專利名稱:一種基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
—種基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建與應(yīng)用,本發(fā)明屬納米材料領(lǐng)域,更具
體地,是涉及應(yīng)用于生命科學(xué)中藥物運輸與腫瘤治療的納米材料。
背景技術(shù):
生物功能化材料是材料學(xué)研究的熱門領(lǐng)域,其中的納米材料自上世紀(jì)80年代以 來由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì),引起科學(xué)家更廣泛的關(guān)注,從而利用納米技術(shù)來研究和解 決生物學(xué)領(lǐng)域的重大問題也成為前沿的研究領(lǐng)域之一。 超順磁性納米顆粒由于其獨特的性質(zhì)(無剩磁)在生物分離、免疫檢測、耙向藥物 等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但其自身化學(xué)穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性及生物相容性差 等缺點,其表面常需要修飾一些聚合物或二氧化硅等。由于二氧化硅具有化學(xué)和膠體穩(wěn)定 性、生物相容性好等優(yōu)點使其成為保護磁性粒子的最理想材料之一。磁性粒子表面修飾二 氧化硅后適用于生物分離,但所得的鐵氧體_ 二氧化硅核殼結(jié)構(gòu)微粒粒徑分布和核數(shù)都不 易控制,需要成熟的技術(shù)。 金納米粒子不僅具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng),而且還具有獨
特的電學(xué)、光學(xué)和催化性能,這些特性適用于納米顆粒在細胞吞噬后的表征。 姜黃素是一種從姜科植物姜黃根莖中提取的天然酚類抗氧化劑,色澤穩(wěn)定且毒性
很低,并能抑制體內(nèi)多種腫瘤細胞系的生長,對腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用。但由于姜黃素不溶
于水,因此需要一種載體增強其生物相容性,并能被有效地運載入相應(yīng)的腫瘤部位發(fā)揮效
用。姜黃素分子結(jié)構(gòu)式
<formula>formula see original document page 4</formula> 當(dāng)前迫切需要解決的技術(shù)問題是提供一種具有生物相容性的表面生物功能化的 核殼型納米平臺及其制備方法和應(yīng)用,以克服單純藥物極低的溶解性和很差的生物相容 性,很難有效被有機體吸收,不能發(fā)揮抗癌功效的不足。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于磁性納米粒子和金納米粒子的納米平臺的構(gòu)建方 法,并將之應(yīng)用于運輸抗癌藥物,誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡,進而抑制其生長,達到發(fā)揮抗癌 功效。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,包括磁性納 米粒子的合成,F(xiàn)e30fSi02核殼結(jié)構(gòu)的合成^6304-5102核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾,表面修飾后質(zhì)子化及靜電吸附金納米粒子,偶聯(lián)姜黃素和偶聯(lián)帶巰基聚乙二醇PEG-SH,制得多功能 納米平臺,細胞培養(yǎng)吸收并表征;工藝步驟為 (1)磁性納米粒子的合成用共沉淀法合成具有超順磁性的磁性納米粒子;
(2)Fe304_Si02核殼結(jié)構(gòu)的合成利用步驟(1)得到的磁性納米粒子,根據(jù)反相微 乳液法在油包水的環(huán)境里合成Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu); (3)Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾用步驟(2)所得到的Fe304-Si02核殼結(jié) 構(gòu),將其外層的硅球表面氨基化; (4)表面修飾后質(zhì)子化及靜電吸附金納米粒子表面氨基修飾后在pH 6. 0的磷酸 鹽緩沖液中質(zhì)子化;所得產(chǎn)物靜電吸附金納米粒子; (5)偶聯(lián)姜黃素和偶聯(lián)帶巰基聚乙二醇PEG-SH:先共軛偶聯(lián)姜黃素;再偶聯(lián) PEG-SH,與金納米粒子形成穩(wěn)定的金硫鍵,制得金磁納米粒子的納米平臺;
(6)細胞培養(yǎng)吸收并表征將金磁納米粒子的載藥平臺運載進入細胞并以多種檢 測手段進行表征 磁共振顯像MRI表征細胞吞噬多功能納米平臺; [OO1 7] 四甲基偶氮唑MTT表征細胞活力; 流式細胞儀FCM,激光共聚焦掃描顯微鏡CLSM表征分析腫瘤細胞早期凋亡的特 征; 細胞電鏡切片表征多功能納米平臺被細胞吞噬后在細胞內(nèi)位置。
—、磁性納米粒子的合成 ①分別稱取Fe3+, Fe2+溶于80mL超純水,F(xiàn)e3+和Fe2+的總濃度為0. 08mol/L,
Fe3+ : Fe2+摩爾比1-1.2 : 2, 80°C 、400r/min攪拌反應(yīng)lOmin ; ②逐滴加入5mL氨水,并維持pH 10. 0,滴加完畢后反應(yīng)30min ; ③超聲混勻,水洗2 3遍; ④磁分離干粉。 二、 Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu)的合成 ①加曲拉通,正己醇各7mL混合超聲約20min至無油絲狀液體;②28mL環(huán)己烷超聲45min,倒入100mL三頸燒瓶中,400r/min攪拌30min ;③4mg磁性納米粒子MNP/2mLH20分散于2mL氨水中,混合液逐滴加入步驟②的三
頸燒瓶中,滴加速度50 ii L/min,滴加完畢后繼續(xù)攪拌30min ; 加入3mL正硅酸四乙酯TE0S,攪拌24h ; ⑤加8mL丙酮,停止攪拌,倒入燒杯中靜置60min,沉淀分層;⑥4000r/min離心10min,沉淀加乙醇溶解,超聲10min,再離心,重復(fù)6 8次; ⑦55"真空干燥7小時; ⑧干燥器中冷卻,備用。 三、Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾①100mL具塞錐形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇,超聲混勻;
②加60mg Fe304-Si02繼續(xù)超聲分散;
③加200 ii L超純水,超聲使均勻分散; 加入2mL 3_氨丙基三乙氧基硅烷APTS, 60。C水浴磁力攪拌6h ;
⑤反應(yīng)結(jié)束后,用無水乙醇洗滌2 3遍,真空干燥。
四、表面修飾后質(zhì)子化,靜電吸附金納米粒子①取上述氨基修飾的磁性微球30mg加入到4mL 0. Olmol/L p朋.0的磷酸緩沖液
PB中,氨基修飾的磁性微球表面帶氨基正離子;②5min后加入4mL的0. 3mmol/L金納米粒子; ③靜電吸附20min后3000r/min離心,紫外表征,得靜電吸附金納米粒子的載體。
五、共軛偶聯(lián)姜黃素和帶巰基聚乙二醇PEG-SH : ①將上述靜電吸附金納米粒子的載體以超純水配成濃度為6mg/mL的懸液A,稱取姜黃素溶于二甲亞砜DMSO中得B,濃度2mg/mL ; ②將A/B按2 : 1體積比放在一起反應(yīng)15min后離心,濾餅加超純水恢復(fù)體積,紫外表征; ③加入PEG-SH反應(yīng)20min,離心,濾餅加超純水恢復(fù)體積。 用所述方法構(gòu)建的基于金磁納米粒子的載藥平臺的應(yīng)用,應(yīng)用于生物領(lǐng)域藥物運輸、生物標(biāo)記、細胞成像和顯影、細胞或其他生物分子的分離研究。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的金磁納米粒子的載藥平臺為表面修飾的磁性載體,既具有較強的磁性,又具有良好的化學(xué)惰性、生物相容性和易功能化等特點,且制備方法簡單。這種磁性納米材料可在懸浮體系中用磁場進行快速分離;在外加磁場的導(dǎo)向下,高度濃集、作用于腫瘤細胞;可廣泛的應(yīng)用于生物領(lǐng)域,如生物分離、藥物運輸、生物標(biāo)記、細胞成像和顯影、細胞或其他生物分子的分離研究。
圖1修飾后的磁性納米粒子靜電吸附金納米粒子,偶聯(lián)姜黃素紫外表征。 圖2細胞培養(yǎng)及磁共振顯像(MRI)表征,其中左側(cè)為實驗組制得的多功能納米平
臺MNPS-Au-Curcumin-PEG ;右側(cè)為空白組。
ABCD
Mean/SD1164.9/4341299.3/2843042.5/15802391.8/1937 圖3流式細胞儀檢測細胞凋亡。
具體實施例方式
實施例1 (1)共沉淀法合成磁性納米粒子 ①分別稱取Fe3+, Fe2+溶于80mL超純水,F(xiàn)e3+和Fe2+的總濃度為0. 08mol/L,
Fe3+ : Fe2+摩爾比1-1.2 : 2, 80°C 、400r/min攪拌反應(yīng)lOmin ; ②逐滴加入5mL氨水,并維持pHlO. 0,滴加完畢后反應(yīng)30min ; ③超聲混勻,水洗2 3遍; ④磁分離干粉,制得磁性納米粒子。[ooeo](2) Si02包裹磁性納米粒子 利用反相微乳液法,在油包水的環(huán)境里,將正硅酸四乙酯溶解成硅球,將磁性納米
粒子包裹起來。 ①加曲拉通,正己醇各7mL混合超聲約20min至無油絲狀液體;②28mL環(huán)己烷超聲約45min,倒入lOOmL三頸燒瓶中,400r/min攪拌約30min ;③4mg磁性納米粒子(MNP) /2mLH20分散于2mL氨水中,混合液逐滴加入②的三頸
燒瓶中,滴加速度約50 ii L/min,滴加完畢后繼續(xù)攪拌30min 加入3mL TEOS (正硅酸四乙酯)攪拌24h ; ⑤加8mL丙酮同時停止攪拌,倒入燒杯中靜置60min,沉淀分層;⑥4000r/min離心10min,沉淀加乙醇溶解,超聲10min,再離心,重復(fù)6 8次; ⑦55。C真空干燥7h; ⑧干燥器中冷卻,制得核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子,備用。
(3)表面氨基修飾①100mL具塞錐形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇,超聲混勻; ②加60mg MNP繼續(xù)超聲分散; ③加200 ii L超純水,超聲使均勻分散; 加入2mL 3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTS) , 60。C水浴磁力攪拌6h ; ⑤反應(yīng)結(jié)束后,用無水乙醇洗滌2 3遍,真空干燥,制得表面氨基修飾的核殼結(jié)
構(gòu)納米粒子。
(4)質(zhì)子化,靜電吸附金納米粒子 ①取上述制得的表面氨基修飾的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子30mg加入到4mL0. Olmol/Lp朋.0的PB中,氨基修飾的核殼納米粒子的二氧化硅表面帶氨基正離子;
②5min后加入4mL的0. 3mmol/L金納米粒子液;
③靜電吸附20min后3000r/min離心,紫外表征。
(5)共軛偶聯(lián)姜黃素和PEG-SH ①將上述偶聯(lián)物以超純水配成濃度為6mg/mL的懸液A,稱取姜黃素溶于二甲亞砜(DMSO)中得B,濃度2mg/mL ; ②將A/B按2 : 1體積比放在一起反應(yīng)15min后離心,濾餅加超純水恢復(fù)體積,紫外表征; ③加入PEG-SH(麗3000)反應(yīng)20min,離心,加超純水恢復(fù)體積,制得多功能納米平臺° 實施例2
(1)細胞培養(yǎng) 白血病細胞HL-60復(fù)蘇后,以含20%胎牛血清的MDM培養(yǎng)液,37°C , 5% C02環(huán)境下培養(yǎng),至細胞進入指數(shù)生長期(對數(shù)期)。
(2)多功能納米平臺的表征 ①磁共振顯像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)表征細胞吞噬多功能納米平臺 實驗采用Siemens Avanto 1. 5T磁共振系統(tǒng)。細胞培養(yǎng),收集對數(shù)期細胞,實驗組細胞以合成的多功能納米平臺作用24h以后,收集細胞于1.5mL PE管內(nèi),調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1X107mL。對照組細胞不添加多功能納米平臺,其余處理相同。
②四甲基偶氮唑(MTT)表征細胞活力 收集對數(shù)期細胞,調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1 X 106/mL,取lOOuL加入到96孔板(邊緣孔用pH7. 4的PBS填充),同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)二甲亞砜匿SO、培養(yǎng)液、MTT、DMSO),每組設(shè)定4復(fù)孔。置37°C,5% C02孵育48h,倒置顯微鏡下觀察。實驗組中加入合成的多功能納米平臺,設(shè)9個時間梯度,設(shè)定濃度3. 2mg/mL,每孔添加10uL。 呈色培養(yǎng)36h后,每孔加入lOuL MTT溶液(5mg/mL,即0. 5% MTT,以pH7. 4PBS配制),繼續(xù)培養(yǎng)4h 每孔加入100uL 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm測量各孔的吸光值(Absorbance, Ab) ③流式細胞儀(FCM),激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)表征分析腫瘤細胞早期凋亡的特征 對白血病細胞HL60加入合成的多功能納米平臺進行凋亡剌激后,1000g離心5min,棄上清,收集細胞,pH7. 4PBS重懸細胞并計數(shù);取50000 100000重懸的細胞,1000g離心5min,棄上清,加入195uL Annexin V-FITC結(jié)合液(IX)輕輕重懸細胞;加入5uLAnnexin V-FITC,輕輕混勻;室溫(20 25°C )避光孵育10min ;1000g離心5min,棄上清,加入190uL AnnexinV-FITC結(jié)合液(IX)輕輕重懸細胞;加10uL碘化丙啶(PI),輕輕混勻,冰浴避光,隨即進行FCM和CLSM檢測 ④細胞電鏡切片表征多功能納米平臺細胞吞噬后細胞內(nèi)位置 實驗采用100kV Hitachi-600透射電鏡。實驗設(shè)三組空白組;實驗組1 :單純以姜黃素作凋亡剌激,姜黃素濃度2mg/mL ;實驗組2 :以合成的多功能納米平臺作凋亡剌激,濃度3. 2mg/mL。凋亡剌激后36h,收集2mL細胞,以2. 5 %戊二醛溶液調(diào)整細胞懸液濃度l-1.2X107mL,固定lh。以pH 7.4PBS洗滌兩次后,再用1%四氧化鋨固定。以梯度濃度的乙醇溶液進行細胞樣品脫水,乙醇梯度濃度為50 % , 70 % , 90 % , 95 % , 100 % 。然后,樣品浸潤到醋酸異戊醚中30min,重復(fù)三次。取出晾干后,樣品切成片狀,隨后進行透射電鏡觀察。
權(quán)利要求
一種基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是包括磁性納米粒子的合成,F(xiàn)e3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的合成,F(xiàn)e3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾,表面修飾后質(zhì)子化及靜電吸附金納米粒子,偶聯(lián)姜黃素和偶聯(lián)帶巰基聚乙二醇PEG-SH制得多功能納米平臺,細胞培養(yǎng)吸收并表征;步驟為(1)磁性納米粒子的合成用共沉淀法合成具有超順磁性的磁性納米粒子;(2)Fe3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的合成利用步驟(1)得到的磁性納米粒子,根據(jù)反相微乳液法在油包水的環(huán)境里合成Fe3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu);(3)Fe3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾用步驟(2)所得到的Fe3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu),將其外層的硅球表面氨基化;(4)表面修飾后質(zhì)子化及靜電吸附金納米粒子表面氨基修飾后在pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中質(zhì)子化;所得產(chǎn)物靜電吸附金納米粒子;(5)偶聯(lián)姜黃素和偶聯(lián)帶巰基聚乙二醇PEG-SH先共軛偶聯(lián)姜黃素;再偶聯(lián)PEG-SH,與金納米粒子形成穩(wěn)定的金硫鍵,制得金磁納米粒子的納米平臺;(6)細胞培養(yǎng)吸收并表征將金磁納米粒子的載藥平臺運載進入細胞并以多種檢測手段進行表征磁共振顯像MRI表征細胞吞噬多功能納米平臺;四甲基偶氮唑MTT表征細胞活力;流式細胞儀FCM,激光共聚焦掃描顯微鏡CLSM表征分析腫瘤細胞早期凋亡的特征;細胞電鏡切片表征多功能納米平臺被細胞吞噬后在細胞內(nèi)位置。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是磁性納米粒子的合成① 分別稱取Fe3+, Fe2+溶于80mL超純水,F(xiàn)e3+和Fe2+的總濃度為0. 08mol/L, Fe3+ : Fe2+ 摩爾比1-1.2 : 2,80°C、400r/min攪拌反應(yīng)lOmin ;② 逐滴加入5mL氨水,并維持pH 10. 0,滴加完畢后反應(yīng)30min ;③ 超聲混勻,水洗2 3遍;④ 磁分離干粉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是 Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu)的合成① 加曲拉通,正己醇各7mL混合超聲20min至無油絲狀液體;② 28mL環(huán)己烷超聲45min,倒入100mL三頸燒瓶中,400r/min攪拌30min ;③ 4mg磁性納米粒子MNP/2mLH20分散于2mL氨水中,混合液逐滴加入步驟②的三頸燒 瓶中,滴加速度50 ii L/min,滴加完畢后繼續(xù)攪拌30min ; 加入3mL正硅酸四乙酯TEOS,攪拌24h ; 加8mL丙酮,停止攪拌,倒入燒杯中靜置60min,沉淀分層;⑥ 4000r/min離心10min,沉淀加乙醇溶解,超聲10min,再離心,重復(fù)6 8次;⑦ 55t:真空干燥7小時;⑧ 干燥器中冷卻,備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是 Fe304-Si02核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾① lOOmL具塞錐形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇,超聲混勻;② 加60mg Fe304-Si02繼續(xù)超聲分散;③ 加200 L超純水,超聲使均勻分散; 加入2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTS, 60。C水浴磁力攪拌6h ; ⑤反應(yīng)結(jié)束后,用無水乙醇洗滌2 3遍,真空干燥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是表面修 飾后質(zhì)子化,靜電吸附金納米粒子① 取上述氨基修飾的磁性微球30mg加入到4mL 0. Olmol/L p朋.0的磷酸緩沖液PB中, 氨基修飾的磁性微球表面帶氨基正離子;② 5min后加入4mL的0. 3mmol/L金納米粒子液;③ 靜電吸附20min后3000r/min離心,紫外表征,得靜電吸附金納米粒子的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建方法,其特征是共軛偶 聯(lián)姜黃素和帶巰基聚乙二醇PEG-SH :① 將上述靜電吸附金納米粒子的載體以超純水配成濃度為6mg/mL的懸液A,稱取姜黃 素溶于二甲亞砜DMSO中得B,濃度2mg/mL ;② 將A/B按2 : l體積比放在一起反應(yīng)15min后離心,濾餅加超純水恢復(fù)體積,紫外表征;③ 加入PEG-SH反應(yīng)20min,離心,濾餅加超純水恢復(fù)體積。
7. 用權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的基于金磁納米粒子的載藥平臺的應(yīng)用,其特征是應(yīng)用 于生物領(lǐng)域藥物運輸、生物標(biāo)記、細胞成像和顯影、細胞或其他生物分子的分離研究。
全文摘要
一種基于金磁納米粒子的載藥平臺的構(gòu)建與應(yīng)用,屬于磁性納米材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括磁性納米粒子的合成,F(xiàn)e3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的合成,F(xiàn)e3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)的表面氨基修飾,表面修飾后質(zhì)子化及靜電吸附金納米粒子,偶聯(lián)姜黃素和偶聯(lián)帶巰基聚乙二醇PEG-SH,制得多功能金磁納米平臺。本發(fā)明優(yōu)點在于,金磁納米粒子的載藥平臺為表面修飾的磁性載體既具有較強的磁性,又具有良好的化學(xué)惰性、生物相容性和易功能化等特點,且制備方法簡單。這種磁性納米材料可在懸浮體系中用磁場進行快速分離;在外加磁場的導(dǎo)向下,高度濃集、作用于腫瘤細胞;可廣泛的應(yīng)用于生物領(lǐng)域,如生物分離、藥物運輸、生物標(biāo)記、細胞成像和顯影、細胞或其他生物分子的分離研究。
文檔編號A61K47/34GK101716348SQ200910232340
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者徐麗廣, 徐乃豐, 朱穎越, 胥傳來, 陳偉 申請人:江南大學(xué)