專利名稱：高良姜提取物在制備抑制鈣離子通道藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有高良姜素的高良姜提取物在制備防治高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化 等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，尤其涉及高良姜素在制備通過抑制瞬時(shí)感受器陽離子通道 (transient receptor potential，TRP)，進(jìn)而抑制鈣離子內(nèi)流的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瞬時(shí)感受器陽離子通道(TRP通道)是一種跨膜蛋白質(zhì)，被激活時(shí)允許包括鈣離子 在內(nèi)的陽離子進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。與其它的鈣通道如電壓門控通道和配體門控通道參與相對(duì) 特化的細(xì)胞功能不同，TRP家族的引人入勝之處在于其潛在的細(xì)胞功能的普遍性和多樣性。 TRP基因在種系發(fā)生樹中相當(dāng)保守，存在于從微生物到高等脊椎動(dòng)物中。其組織分布也極 為廣泛，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，還分布于感覺器官和心血管、胃腸道、呼吸、泌尿生殖、造血、 免疫系統(tǒng)中。在28種已經(jīng)被鑒定的哺乳動(dòng)物TRP通道亞型中，至少有19種在血管內(nèi)皮細(xì) 胞表達(dá)。這些通道參加了多種血管功能，包括調(diào)節(jié)血管張力、血管通透性，參與機(jī)械信號(hào)傳 導(dǎo)，血管分泌功能，血管新生，內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和死亡等等。TRP通道功能異常 可能會(huì)導(dǎo)致人類心血管系統(tǒng)的異常。W02006/074802A1專利申請(qǐng)書中論述了 TRPC通道用于心腦血管疾病中的治療。其 研究表明利用基因技術(shù)，在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞TRPC3，TRPC6和 TRPC7活性，血管功能會(huì)明顯改善，并且明顯改善動(dòng)脈粥樣硬化的血管病理改變。該研究建 立了 TRPC通道與心腦血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化的聯(lián)系。研究證明在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，TRPCl蛋白在被損傷的血管平滑肌和新生內(nèi)膜 中高表達(dá)，D. J. Beech等利用TRPCl的阻斷抗體(T1E3)顯著降低了體外培養(yǎng)的人隱靜脈新 生內(nèi)膜的形成，并且對(duì)內(nèi)皮功能沒有明顯的抑制作用；其研究結(jié)果提示TRPCl阻斷劑可以 抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和內(nèi)膜新生，從而證明了 TRPCl拮抗劑在治療血管損傷性疾病中 的作用，因此以TRPCl為靶標(biāo)治療阻塞性血管疾病具有很好的前景[文獻(xiàn)Biochim Biophys Acta. 2007，1772 (8) :907-14.]。研究證明TRPC5和TRPM3通道與血管平滑肌細(xì)胞的遷移、 增殖密切相關(guān)。平滑肌細(xì)胞遷移與增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚等疾病的重要病理過程。高良姜是姜科植物高良姜(Alpinia officinarum Hance.)干燥根莖。為常用中 藥，具有溫胃散寒、止痛解痙之功。高良姜素&3&叫^1，3，5，7—三羥基黃酮)是一種天 然的黃酮醇類化合物，是中藥高良姜主要有效成分之一。近年來國外對(duì)該成分的藥理藥效 活性進(jìn)行了大量研究，對(duì)它的化學(xué)防護(hù)作用、抗氧化作用、抗病毒、抗菌作用、抗腫瘤作用的 探索較為深入。高良姜素可以抑制咖啡因與碳酰膽堿誘導(dǎo)的離體豬膀胱平滑肌的收縮作用 (文獻(xiàn)Planta Medica 2005,71(10) :962-964)，其作用機(jī)制與平滑肌的鈣動(dòng)員有關(guān)。另有 研究表明高良姜素可以抑制對(duì)笨腎上腺素或KCL誘導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈血管段收縮，高 良姜素可能通過影響血管內(nèi)皮功能和抑制鈣離子內(nèi)流發(fā)揮作用。但是尚沒有研究表明高良姜對(duì)TRPC通道的抑制作用，以及高良姜素在心腦血管 疾病防治中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了含有高良姜素的高良姜提取物在心腦血管疾病防治中的新用途。高良姜提取物對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈的舒張作用取SD大鼠胸主動(dòng)脈離體血管環(huán)，利用氯化鉀(終濃度45mmol/L)刺激血管造成血 管收縮模型，用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)血管的舒張作用。采用ALC-M離體組織器官實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，浴槽內(nèi)加入KH液作為等壓等滲溶液。精密稱 取2. 43mg高良姜素，加入IOOul的二甲基亞砜(DMSO)和900ul的KH液。配成高良姜素 母液。將高良姜素母液按3倍梯度稀釋成梯度溶液，用KCL預(yù)激血管使其收縮，至血管張 力穩(wěn)定后，累計(jì)濃度給藥，每?jī)纱谓o藥時(shí)間間隔lOmin。最終的濃度梯度為3X10_7mol/l， lX10"6mol/l,3X10"6mol/l,lX10"5mol/l,3X10"5mol/l,9X10"5mol/l,2. 7X10、ol/l，結(jié) 果顯示高良姜素具有很好的血管舒張作用，半數(shù)有效劑量為1. 17mmol/L。高良姜素對(duì)TRP通道的抑制作用高良姜素可以通過抑制TRP蛋白，抑制鈣離子內(nèi)流。本發(fā)明中TRPC通道的活性分析包括以下步驟(1)表達(dá)TRPC通道的細(xì)胞與熒光染料共同孵育(2)利用離子通道激活劑刺激鈣離子內(nèi)流，然后加入待測(cè)化合物。檢測(cè)熒光變化(3)檢測(cè)熒光變化。TRP通道的活性分析還包括利用膜片鉗技術(shù)、全細(xì)胞電流技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外的離子變化。本發(fā)明所述的表達(dá)TRPC通道的細(xì)胞包括HEK293、SMC、CHO細(xì)胞等。本發(fā)明所 述的熒光染料包括Furo2，F(xiàn)luo4，Di-4-ANEPPS等。離子通道激活劑包括gadolinium， pregnenolone, OAG 等。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC5cDNA，經(jīng)四環(huán)素篩選后，細(xì)胞膜穩(wěn)定表達(dá)TRPC5蛋白。熒光 染料Fura2孵育細(xì)胞1小時(shí)后，高良姜素乙醇溶液10 μ M孵育細(xì)胞15分鐘，加入gadolinium 50 μ M作為激動(dòng)劑。在鈣離子通道高通量熒光分析儀Flexstation ΙΙ384進(jìn)行熒光濃度讀 取。附

圖1是10 μ M高良姜素對(duì)TRPC5通道的抑制作用圖(Gadolinium 50μΜ作為激動(dòng) 劑)。高良姜素對(duì)TRPC5的半數(shù)抑制濃度為0. 2uM。以pregnenolone sulphate 1 μ M為激動(dòng)劑，高良姜素1 μ M溶液對(duì)TRPM3通道具 有明顯的抑制作用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)高良姜素通過抑制TRPC通道，抑制鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而影響 內(nèi)皮功能及平滑肌細(xì)胞的遷移與增生。高良姜素通過抑制TRPC通道用于心腦血管疾病特 別是心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化的防治，具有全新的作用機(jī)制，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋，但不限制本發(fā)明實(shí)施例1高良姜總黃酮的制備1高良姜10kg，10倍95%乙醇回流提取2小時(shí)，8倍95%乙醇回流提取1小時(shí)，合并提取液，減壓回收至無醇味。等體積乙酸乙酯萃取3-4次(以高良姜素或黃酮顏色反應(yīng)為指示)，合并乙酸乙酯 萃取液?；厥找宜嵋阴?，回收物用20%乙醇分散，后上大孔樹脂，用30%乙醇洗脫2個(gè)柱體 積后，再用70%乙醇洗脫5個(gè)柱體積，得高良姜總黃酮。提取路線見附圖2實(shí)施例2高良姜總黃酮的制備2高良姜10kg，10倍95%乙醇回流提取2小時(shí)，8倍95%乙醇回流提取1小時(shí)，合并 提取液，減壓回收至無醇味。上大孔樹脂，先用水洗脫5個(gè)柱體積，再用30%乙醇洗脫，以黃酮顏色反應(yīng)為指 示，洗脫5個(gè)柱體積；再用70%乙醇洗脫5個(gè)柱體積，得高良姜總黃酮。提取路線見附圖3實(shí)施例3高良姜總黃酮片劑的制備按照實(shí)施例1所述的方法制備得到高良姜總黃酮提取物，提取物80°C以下干燥后 過60-80目篩，取高良姜總黃酮有效部位200克，加入適量微晶纖維素和硬脂酸鎂，混勻，干 壓成1000片。實(shí)施例4高良姜總黃酮顆粒劑的制備按照實(shí)施例1所述的方法制備得到高良姜總黃酮提取物，提取物80°C以下干燥 后，取高良姜總黃酮有效部位200克，加入蔗糖100g、羥丙纖維素100g、微粉硅膠20g，以適 量70%乙醇作濕潤劑，濕法制粒，烘干，分裝制成100袋顆粒劑。實(shí)施例5高良姜總黃酮口服液的制備取蒸餾水適量，加入聚山梨酯-80制成溶液，再加入高良姜總黃酮提取物200g，邊 加熱邊攪拌使之溶解，另外將蔗糖30g、防腐劑適量溶于蒸餾水，在攪拌下緩緩加入上述溶 液中，加蒸餾水至1000ML，混勻，過濾，分裝成200支，滅菌，得口服液。權(quán)利要求
1.一種治療心腦血管疾病的藥物，其特征在于，它是一種高良姜提取物，其中高良姜總 黃酮為50-85%，高良姜素含量為5-10%。
2.一種治療心腦血管疾病藥物的制備方法，其特征在于(1)高良姜根莖清洗干凈，烘干。(2)醇類回流提取，合并提取液，減壓回收，得提取物。提取物加水分散后，上大孔樹脂， 先用10-30%濃度的乙醇洗脫除雜，再用60-80%濃度乙醇洗脫得高良姜總黃酮提取物。以 紫外法測(cè)定提取物中總黃酮含量達(dá)50%以上，采用HPLC法測(cè)定提取物中高良姜素的含量 達(dá)5%以上。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，回流提取所用的醇類為乙醇、甲醇、乙 酸乙酯，優(yōu)選乙醇。
4.如權(quán)利要求1所述的高良姜提取物制備防治心腦血管疾病藥物中的用途，其特征在 于高良姜提取物在抑制鈣離子通道藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的高良姜提取物的應(yīng)用，其特征在于高良姜素在制備抑制鈣離 子通道藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的高良姜素的應(yīng)用，其特征在于高良姜素在制備抑制TRP通道 藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的高良姜素的應(yīng)用，其特征在于高良姜素在制備抑制TRPC通道 藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求6所述的高良姜素的應(yīng)用，其特征在于高良姜素在制備抑制TRPM通道 藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病藥物，其特征在于，所述的藥物是有高良 姜總黃酮添加藥用輔料制成的注射劑或口服劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的治療心腦血管疾病的藥物，其特征在于，所述口服劑是片 劑、膠囊劑、滴丸劑。
全文摘要
本發(fā)明目的在于擴(kuò)展高良姜提取物的用途將含有高良姜素的高良姜提取物用于抑制鈣離子通道特別是抑制TRP通道，從而防治動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的藥物。TRP通道是非選擇性陽離子通道。TRPC通道與動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關(guān)。通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞TRPC通道活性，血管功能會(huì)明顯改善，并且可以明顯改善動(dòng)脈粥樣硬化的血管病理改變。既往對(duì)高良姜素的化學(xué)防護(hù)作用、抗氧化作用、抗病毒、抗菌作用、抗腫瘤作用的探索較為深入；本發(fā)明擴(kuò)展高良姜提取物用于制備防治心腦血管疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P9/00GK102048993SQ20091023647
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者吳宏偉, 楊洪軍, 游云, 陳暢, 黃璐琦 申請(qǐng)人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所