專利名稱：以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制的疫苗及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉及一種以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生 產(chǎn)的疫苗以及其方法。
背景技術(shù)：
目前公知的全病毒疫苗生產(chǎn)方法，多以雞胚胎蛋、動物組織或細胞培養(yǎng)方式來產(chǎn) 制病毒；然而，以雞胚胎蛋產(chǎn)制病毒有蛋源質(zhì)量及來源不穩(wěn)定等問題，而以動物組織產(chǎn)制全 病毒疫苗則含有太多外來的蛋白質(zhì)，容易使施打?qū)ο笠疬^敏反應(yīng)和神經(jīng)方面的并發(fā)癥； 因此，較佳的方式是找到對該病毒具有感受性的細胞，以細胞培養(yǎng)方式來大量產(chǎn)制病毒。以貼附型細胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒以制造全病毒疫苗(包括活毒及滅活疫苗)，其中細 胞的大量培養(yǎng)是生產(chǎn)疫苗的關(guān)鍵之一，傳統(tǒng)上，制苗用細胞系(貼附型)的培養(yǎng)，先經(jīng)過 EDTA-胰酶細胞分散消化傳代，以細胞培養(yǎng)液于適當溫度下在培養(yǎng)盤或培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，形 成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。目前實驗室或企業(yè)大多使用轉(zhuǎn)瓶自動培養(yǎng)系統(tǒng) (Roller BottleSystem)，使細胞可以獲得充足的氣體及養(yǎng)分交換。然而，這種傳統(tǒng)式細胞培養(yǎng)工藝的缺點是準備時間繁雜，無法一次大量培養(yǎng)細 胞，而且每一個培養(yǎng)盤或培養(yǎng)瓶只能培養(yǎng)單層細胞。若要短時間內(nèi)大量培養(yǎng)，所需要的空間 與設(shè)備使用及維護成本非常龐大，增加企業(yè)人力、物力的成本負擔。由此可知，以上述細胞培養(yǎng)方式制造全病毒疫苗具有諸多缺點，亟需加以改良。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有工藝存在的不足之處，提供一種以懸浮微載體細胞培 養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法以及根據(jù)此方法制得的疫苗。該方法具有生產(chǎn)工藝簡單且穩(wěn)定、易 操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控制，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn) 的疫苗安全性好、免疫效力高，對病毒攻毒具有完全的免疫保護作用。為達到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，包括下列技術(shù)步驟1.將制苗用細胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；2.將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；3.在適當溫度下，提供上述細胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上繼續(xù) 生長；4.將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔數(shù)日收 獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；毒種鑒定各種疫苗須完全符合《中華人民共和國藥典》及/或《中華人民共和國 獸藥典》規(guī)范，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。5.將上述收獲的病毒液純化后，依照是否需要滅活而加入滅活劑或不加入滅活 劑，滅活后的病毒液加入適當佐劑，不經(jīng)滅活的病毒液則加入適當?shù)膬龈杀Ｗo劑，充分混勻后定量分裝，即得到滅活或活毒疫苗。成品檢驗各種疫苗皆按《中華人民共和國藥典》及/或《中華人民共和國獸藥典》 進行檢驗，應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，對該疫苗施用人體或動物安全無副作用。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的微載體為玻璃圓珠、聚酯纖維圓片、聚酯纖維平板。上述技術(shù)方案中，(3)步驟是以攪拌通氣或是以培養(yǎng)液液面升降方式，使細胞獲得 氣體交換。上述技術(shù)方案中，步驟(2)、(3)、(4)中所述的細胞培養(yǎng)溫度是36 37°C，并含有 2. 5 5% 二氧化碳。上述技術(shù)方案中，⑴步驟中的細胞為狗腎細胞(MDCK)，(4)步驟中的病毒為禽流 感病毒(H5N1)。上述技術(shù)方案中，⑴步驟中的細胞為倉鼠幼鼠腎細胞(BHK)、兔腎細胞(PK13)或 非洲綠猴腎細胞(VERO)，(4)步驟中的病毒為豬偽狂犬病病毒(PRV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細胞為豬腎細胞(PK)、倉鼠腎細胞(HK)或非洲綠 猴腎細胞(VERO)，(4)步驟中的病毒為日本腦炎病毒(JEV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細胞為倉鼠幼鼠腎細胞(BHK)，(4)步驟中的病毒 為牛流行熱病毒(BEFV)。上述技術(shù)方案中，(1)步驟中的細胞為非洲綠猴腎細胞(VERO)，(4)步驟中的病毒 為狂犬病病毒(rabies virus)。本發(fā)明所提供的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，與其它現(xiàn)有技術(shù)相 互比較時，更具有下列優(yōu)點1.本發(fā)明所提供的細胞培養(yǎng)方法，在一個瓶子內(nèi)可以讓細胞貼附的面積大增，可 以減少培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基的使用，其效能為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶自動培養(yǎng)系統(tǒng)的數(shù)十倍，可以節(jié)省許多成 本及人力，亦可減少操作人員與病毒接觸的機會，減少操作人員感染人畜共通病毒(如禽 流感H5m病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒)的機會。2.本發(fā)明提供的方法細胞接種量低，容易控制，且病毒感染效率高，生產(chǎn)效能高。


請參閱以下有關(guān)本發(fā)明一較佳實施例的詳細說明及其附圖，將可進一步了解本發(fā) 明的技術(shù)內(nèi)容及其目的功效；有關(guān)該實施例的附圖為圖1為本發(fā)明的制備流程圖。
具體實施例方式下面的說明部分及示意圖，僅具示范說明性而非限制性。實施例1禽流感活毒疫苗的制作1.1病毒與細胞株用來制作禽流感疫苗的病毒須由政府授權(quán)的單位提供，為H5W重配疫苗原型株 (reassortant)，該病毒株是分離自高致病性禽流感病毒株(例如A/Hong Kong/213/2003 或A/VietNam/1194/2004，或NIBRG-14)。經(jīng)過致病性測試，結(jié)果顯示H5m重配疫苗原型株 病毒不具有致病性后，才可用來制作H5W禽流感疫苗。并且使用對該病毒株具有良好的感受性的細胞系(本實施例選用狗腎細胞系Madin Darby Canine Kidney，MDCK)，作為制苗 用細胞系，通過感染并大量繁殖H5W禽流感病毒。細胞系、種毒株及量產(chǎn)用病毒株，都是依照《中華人民共和國藥典》及《中華人民共 和國獸藥典》所規(guī)定，來進行特性試驗、病毒含量試驗及外來物質(zhì)試驗。1. 2 方法(1)將制苗用狗腎細胞系(MDCK細胞)細胞接種到含有DMEM液體培養(yǎng)基(GIBC0 公司)(含體積百分比為10%的犢牛血清)與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約1小時，使上述細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上生長約4 7天，直到細胞長滿整個微載體， 更換新的DMEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準備接種病毒；(4)將制苗用的H5W重配疫苗原型株病毒以DMEM液體培養(yǎng)基制成病毒懸浮液 (接種濃度為10_4M.0. I.(感染復數(shù)，Multiplicity of infection))，接種于上述細胞上， 置于34°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細胞足夠 的養(yǎng)分及氣體；經(jīng)過2 3日收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進行毒種鑒定以確 認合乎各項標準；毒種鑒定(a)病毒含量以噬斑形成單位(plaque forming unit,PFU)方法計算病毒含量， 每LOmL病毒含量須彡IXIO6PFUo(b)純凈性應(yīng)無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(5)經(jīng)檢驗合格的病毒含量彡IX 106PFU/mL H5W重配疫苗原型株病毒抗原原液 經(jīng)過離心純化后，以甲醛(formaldehyde)或2_溴乙胺(binary ethyleneimine, BEI)將病 毒滅活后，經(jīng)氫氧化鋁佐劑或以乳化(水包油，w/o)或雙相乳化(水包油包水，w/o/w)制 成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗編號為 H5N1-T001、H5N1-TO02、H5N1-T003。成品檢驗按《中華人民共和國獸藥典》進行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定，對施打動物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX106PFU/mL。無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄15頁進行檢驗， 應(yīng)無細菌生長。1. 3 結(jié)果病毒含量H5m重配疫苗原型株病毒接種MDCK細胞后，收獲病毒液，共3批，分別 測定病毒含量，每ImL病毒含量分別為109_°2PFU、10915PFU、109_°6PFU。無菌檢驗三批產(chǎn)品均無菌生長。比較以本發(fā)明“懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)MDCK細胞 系，以增殖禽流感病毒H5m，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表1-1所示。表1-1不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖禽流感病毒H5m的產(chǎn)量比較
5 上述對比試驗結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的禽流感疫苗與 現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對雞只均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載體細胞 培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)禽流感疫苗的產(chǎn)量，遠大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)量。實施例22. 1豬偽狂犬病活毒疫苗的制作2. 1. 1病毒與細胞株用來制作豬偽狂犬病活毒疫苗的病毒，是將偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)強毒株(LC)上的gl醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)雙基因以遺傳工程方式去除而成的 基因缺損弱毒株。經(jīng)過致病性測試，結(jié)果顯示gl醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)雙基因缺損 弱毒株(LCM株)病毒不具有致病性后，才可用來制作豬偽狂犬病活毒疫苗。并且使用對該 病毒株具有良好的感受性的細胞系(本實施例選用倉鼠幼鼠腎細胞BHK細胞；其它細胞如 兔腎細胞(PK13)或非洲綠猴腎細胞(VERO)也對豬偽狂犬病毒有良好的感受性)，作為制苗 用細胞系，通過感染并大量繁殖豬偽狂犬病病毒。2. 1. 2 方法(1)將制苗用BHK細胞接種到含有體積百分比為10%的犢牛血清DMEM液體培養(yǎng) 基(GIBC0公司)與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培 養(yǎng)基液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約1 3小時，使上述細胞與微載體混合均勻，并使 細胞貼附在微載體上；(3)于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上 述細胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細胞長滿整個微載 體，更換新的DMEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準備接種病毒；(4)將豬偽狂犬病gl7TK_雙基因缺損株(LCM株)病毒以DMEM液體培養(yǎng)基(含體 積百分比為2%的犢牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為1 TCID5tl/細胞)，接種于上述 細胞上，置于36 37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式， 提供細胞足夠的養(yǎng)分及氣體；每隔18 24小時(當細胞病變(CPE)達90%以上)收獲病 毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進行毒種鑒定以確認合乎各項標準；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用DMEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、 10_83個稀釋度，每個稀釋度分別接種BHK細胞4瓶，在36 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 120小時，每日觀察并紀錄細胞病變(CPE)，按Reed-Muench計算TCID5tl，每1. OmL病毒含量須≥IXIO5TCID50O(b)純凈性按《中華人民共和國獸藥典》進行，應(yīng)無細菌、霉菌、支原體及外源病
毒污染。(c)特異性將收獲的病毒液用DMEM液體培養(yǎng)基稀釋為103TCID5(1/mL，與等量抗 PRV家兔免疫血清等量混合，經(jīng)37°C感作一小時后分別接種于豬腎(PK)、兔腎(RK)等株化 細胞經(jīng)培養(yǎng)5日，須無細胞變性效應(yīng)，并經(jīng)次代同源細胞繼代培養(yǎng)7日，也須無細胞變性效 應(yīng)，并分別以天竺鼠、鵝及雞的紅血球進行吸附試驗，均須呈陰性反應(yīng)。(5)經(jīng)檢驗合格的病毒含量彡1 X IO5 TCID5tZmL豬偽狂犬病gI_/TK_雙基因缺損株 (LCM株)病毒抗原原液經(jīng)過離心純化后，以50% (體積比)乳糖作為凍干保護劑，充分搖 勻后凍結(jié)真空干燥，并定量分裝，加蓋密封后儲存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗 編號為 PR-T1、PR-T2、PR-T3。成品檢驗按《中華人民共和國獸藥典》進行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定，對施打動物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX105TCID5(l/mL。無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄15頁進行檢 驗，應(yīng)無細菌生長。2. 1. 3 結(jié)果病毒含量豬偽狂犬病gl7TK_雙基因缺損株(LCM株)病毒接種BHK細胞后，收 獲病毒液，共3批，分別測定病毒含量，每ImL病毒含量分別為10715TCID5(i、107 2°TCID5(i、 IO7.35TCID50O疫苗性狀試驗結(jié)果見表2-1。表2-1三批疫苗性狀試驗結(jié)果 無菌試驗為陰性，結(jié)果見表2-2。表2-2三批疫苗無菌試驗結(jié)果 每批疫苗抽10只樣品溶解后進行試驗。BHI 腦心抽出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth)接種檢體后，經(jīng)37°C培 養(yǎng)1周。PPLO Agar 支原體固體培養(yǎng)基。檢體先接種于Friis液體培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1周取培養(yǎng)液移至PPLO Agar,于5% CO2條 件下繼續(xù)培養(yǎng)1周，然后以顯微鏡檢查是否有支原體菌落生成。特異性試驗無其它病毒污染，結(jié)果見表2-3。表2-3三 CPE 細胞病變2. 2本發(fā)明制得的豬偽狂犬病活毒疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗2. 2. 1 材料(1)疫苗豬偽狂犬病活毒疫苗(以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號 PR-T1、PR-T2、PR-T3。豬偽狂犬病活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號PR-RB1。(2)實驗動物1月齡斷奶仔豬、易感后備母豬，I3R疾病抗體均為陰性(血清中和 價彡1 2)。(3)病毒豬偽狂犬病毒(PRV) TNL強毒株。2. 2. 2 方法(1)安全性試驗a.對仔豬的安全性試驗取1月齡I3R病毒抗體陰性(血清中和抗體彡1 2)斷奶 仔豬16頭，隨機分為4組，各組分別注射PR-ΤΙ、PR-T2、PR-T3批和PR-RBl疫苗，每頭均肌 肉注射疫苗4ml，連續(xù)觀察21日，同時測溫、觀察采食、呼吸等情況。b.后備母豬的安全性試驗取后備母豬8頭，配種前4周分別肌肉接種 PRV(LCM)-gl7TK_疫苗(批號=PR-Tl)和PR-RBl疫苗各4頭，8ml/頭。免疫后測溫，每日 作常規(guī)臨床觀察。配種懷孕后觀察是否發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障礙， 連續(xù)觀察至分娩。(2)抗體檢測與攻毒保護試驗取1月齡ra病毒抗體陰性(血清中和抗體 2)易感仔豬20頭，隨機分為5組，每組4頭，1、2、3組分別各肌肉注射PR-T1、PR-T2、
PR-T3三批PRV (LCM)-gl7TK_疫苗2ml/頭，4組肌肉注射PR-RBl疫苗2ml/頭，5組作為負 對照，21日后采血分離血清測定中和抗體效價，同時每頭豬滴鼻105_°TCID5Q2ml的PRV(TNL 強毒)病毒，連續(xù)觀察14日，測量并觀察仔豬臨床表現(xiàn)。2. 2. 3 結(jié)果(1)安全性試驗1月齡斷奶仔豬分別注射免疫4ml的疫苗(PR-T1、PR_T2、PR_T3) ,PR-RBl疫苗后， 仔豬無體溫升高，采食、精神狀況及生長發(fā)育情況均正常，試驗仔豬均存活。后備母豬免疫 8ml的疫苗(PR-Tl)和PR-RBl疫苗后，均無體溫變化，食欲正常。正常配種后，未發(fā)生目標病 征。結(jié)果表明，三批實驗疫苗和PR-RB疫苗對靶動物超劑量接種是安全的。結(jié)果見表2-4。表2-4疫苗安全性試驗結(jié)果
9 (2)抗體檢測與攻毒保護試驗以中和試驗方法檢測疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是PR-T1、PR_T2、 PR-T3疫苗還是PR-RBl疫苗免疫后抗體均在1 16以上，攻毒后均4/4保護，對照4/4發(fā) 病，結(jié)果見表2-5。表2-5疫苗免疫效力試驗結(jié)果 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)BHK細胞 系，以增殖豬偽狂犬病病毒，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表2-6所示。 表2-6不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖豬偽狂犬病病毒的產(chǎn)量比較 上述對比試驗結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的豬偽狂犬病疫 苗與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對易感仔豬和后備母豬均具有良好的安全性及免疫效果，且以本 發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬偽狂犬病疫苗的產(chǎn)量，遠大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn) 疫苗的產(chǎn)量。實施例33. 1日本腦炎活毒疫苗的制作3. 1.1病毒與細胞株用來制作日本腦炎活毒疫苗的病毒是“at”株，該病毒株是采自受日本腦炎感染的 豬只，以倉鼠腎細胞(hamster kidney cell,HK cell)經(jīng)過傳代220代，成為弱毒株。經(jīng)過 致病性測試，結(jié)果顯示該弱毒株病毒不具有致病性后，才可用來制作日本腦炎活毒疫苗。并 且使用對該病毒株具有良好的感受性的細胞系(本實施例選用倉鼠腎細胞(HK)；其它細胞 如豬腎細胞(PK)與非洲綠猴腎細胞(VERO)也對日本腦炎病毒有良好的感受性)，作為制 苗用細胞系，通過感染并大量繁殖日本腦炎病毒。3. 1.2 方法(1)將制苗用HK細胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為10% 的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU青霉 素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時，使上述細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細胞長滿整個微載體， 更換新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為10%的犢牛血清，準備接種病毒；(4)將日本腦炎弱毒株(JEV- "at"strain)病毒以MEM液體培養(yǎng)基(含體積百分 比為10%的犢牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 005M. 0. I.)，接種于上述細胞上， 置于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細胞足夠 的養(yǎng)分及氣體；每隔3 5天收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進行毒種鑒定以確 認合乎各項標準；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、10_83個稀釋度，每個稀釋度分別接種HK細胞4瓶，在36 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 120小時，每日觀察并紀錄細胞病變(CPE)，按Reed-Muench計算TCID5tl，每1. OmL病毒含量 須彡 IX IO5TCID50。(b)純凈性應(yīng)無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(c)特異性將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基稀釋為200pfu/mL，加入等量中和 抗體價為IO4以上(以噬斑法測定)的抗豬瘟病毒家兔免疫血清，經(jīng)37°C感作1. 5小時后 接種于倉鼠腎細胞(HK)經(jīng)培養(yǎng)5日，須無細胞變性效應(yīng)，并經(jīng)次代同源細胞繼代培養(yǎng)7日， 也須無細胞變性效應(yīng)，并分別以天竺鼠、鵝及雞的紅血球進行吸附試驗，均須呈陰性反應(yīng)。(5)經(jīng)檢驗合格的病毒含量彡IX IO5TCID5ciAiL日本腦炎弱毒株病毒抗原原液 經(jīng)過離心純化后，以50 % (體積比)乳糖作為凍干保護劑，并加入5μ g/ml卡那霉素 (kanamycin)、5IU/mL青霉素(Penicillin)，充分搖勻后凍結(jié)真空干燥，并定量分裝，加蓋 密封后儲存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗編號為JE-TO1、JE-T02、JE-T03。成品檢驗按《中華人民共和國藥典》及《中華人民共和國獸藥典》進行檢驗，應(yīng)符 合規(guī)定，對施打動物安全無副作用。疫苗病毒含量> lX105TCID5(1/mL。無菌檢驗按《中國 獸藥典》附錄15頁進行檢驗，應(yīng)無細菌生長。3. 1.3 結(jié)果病毒含量日本腦炎弱毒株病毒接種HK細胞后，收獲病毒液，共3批，分別測定病 毒含量及疫苗性狀，試驗結(jié)果見表3-1。表3-1三批疫苗性狀試驗結(jié)果 無菌試驗為陰性，結(jié)果見表3-2。表3-2三批疫苗無菌試驗結(jié)果 HK:倉鼠腎細胞CPE:細胞病變3.2本發(fā)明制得的日本腦炎活毒疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗3. 2.1 材料(1)疫苗日本腦炎活毒疫苗(以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號: JE-TO 1、JE-T02、JE-T03。豬溫活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號JE_RB01。(2)實驗動物4周齡斷奶仔豬，體重為2 3kg，日本腦炎抗體均為陰性(血清中 和價彡0. 9)。 每批疫苗抽10只樣品溶解后進行試驗。BHI 腦心抽出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth)接種檢體后，經(jīng)37°C培 養(yǎng)1周。PPLO Agar 支原體固體培養(yǎng)基。檢體先接種于Friis液體培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1周取培養(yǎng)液移至PPLO Agar，于5% CO2條 件下繼續(xù)培養(yǎng)1周，然后以顯微鏡檢查是否有支原體菌落生成。特異性試驗無其它病毒污染，結(jié)果見表3-3。表3-3三批疫苗特異性試驗結(jié)果
對照
陰性
性
mM Rr
13
3. 2. 2 方法(1)安全性試驗取4周齡日本腦炎病毒抗體陰性(血清中和抗體< 0. 9)斷奶仔豬8頭，隨機分為 4組，各組分別注射JE-T01、JE-T02、JE-T03批和JE-RBOl疫苗，每頭均肌肉注射建議劑量 疫苗(2mL)，連續(xù)觀察14日，同時測體重、觀察采食、神經(jīng)學上的癥狀等情況。(2)抗體檢測試驗取4周齡日本腦炎病毒抗體陰性(血清中和抗體彡1 10)易感仔豬10頭，隨機 分為5組，每組2頭，第1、2、3組分別各肌肉注射1倍劑量的JE-TO 1、JE-T02、JE-T03疫苗， 第4組肌肉注射1倍劑量的JE-RBOl疫苗，第5組不注射任何疫苗，以作為負對照；免疫14 日后采血分離血清，以測定中和(NT)抗體力價與血凝抑制(HI)抗體力價。3. 2. 3 結(jié)果(1)安全性試驗4周齡斷奶仔豬分別注射免疫建議劑量的疫苗(JE-T01、JE-T02、JE-T03)、 JE-RBOl疫苗后，仔豬無體溫升高，采食、精神狀況及生長發(fā)育情況均正常，試驗仔豬均存 活。結(jié)果表明，三批實驗疫苗和JE-RBOl疫苗對靶動物超劑量接種是安全的。結(jié)果見表3-4。表3-4疫苗安全性試驗結(jié)果 (2)抗體檢測試驗以中和試驗方法檢測疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是JE-T01、 JE-T02、JE-T03疫苗還是JE-RBOl疫苗免疫后抗體力價均在1 20以上，結(jié)果見表3-5。表3-5疫苗免疫效力試驗結(jié)果
免疫前 免疫14天 免疫前 免疫14天 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)HK細胞系， 以增殖日本腦炎病毒，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表3-6所示。表3-6不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖日本腦炎病毒的產(chǎn)量比較 上述對比試驗結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的日本腦炎疫苗 與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對易感仔豬均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載 體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)日本腦炎疫苗的產(chǎn)量，遠大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。實施例44. 1牛流行熱滅活疫苗的制作4. 1.1病毒與細胞株以牛流行熱病毒強毒株(bovine ephemeral fever virus，BEFV，例如Tn73 或 Τη88128株)制作牛流行熱滅活疫苗，并且使用對該病毒株具有良好的感受性的細胞系(本 實施例選用倉鼠幼鼠腎細胞BHK)，作為制苗用細胞系，通過感染并大量繁殖牛流行熱病毒。4. 1.2 方法
(1)將制苗用BHK細胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為7% 的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU青霉 素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時，使上述細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附 在微載體上；(3)于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上生長約2 5天，直到細胞長滿整個微載體， 更換新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準備接種病毒；(4)將牛流行熱病毒強毒株(Tn88128株)以MEM液體培養(yǎng)基(含2%犢牛血清) 制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 05M. 0. I.)，接種于上述細胞上，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán) 境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細胞足夠的養(yǎng)分及氣體；每隔3 5 天收獲病毒液，置于4°C保存；收獲的病毒液進行毒種鑒定以確認合乎各項標準；毒種鑒定(a)病毒含量將收獲的病毒液用MEM液體培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10_6、10_7、 10_83個稀釋度，每個稀釋度分別接種BHK細胞4瓶，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 120小時，每日觀察并紀錄細胞病變(CPE)，按Reed-Muench計算TCID5tl，每1. OmL病毒含量 須彡 IX IO6TCID50。(b)純凈性按《中華人民共和國獸藥典》進行，應(yīng)無細菌、霉菌、支原體及外源病
^fe ο(5)經(jīng)檢驗合格的病毒含量彡IX 106TCID5(1/mL牛流行熱病毒抗原原液經(jīng)過離心 純化后，以2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)將病毒滅活后，經(jīng)雙相乳化(水包油包 水)制成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲存于2 8°C得到成品。將制成的3批疫苗 編號為 BEF-TO1、BEF-T02、BEF-T03。成品檢驗按《中華人民共和國獸藥典》進行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定，對施打動物安全無 副作用。疫苗病毒含量> lX106TCID5(l/mL。無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄15頁進行檢驗， 應(yīng)無細菌生長。4. 1.3 結(jié)果病毒含量牛流行熱病毒病毒接種BHK細胞后，收獲病毒液，共3批，分別測定病毒 含量，每 ImL 病毒含量分別為 1 X ΙΟ8'2TCID50,1 X IO8' 5TCID50,1 X IO8' 35TCID500無菌檢驗按2000年獸用生物制品規(guī)程附錄445頁進行，三批產(chǎn)品均無菌生長。4. 2本發(fā)明制得的牛流行熱滅活疫苗與同類產(chǎn)品的比較試驗4. 2.1 材料(1)疫苗牛流行熱滅活疫苗(以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)制得)3批，批號 BEF-TO1、BEF-T02、BEF-T03。豬溫活毒疫苗(以轉(zhuǎn)瓶自動培養(yǎng)系統(tǒng)制得)1批，批號 BEF-RBO1。(2)實驗動物6月齡仔牛，牛流行熱病毒抗體均為陰性(血清中和價< 1 10)。4. 2. 2 方法抗體檢測與攻毒保護試驗取6月齡仔牛10頭，牛流行熱病毒抗體呈陰性(血清中和抗體 10)，隨機分為5組，每組2頭，第1、2、3組分別各肌肉注射1倍劑量的 BEF-TOU BEF-T02、BEF-T03疫苗，第4組肌肉注射1倍劑量的BEF-RBOl疫苗，第5組不注 射任何疫苗，以作為負對照；免疫8周后采血分離血清，以測定中和抗體力價。4. 2. 3 結(jié)果以中和試驗方法檢測疫苗免疫后的血清中和抗體，結(jié)果表明無論是BEF-T01、 BEF-T02、BEF-T03疫苗還是BEF-RBOl疫苗免疫后抗體力價均在1 32以上，結(jié)果見表4_1。表4-1疫苗免疫效力試驗結(jié)果 比較以本發(fā)明“懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)BHK細胞 系，以增殖牛流行熱病毒，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表4-2所示。表4-2不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖牛流行熱病毒的產(chǎn)量比較 上述對比試驗結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的牛流行熱疫苗 與現(xiàn)有方法生產(chǎn)的疫苗對易感仔牛均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發(fā)明懸浮微載 體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)牛流行熱疫苗的產(chǎn)量，遠大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。實施例5狂犬病滅活疫苗的制作5.1病毒與細胞株
以狂犬病病毒強毒株(Rabies virus, RV，例如CTN_1或aGV株)制作狂犬病滅 活疫苗，并且使用對該病毒株具有良好的感受性的細胞系(本實施例選用非洲綠猴腎細胞 VER0)，作為制苗用細胞系，通過感染并大量繁殖狂犬病病毒。5. 2 方法(1)將制苗用VERO細胞接種到MEM液體培養(yǎng)基(GIBC0公司，內(nèi)含體積百分比為 7%的犢牛血清、0. OlM NaHC03、0. lmg/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100，000IU 青霉素G鈉鹽(Penicillin G Sodium))與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，利用溫和攪拌，或抽、放真空方式使液體培養(yǎng)基 液面在培養(yǎng)罐內(nèi)小幅度升降，作用約2小時，使上述細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附 在微載體上；(3)于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供上述細 胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上生長約7天，直到細胞長滿整個微載體，更換 新的MEM培養(yǎng)液并加入體積百分比為2%的犢牛血清，準備接種病毒；(4)將狂犬病病毒強毒株(aGV株)以MEM液體培養(yǎng)基(含體積百分比為2%的犢 牛血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為0. 05M. 0. I.)，接種于上述細胞上，置于36°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，同樣利用攪拌或抽、放真空的方式，提供細胞足夠的養(yǎng)分及氣體； 于接種第4天收獲第1次病毒液，并加入新的MEM培養(yǎng)液(含體積百分比為2%的犢牛血 清)，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天連續(xù)收獲病毒液；收獲的病毒液置于4°C保存，并進行毒種鑒定以 確認合乎各項標準，應(yīng)無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染，并測定病毒液滴度，每LOmL 病毒含量須彡5. 51g LD5tlAil ；(5)經(jīng)檢驗合格的病毒含量彡5. 51g LD5tlAil的狂犬病病毒抗原原液經(jīng)過離心純 化后，以甲醛或2-溴乙胺(BEI)將病毒滅活后，經(jīng)氫氧化鋁佐劑或以乳化(水包油，w/o)或 雙相乳化(水包油包水，w/o/w)制成油質(zhì)疫苗，并定量分裝，加蓋密封后儲存于2 8°C得 到成品。成品檢驗應(yīng)符合規(guī)定，對施打動物安全無副作用。疫苗病毒含量>5.51g LD50/ ml，且應(yīng)無細菌生長。5. 3 結(jié)果病毒含量狂犬病病毒接種VERO細胞后，連續(xù)收獲病毒液，共重復2次試驗，分別 測定病毒含量，每ImL病毒含量分別如表5-1所示。表5-1病毒收獲量
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無菌檢驗三批產(chǎn)品均無菌生長。比較以本發(fā)明“懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)”與現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)VERO細胞 系，以增殖狂犬病病毒，兩系統(tǒng)細胞培養(yǎng)的病毒產(chǎn)量如表5-2所示。表5-2不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖狂犬病病毒的產(chǎn)量比較 上述對比試驗結(jié)果可知，以本發(fā)明懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)狂犬病疫苗的產(chǎn) 量，遠大于現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗的產(chǎn)量。雖然已經(jīng)就特別具體實例及應(yīng)用說明過本發(fā)明，不過諳于此技者，從本揭示可以 產(chǎn)生附加的具體實例，及修改而不違離所主張的本發(fā)明旨意或超過本發(fā)明所主張的范圍。 因此，要了解本文的圖式及說明部份是僅提出作為例子以幫助本發(fā)明的理解且不應(yīng)該視為 要限制其范圍。上列詳細說明是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，該實施例并非用以限制本 發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本案的專利范圍中。
權(quán)利要求
以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在于包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；(3)在適當溫度下，提供上述細胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；于一定時間或一段時間連續(xù)收獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；(5)將上述收獲的病毒液純化后，加入適當?shù)膬龈杀Ｗo劑，充分混勻后定量分裝，即得到所需的活毒疫苗。
2.以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在于包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；(3)在適當溫度下，提供上述細胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用的病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；于一定時間或一 段時間連續(xù)收獲病毒液，并且更換培養(yǎng)基；(5)將上述收獲的病毒液純化后，以滅活劑進行滅活，并加入適當?shù)淖魟?，充分混勻?定量分裝，即得到所需的滅活疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的微載體為玻璃圓珠、聚酯纖維圓片、或聚酯纖維平板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細胞為狗腎細胞，(4)步驟中的病毒為禽流感病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于⑴步驟中的細胞為倉鼠幼鼠腎細胞、兔腎細胞或非洲綠猴腎細胞，⑷步驟中的病毒 為豬偽狂犬病病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細胞為豬腎細胞、倉鼠腎細胞或非洲綠猴腎細胞，⑷步驟中的病毒為日 本腦炎病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細胞為倉鼠幼鼠腎細胞，(4)步驟中的病毒為牛流行熱病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(1)步驟中的細胞為非洲綠猴腎細胞，(4)步驟中的病毒為狂犬病病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(3)步驟是以攪拌通氣方式使細胞獲得氣體交換。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(3)步驟是以培養(yǎng)液液面升降方式，以提供細胞足夠的養(yǎng)分及氣體交換。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制疫苗的方法，其特征在 于(4)步驟是以1至5天為時間單位收獲1次病毒液，并連續(xù)收獲病毒液。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法制備的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以懸浮微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)制的疫苗及其方法，包括如下技術(shù)步驟(1)將制苗用細胞接種到含有培養(yǎng)基與微載體的培養(yǎng)罐內(nèi)；(2)將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；(3)在適當溫度下，提供上述細胞足夠的養(yǎng)分及氣體，使細胞在上述微載體上繼續(xù)生長；(4)將制苗用病毒制成病毒懸浮液，接種于上述細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔1～3日收獲病毒液或含有病毒的細胞，并且更換培養(yǎng)液；(5)將上述收獲的病毒液純化后，視需要進行滅活，滅活后的病毒液加入適當佐劑，不經(jīng)滅活的病毒液則加入適當?shù)膬龈杀Ｗo劑，充分混勻后定量分裝，即得到所需的疫苗。該方法生產(chǎn)工藝簡單、可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號A61K39/12GK101869702SQ20091013782
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者郭村勇, 陳旭中 申請人:福又達生物科技股份有限公司