專利名稱：：一種高純度桑葉多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高純度桑葉多糖的制備方法。(二)
背景技術(shù)：
：桑葉為?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉，是我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用原料，具有降血糖、降血壓、降血脂等作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗表明，桑葉多糖可以通過多靶點途徑抑制a-葡萄糖苷酶活性和促進(jìn)胰腺a-細(xì)胞分泌胰島素，具有預(yù)防和治療糖尿病的作用。我國每年桑葉產(chǎn)量達(dá)1000萬噸，除了用于養(yǎng)蠶之外，約有250萬噸因過剩而浪費。為了開發(fā)桑葉資源和生產(chǎn)天然降血糖保健品、藥品，利用現(xiàn)代分離技術(shù)提取桑葉多糖具有重要的意義。目前國內(nèi)外關(guān)于桑葉多糖的提取分離研究主要是通過提取手段和工藝的改進(jìn)來提高其得率，而對桑葉多糖的純化方面研究相對甚少。張琳華等通過正交實驗得到桑葉多糖的最佳提取工藝為蒸餾水原料(質(zhì)量比)=10:1，提取溫度7(TC，提取時間1.5h，提取次數(shù)2次；醇沉最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液濃度lmL/g生藥，pH值為4;劉學(xué)軍等利用超聲波方法提取桑葉多糖，通過正交實驗得到提取的最佳工藝條件為原料80目，超聲波功率50W，提取溫度85t:，提取時間2.5h，得率達(dá)2.5%。這些方法雖然應(yīng)用較廣，但提取溫度高、時間長，對桑葉多糖分子結(jié)構(gòu)造成一定破壞作用。凌慶枝等采用超高壓技術(shù)提取桑葉多糖，考察了壓力、保壓時間、pH和料液比(W:V)對桑葉多糖提取率的影B向，實驗結(jié)果表明在超高壓300MPa、保壓4.5min、pH9.0、料液比1:16條件下，桑葉多糖的提取率達(dá)到最高，但該法不適于連續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)量低，具有一定弊端。在專利方面，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所《一種桑葉多糖產(chǎn)品及其用途》、天津大學(xué)《從桑葉中連續(xù)提取生物堿、黃酮和多糖活性成分的方法》、浙江工商大學(xué)《一種從桑葉中提取黃酮、多糖的方法》和江蘇科技大學(xué)《一種聯(lián)產(chǎn)桑葉黃酮、多糖和生物堿的復(fù)合提取工藝》四個發(fā)明專利中，主要采用了熱水法和超聲波法提取桑葉多糖，但在提取桑葉多糖之前進(jìn)行了預(yù)處理，即有機(jī)溶劑提取桑葉黃酮類物質(zhì)，再利用大孔樹脂和離子交換樹脂進(jìn)行桑葉多糖純化，溶劑消耗大，成本高，提取時間長、提取溫度高，桑葉多糖得率低、純度低，工藝條件為提取時間lh-2h、提取溫度60°C-IO(TC、料液比1:10-1:50，桑葉多糖得率1.5%-2.5%，產(chǎn)品純度僅為30%-50%。微波法作為一種現(xiàn)代分離提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥和食品領(lǐng)域，具有設(shè)備簡單易得、能耗低、適用范圍廣、提取效率高、重現(xiàn)性好、污染小等特點，而其在桑葉多糖提取方面還沒有報道，所以本項目采用微波法輔助提取桑葉多糖，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝條件。桑葉多糖粗體液經(jīng)萃取技術(shù)和聚集沉淀技術(shù)分別去除色素、蛋白質(zhì)后，利用超濾技術(shù)進(jìn)行濃縮，再通過醇沉、干燥得到高純度桑葉多糖。(三)
發(fā)明內(nèi)容為了克服桑葉多糖提取工藝溫度高、時間長、純度低、產(chǎn)量低、溶劑消耗大等缺點，本發(fā)明提供了一種高純度的桑葉多糖的制備工藝。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案制備高純度桑葉多糖—種桑葉多糖的制備方法，所述的方法以桑樹的葉為原料，按以下步驟進(jìn)行(1)取桑樹經(jīng)風(fēng)干的桑葉，粉碎得40目-80目桑葉粗粉；(2)取桑葉粗粉用去離子水浸泡，桑葉粗粉與去離子水的質(zhì)量比為1:10-30，加堿調(diào)節(jié)pH值至7-10，再于微波條件下提取3min-10min，微波功率300W-800W，優(yōu)選為650W-750W過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2-5次，合并每次的濾液收集為提取液；(3)將步驟(2)所得的提取液，加酸調(diào)節(jié)pH值至2-5，再加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯與提取液的體積比為l:2-4，攪拌后靜置、分層，保留收集下層，重復(fù)用乙酸乙酯萃取2-5次，合并所有的下層收集為保留液；(4)將步驟(3)的保留液用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2-3，降低溫度至4t:-l(rC，攪拌、靜置8h-12h后，離心，除去沉淀物，收集上清液；(5)將步驟(4)所得的上清液超濾濃縮至濃縮液中多糖質(zhì)量濃度為5%-1.5%，所述超濾截留分子量為5000D-10000D，濃縮液中加入體積濃度為95%_100%乙醇水溶液至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%-80%，降溫至4°C-l(TC，攪拌，靜置12h-18h后，離心，收集沉淀物；(6)取步驟(5)所得的沉淀物，經(jīng)減壓低溫干燥、粉碎，即得桑葉多糖產(chǎn)品。進(jìn)一步，所述的桑葉多糖的制備方法優(yōu)選步驟(2)所述的堿為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液或氨水，濃度通常為1M。本發(fā)明推薦步驟(3)所述的酸為鹽酸溶液或硫酸溶液。所用的鹽酸溶液或硫酸溶液的濃度通常為1M。步驟(4)三氯乙酸溶液質(zhì)量濃度為10%-20%。步驟(4)所述的離心轉(zhuǎn)速5000rpm-10000rpm。再進(jìn)一步，本發(fā)明所述的桑葉多糖的制備方法，步驟(6)所述的沉淀物在減壓低溫干燥以前先推薦以無水乙醇洗滌后再進(jìn)行減壓低溫干燥。做為優(yōu)選，步驟(6)所述的減壓低溫干燥條件為在4(TC-6(TC，真空度低于-0.085MPa，通常在-0.lMPa-0.085MPa真空條件下，干燥12_18h。更進(jìn)一步，步驟(2)于微波功率為650W-750W條件下提取3min-5min，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2-5次，合并每次的濾液收集為提取液。具體的，所述的桑葉多糖的制備方法，以桑樹的葉為原料，按以下步驟進(jìn)行(1)取桑樹經(jīng)風(fēng)干的桑葉，粉碎得40目-80目桑葉粗粉；(2)取桑葉粗粉用去離子水浸泡，桑葉粗粉與去離子水的質(zhì)量比為1:10-30，加1M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，再于微波條件下提取3min-5min，微波功率650W-750W，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2-5次，合并每次的濾液收集為提取液；(3)將步驟(2)所得的提取液，加lM鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2-5，再加入乙酸乙酯萃取，所述的乙酸乙酯與提取液的體積比為1:2-4，攪拌后靜置、分層，保留收集下層，重復(fù)用乙酸乙酯萃取2-5次，合并所有的下層收集為保留液；(4)將步驟(3)的保留液用質(zhì)量濃度為10%_20%的三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2-3，降低溫度至4t:-l(TC，攪拌.靜置8h-12h后，離心，除去沉淀物，收集上清液；(5)將步驟(4)所得的上清液超濾濃縮至濃縮液中多糖質(zhì)量濃度為5%_15%，超濾膜截留分子量為5000D-10000D，濃縮液中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%-80%，降溫至4。C-1(TC，攪拌、靜置12h-18h后，5000rpm-10000rpm離心，收集沉淀物；(6)取步驟(5)所得的沉淀物，用無水乙醇洗滌后低溫減壓干燥，通常在40°C-60°C、0.085MPa條件下減壓干燥12h-18h，干燥至含水量低于10X，粉碎至60目-100目，即得桑葉多糖產(chǎn)品。本發(fā)明采用微波法輔助提取桑葉多糖，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳桑葉多糖提取工藝條件，桑葉多糖粗體液經(jīng)萃取和凝聚沉淀后去除了雜質(zhì)色素和蛋白質(zhì)，再通過超濾、醇沉、干燥后得到了高純度桑葉多糖，產(chǎn)品中桑葉多糖的含量在60%以上。本發(fā)明的有益效果為該方法過程簡單、重現(xiàn)性好、操作時間短、溶劑消耗少、綠色環(huán)保，桑葉多糖提取率高，產(chǎn)品純度高，具有較好的應(yīng)用前景。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此1、高純度桑葉多糖制備實例實施例1稱取干燥粉碎后的桑葉原料100g，倒入微波提取罐中，加入1000mL去離子水，利用1M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，調(diào)節(jié)微波功率650W，提取時間200s，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取3次，合并得到濾液2600mL。將濾液倒入萃取罐中，利用1M鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2，加入7000mL乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?min，靜置30min后，除去上層相溶劑，收集下層，重復(fù)用乙酸乙酯萃取2次，合并下層液，得到保留液2500mL桑葉多糖溶液I。向桑葉多糖溶液I加入10%三氯乙酸溶液200mL，調(diào)節(jié)pH值至3，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4t:，靜置12h后，離心除去沉淀物，離心轉(zhuǎn)速5000rpm，收集上清液得到2600mL桑葉多糖溶液II。將桑葉多糖溶液II進(jìn)行超濾濃縮，濾膜截留分子量5000D，得到濃縮液多糖含量為5%的桑葉多糖溶液11165mL。向多糖溶液III溶液中加入95^乙醇300mL，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置18h后，離心，取沉淀物。利用100mL無水乙醇洗滌沉淀物，沉淀物減壓低溫干燥(-0.085MPa，60°C)后，粉碎至60目，得到淺黃色粉末4.2g，經(jīng)苯酚_硫酸法測定該產(chǎn)品桑葉多糖含量達(dá)62.5%。實施例2稱取干燥粉碎后的桑葉原料100g，倒入微波提取罐中，加入1200mL去離子水，利用1M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8，調(diào)節(jié)微波功率700W，提取時間240s，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取3次，合并得到濾液3350mL。將濾液倒入萃取罐中，利用1M鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2，先加入5000mL乙酸乙酯沸程，充分?jǐn)嚢?min，靜置30min后，除去上層相溶劑，重復(fù)萃取2次，合并下層液，得到3200mL桑葉多糖溶液I。向桑葉多糖溶液I加入12%三氯乙酸溶液270mL，調(diào)節(jié)pH值至3，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置12h后，離心除去沉淀物，離心轉(zhuǎn)速6000rpm，收集上清液得到3400mL桑葉多糖溶液II。將桑葉多糖溶液II進(jìn)行超濾，濾膜截留分子量5000D，濃縮后得到濃縮液多糖含量為7%的桑葉多糖溶液III48mL。向桑葉多糖溶液III中加入95X乙醇280mL，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置18h后，離心，取沉淀物。利用100mL無水乙醇洗滌沉淀物，沉淀物減壓低溫干燥6(-0.09MPa，40°C)，粉碎至60目，得到淺黃色粉末4.5g，經(jīng)苯酚-硫酸法測定該產(chǎn)品桑葉多糖含量達(dá)60.8%。實施例3稱取干燥粉碎后的桑葉原料200g，倒入微波提取罐中，加入2000mL去離子水，利用1M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，調(diào)節(jié)微波功率700W，提取時間300s，過濾得到濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取4次，合并得到濾液7700mL。將濾液倒入萃取罐中，利用IM鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2，在加入25000mL乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?min，靜置30min后，除去上層相溶劑，重復(fù)萃取3次，收集合并下層得到7600mL桑葉多糖溶液I。向桑葉多糖溶液I加入10%三氯乙酸溶液650mL，調(diào)節(jié)pH值至3，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置10h后，離心除去沉淀物，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，收集上清液得到S100mL桑葉多糖溶液II。將桑葉多糖溶液II進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜截留分子量為IOOOOD，得到多糖含量為11%的桑葉多糖溶液11165mL。向多糖溶液III溶液中加入無水乙醇280mL，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置18h后，離心，取沉淀物。利用lOOmL無水乙醇洗滌沉淀物，減壓低溫干燥(-0.085MPa，50°C)，粉碎至80目，得到淺黃色粉末8.7g，經(jīng)苯酚-硫酸法測定該產(chǎn)品桑葉多糖含量達(dá)61.4%。對比實施例4稱取干燥粉碎后的桑葉原料200g，倒入微波提取罐中，加入2500mL去離子水，利用1M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8，調(diào)節(jié)微波功率800W，提取時間300s，過濾得到濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2次，過濾、合并得到濾液4800mL。將濾液倒入萃取罐中，利用1M鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2，先加入lOOOOmL乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?min，靜置30min后，除去上層相溶劑，在加入lOOOOmL乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?min，靜置30min后，除去上層相溶劑，重復(fù)萃取2次，收集合并下層得到4700mL桑葉多糖溶液I。將桑葉多糖溶液I進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜截留分子量為8000D，得到多糖含量為6^的桑葉多糖溶液I11130mL。向多糖溶液III溶液中加入95%乙醇560mL，充分?jǐn)嚢?min，降低溶液溫度至4°C，靜置18h后，離心，取沉淀物。利用200mL無水乙醇洗滌沉淀物，低溫減壓干燥(-0.095MPa，6(TC)，粉碎至60目，得到棕黃色粉末38g，經(jīng)苯酚-硫酸法測定該產(chǎn)品桑葉多糖含量達(dá)18.2%。2、動物藥效試驗本發(fā)明制備的桑葉多糖產(chǎn)品已經(jīng)過動物實驗證明，具有顯著的降血糖效果，藥效實驗報告如下樣品實施例1和實施例4制得的桑葉多糖產(chǎn)品配置濃度為0.lg/mL溶液。實驗動物選用雄性小鼠(26±2g)，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。試劑四氧嘧啶、葡萄糖、磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH7.0)、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、4-氨基安替比林、疊氮鈉、苯甲酸、苯酚、磷酸氫二鈉、鎢酸鈉、氯化鈉、鹽酸、蒸餾水，所有試劑均為分析純。儀器722型分光光度計、離心機(jī)。實驗方法5.1模型小鼠小鼠禁食24h后，靜脈注射四氧嘧啶(劑量為50mg/Kg)，7天后禁食5h，血糖值為大于1Ommol/L為模型小鼠。5.2操作步驟選用成功造模小鼠按禁食5h的血糖水平分組，隨機(jī)選1個模型對照組和3個劑量組(組間差異不大于lmmol/L)，每組12只，每天灌胃15mL桑葉多糖溶液，7對照組灌胃15mL蒸餾水，連續(xù)42天后，測空腹血糖值，比較各組動物血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率=(實驗前血糖值-實驗后血糖值)/(實驗前血糖值-6.5)X100%式中6.5:無禁食正常小鼠血糖水平(mmol/L)。5.3血糖值測試葡萄糖氧化酶_過氧化物酶法6測試結(jié)果不同純度桑葉多糖溶液的降血糖效果見表。表1不同純度桑葉多糖降血糖效果n=12<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*達(dá)到正常水平實驗結(jié)果表明，由高純度桑葉多糖配置的溶液具有顯著的降血糖活性，而低純度桑葉多糖溶液降血糖效果不顯著。權(quán)利要求一種桑葉多糖的制備方法，其特征在于所述的方法以桑樹的葉為原料，按以下步驟進(jìn)行(1)取桑樹經(jīng)風(fēng)干的桑葉，粉碎得40目-80目桑葉粗粉；(2)取桑葉粗粉用去離子水浸泡，桑葉粗粉與去離子水的質(zhì)量比為1∶10-30，加堿調(diào)節(jié)pH值至7-10，再于微波條件下提取3min-10min，微波功率300W-800W，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2-5次，合并每次的濾液收集為提取液；(3)將步驟(2)所得的提取液，加酸調(diào)節(jié)pH值至2-5，再加入乙酸乙酯萃取，所述的乙酸乙酯與提取液的體積比為1∶2-4，攪拌后靜置、分層，保留收集下層，重復(fù)用乙酸乙酯萃取2-5次，合并所有的下層，收集為保留液；(4)將步驟(3)的保留液用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2-3，降低溫度至4℃-10℃，攪拌、靜置8h-12h后，離心，除去沉淀物，收集上清液；(5)將步驟(4)所得的上清液超濾，至濃縮液中多糖質(zhì)量濃度為5％-15％，超濾膜截留分子量為5000D-10000D，濃縮液中加入體積濃度為95％-100％乙醇水溶液至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％-80％，降溫至4℃-10℃，攪拌、靜置12h-18h后，離心，收集沉淀物；(6)取步驟(5)所得的沉淀物，經(jīng)減壓低溫干燥、粉碎，即得桑葉多糖產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求1所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的堿為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液或氨水。3.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的酸為鹽酸溶液或硫酸溶液。4.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(4)三氯乙酸溶液質(zhì)量濃度為腦_20%。5.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的離心轉(zhuǎn)速為5000rpm-10000rpm。6.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的沉淀物先以無水乙醇洗滌后再進(jìn)行減壓低溫干燥。7.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的減壓低溫干燥條件為在40°C-60。C，真空度-0.lMPa—0.085MPa，干燥12h-18h。8.如權(quán)利要求l所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于步驟(2)于微波功率為650W-750W條件下提取3min-5min，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2_5次，合并每次的濾液收集為提取液。9.如權(quán)利要求1所述的桑葉多糖的制備方法，其特征在于所述的方法為以桑樹的葉為原料，按以下步驟進(jìn)行(1)取桑樹經(jīng)風(fēng)干的桑葉，粉碎得40目-80目桑葉粗粉；(2)取桑葉粗粉用去離子水浸泡，桑葉粗粉與去離子水的質(zhì)量比為1:10-30，加lM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，再于微波條件下提取3min-5min，微波功率650W-750W，過濾收集濾液，濾餅重復(fù)提取，共提取2-5次，合并每次的濾液收集為提取液；(3)將步驟(2)所得的提取液，加1M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2-5，再加入乙酸乙酯萃取，所述的乙酸乙酯與提取液的體積比為1:2-4，攪拌后靜置、分層，保留收集下層，重復(fù)用乙酸乙酯萃取2-5次，合并所有的下層，收集為保留液；(4)將步驟(3)的保留液用質(zhì)量濃度為10%_20%的三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)。11值至2-3，降低溫度至4°C-10°C，攪拌、靜置8h-12h后，離心，除去沉淀物，收集上清液；(5)將步驟(4)所得的上清液超濾濃縮至濃縮液中多糖質(zhì)量濃度為5%_15%，超濾膜截留分子量為5000D-10000D，濃縮液中加入體積濃度為95%的乙醇水溶液至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%_80%，降溫至4"-1(TC，攪拌、靜置12h-18h后，5000rpm-10000rpm離心，收集沉淀物；(6)取步驟(5)所得的沉淀物，用無水乙醇洗滌后，4(TC-6(TC、0.085MPa條件下減壓干燥12h-18h，粉碎，即得桑葉多糖產(chǎn)品。全文摘要本發(fā)明公開了一種高純度桑葉多糖的制備方法，所述的方法以桑樹的葉為原料，采用微波法輔助提取桑葉多糖，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳桑葉多糖提取工藝條件，桑葉多糖粗體液經(jīng)萃取和凝聚沉淀后去除了雜質(zhì)色素和蛋白質(zhì)，再通過超濾、醇沉、干燥后得到了高純度桑葉多糖，產(chǎn)品中桑葉多糖的含量在60％以上。本發(fā)明的有益效果為該方法過程簡單、重現(xiàn)性好、操作時間短、溶劑消耗少、綠色環(huán)保，桑葉多糖提取率高，產(chǎn)品純度高，具有較好的應(yīng)用前景。文檔編號A61P3/10GK101712726SQ20091015370公開日2010年5月26日申請日期2009年10月30日優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日發(fā)明者章華偉,錢俊青,高水榮申請人:浙江工業(yè)大學(xué);湖州榮凱植物提取有限公司