專利名稱：用于制備薄芝糖肽注射液的靈芝屬薄樹芝菌的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和化工技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，涉及一種用于制備薄芝糖肽注射 液的靈芝屬薄樹芝菌的培養(yǎng)基、用該培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝屬薄樹芝菌的方法以及利用該培養(yǎng)基 培養(yǎng)的薄樹芝菌來制備薄芝糖肽注射液的方法。
背景技術(shù)：
薄芝糖肽注射液系用GCL菌株，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)制得薄樹芝干燥菌絲體，菌絲體 經(jīng)提取、純化、稀配、過濾、灌封而制得的滅菌水溶液。本品具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，對機(jī)體非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫 等有促進(jìn)作用；具有抗氧化作用，清除氧自由基，還有促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)生物合成作用。臨床 使用靜脈注射或肌肉注射治療進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、萎縮性肌強(qiáng)直及前庭功能障礙、高血壓 等引起的眩暈和植物神經(jīng)功能紊亂、癲癇、失眠等癥，亦可用于腫瘤、肝炎的輔助治療。多糖、多肽是薄芝糖肽注射液的主要有效成分，現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，薄芝糖肽注 射液的規(guī)格為2ml中含多糖5mg，含多肽lmg，產(chǎn)品中多糖多肽的含量不得低于標(biāo)示量的 90%。當(dāng)前工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中，單位發(fā)酵液中多糖多肽的得量不高，每毫升發(fā)酵液平均 得多糖0.5毫克，得多肽0. 1毫克。在薄芝糖肽注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，可見異物和熱原是兩個重要檢查項(xiàng)目，因本品是 經(jīng)發(fā)酵制備的產(chǎn)品，如生產(chǎn)條件控制不當(dāng)，很易造成上述兩項(xiàng)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)要求，從而降低成 品收率。如何提高單位發(fā)酵液中多糖多肽的得量，以及如何改進(jìn)稀配、灌裝工藝，使可見異 物、熱原兩項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)穩(wěn)定合格，對提高薄芝糖肽注射液的技術(shù)水平、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低 生產(chǎn)成本方面具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種適合靈芝屬薄樹芝菌生長、代謝的發(fā)酵培養(yǎng)
基配方。該培養(yǎng)基的配方為黃豆餅粉2.0 3.0%、麩皮粉1.0 2.0%、蔗糖3. 0 5. 0%、硫酸銨0. 04 0. 06%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鈉0. 1 0.2%、磷酸氫二 鈉0. 2 0. 4 %、豆油0. 4 0. 6%、維生素B2 0. 00005 0. 0002%、賴氨酸0. 0001 0. 0003%、甘氨酸0. 0002 0. 0004%，其余為水。上述培養(yǎng)基的配方優(yōu)選黃豆餅粉2. 5 %、麩皮粉1. 5 %、蔗糖4. 0%、硫酸銨 0. 05%、硫酸鎂0. 075%、磷酸二氫鈉0. 15%、磷酸氫二鈉0. 3%、豆油0. 5%、維生素B2 0. 0001%、賴氨酸0. 0002%、甘氨酸0. 0003%，其余為水。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝屬薄樹芝菌的方法。本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)的薄樹芝菌來制備薄芝糖肽注射液的方法。上述薄芝糖肽注射液的制備方法，包括下列步驟a)將靈芝屬薄樹芝菌株置上述培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得菌絲體；b)將所得菌絲體用醇溶劑進(jìn)行提取，靜置，得薄芝糖肽提取液；c)將上述提取液進(jìn)行稀配、灌封、滅菌，得薄芝糖肽注射液；其中，步驟b)中所述的醇為乙醇、丙醇、1，2-丙二醇中的一種或幾種，優(yōu)選乙醇， 更優(yōu)選75 % 95 %的乙醇水溶液，最優(yōu)選85 %的乙醇水溶液；考慮到薄芝糖肽注射液為經(jīng)發(fā)酵得到，為去除產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，故提取 液在稀配前，增加了步驟b)中的低溫靜置過程；具體說，步驟b)中靜置的溫度為0 15°C， 優(yōu)選2V ；靜置的時(shí)間為6 16小時(shí)，優(yōu)選10小時(shí)；此外，在注射液稀配過濾灌裝過程中，控制藥液在較低溫度范圍內(nèi)，以防止微生物 污染；具體說，步驟c)中對提取液進(jìn)行稀配、過濾、灌封的過程中，將提取液溫度控制在0 20°C，優(yōu)選控制在4 6°C ；另外，薄芝糖肽注射液屬最終滅菌的小容量注射劑，按GMP (藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī) 范)要求，最終滅菌的小容量注射劑的稀配、過濾和灌封應(yīng)在10000級空氣潔凈條件下進(jìn) 行。本發(fā)明考慮到產(chǎn)品的特點(diǎn)，為了進(jìn)一步提高產(chǎn)品的質(zhì)量，提高了對制造環(huán)境的潔凈度要 求。即，步驟C)中提取液進(jìn)行稀配、過濾、灌封的過程在10000級背景下局部100級的空氣 潔凈度條件下進(jìn)行。采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的靈芝屬薄樹芝菌菌絲粗壯，單位發(fā)酵液中多糖、多肽 的產(chǎn)量顯著提高，平均每毫升發(fā)酵液可得多糖0.8毫克，可得多肽0. 14毫克。利用該培養(yǎng) 基培養(yǎng)的薄樹芝菌制備的薄芝糖肽注射液，其產(chǎn)品質(zhì)量得到明顯提高。其中，可見異物、熱 原兩檢查項(xiàng)目符合要求，一次成品合格率達(dá)98%以上。


圖1是本發(fā)明的薄芝糖肽注射液工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式為了更加清楚地對本發(fā)明進(jìn)行說明，以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方 式進(jìn)行詳細(xì)說明。但是應(yīng)該理解，以下所述具體實(shí)施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)行示例性地說明， 而非用于對本發(fā)明進(jìn)行任何性質(zhì)的限定，其中所用材料、試劑等僅為代表性的，其并不限于 所列舉的情況。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀以下說明可以對本發(fā)明做出不脫離本發(fā) 明權(quán)利要求所限定的保護(hù)范圍的改動和改進(jìn)，這些改動和改進(jìn)也處于本發(fā)明所要求保護(hù)的 范圍內(nèi)。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程如圖1所示。下面是對流程圖中所提到的材料和步驟的詳 細(xì)說明。1.菌種靈芝屬薄樹芝[Ganoderma Capense(Llogd)Teng]2.斜面菌種的制備培養(yǎng)基蔗糖2%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0. 15%、瓊脂2%、麩皮5%，251恒 溫培養(yǎng)5 6天，待白色菌絲布滿斜面，4°C保存。
3. 一級種子瓶制備培養(yǎng)基蔗糖2%、磷酸二氫鈉0.3%、硫酸鎂0. 15%、瓊脂2%、麩皮5%和維生素 B20. 0001%。接入斜面菌種，26 28°C搖床培養(yǎng)72 96小時(shí)，至菌液淺黃棕色，澄清，菌 球多刺，直徑3毫米左右。4. 二級種子瓶制備 培養(yǎng)基蔗糖2 %、磷酸二氫鈉0. 3 %、硫酸鎂0. 15 %、瓊脂2 %、麩皮5 %和維生素 B2 0.0001%。接入一級種子瓶液，種量8%，26 28°C培養(yǎng)72 96小時(shí)，至菌液淺黃棕色，澄 清，菌球多刺，直徑3 5毫米。5.種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)基配比黃豆餅粉2. 0 3. 0%、麩皮粉1. 0 2. 0%、蔗糖3. 0 5. 0%、硫 酸銨0. 04 0. 06%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鈉0. 1 0. 2%、磷酸氫二鈉0. 2 0. 4%、豆油 0. 4 0. 6%、維生素 B2 0. 00005 0. 0002%、賴氨酸 0. 0001 0. 0003%、甘 氨酸0. 0002 0. 0004%，其余為水。最佳培養(yǎng)基配比為黃豆餅粉2.5%、麩皮粉1.5%、蔗糖4.0%、硫酸銨0.05%、硫 酸鎂0. 075%、磷酸二氫鈉0. 15%、磷酸氫二鈉0. 3%、豆油0. 5%、維生素B2 0. 0001%、賴 氨酸0. 0002%、甘氨酸0. 0003%，其余為水。實(shí)罐滅菌，罐壓0. IMpa 122°C滅菌30分鐘，保壓0. IMpa，降溫至培養(yǎng)溫度，接入二 級種瓶液，培養(yǎng)條件溫度26 28°C，罐壓0. 05Mpa,空氣流量0 16小時(shí)時(shí)10 15立 方米/時(shí)；16小時(shí) 放罐20立方米/時(shí)。6.發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基配比黃豆餅粉2. 0 3. 0%、麩皮粉1. 0 2. 0%、蔗糖3. 0 5. 0%、硫 酸銨0. 04 0. 06%、硫酸鎂0. 05 0. 1%、磷酸二氫鈉0. 1 0. 2%、磷酸氫二鈉0. 2 0. 4%、豆油 0. 4 0. 6%、維生素 B2 0. 00005 0. 0002%、賴氨酸 0. 0001 0. 0003%、甘 氨酸0. 0002 0. 0004%，其余為水。最佳培養(yǎng)基配比為黃豆餅粉2.5%、麩皮粉1.5%、蔗糖4.0%、硫酸銨0.05%、硫 酸鎂0. 075%、磷酸二氫鈉0. 15%、磷酸氫二鈉0. 3%、豆油0. 5%、維生素B2 0. 0001%、賴 氨酸0. 0002%、甘氨酸0. 0003%，其余為水。實(shí)罐滅菌，罐壓0. IMpa, 122°C滅菌30分鐘，保壓0. IMpa,降溫至培養(yǎng)溫度，利用壓 差將種子罐種子壓入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件溫度26 28°C，罐壓0. 05Mpa,空氣流量0 16小時(shí)5 20立方米 /時(shí)，16小時(shí) 放罐25立方米/時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間66 78小時(shí)。放罐條件菌絲內(nèi)充滿液泡，分枝分節(jié)部分?jǐn)嗔?，溶液淺黃棕色，發(fā)酵液開始變稀。7.發(fā)酵液及菌絲體處理放罐發(fā)酵液以離心機(jī)脫水，所得潮菌絲體于70 80°C干燥，至水份< 5%，得干菌 絲體。8.菌絲體提取菌絲體以75 95%乙醇或丙醇提取，過濾，得提取液。最佳提取工藝為干菌絲體加85 %乙醇，回流提取2次，加活性炭，攪拌過濾，濾液減壓趕醇，加注射用水，于2°C靜置10小時(shí)，過濾，得提取液。9.提取液靜置提取液在0 15°C靜置6 16小時(shí)。最佳提取液靜置條件為提取液稀配前2°C靜置10小時(shí)。10.稀配控制藥液溫度0 20°C進(jìn)行稀配。最佳稀配工藝為操作在10000級背景下局部100級中進(jìn)行，控制藥液溫度4 6°C，以5%碳酸氫鈉液調(diào)節(jié)提取液，pH值為5. 8 6. 5，加注射用水，使溶液中多糖含量為 2. 5 10毫克/毫升，多肽含量為0. 5 2毫克/毫升，經(jīng)0. 45毫微米和0. 22毫微米濾器 過濾，在2000 3000Lx照度下燈檢，藥液應(yīng)為淺黃棕色溶液，澄明，無可見異物。11.灌封控制藥液溫度0 20°C進(jìn)行灌封。最佳灌封工藝為操作在10000級背景下局部100級中進(jìn)行，控制藥液溫度4 6°C。將燈檢合格的藥液按規(guī)定裝量灌注至潔凈安瓿中，封口。12.滅菌在121°C流通蒸氣下滅菌30分鐘。
權(quán)利要求
1.一種用于制備薄芝糖肽注射液的靈芝屬薄樹芝菌的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基 的配方為黃豆餅粉2. 0 3. 0%、麩皮粉1. 0 2. 0%、蔗糖3. 0 5. 0%、硫酸銨0. 04 0. 06 %、硫酸鎂0. 05 0. 1 %、磷酸二氫鈉0. 1 0. 2 %、磷酸氫二鈉0. 2 0. 4 %、豆 油0.4 0.6%、維生素B2 0. 00005 0. 0002 %、賴氨酸0. 0001 0.0003 %、甘氨酸 0. 0002 0. 0004%，其余為水。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基的配方為黃豆餅粉2.5%、麩 皮粉1. 5%、蔗糖4. 0%、硫酸銨0. 05%、硫酸鎂0. 075%、磷酸二氫鈉0. 15%、磷酸氫二鈉 0. 3%、豆油0. 5%、維生素B2 0. 0001%、賴氨酸0. 0002%、甘氨酸0. 0003%，其余為水。
3.用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝屬薄樹芝菌的方法。
4.一種利用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的薄樹芝菌來制備薄芝糖肽注射液的方 法，包括下列步驟a)將靈芝屬薄樹芝菌株置所述培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得菌絲體；b)將所得菌絲體用醇液進(jìn)行提取，靜置，得薄芝糖肽提取液；c)將上述提取液進(jìn)行稀配、灌封、滅菌，得薄芝糖肽注射液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟b)中所述的醇液為乙醇、丙醇、1，2_丙 二醇中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，步驟b)中所述的醇液為75% 95%的 乙醇水溶液。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟b)中靜置的溫度為0 15°C，靜置的 時(shí)間為6 16小時(shí)。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟c)中對提取液進(jìn)行稀配、過濾、灌封的 過程中，將提取液溫度控制在0 20°C。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟c)中對提取液進(jìn)行稀配、過濾、灌封的 過程中，將提取液溫度控制在4 6°C。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟C)中提取液進(jìn)行稀配、過濾、灌封的過 程在10000級背景下局部100級的空氣潔凈度條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于制備薄芝糖肽注射液的靈芝屬薄樹芝菌的培養(yǎng)基、用該培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝屬薄樹芝菌的方法以及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的薄樹芝菌來制備薄芝糖肽注射液的方法。所述培養(yǎng)基的配方為黃豆餅粉2.0～3.0％、麩皮粉1.0～2.0％、蔗糖3.0～5.0％、硫酸銨0.04～0.06％、硫酸鎂0.05～0.1％、磷酸二氫鈉0.1～0.2％、磷酸氫二鈉0.2～0.4％、豆油0.4～0.6％、維生素B20.00005～0.0002％、賴氨酸0.0001～0.0003％、甘氨酸0.0002～0.0004％，其余為水。
文檔編號A61P1/08GK101993281SQ200910166558
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者吳文格, 姚興田, 左義華, 潘和平, 胡長坤, 賀曾佑 申請人:揚(yáng)州制藥有限公司;江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司