA全長的質(zhì)粒為模板、F2和R2為上下游 引物進(jìn)行PCR，PCR條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒，72°C 延伸2. 5分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠 回收試劑盒切膠回收純化。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為 PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在約3000bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2)GRP170真核表達(dá)載體的構(gòu)建將純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3. 1分別用BamH I和Xba I進(jìn)行雙酶 切，用凝膠回收試劑盒切膠回收純化雙酶切后的GRP170cDNA全長和線性化載體pcDNA3. 1， 16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩 選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒，用BamH I和Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定，并委托上海生工公 司測定質(zhì)粒序列，將插入了 GRP170cDNA全長序列(SEQ ID No. 5)的陽性克隆質(zhì)粒命名為 GRP170 真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1-GRPl70 (3)GRP170工程菌的制備將GRP170真核表達(dá)載體pcDNA3. 1-GRP170用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn) 化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)3 4天，挑取白色酵母
6菌落，分別點(diǎn)接于MD和匪平板，30°C培養(yǎng)3 6天(每天向匪平板中添加甲醇100 μ L)， 挑取MD平板上生長明顯快于匪平板的酵母菌落，點(diǎn)接于含有濃度為4mg/mL的G418的YPD 平板，30°C培養(yǎng)7天，所得酵母單菌落為高拷貝GRP170工程菌。(4)GRP170的誘導(dǎo)表達(dá)將高拷貝GRP170工程菌于30°C培養(yǎng)至0D600為2，按10%接種量接入BMGY培 養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24小時，5000g離心5分鐘，棄上清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于 等體積的BMMY培養(yǎng)基中，30°C誘導(dǎo)表達(dá)3天(每24小時補(bǔ)加誘導(dǎo)劑甲醇至最終體積百分 濃度為0. 5% )，4°C、6000g離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使 蛋白質(zhì)沉淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0. 02mol/L、pH為8. 0的PBS透析脫鹽，再 用Q-Sepharose柱進(jìn)行分離純化，用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含有 GRP170的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用S印hdex G-25柱脫鹽，即得純化的GRP170 (氨基酸序列如 SEQ ID No. 6 所示)。Western Blot鑒定取純化的GRP170，加入內(nèi)參β -actin和上樣緩沖液，100°C 加熱3 5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層膠進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂牛奶 封膜，加入鼠抗人GRP170單克隆抗體和鼠抗人β -actin單克隆抗體，溫度37°C孵育1小 時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè) 置陰性對照(不加入純化的GRP170)；結(jié)果見圖4，其中1泳道為純化的GRP170，2泳道為 陰性對照，可見1泳道除內(nèi)參β -actin條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見相應(yīng)條
市ο3、HBcAg_GRP170 復(fù)合物的制備在濃度為0. 01mol/L、pH為7. 2 7. 4的PBS (由濃度為137mmol/L的NaCl、濃度 為 2. 7mmol/L 的 KCl、濃度為 4. 3mmol/L 的 Na2HPO4 和濃度為 1. 4mmol/L 的 KH2PO4 組成)中， 按摩爾比為1 1加入純化的HBcAg和GRP170，使HBcAg和GRP170在PBS中的濃度均為 3 6 μ g/mL,混合均勻，43°C孵育30分鐘，再37°C孵育1小時，即得HBcAg_GRP170復(fù)合物， 取樣進(jìn)行Western Blot鑒定。二、HBcAg-GRP 170復(fù)合物的抗病毒活性研究效應(yīng)細(xì)胞的制備將30只6 8周齡雌性HBV轉(zhuǎn)基因Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組 實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組，每組10只；將HBcAg-GRP170復(fù)合物和0VA-GRP170復(fù)合物(卵 清蛋白與GRP170按前述步驟3方法制得的復(fù)合物)分別用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的 PBS溶解制成濃度為0. 5mg/mL的溶液；實(shí)驗(yàn)組以濃度為0. 5mg/mL的HBcAg-GRP170復(fù)合物 溶液為免疫原，對照組以濃度為0. 5mg/mL的0VA-GRP170復(fù)合物溶液為免疫原，空白組以濃 度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只 100μ L，之后每間隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。1、ELISP0T法檢測HBcAg-GRP 170復(fù)合物激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，在無菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì) 胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃 度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為IX IO6個/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞；采 用ELISP0T檢測試劑盒進(jìn)行檢測，按照試劑盒說明書操作在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入體積百分濃度為70%的乙醇100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入IFN-γ捕獲抗體(稀 釋度為1 100) IOOyL,溫度4°C孵育過夜，PBS洗滌，再加入質(zhì)量百分濃度為2%的脫脂 奶粉100 μ L，室溫封閉2小時，PBS洗滌，再加入效應(yīng)細(xì)胞100 μ L，溫度37°C孵育48小時， PBST (即含有質(zhì)量百分濃度為0. 的吐溫20的PBS)洗滌，再加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ 抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1.5小時，PBST洗滌，再加入鏈霉親和素 標(biāo)記的堿性磷酸酶(稀釋度為1 5000) 100 μ L，溫度37°C孵育1小時，PBST洗滌，拍干培 養(yǎng)板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100 μ L，室溫避光顯色2 10分鐘至斑點(diǎn)形成， 用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測斑點(diǎn)數(shù)；同時設(shè)置陰性對照組(不加入效應(yīng)細(xì)胞)，各組斑 點(diǎn)數(shù)以3個復(fù)孔的均值表示。結(jié)果見圖5，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于對照組、空白組和陰性對照組，表明本發(fā)明 的HBcAg-GRP170復(fù)合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- γ。2、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動生化儀檢測血清ALT活 性。結(jié)果見圖6，實(shí)驗(yàn)組的血清ALT活性明顯高于對照組、空白組和陰性對照組，表明 本發(fā)明的HBcAg-GRP170復(fù)合物能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞， 從而導(dǎo)致血清ALT活性明顯升高。3、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動生化儀檢測血清HBV DNA抑制率。結(jié)果見圖7，實(shí)驗(yàn)組的血清HBV DNA抑制率明顯高于對照組、空白組和陰性對照 組，表明本發(fā)明的HBcAg-GRP170復(fù)合物能夠有效抑制HBV的復(fù)制，顯著降低血清HBV DNA載量。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用<160>8<210>1<211>552<212>DNA<213> 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)<220><221>CDS<222>(1)......(552)<400>1
8
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物 Fl
<400>3
cggaat tcgg catggacatcgaccct tat29
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Rl
<400>4
ccgctcgagagttccccacc ttatgagtc29
<210>5
<211>3000
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>⑴……(3000)
<400>5
atggcagacaaagttaggaggcagaggccg aggaggcgagtctgttgggc cttggtggct60
gtgctcttggcagacctgttggcactgagt gatacactggcagtgatgtc tgtggacctg120
ggcagtgagtccatgaaggtggccattgtc aaacctggagtgcccatgga aattgtcttg180
aataaggaatctcggaggaaaacaccggtg atcgtgaccctgaaagaaaa tgaaagattc240
tttggagacagtgcagcaagcatggcgatt aagaatccaaaggctacgct acgttacttc300
cagcacctcctggggaagcaggcagataac ccccatgtagctctttacca ggcccgcttc360
ccggagcacgagctgactttcgacccacag aggcagactgtgcactttca gatcagctcg420
cagctgcagttctcacctgaggaagtgttg ggcatggttctcaattattc tcgttctcta480
gctgaagattttgcagagcagcccatcaag gatgcagtgatcaccgtgcc agtcttcttc540
aaccaggccgagcgccgagctgtgctgcag gctgctcgtatggctggcct caaagtgctg600
cagctcatcaatgacaacaccgccactgcc ctcagctatggtgtcttccg ccggaaagat660
clttclclCclCCclctgcccagaatatcatgttc tatgacatgggctcaggcag caccgtatgc720
accattgtgacctaccagatggtgaagact aaggaagctgggatgcagcc acagctgcag780
atccggggagtaggatttgaccgtaccctg gggggcctggagatggagct ccggcttcga840
gaacgcctggctgggcttttcaatgagcag cgcaagggtcagagagcaaa ggatgtgcgg900
gagaacccgcgtgccatggccaagctgctgcgtgaggctaatcggctcaaaaccgtcctc960
agtgccaacgctgaccacatggcacagattgaaggcctgatggatgatgtggacttcaag1020
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gggcctgtacagcaggccctccagagtgccgaaatgagtctggatgagattgagcaggtg1140
atcctggtgggtggggccactcgggtccccagagttcaggaggtgctgctgaaggccgtg1200
ggcaaggaggagctggggaagaacatcaatgcagatgaagcagccgccatgggggcagtg1260
taccaggcagctgcgctcagcaaagcctttaaagtgaagccatttgtcgtccgagatgca1320
gtggtctaccccatcctggtggagttcacgagggaggtggaggaggagcctgggattcac1380
agcctgaagcacaataaacgggtactcttctctcggatggggccctaccctcaacgcaaa1440
gtcatcacctttaaccgctacagccatgatttcaacttccacatcaactacggcgacctg1500
ggcttcctggggcctgaagatcttcgggtatttggctcccagaatctgaccacagtgaag1560
ctaaaaggggtgggtgacagcttcaagaagtatcctgactacgagtccaagggcatcaag1620
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gagacactggtagaggacagcgcagaagaggaatctactctcaccaaacttggcaacacc1740
atttccagcctgtttggaggcggtaccacaccagatgccaaggagaatggtactgatact1800
gtccaggaggaagaggagagccctgcagaggggagcaaggacgagcctggggagcaggtg1860
gagctcaaggaggaagctgaggccccagtggaggatggctctcagcccccaccccctgaa1920
cctaagggagatgcaacccctgagggagaaaaggccacagtggggacaag1980
tctgaggcccagaaaccaagtgagaaggcagaggcagggcctgagggcgtcgctccagcc2040
ccagagggagagaagaagcagaagcccgccaggaagcggcgaatggtagaggagatcggg2100
gtggagctggttgttctggacctgcctgacttgccagaggataagctggctcagtcggtg2160
cagaaacttcaggacttgacactccgagacctggagaagc aggaacggga aaaagctgcc2220
aacagcttggaagcattcatatttgagacccaggacaagc tgtaccagcc cgagtaccag2280
gaagtgtccacagaggagcagcgtgaggagatctctggga agctcagcgc cgcatccacc2340
tggctggaggatgagggtgttggagccaccacagtgatgt tgaaggagaa gctggctgag2400
ctgaggaagctgtgccaagggctgttttttcgggtagagg agcgcaagaa gtggcccgaa2460
cggctgtctgccctcgataatctcctcaaccattccagca tgttcctcaa gggggcccgg2520
ctcatcccagagatggaccagatcttcactgaggtggaga tgacaacgtt agagaaagtc2580
atcaatgagacctgggcctggaagaatgcaactctggccg agcaggctaa gctgcccgcc2640
acagagaagcctgtgttgctctcaaaagacattgaagcta agatgatggc cctggaccga2700
gaggtgcagtatctgctcaataaggccaagtttaccaagc cccggccccg gcctaaggac2760
aagaatgggacccgggcagagccacccctcaatgccagtg ccagtgacca gggggagaag2820
gtcatccctccagcaggccagactgaagatgcagagccca tttcagaacc tgagaaagta2880
gagactggatccgagccaggagacactgagcctttggagt taggaggtcc tggagcagaa2940
cctgaacagaaagaacaatcgacaggacagaagcggcctt tgaagaacga cgaactataa3000
<210>6
<211>999
<212>PRT
<213>智人(homo sapiens)
110188]<400>60189]MetAlaAspLysValArgArgGlnArgProArgArgArgValCysTrp0190]1510150191]AlaLeuValAlaValLeuLeuAlaAspLeuLeuAlaLeuSerAspThr0192]2025300193]LeuAlaValMetSerValAspLeuGlySerGluSerMetLysValAla0194]3540450195]IleValLysProGlyValProMetGlulieValLeuAsnLysGluSer0196]5055600197]ArgArgLysThrProVallieValThrLeuLysGluAsnGluArgPhe0198]657075800199]PheGlyAspSerAlaAlaSerMetAlalieLysAsnProLysAlaThr0200]8590950201]LeuArgTyrPheGlnHisLeuLeuGlyLysGlnAlaAspAsnProHis0202]1001051100203]ValAlaLeuTyrGlnAlaArgPheProGluHisGluLeuThrPheAsp0204]1151201250205]ProGlnArgGlnThrValHisPheGlnlieSerSerGlnLeuGlnPhe0206]1301351400207]SerProGluGluValLeuGlyMetValLeuAsnTyrSerArgSerLeu0208]1451501551600209]AlaGluAspPheAlaGluGlnProlieLysAspAlaVallieThrVal0210]1651701750211]ProValPhePheAsnGlnAlaGluArgArgAlaValLeuGlnAlaAla0212]1801851900213]ArgMetAlaGlyLeuLysValLeuGlnLeulieAsnAspAsnThrAla0214]1952002050215]ThrAlaLeuSerTyrGlyValPheArgArgLysAsplieAsnThrThr0216]2102152200217]AlaGlnAsnlieMetPheTyrAspMetGlySerGlySerThrValCys0218]2252302352400219]ThrlieValThrTyrGlnMetValLysThrLysGluAlaGlyMetGln0220]2452502550221]ProGlnLeuGlnlieArgGlyValGlyPheAspArgThrLeuGlyGly 0222]2602652700223]LeuGluMetGluLeuArgLeuArgGluArgLeuAlaGlyLeuPheAsn0224]2752802850225]GluGlnArgLysGlyGlnArgAlaLysAspValArgGluAsnProArg0226]290295300
AlaMetAlaLysLeuLeuArgGluAlaAsnArgLeuLysThrValLeu
305310315320
SerAlaAsnAlaAspHisMetAlaGlnlieGluGlyLeuMetAspAsp
325330335
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340345350
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355360365
SerAlaGluMetSerLeuAspGlulieGluGlnVallieLeuValGly
370375380
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385390395400
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485490495
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Gly
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Thr
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Glu
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Gln Ser Thr
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<210>7 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223> 引物 F2 <400>7
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<223> 引物 R2 <400>8
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25
51
10
CN
8
29
30
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乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物，其特征在于由乙型肝炎病毒核心抗原與糖調(diào)蛋白170以非共價鍵結(jié)合而成，所述乙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，糖調(diào)蛋白170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物，其特征在于 由乙型肝炎病毒核心抗原與糖調(diào)蛋白170以摩爾比為1 1結(jié)合而成。
3.權(quán)利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物的制備方法，其特征 在于在濃度為0. Olmol/L.pH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖液即PBS中，分別加入乙型肝炎 病毒核心抗原和糖調(diào)蛋白170，混合均勻，在43°C孵育30分鐘，再在37°C孵育1小時，即得 乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物的制備方法，其 特征在于按摩爾比為1 1加入乙型肝炎病毒核心抗原和糖調(diào)蛋白170，使乙型肝炎病毒 核心抗原和糖調(diào)蛋白170在PBS中的濃度均為3 6 μ g/mL。
5.權(quán)利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物在制備乙型肝炎治 療性疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙型肝炎病毒核心抗原與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合物由乙型肝炎病毒核心抗原與糖調(diào)蛋白170以非共價鍵結(jié)合而成，能夠激活識別乙型肝炎病毒核心抗原的特異性CTL，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗病毒免疫，且不需要任何佐劑，在同種間應(yīng)用不受MHC的限制；該復(fù)合物的制備方法簡單，可以用于制備乙型肝炎治療性疫苗，在乙型肝炎免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/29GK101914160SQ20091025105
公開日2010年12月15日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)