專利名稱：一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于養(yǎng)殖動物病毒性感染防治的藥物組合以及該組合用藥物 的制備及穩(wěn)定性控制方法，具體涉及一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒性感染是引起養(yǎng)殖動物死亡、影響動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要因素，隨著國家 獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范，取消了大批原地方標(biāo)準(zhǔn)的抗病毒藥物，可選用的抗病毒藥物的短缺 與獸醫(yī)臨床的需求矛盾日益突出。 1967年，美國Merck藥廠的Field等人發(fā)現(xiàn)了酶促合成的雙鏈核酸(double strained RNA，dsRNA)具有誘生干擾素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid，PIC)的誘生能力最強(qiáng)，它可以剌激機(jī)體產(chǎn)生廣譜的內(nèi)源干擾素，進(jìn)而激活蛋白激酶和 2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶、1^蛋白等抗病毒因子，以降解進(jìn)入細(xì)胞的病毒，達(dá)到抑制、治療 病毒性感染的目的。 PIC由寡聚肌苷酸與寡聚胞苷酸在合適的條件下按堿基配對的原則聚合而成。研 究表明，PIC分子量的大小、雙鏈的緊密程度及其穩(wěn)定性是決定其誘導(dǎo)干擾素活性高低的重 要影響因素。目前，國內(nèi)雖然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生產(chǎn)，但尚缺乏對雙鏈配對 的合適條件、穩(wěn)定性影響因素等的系統(tǒng)研究，也未見到其與其他活性物質(zhì)配伍方面的報道。
國內(nèi)外的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究表明，PIC應(yīng)用于動物體后，可發(fā)生一過性低熱的副 作用，而如何防止這一副作用的發(fā)生，尚未見研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用，它能夠誘導(dǎo)動 物機(jī)體產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗病毒作用的合成核酸類化學(xué)藥品與中藥提取 物的組合用藥物，以及本組合藥品穩(wěn)定性控制方法和在家禽，家畜、寵物和水產(chǎn)動物上的應(yīng) 用。 為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案它的配方組成為 柴胡皂甙含量范圍20-50 ii g/ml ;柴胡油含量范圍紫外吸收值0. 45以上；聚肌胞l_3mg/ ml，分子量范圍200-500bp(瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為將上述組成部分添加
適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。這些組分
之間具有一定的促效與增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。 為了制成上述的復(fù)方制劑，需要對其穩(wěn)定性進(jìn)行控制，以確保改組和藥品適合保
存運(yùn)輸，從而具有上述的藥效。 所述的聚肌胞的合成方法為 500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0. 3g、氯化鈉0. 6g以及適量的磷酸二氫鈉 與磷酸氫二鈉，加熱至20-60°C ，進(jìn)一步優(yōu)選為30-5(TC之間的某一特定溫度，加入500mg聚 胞苷酸攪拌使溶 解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶解，保溫配對15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值1. 6以上、柴胡皂甙含量0. 4%以上的柴胡揮發(fā)油400ml，充 分?jǐn)嚢杌靹?，用注射用水定容至lOOOml，O. 45um微孔濾膜法過濾，灌封，IO(TC流通蒸汽滅 菌30分鐘，燈檢、貼標(biāo)即得。 所述的柴胡皂甙、柴胡揮發(fā)油的分步提取工藝為 柴胡飲片按料液比l : 6在30-6(TC，進(jìn)一步優(yōu)化為35-45t:之間某一特定溫度下 溫漬，收集相當(dāng)于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮，得到較高紫外吸收值的柴胡揮發(fā)油；溫漬 后的柴胡藥材，按料液比l : 6，加入體積百分比濃度60-98%之間，進(jìn)一步優(yōu)選為75-96% 之間某一特定濃度乙醇，加熱至45°C，回流提取1-1. 5小時提取柴胡皂甙，提取液經(jīng)濃縮， 得到較高濃度的柴胡皂甙。 因?yàn)楸窘M合藥物制備過程中需要加入較高濃度的柴胡油及柴胡皂甙，而這兩種成 分在提取過程中存在相互影響，所以本發(fā)明采用了兼顧兩種成分的分步提取工藝。
本發(fā)明具有以下特征通過柴胡皂甙與dsRNA的協(xié)同作用，誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi) 源性干擾素，阻遏病毒在動物體內(nèi)的繁殖；另一方面，通過柴胡皂甙疏散退熱的功效，避免 dsRNA類藥物可能出現(xiàn)的一過性低熱的副作用。本發(fā)明涉及以下過程二步抽提法制備柴 胡皂甙和揮發(fā)油的工藝參數(shù)；由聚肌苷酸與聚胞苷酸合成一定分子量大小并且對核酸酶具 有一定抗性的dsRNA的工藝參數(shù)；本發(fā)明的穩(wěn)定化技術(shù)及其對家禽、家畜，水產(chǎn)動物的藥效 學(xué)研究。


圖1為本發(fā)明的熱源性測定示意圖，圖2為本發(fā)明對新城疫感染免疫后15d時攻 毒后試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖3為本發(fā)明對新城疫感染免疫后22d時攻毒后試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖 4為本發(fā)明對豬瘟病毒感染的保護(hù)作用示意圖，圖5為本發(fā)明對犬的犬瘟熱病毒感染的保 護(hù)作用示意圖， 圖6為本發(fā)明對虹鱒病毒感染的保護(hù)作用示意圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一 本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案它的配方組成為聚肌胞、 柴胡皂甙和柴胡揮發(fā)油；它的制備方法為將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按一定工 藝制成復(fù)方制劑；這些組分之間具有一定的促效與增效作用，并且可以避免dsRNA的副作 用。
具體實(shí)施方式
二 參照圖l，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案取用兩組試驗(yàn)家 兔，分別注射單純聚肌胞注射液和該組合藥物進(jìn)行熱源性試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)兔體溫變化情況。 結(jié)果表明，該組合藥物能夠減輕單獨(dú)聚肌胞注射液的熱源反應(yīng)。
具體實(shí)施方式
三參照圖2和圖3，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案將該藥物 組合用注射用水稀釋至50 ii g/ml 。將240只試驗(yàn)用雛雞隨機(jī)分為6個試驗(yàn)組，每組40只。
I組空白對照組；11組藥物對照組(黃芪多糖注射液，按每千克體重20mg) ;III組疫苗 對照組(無藥物)；IV組高劑量藥物組合試驗(yàn)組(每千克體重0. lmg) ;V組中劑量藥物 組合試驗(yàn)組(每千克體重0. 05mg) ;VI組低劑量藥物組合試驗(yàn)組(每千克體重0. Olmg)。 將以上雛雞隔離籠養(yǎng)，空白對照組與陽性對照組和用藥試驗(yàn)組在不同雞舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件
4保持一致。飼養(yǎng)至iod， ni、iv、v、vi四個組進(jìn)行新城疫疫苗免疫。將各組再分別分成兩
組，其中的一部分在免疫后15d，將II、 IV、 V、 VI組用藥物處理，12h后將I至VI組進(jìn)行第 一次攻毒(攻毒500個單位LD5。的ND強(qiáng)毒)，攻毒后24h將II、 IV、 V、 VI組再次注射與首 次注射劑量相同的藥物觀察7d;每個組的另一半雞在免疫后21d進(jìn)行攻毒，處理同第一次。
結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合對家禽(雞)病毒病的自然感染發(fā)病有明 顯的保護(hù)率和高的治愈率，能夠抑制病毒在家禽體內(nèi)的增殖。尤其對于免疫失敗的家禽病 毒病的防治具有高的效果。
具體實(shí)施方式
四參照圖4，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案將該藥物組合用 注射用水稀釋至50 ii g/ml。將60頭試驗(yàn)用仔豬隨機(jī)均分為6個試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組10 頭。分組及試驗(yàn)方法如下第I組為生理鹽水對照組；第II組為藥物對照組(黃芪多糖注 射液，20mg/kg *bw);第III組為疫苗對照組(無藥物)；第IV組為疫苗組+藥物組合高劑 量組(0. lmg/kg bw);第V組為疫苗組+藥物組合中劑量組(0. 05mg/kg bw);第VI組為 疫苗組+藥物組合低劑量組(0. 01mg/kg bw)。 將斷奶仔豬按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，生理鹽水對照組與陽性對照組和用藥試驗(yàn) 組在不同豬舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)至15天，III、IV、V、VI4個組分別進(jìn)行豬瘟疫 苗(免疫劑量為常規(guī)免疫劑量)免疫。免疫后15天，第II組注射黃芪多糖注射液；IV、V、 VI組仔豬肌注藥物組合，12小時后進(jìn)行攻毒(攻毒劑量為500LD5。豬瘟強(qiáng)病毒)，攻毒后24 小時給藥組再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察7-15天。 結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合對豬病毒病的感染發(fā)病有明顯的保護(hù)率
和較高的治愈率，能夠抑制病毒在家畜體內(nèi)的增殖。能夠降低家畜的死亡率。 具體實(shí)施方式
五參照圖5，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案將該藥物組合用
注射用水稀釋至50 ii g/ml。將75只試驗(yàn)用犬隨機(jī)均分為5個試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組15只。
第I組為空白對照組；第II、 III、 IV組分別以聚肌胞藥物組合高、中、低劑量用藥試驗(yàn)組
(高劑量組用藥劑量為0. lmg/kg bw ;中劑量組用藥劑量為0. 05mg/kg bw ;低劑量組用藥
劑量為0. 01mg/kg bw);第V組為黃芪多糖注射液藥物對照組20mg/kg bw。 將比格犬按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，空白對照組與陽性對照組和用藥試驗(yàn)組在不
同犬舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)一周后，II、 III、 IV組比格犬肌注聚肌胞藥物組合
(按照各組的給藥劑量給藥)，12小時后試驗(yàn)犬全部注射500LD5。的犬瘟熱病毒，攻毒后24
小時各組按設(shè)計的方法再次注射與首次注射劑量相同的藥物，觀察7-15天。 結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合對寵物(犬)病毒病的感染發(fā)病有明顯的
保護(hù)率和高的治愈率，能夠抑制病毒在寵物犬體內(nèi)的增殖。
具體實(shí)施方式
六參照圖6，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案將150條試驗(yàn)用 虹鱒稚魚隨機(jī)均分為6個試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組25條。第I組為空白對照組；第II組為黃 芪多糖注射液藥物對照組，給藥劑量為藥物推薦劑量；第ni、iv、v組分別以聚肌胞高、中、 低劑量用藥(高劑量組用藥劑量為0. lmg/kg *bw ;中劑量組用藥劑量為0. 05mg/kg *bw ;低 劑量組用藥劑量為0. 0lmg/kg bw);第VI組為攻毒對照組。 將虹鱒稚魚按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，空白對照組與陽性對照組和用藥試驗(yàn)組在
不同漁缸中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)一周后，第ni、iv、v組虹鱒稚魚腹腔注射聚肌
胞注射液，24小時后II、 III、 IV、 V、 VI注射3000TCID5。的傳染性胰臟壞死癥病毒，攻毒后24小時后，按各組方案再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察結(jié)果。 結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合能夠抑制水產(chǎn)魚類病毒病增殖。從而達(dá)到
對水產(chǎn)魚類病毒病感染的治療與預(yù)防作用。
權(quán)利要求
一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用，其特征在于它的配方組成為柴胡皂甙含量范圍20-50μg/ml；柴胡油含量范圍紫外吸收值0.45以上；聚肌胞1-3mg/ml，分子量范圍200-500bp(瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用，其特征在于所 述的聚肌胞的合成方法為500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0. 3g、氯化鈉0. 6g以及 適量的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，加熱至20-6(TC，進(jìn)一步優(yōu)選為30-5(TC之間的某一特定 溫度，加入500mg聚胞苷酸攪拌使溶解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶 解，保溫配對15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值1. 6以上、柴胡皂甙含量0. 4%以上 的柴胡揮發(fā)油400ml，充分?jǐn)嚢杌靹颍米⑸溆盟ㄈ葜羖OOOml，O. 45um微孔濾膜法過濾， 灌封，IO(TC流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢、貼標(biāo)即得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用，其特征在于 所述的柴胡皂甙、柴胡揮發(fā)油的分步提取工藝為柴胡飲片按料液比1 : 6在30-6(TC，進(jìn) 一步優(yōu)化為35-45t:之間某一特定溫度下溫漬，收集相當(dāng)于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮， 得到較高紫外吸收值的柴胡揮發(fā)油；溫漬后的柴胡藥材，按料液比1 : 6，加入體積百分比 濃度60-98%之間，進(jìn)一步優(yōu)選為75-96%之間某一特定濃度乙醇，加熱至451:，回流提取 1-1. 5小時提取柴胡皂甙，提取液經(jīng)濃縮，得到較高濃度的柴胡皂甙。
全文摘要
一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物組合及其應(yīng)用，它涉及一種應(yīng)用于養(yǎng)殖動物病毒性感染防治的藥物組合以及該組合用藥物的制備及穩(wěn)定性控制方法。它的配方組成為柴胡皂甙含量范圍20-50μg/ml；柴胡油含量范圍紫外吸收值0.45以上；聚肌胞1-3mg/ml，分子量范圍200-500bp(瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。它能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，阻遏病毒在動物體內(nèi)的繁殖。
文檔編號A61K31/704GK101703542SQ200910177090
公開日2010年5月12日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者劉宗柱, 劉西鋒, 尹立杰, 段坤 申請人:青島漢河動植物藥業(yè)有限公司