專利名稱：松杉靈芝活性物質(zhì)、其制備法及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種松杉靈芝活性物質(zhì)，特別是指一種可預防動脈粥狀硬化的松杉 靈芝活性物質(zhì)、其制備法及其組合物。
背景技術(shù)：
數(shù)千年來，在東方國家中，靈芝科(Ganodermataceae family)植物已被證實具有 藥用效果，靈芝的抗氧化效果是其醫(yī)藥效果中的一種。松杉靈芝(Ganoderma tsugae)為一 種靈芝屬扁平狀多孔的蕈類，也是一種在臺灣被作為膳食補充劑的栽培品種。近年來，松杉 靈芝固態(tài)培養(yǎng)的子實體與菌絲體的萃取物已被報導具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗發(fā)炎以及抗氧 化等療效。然而，有關(guān)松杉靈芝液態(tài)酸酵培養(yǎng)所產(chǎn)生的胞外多醣體(exopolysaccharides)， 其抗氧化的特性或其它活性成分卻很少被了解。氧化壓力(oxidative stress)在動脈粥狀硬化(Atherosclerosis)的病理生理 學上扮演重要的角色。氧化壓力可被定義為過度產(chǎn)生氧化物(oxidants)所造成的病理結(jié) 果，該氧化物會覆蓋可溶性抗氧化劑(soluble antioxidants)與自由基抑制酵素(free radical-quenching enzymes)的抗氧化能力。近來研究顯示，由于第一型血紅素氧化酶 (heme oxygenase-1, H0-1)具有抗氧化能力，因此該酵素具有細胞保護的效果。文獻亦指 出過度表現(xiàn)第一型血紅素氧化酶(H0-1)會減少動脈粥狀硬化的發(fā)生，由此可突顯以第一 型血紅素氧化酶(H0-1)作為預防心血管疾病的新穎治療標的的潛力。最近，一個氧化還原 敏感個生轉(zhuǎn)錄因子(redox-sensitive transcription factor), NF—E2 才目關(guān)因子 2 (Nuclear factor-erythroid 2related factor 2，Nrf2)被顯示可調(diào)節(jié)許多抗氧化劑蛋白質(zhì)的 表現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)包含第一型血紅素氧化酶(H0-1)、麩胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S_transferase，GST)、麩胺酰半胱胺酸合成酶(glutamylcysteine synthase, GCS)以及硫 氧化還原蛋白酶(Thioredoxin reductases，TrxR)。就此，尋找新穎以及更具有潛力的轉(zhuǎn) 錄因子Nrf2相關(guān)基因的誘導劑，將有助于針對預防或治療心血管失調(diào)新治療方法的發(fā)展。本案發(fā)明人鑒于上述靈芝所具有的廣泛功效，以及動脈粥狀硬化學理研究，研究 松杉靈芝液體培養(yǎng)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)，對于內(nèi)皮細胞中第一型血紅素氧化酶(H0-1)與第 一型硫氧化還原蛋白酶(TrxRl)表現(xiàn)的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于提供一種松杉靈芝活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)具有可預防動脈粥 狀硬化的效果?？蛇_成上述發(fā)明目的的松杉靈芝活性物質(zhì)，是將松杉靈芝菌絲體經(jīng)過下列步驟所
產(chǎn)生步驟1 將松杉靈芝進行培養(yǎng)，以取得培養(yǎng)物；步驟2 將步驟1所得培養(yǎng)物，以壓榨過濾取得的濾液，經(jīng)過乙醇萃取，得到乙醇萃 取沉淀物；
步驟3 將步驟2所得乙醇萃取沉淀物以膠體過濾層析純化，得到膠體過濾層析 物；步驟4 將步驟3所得膠體過濾層析物以丙酮萃取，得到的上清液即為松杉靈芝活 性物質(zhì)。步驟1所述的培養(yǎng)方式包含但不限于液態(tài)酸酵培養(yǎng)、固態(tài)培養(yǎng)或其它適用本發(fā)明 的培養(yǎng)方法。優(yōu)選地，所用的松杉靈芝(Ganoderma tsugae)是得自寄存于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC ；地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，寄存編號為CGMCC No. 2861，寄存日期為2009年1月8日，但本發(fā)明所述的松杉靈芝活性物質(zhì)不限于由此菌株 所得。優(yōu)選地，該液體酸酵培養(yǎng)步驟為在含有蛋白質(zhì)水解物0. 1 Iwt. %、綜合性氮源 0. 2 2wt. %、微量礦物質(zhì)0. 01 0. Iwt. %、無機鹽類0. 01 0. Iwt. %以及綜合性碳源 2 IOwt. %的培養(yǎng)液中，以20 35°C、槽壓0. 5 lvvm、20 IOOrpm攪拌速率條件下培 養(yǎng)5 15天；其中該綜合性碳氮源可為榖類或豆類；其中該無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫 二鉀、硫酸鐵等；其中該綜合性碳源可為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等。優(yōu)選地，該乙醇萃取步驟為以最終濃度10%乙醇萃取30 60分鐘后，離心取得 的上清液再以最終濃度20%乙醇萃取30 60分鐘。于另一較佳實施例中，該乙醇萃取步 驟為以最終濃度20%乙醇萃取30 60分鐘。優(yōu)選地，該膠體過濾層析步驟為將該乙醇萃取沉淀物注入丙烯葡聚醣凝膠 S-400 膠體管柱，以 0. 05 0. 5M 三羥甲基氨甲烷鹽(tris (hydroxymethyl) aminomethane， Tris)緩沖溶液(pH 6. 8 7. 2)為移動相，流速為0. 5毫升/分鐘，收集第161 200毫升 或第321 400分鐘的過濾液。優(yōu)選地，該丙酮萃取步驟為于8 -20°C下，以最終濃度55wt. %丙酮萃取30 120分鐘。另外，本發(fā)明并提供一種預防動脈粥狀硬化的組成物，是包含上述松杉靈芝活性 物質(zhì)，以及適當?shù)南♂寗?、賦形劑或載體。本發(fā)明所提供的松杉靈芝活性物質(zhì)，與其它已知技術(shù)或物質(zhì)相互比較時，更具有 下列優(yōu)點經(jīng)試驗證明，本發(fā)明所提供的松杉靈芝活性物質(zhì)可經(jīng)由增加細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2的數(shù)量(促進Nfr2轉(zhuǎn)位進入細胞核)，提高抗氧化反應片段啟動子(AREpromoter)的 活性、硫氧化還原蛋白酶啟動子(TrxR promoter)的活性，進而誘導第一型血紅素氧化酶 (H0-1)與第一型硫氧化還原蛋白酶(TrxR)表現(xiàn)，以達到預防動脈粥狀硬化的效果；相較之 下，已知的松杉靈芝活性物質(zhì)并無這樣的效果。


請參閱以下有關(guān)本發(fā)明一較佳實施例的詳細說明及其附圖，將可進一步了解本發(fā) 明的技術(shù)內(nèi)容及其目的功效；有關(guān)該實施例的附圖為圖1為本發(fā)明松杉靈芝活性物質(zhì)萃取的流程圖，圖中顯示由松杉靈芝液體培養(yǎng)濾液制備不同萃取物的步驟；圖2為松杉靈芝萃取物F5-2在內(nèi)皮細胞中誘導第一型血紅素氧化酶(H0_1)表現(xiàn) 的分析，其中_代表控制組(未添加萃取物進行處理)；圖3為經(jīng)PNGase F酵素水解后的松杉靈芝萃取物F5_2弱化誘導第一型血紅素氧 化酶(H0-1)表現(xiàn)的分析。其中-代表未進行該項處理；+代表進行該項處理，如第一條lane 即表示內(nèi)皮細胞未處理F5-2、F5-2無經(jīng)PNGase F酵素水解及未煮沸處理；圖4A為松杉靈芝萃取物F5-2誘導第一型硫氧化還原蛋白酶(TrxR-I)表現(xiàn)的分 析；圖4B為松杉靈芝萃取物F5-2誘導硫氧化還原蛋白酶(Thioredoxin reductases, TrxR)的啟動子活性的分析，其中-代表控制組(未添加萃取物進行處理)；圖5A及圖5B分別為松杉靈芝萃取物F5-2增加細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)位以及 誘導ARE-Iuciferase報導基因活性表現(xiàn)的分析，其中-代表控制組(未添加萃取物進行處 理)；圖6A為松杉靈芝萃取物F5-2對抗氧化逆境的保護效果分析，結(jié)果以mean士SEM 表示，該試驗獨立重復5次以上；*p < 0. 05即相對于未處理的對照組，代表有顯著差異；#p < 0. 05即相對于只處理H2O2的對照組，代表有顯著差異；圖6B為松杉靈芝萃取物F5-2對 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)表現(xiàn)的分析。其中-代表控制組(未添加萃取物進行處理)。
具體實施例方式本發(fā)明是以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實施例所限制。實施例1松杉靈芝酸酵液的制備1. 1松杉靈芝來源本實施例所用的松杉靈芝是得自寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，寄存 編號為CGMCC No. 2861，寄存日期為2009年1月8日，但本發(fā)明所述的松杉靈芝活性物質(zhì)不 限于由此菌株所得。1. 2松杉靈芝培養(yǎng)將松杉靈芝接種于馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar, PDA, Difco ,REF213400)的培養(yǎng)皿上，于20 35°C條件下培養(yǎng)5 10天后，將其切割成碎塊后 接種入內(nèi)含馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(Potato Dextrose Broth,PDB,Difco ,REF254920)的3L 凹槽搖瓶中，以20 35°C、100 200rpm振蕩速率條件下培養(yǎng)5 10天。將3L凹槽搖瓶內(nèi)培養(yǎng)完成的松杉靈芝種菌，于無菌操作臺內(nèi)轉(zhuǎn)接入無菌接菌瓶 中，再利用蒸氣滅菌后無菌管路轉(zhuǎn)接入內(nèi)含蛋白質(zhì)水解物0. 1 Iwt. %、綜合性氮源0.2 2wt. %、微量礦物質(zhì)0.01 0. Iwt. %、無機鹽類0.01 0. Iwt. %、綜合性碳源2 IOwt. % 等營養(yǎng)源的50L酸酵種菌槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽壓0. 5 Ivvm(無菌空 氣)、90 120rpm攪拌速率條件下培養(yǎng)3 7天。再于50L酸酵槽內(nèi)種菌，利用蒸氣滅菌2hr后無菌管路轉(zhuǎn)接入內(nèi)含蛋白質(zhì)水解物 0.1 Iwt. %、綜合性氮源0. 2 2wt. %、微量礦物質(zhì)0.01 0. Iwt. %、無機鹽類0.01 0. Iwt. %、綜合性碳源2 IOwt. %等營養(yǎng)源的500L酸酵種菌槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽壓0. 5 Ivvm(無菌空氣)、20 50rpm攪拌速率條件下培養(yǎng)3 7天。接著，于500L酸酵槽內(nèi)種菌，利用蒸氣滅菌2hr后無菌管路轉(zhuǎn)接入內(nèi)含蛋白質(zhì)水 解物0. 1 Iwt. %、綜合性氮源0. 2 2wt. %、微量礦物質(zhì)0. 01 0. Iwt. %、無機鹽類 0.01 0. Iwt. %、綜合性碳源2 IOwt. %等營養(yǎng)源的5000L酸酵生產(chǎn)槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽壓0. 5 Ivvm(無菌空氣)、20 60rpm攪拌速率條件下培養(yǎng)5 10 天。松杉靈芝菌酸酵液壓榨將硅藻土(Celite)以5 IOwt. %添加量混入5000L酸 酵生產(chǎn)槽，與松杉靈芝菌絲體酸酵液攪拌混合均勻，再以無菌管路輸送至板式壓榨機進行 壓榨作業(yè)。壓榨完成的液體即為松杉靈芝酸酵濾液。實施例2松杉靈芝活性物質(zhì)的制備與成分及生物活性分析2. 1 材料第一型血紅素氧化酶(H0-1)的初級抗體(primary antibody)是購自Stressgen Biotechnologies公司(SB，圣地亞哥，加州，美國)?？罐D(zhuǎn)錄因子Nrf2的抗體則自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz，加州，美國)購得。結(jié)合過氧化物酶(peroxidase) 的抗-兔子抗體與抗-小鼠抗體則自Amersham公司(Arlington Heights，伊利諾伊州，美 國)購得。其它所有試劑或材料可購自Sigma公司(St. Louis，密蘇里州，美國)，或其它易 于取得的市售管道。2. 2 方法(1)內(nèi)皮細胞培養(yǎng)牛主動脈內(nèi)皮細胞(bovineaortic endothelial cells, BAECs)培養(yǎng)在 DMEM 培 養(yǎng)液(Dulbecco' s modified Eagle' s medium, Invitrogen公司)，并添加10%小牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Invitrogen公司)及適當濃度的適用抗生素。細胞置于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)至長滿培養(yǎng)皿。清除培養(yǎng)液后加入無血清的DMEM培養(yǎng)液取代， 并于進行試驗前，先將細胞置于培養(yǎng)箱12小時。(2)細胞溶解物(cell lysates)的準備內(nèi)皮細胞的總?cè)芙馕?whole lysates)是依照常規(guī)方法取得總?cè)芙馕?whole lysates)的技術(shù)取得。為了制備細胞核萃取物，在冰冷的磷酸緩沖溶液(PBS)中以刮棒收 集內(nèi)皮細胞。細胞團塊隨后以 IOmM HEPESU. 5mM MgCl2UOmM KClUmM DTT,0. 5mM PMSF 以 及 0.3% Nonidet P-40 溶解。再以含有 25% glycerol、20mM HEPES、0· 6M KCl U. 5mM MgCl2 以及0. 2mM EDTA的緩沖溶液萃取細胞核蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度以protein assay DC系統(tǒng) (Bio-Rad, Richmond，力口州，美國)決定的。(3)西方點墨法(Western blotting)請參考現(xiàn)有技術(shù)中的的西方點墨法的技術(shù)步驟，簡述如下將總量IXlO6個細胞 在分解緩沖液(1% NP-40、0. 5% sodium deoxycholate、0. 1% SDS以及蛋白質(zhì)水解酶抑制 劑混合物)中于冰上靜置，再將得到的總細胞萃取物以10%電泳膠片(SDS-PAGE)分離。再 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝化纖維膜(Millipore)上。加入第一型血紅素氧化酶(H0-1)抗體于4°C 下緩和震蕩。結(jié)果以ECL試劑(Amersham Pharmacia Biotech)利用化學發(fā)光反應來觀測， 操作方法是根據(jù)廠商建議進行。(4)細胞存活能力測定(Cell Viability Assay)
細胞存活能力的評估是以Alarmar blue分析法測定，操作方法是根據(jù)廠商 (Serotec，牛津，英國)建議進行。該分析法是使用一種會從氧化態(tài)(藍色)變成還原態(tài) (紅色)的氧化還原指示劑，來偵測活細胞內(nèi)的代謝活性。紅色的強度與細胞存活能力成正 比，且該強度由波長570nm與600nm吸光值的差異計算而來。該數(shù)值是以對照組的百分比 來表不。(5)過渡性轉(zhuǎn)染作用(Transient transfection)及熒光素酶(Luciferase)活性 分析在轉(zhuǎn)染的前一天，將IXlO6個內(nèi)皮細胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)進行繼代培養(yǎng)。到細胞約長 滿時，以 Iipofectamine 將帶有抗氧化反應片段(antioxidant response element, ARE)序 列的質(zhì)體(plasmid)轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，操作方法是根據(jù)廠商(GIBC0-BRL)建議進行。該些細 胞于各組中共轉(zhuǎn)染(co-transfected)帶有pSV-β-galactosidase基因的質(zhì)體，以使轉(zhuǎn)染 效率標準化。經(jīng)過隔夜轉(zhuǎn)染后，該細胞以不同濃度的F5-2萃取液處理，接著以磷酸緩沖溶 液(PBS)清洗，并以報告基因裂解緩沖液(importer lysis buffer,Promega)溶解細胞，離 心取上清液，加入 ONPG (ortho-nitrophenyl- β -D-galactopyranoside)混合靜置 2 3 天 后，以酵素免疫分析儀(ELISA reader)讀取420nm波長的值(A)。另外取上清液加入熒光 素酶活性分析試劑混合，混合后立即以單管冷光儀測定報告基因表現(xiàn)的Luciferase活性 數(shù)值(B)，兩數(shù)值經(jīng)計算后(B/A)再除以控制組數(shù)值，做長條圖。(6)谷胱甘肽(GSH)含量分析以F5-2處理后的細胞，吸除培養(yǎng)液，以磷酸緩沖液(PBS)清洗，并以 monochlorobimane (MCB, 40 μ Μ)避光處理后，將細胞溶解。使用熒光分光儀(Shimadzu， Rf-5301PC)，以激發(fā)波長380nm及放射波長470nm來偵測GSH的含量相對值。(7)自松杉靈芝以生物分析導向(Bioassay-guided)分離活性物質(zhì)F5-2松杉靈芝酸酵濾液依照圖1流程圖進行萃取。先將凍干的松杉靈芝酸酵濾液以水 溶解，并分別以10%、20%乙醇(體積百分比)萃取30 60分鐘，離心以收集萃取液的沉 淀物，將沉淀物于40°C下真空干燥后，以去離子水溶解，標示為GTFE-2。GTFE-2 再以膠體過濾層析法(Gel filtration chromatography)將 GTFE-2 的成 分分離；使用 S印hacryl S-400 管柱(16mmX 100cm) (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire，美國)，以0. 05 0. 5M三羥甲基氨甲燒鹽(Tris)緩沖溶液(pH 6. 8 7. 2)，以0. 5mL/min速度流洗。每4mL收集一管，收集第161 200毫升或第321 400分 鐘的過濾液，命名為F5。F5再以丙酮萃取(于8 -20°C下，以最終濃度55wt. %丙酮萃取30 120分鐘) 并離心，上清液于40°C真空下去除丙酮。所得到分離液命名為F5-2。F5-2接著進行化學分 析與生物活性分析。F5-2的特性描述(8)F5_2經(jīng)PNGase F酵素醣解(Glycolysis)后，誘導第一型血紅素氧化酶(H0-1) 表現(xiàn)能力分析取F5-2萃取物加入0.5M sodium phosphate (pH 7. 5)、50mM EDTA、0. 5% (w/v) SDS 以及5% (ν/ν) β-mercaptoethanol，以肽-N-糖苷酶F(P印tide-N-glycosidase F,PNGase F，BioLabs0Inc.，新英格蘭)進行水解作用(glycolysis)。在37°C下以PNGase F水解12小時。取1. 6% F5-2對牛主動脈內(nèi)皮細胞(BAECs)作用6小時，另外以煮沸的F5-2或經(jīng) PNGase F醣解過的F5-2處理細胞。收集細胞溶解物并以第一型血紅素氧化酶(H0-1)抗體 或微管蛋白(Tubulin，作為樣品內(nèi)對照)進行西方轉(zhuǎn)漬法分析。(9)統(tǒng)計分析所有試驗的數(shù)據(jù)皆來自至少3次獨立的試驗，每次試驗3重復。以變異數(shù)分析方法 (ANOVA)分析這些數(shù)據(jù)；接著，針對有顯著的變異數(shù)分析，使用Tukey test (SPSS software package，芝加哥，伊利諾伊州，美國)以事后比較(post hoc Comparison)進行對照組與試 驗組之間的成對比較(pair-wise comparison) 0以*p < 0. 05作為群組之間具有顯著差異 的指標。在所有的圖表中，數(shù)據(jù)是以平均值士標準差(mean士SD)顯示。2. 3 結(jié)果(1)松杉靈芝活性物質(zhì)F5-2誘導第一型血紅素氧化酶(H0-1)表現(xiàn)F5-2以西方墨點法分析內(nèi)皮細胞中第一型血紅素氧化酶(H0-1)的表現(xiàn)量。小牛 動脈內(nèi)皮細胞(BAECs)分別處理萃取物F5-2(l、l. 3、1. 6或2. 0% ) 6小時，以西方點墨法分 析細胞內(nèi)H0-1蛋白質(zhì)表現(xiàn)量，以微管蛋白為樣品內(nèi)對照，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)5-2明顯誘導 第一型血紅素氧化酶(H0-1)的表現(xiàn)。(2)F5_2經(jīng)PNGase F (醣蛋白分解酵素)酵素水解后，誘導第一型血色素氧化酶表 現(xiàn)能力減弱PNGase F酵素主要作用在具有N-glycan的醣蛋白或糖勝肽的GIcNAc和 asparagines鍵結(jié)位置上。將F5-2以PNGase F酵素水解后，進行細胞H0-1活性測定，結(jié)果 如圖3所示以PNGase F處理過的F5-2的誘導活性減弱。因此，F(xiàn)5-2誘導內(nèi)皮細胞表現(xiàn)第 一型血紅素氧化酶(H0-1)的活性可能來自N-glycans。(3)F5-2 為勝肽醣(ρ印tidoglycan)類似物分析F5-2的總醣與蛋白質(zhì)含量，以硫酸酚法測定總醣含量，以Lowry-Folin測定 蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果為總醣含量63. 7mg/mL，蛋白質(zhì)含量0. 77mg/mL，總醣與蛋白質(zhì)含量比 例為82比1。經(jīng)分析F5-2含有16種不同的胺基酸，該些胺基酸的名稱與濃度(mg/mL)分 別為天冬胺酸(Asp)O. 83、蘇胺酸(Thr)O. 44、絲胺酸(Ser) 0. 41、麩胺酸(Glu) 1. 63、脯胺 酸(Pro)O. 54、甘胺酸(Gly)O. 46、丙胺酸(Ala)O. 70、胱胺酸(Cys)O. 17、纈胺酸(Val)O. 43、 甲硫胺酸(Met)O. 10、異白胺酸(Ile)O. 31、白胺酸(Leu)O. 44、酪胺酸(Tyr)O. 10、苯丙胺酸 (Phe)O. 26、離胺酸(Lys)O. 20、組胺酸(His)O. 36、精胺酸(Arg)O. 35。以三氟乙酸(TFA) 水解F5-2后，不同單醣的莫耳比是由氣相層析儀測定。F5-2含有6種不同的單醣葡萄 糖(D-glucose)、甘露糖(D-mannose)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)、阿拉 伯糖(L-arabinose)、半乳糖(D-galactose)、巖藻糖(L-fucose)；這些單醣的莫耳比為 12. 8 3. 2 5. 2 5. 2 1. 2 1。且 F5-2 在以 Coomassie blue 染劑分析的 SDS-PAGE 上顯示具有蛋白質(zhì)條帶，在以Schiff’ s reagent染劑分析的SDS-PAGE上顯示具有紅色多 醣體條帶。F5-2以膠體透析層析儀(gel permeation chromatography,GPC)分析F5-2分 子量為IlKDa等結(jié)果，說明F5-2為一勝肽醣(ρ印tidoglycan)類似物。(4) F5-2誘導第一型硫氧化還原蛋白酶(TrxR-I)的表現(xiàn)對內(nèi)皮細胞處理F5-2后，可發(fā)現(xiàn)第一型血紅素氧化酶(H0-1)表現(xiàn)增加。因此，進 一步分析F5-2是否也會誘導其它與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2有關(guān)的基因的表現(xiàn)。如圖4A所示，當內(nèi)皮細胞以1. 3%,2. 0%,2. 3%濃度的F5-2處理時，第一型硫氧化還原蛋白酶(TrxR-I)(另 一個轉(zhuǎn)錄因子Nrf2相關(guān)基因)的蛋白表現(xiàn)也會增加。將細胞轉(zhuǎn)染帶有TrxR-luciferase的 構(gòu)筑物(以習知的TrxR啟動子連接報導基因Iuciferase于構(gòu)筑物上)，待12小時后，被轉(zhuǎn) 染的細胞以低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，隨后分別處理不同濃度(1.3、1.6、2.0%)的F5-2， 時間為12小時。之后將細胞融解并分析Iuciferase的活性；結(jié)果如圖4B所示，硫氧化還 原蛋白酶(Thioredoxin reductases, TrxR)的啟動子活性也會被F5_2的處理活化。(5) F5-2增加轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)位(translocation)的速度并誘導抗氧化反應片段 啟動子(ARE promoter)-Iuciferase報告基因的活性進一步檢測在內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2本身是否會被F5-2所活化。結(jié)果如圖 5A所示，與未處理的細胞相較，處理1.3%與1.6%F5-2的內(nèi)皮細胞，其細胞核萃取物中有 較多的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2累積，且于處理后30分鐘時就可以觀察到轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的累積。習知轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是一個調(diào)節(jié)抗氧化反應片段(ARE)以驅(qū)動基因表現(xiàn)的主要轉(zhuǎn) 錄因子。以轉(zhuǎn)染抗氧化反應片段啟動子(ARE promoter)-熒光素酶(Luciferase)報導基 因構(gòu)筑物的內(nèi)皮細胞，來分析F5-2對于ARE序列的專一性；結(jié)果如圖5B所示，處理F5-2的 細胞顯示其ARE-Iuciferase的活性增加。(6) F5-2對氧化逆境的保護效果由以上試驗數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)5-2是一種對第一型血紅素氧化酶(H0-1)與第一型硫氧 化還原蛋白酶(TrxR-I)表現(xiàn)的有效誘導劑。因此，進一步測試F5-2是否對于內(nèi)皮細胞具 有對抗氧化逆境的保護效果。內(nèi)皮細胞先以1. 6% F5-2處理6小時，以促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 相關(guān)基因的誘導。之后，將培養(yǎng)基以含有10%過氧化氫(H2O2)的培養(yǎng)基取代，處理2小時 后分析細胞存活能力。結(jié)果如圖6A所示，未處理F5-2的內(nèi)皮細胞曝露于過氧化氫環(huán)境下， 導致細胞存活率大幅下降；但預先對內(nèi)皮細胞處理F5-2則會減弱此細胞毒性。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種抗氧化劑，且由谷胺酰半胱胺酸合成酶 (glutamylcysteine synthetase，一種依賴轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的酵素)的誘導而增加。因此， 以F5-2預先處理后，經(jīng)過不同時間后，再測試內(nèi)皮細胞內(nèi)GSH的濃度。結(jié)果如圖6B所示，細 胞內(nèi)GSH濃度在F5-2預先處理后6小時增加，經(jīng)過12小時仍持續(xù)增加。該數(shù)據(jù)顯示F5-2 所誘導的基因為細胞對抗氧化反應所必需。上列詳細說明是針對本發(fā)明的一可行實施例的具體說明，惟該實施例并非用以限 制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含于本案 的專利范圍中。
權(quán)利要求
一種松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，它是將松杉靈芝經(jīng)過下列步驟所產(chǎn)生的步驟1將松杉靈芝進行培養(yǎng)，以取得培養(yǎng)物；步驟2將松杉靈芝培養(yǎng)物經(jīng)過乙醇萃取，得到乙醇萃取沉淀物；步驟3將步驟2所得乙醇萃取沉淀物以膠體過濾層析純化，得到膠體過濾層析物；步驟4將步驟3所得膠體過濾層析物以丙酮萃取，得到的上清液即為松杉靈芝活性物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述松杉靈芝為寄存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的松杉靈芝CGMCC No. 2861。
3.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述培養(yǎng)步驟為在含有蛋白質(zhì) 水解物0. 1 Iwt. %、綜合性氮源0. 2 2wt. %、微量礦物質(zhì)0. 01 0. Iwt. %、無機鹽類 0.01 0. Iwt. %以及綜合性碳源2 IOwt. %的培養(yǎng)液中，以20 35°C、槽壓0. 5 lvvm、 20 IOOrpm攪拌速率條件下培養(yǎng)5 15天。
4.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述乙醇萃取步驟為以最終濃 度10%乙醇萃取30 60分鐘后，離心取得的上清液再以最終濃度20%乙醇萃取30 60 分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述乙醇萃取步驟為以最終濃 度20%乙醇萃取30 60分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述膠體過濾層析為將所述 乙醇萃取沉淀物注入膠體管柱，以鹽類緩沖液為移動相，流速為0. 5毫升/分鐘，收集第 161 200毫升或第321 400分鐘的過濾液。
7.如權(quán)利要求6所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述膠體管柱為丙烯葡聚醣凝 膠S-400管柱。
8.如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活性物質(zhì)，其特征是，所述丙酮萃取步驟為于 8 -20°C下，以最終濃度55wt. %丙酮萃取30 120分鐘。
9.一種預防動脈粥狀硬化的組成物，其特征是，包含如權(quán)利要求1所述的松杉靈芝活 性物質(zhì)，以及適當?shù)南♂寗①x形劑或載體。
10.如權(quán)利要求9所述預防動脈粥狀硬化的組成物，其特征是，具有誘導第一型血紅素 氧化酶及第一型硫氧化還原蛋白酶的活性，以及促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2進入細胞核。
全文摘要
一種松杉靈芝活性物質(zhì)，是將松杉靈芝經(jīng)過下列步驟所產(chǎn)生者(1)將松杉靈芝以液體酦酵培養(yǎng)；(2)將所得酦酵濾液經(jīng)過乙醇萃取，得到乙醇萃取沉淀物；(3)將所得乙醇萃取沉淀物以膠體過濾層析純化，得到膠體過濾層析物；(4)將所得膠體過濾層析物以丙酮萃取，得到的上清液即為松杉靈芝活性物質(zhì)。本發(fā)明還提供含有經(jīng)上述步驟產(chǎn)生的松杉靈芝活性物質(zhì)的組合物，該組合物可用以誘導或增加細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的量、提高抗氧化反應片段啟動子的活性、硫氧化還原蛋白酶啟動子的活性、可誘導第一型血紅素氧化酶與第一型硫氧化還原蛋白酶表現(xiàn)，以達到細胞保護或預防動脈粥狀硬化的效果。
文檔編號A61P9/10GK101904875SQ20091020317
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者翁炳孫, 謝佳雯, 魏鈺珊 申請人:生展生物科技股份有限公司