專利名稱：一種由十大功勞葉中提取總生物堿及總黃酮的方法
一種由十大功勞葉中提取總生物堿及總黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥成分的提取工藝，特別涉及一種由十大功勞葉中提取總生物
堿及黃酮的方法。背景技術(shù)：
自20世紀(jì)40年代青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素的發(fā)展突飛猛進(jìn)，為控制和治療細(xì)菌引 起的感染提供了有力的工具。但是由于抗生素不合理使用，導(dǎo)致日趨嚴(yán)重的耐藥性問題。耐 藥菌不僅使抗生素的療效減弱，治療費(fèi)用增加，而且還會(huì)引起并發(fā)癥，甚至使抗生素失去療 效導(dǎo)致病人、患畜死亡率升高。特別是近年來，臨床上出現(xiàn)了多重、超強(qiáng)耐藥菌株。使得抗 菌藥失去了原有的療效，從而使得大腸桿菌耐藥性問題的解決變得更加棘手。致病性大腸 桿菌可引起禽敗血性大腸桿菌病、腸炎、臍帶炎、心包炎、全眼球炎，甚至還導(dǎo)致胚胎和幼畜 的死亡。 由于上述原因，如何消除或降低細(xì)菌的耐藥性，使其重新恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感 性，以及在開發(fā)特效的新藥之前，延緩抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生速度，減少抗菌藥物的用量和 毒性，對(duì)于解決耐藥性問題具有重要的意義。公知的中藥作用靶點(diǎn)多，恰好針對(duì)多藥耐藥機(jī) 制復(fù)雜的特點(diǎn)，以恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，現(xiàn)有研究亦提示開發(fā)中藥多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑 有較好的前景。 小檗科(Berberidaceae)十大功勞屬植物，多具有藥用價(jià)值，分布于美洲中部和 北部及亞洲。我國有50種，產(chǎn)于西南部和南部。該屬植物根、莖、葉均可入藥，以根、莖入 藥的稱為功勞木，以葉入藥的稱為功勞葉，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，民間常用于清 熱、解毒、治感冒等。現(xiàn)已從該屬植物中提取分離出幾十種生物堿，如小檗堿、異漢防己 堿、小檗胺、藥根堿、巴馬亭堿、非洲防己胺、尖剌堿等，這些生物堿多具有生理活性；除此 之外還分離出一些黃酮類及木脂素類成分，如ampelopsin(dihydromyricetin)，丁香樹脂 醇(syringaresinol)等。鹽酸小檗堿具有廣譜抗菌作用，體外對(duì)多種革蘭氏陽性菌及陰 性菌均具有抑制作用，主要用于治療腸道細(xì)菌感染性疾病、胃腸炎等。張立新(張立新、 孫諾.小檗堿及其類似物在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥泵中的應(yīng)用.專利申請(qǐng)?zhí)?00810112350. 1) 研究小檗堿及其結(jié)構(gòu)類似物可作為多藥耐藥泵的逆轉(zhuǎn)劑，與其他藥物聯(lián)合使用，可預(yù)防 和治療由于耐藥菌所引起的淺部和深部微生物感染。黃酮類成分具有廣泛的藥理活性， 可作為防治高血壓及動(dòng)脈血管硬化的輔助治療劑，對(duì)降低血管脆性及異常通透性及保 肝、利膽亦具有明顯的作用。小檗屬植物中的黃酮木脂素類化合物5'-甲氧基大風(fēng)子 品-D (5' -methoxyhydnocarpin-D， 5' -MHC)有抑制金黃色葡萄球菌NorA外排泵的活性。
目前，十大功勞藥材被用于提取黃連素，采用的加工工藝是酸水提取或乙醇回流 提取，再用石灰水及鹽酸調(diào)節(jié)pH得到黃連素，此工藝得到的黃連素成品含雜質(zhì)較多，并且 未能充分利用原料。有報(bào)道闊葉十大功勞葉及花中黃酮類成分的含量測(cè)定方法，就如何制 備十大功勞葉黃酮類成分未見報(bào)道。大孔樹脂是利用樹脂的吸附和分子篩作用原理進(jìn)行 分離純化，因而針對(duì)性不強(qiáng)，不能將生物堿類和黃酮類物質(zhì)進(jìn)行選擇性的分離，但是能很好
3的除去葉綠素、糖類及粘液質(zhì)類等雜質(zhì)；聚酰胺可以選擇性的分離黃酮類成分，如楊新波 (楊新波、黃正明、曹文斌等.一種羅布麻提取物的制備方法及其藥物制劑與應(yīng)用.專利申 請(qǐng)?zhí)?00610083712. X)利用聚酰胺分離羅布麻葉總黃酮；余丹妮(余丹妮、徐德生、馮怡， 等.聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用富集益母草總黃酮[J]，中國中藥雜志.2008，33(3) :264-268) 利用聚酰胺大孔樹脂聯(lián)用分離益母草總黃酮；蔡鷹(蔡鷹、陸曉和、魏群.聚酰胺柱層析法 分離回心草總黃酮的研究[J]，藥學(xué)實(shí)踐雜志.2009,27(1) :58-60)利用聚酰胺分離回心草 總黃酮。 參考專利 1)、專利申請(qǐng)?zhí)枴?00810112350. 1 ;小檗堿及其結(jié)構(gòu)類似物在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥泵中的 應(yīng)用； 2)、專利申請(qǐng)?zhí)枴?00610083712.X ;專利名稱、一種羅布麻提取物的制備方法及其
藥物制劑與應(yīng)用。
參考文獻(xiàn) 1)、利用聚酰胺分離羅布麻葉總黃酮、余丹妮(余丹妮、徐德生、馮怡，等.聚酰 胺-大孔樹脂聯(lián)用富集益母草總黃酮[J]，中國中藥雜志.2008，33(3) :264-268)利用聚酰 胺大孔樹脂聯(lián)用分離益母草總黃酮； 2)、蔡鷹(蔡鷹、陸曉和、魏群.聚酰胺柱層析法分離回心草總黃酮的研究[J]，藥 學(xué)實(shí)踐雜志.2009， 27(1) :58-60)利用聚酰胺分離回心草總黃酮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，本發(fā)明 所述提取方法通過大孔樹脂除去其中的葉綠素及糖類、黏液質(zhì)類雜質(zhì)，再用聚酰胺分離，從 而獲取所述總生物堿及總黃酮。 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 —種由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，所述工藝步驟如下
1)、取十大功勞葉，粉碎過10-60目篩； 2)、用十大功勞葉的6 10倍量乙醇"乙醇含量80-95%"回流提取3次，每次 1. 5-2小時(shí)，然后合并3次濾液； 3)、濾液合并后靜置12小時(shí)以上，而后濾過，減壓回收乙醇得浸膏； 4)、浸膏中加入4-6倍量熱水，邊加邊攪拌；然后用稀酸調(diào)節(jié)pH5.0-6.0，靜置2小
時(shí)，上清液上于非極性或弱極性大孔吸附樹脂。 5)、用水洗至Molisch反應(yīng)陰性，再用2-8倍柱體積10_80%乙醇洗脫，收集乙醇洗 脫液，于7(TC減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用90%乙醇l-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺 粉拌樣，揮干溶劑。 6)、然后以聚酰胺為載體的層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用5-10倍 量柱體積的80%乙醇洗脫，分別收集水及80%洗脫液，分別于7(TC減壓濃縮，真空干燥得 十大功勞總生物堿及總黃酮。 本發(fā)明由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其中大孔吸附樹脂為弱極 性，包括AB-8、HPD-100、HPD-300或DIOI型等。CN 101703551 A 本發(fā)明由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，所述大孔吸附樹脂柱層析 時(shí)，上樣樣品pH5. 0-6.0。 本發(fā)明由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，所述聚酰胺柱層析，樣品使 用90%乙醇溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌樣，揮干溶劑，并上于載體為聚酰胺的層析柱。
本發(fā)明由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，所述的聚酰胺規(guī)格包括 80-120目、100-200目。 所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，所述大孔樹脂的處理方法； 大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24小時(shí)后使其充分溶脹后，濕法裝柱，并用5倍樹脂體積 95%乙醇動(dòng)態(tài)清洗，水洗至無醇后，依次用5%Na0H "動(dòng)態(tài)清洗3_5倍樹脂體積，水洗至中 性"和5%鹽酸"動(dòng)態(tài)清洗3-5倍樹脂體積，水洗至中性"處理，最后用95%乙醇動(dòng)態(tài)清洗至 乙醇洗脫液與水混合(1 :5)不呈白色混濁溶液止，用水洗去乙醇后即可裝柱便可。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果； 本發(fā)明所述由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，獲取的生物堿及黃酮類 成分與現(xiàn)有的獲取方法相比較，優(yōu)點(diǎn)是 1、本發(fā)明提供的綜合提取工藝可將十大功勞葉中生物堿類及黃酮類成分提取出 來，并能將二者同時(shí)分離； 2、本發(fā)明將大孔樹脂與聚酰胺聯(lián)用分離總生物堿及總黃酮。利用大孔吸附樹脂可 同時(shí)除去葉綠素、糖類及黏液質(zhì)等雜質(zhì)；聚酰胺柱層析能將生物堿類成分及黃酮類成分同 時(shí)分離，減少了操作程序，大孔樹脂及聚酰胺均可再生后使用，從而減少操作工序和有效的 降低了工藝成本； 本發(fā)明所述工藝過中程用到的溶劑為乙醇，毒性相對(duì)較小，各環(huán)節(jié)所用溶劑可回 收再利用，降低生產(chǎn)成本的同時(shí)也減少環(huán)境污染。
具體實(shí)施方式
通過下面的實(shí)施例可以更詳細(xì)的解釋本發(fā)明，本發(fā)明并不局限于下面的實(shí)施例，
公開本發(fā)明的目的旨在保護(hù)本發(fā)明范圍內(nèi)的一切變化和改進(jìn)；
實(shí)施例1 取十大功勞葉100g，粉碎過30目篩，用6倍量80%乙醇回流提取3次，每次2小 時(shí)，合并3次濾液，靜置12小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，7(TC減壓回收乙醇得浸膏；加入 4倍量熱水，邊加邊攪拌，用稀酸調(diào)節(jié)p朋.0，靜置2小時(shí)，上清液上于AB-8型大孔吸附樹脂 柱，用水洗脫至Molisch反應(yīng)陰性，再依次用2倍柱體積的10%乙醇、4倍柱體積的80%乙 醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于7(TC減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用2倍量90%乙醇溶解后 用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌樣，揮干溶劑，上于5倍量聚酰胺(80-120目)為載體的 層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用8倍量柱體積的80%乙醇洗脫，收集水及80% 洗脫液，分別于7(TC減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿1. 93g及總黃酮1. 85g，總生 物堿及總黃酮的含量分別為62%、76%。
實(shí)施例2 取十大功勞葉100g，粉碎過10目篩，用8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1.5小 時(shí)，合并3次濾液，靜置24小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，7(TC減壓回收乙醇得浸膏；加入6倍量熱水，邊加邊攪拌，用稀酸調(diào)節(jié)pH5. O，靜置2小時(shí)，上清液上于HPD-100型大孔吸附 樹脂，用水洗脫至Molisch反應(yīng)陰性，再依次用2倍柱體積的10%乙醇、4倍柱體積的80% 乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于7(TC減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用3倍量90%乙醇溶解， 用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌樣后揮干溶劑，上于8倍量聚酰胺(80-120目)為載體的 層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用8倍量柱體積的80%乙醇洗脫，收集水及80% 洗脫液，分別于7(TC減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿2. 27g及總黃酮2. 04g，總生 物堿及總黃酮的含量分別為54%、68%。
實(shí)施例3 取十大功勞葉100g，粉碎過60目篩，用10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2小 時(shí)，合并3次濾液，靜置12小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，7(TC減壓回收乙醇得浸膏；加入 5倍量熱水，邊加邊攪拌，用稀酸調(diào)節(jié)pH5. 5，靜置2小時(shí)，上清液上于HPD-300型大孔吸附 樹脂，用水洗脫至Molisch反應(yīng)陰性，再依次用4倍柱體積的10%乙醇、8倍柱體積的80% 乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于7(TC減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用3倍量90%乙醇溶解 后用2倍量聚酰胺粉(80-120目)拌樣，揮干溶劑，上于IO倍量聚酰胺(80-120目)為載體 的層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用10倍量柱體積的80%乙醇洗脫，收集水及 80%洗脫液，分別于7(TC減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿2. 33g及總黃酮2. 18g， 總生物堿及總黃酮的含量分別為52%、66%。
實(shí)施例4 取十大功勞葉100g，粉碎過40目篩，用8倍量95%乙醇回流提取3次，每次1.5 小時(shí)，合并3次濾液，靜置24小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，7(TC減壓回收乙醇得浸膏；加 入4倍量熱水，邊加邊攪拌，用稀酸調(diào)節(jié)p朋.0，靜置2小時(shí)，上清液上于D101型大孔吸附 樹脂，用水洗脫至Molisch反應(yīng)陰性，再依次用3倍柱體積的10%乙醇、5倍柱體積的80% 乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于7(TC減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用l倍量90%乙醇溶解 后用3倍量聚酰胺粉(100-200目)拌樣，揮干溶劑，上于5倍量聚酰胺(100-200目)為載 體的層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用8倍量柱體積的80%乙醇洗脫，收集水及 80%洗脫液，分別于7(TC減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿2. 12g及總黃酮2. 07g， 總生物堿及總黃酮的含量分別為55%、67%。
權(quán)利要求
一種由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于所述提取方法步驟如下1)、取十大功勞葉，粉碎過10-60目篩；2)、用十大功勞葉的6～10倍量乙醇“乙醇含量80-95％”回流提取3次，每次1.5-2小時(shí)，然后合并分3次濾液；3)、濾液后靜置12小時(shí)以上，而后濾過，濾液減壓回收乙醇，70℃減壓回收乙醇得浸膏；4)、浸膏中加入4-6倍量熱水，邊加邊攪拌；然后用稀酸調(diào)節(jié)pH5.0-6.0，靜置2小時(shí)，上清液上于非極性或弱極性大孔吸附樹脂；5)、用水洗洗至Molisch反應(yīng)陰性，再用2-8倍柱體積10-80％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于70℃減壓濃縮，得粗提物，此粗提物用90％乙醇1-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌樣，揮干溶劑；6)、然后以聚酰胺為載體的層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用5-10倍量柱體積的80％乙醇洗脫，分別收集水及80％洗脫液，分別于70℃減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿及總黃酮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于 其中大孔吸附樹脂為弱極性，包括AB-8、HPD-100、HPD-300或D101型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于 所述大孔吸附樹脂柱層析時(shí)，上樣樣品PH5. 0-6. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于 所述聚酰胺柱層析，樣品使用90%乙醇溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌樣，揮干溶劑，并上于 載體為聚酰胺的層析柱。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于 所述的聚酰胺規(guī)格為80-120目或100-200目。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，其特征在于 所述大孔樹脂的處理方法為大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24小時(shí)后使其充分溶脹后，濕 法裝柱，并用5倍樹脂體積95%乙醇動(dòng)態(tài)清洗，水洗至無醇后，依次用5% NaOH "動(dòng)態(tài)清洗 3-5倍樹脂體積，水洗至中性"和5%鹽酸"動(dòng)態(tài)清洗3-5倍樹脂體積，水洗至中性"處理，最 后用95%乙醇動(dòng)態(tài)清洗至乙醇洗脫液與水混合"1 : 5"不呈白色混濁溶液止，用水洗去乙 醇后即可裝柱便可。
全文摘要
一種由十大功勞葉中提取總生物堿及黃酮的方法，涉及一種中藥成分的提取工藝提取方法步驟如為；取十大功勞葉粉碎用乙醇回流提取3次，然后合并濾液并靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇得浸膏；而后加入熱水，攪拌；用稀酸調(diào)節(jié)pH5.0-6.0，水洗、乙醇洗脫、收集乙醇洗脫液、得粗提物，所述粗提物用90％乙醇1-3倍量溶解，用2-3倍量聚酰胺粉拌樣，揮干溶劑；然后以聚酰胺為載體的層析柱，用水洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，再用乙醇洗脫，分別收集水及洗脫液，分別于減壓濃縮，真空干燥得十大功勞總生物堿及總黃酮；本發(fā)明提供的方法不僅可將十大功勞葉中兩類主要成分最大化的提取出來，最終得到純度較高的總生物堿及總黃酮。
文檔編號(hào)A61K36/29GK101703551SQ200910172309
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者張曉會(huì), 李興國, 杜麗麗 申請(qǐng)人:洛陽惠中獸藥有限公司