專利名稱：高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干擾素a 2b注射液制劑及其生產(chǎn)工藝，具體說是一種高濃度低 裝量重組人干擾素a 2b注射液制劑，成品濃度達(dá)1000萬IU/ml，比活性可達(dá)到2. 9X108IU/ mg蛋白，內(nèi)毒素小于0. 25EU/1000萬IU，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，宿主菌殘留蛋 白量低，不高于0. 001%。
背景技術(shù)：
干擾素是目前應(yīng)用非常廣泛且臨床效果顯著的治療類生物藥物，具有廣譜抗病 毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能，在臨床治療中有不可取代的地位?，F(xiàn)在國內(nèi)的注射用干擾素一 般有兩種一種是干擾素注射液，即液體干擾素；一種是凍干干擾素，即固體干擾素。絕大 多數(shù)的單劑活性含量最高在500-600萬IU之間，這兩種干擾素的最終使用裝量都是1ml。伴隨著藥物制劑學(xué)和生物藥劑學(xué)的發(fā)展，以及新制劑技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng) 用，干擾素成為生物制藥中劑型種類最多的一個(gè)。隨著對(duì)干擾素作用機(jī)理及其臨床應(yīng)用的 深入研究，干擾素的治療范圍和使用形式有了較大發(fā)展和突破，對(duì)劑型的要求也越來越高 了，但是目前現(xiàn)有的注射劑型尚不能滿足臨床的需要。原因是絕大多數(shù)的注射劑單劑活性 含量最高在500-600萬IU，最終使用裝量都是lml。而在實(shí)際的臨床治療中有相當(dāng)部分患者 對(duì)注射劑型有特殊要求，比如慢性病患者需要長(zhǎng)期注射的，最好能有小體積的液體干擾素 自行注射，而且最好是單劑給藥，這樣購買，保存，使用，及使用后處理都很方便，造價(jià)也低； 另外一些新的適應(yīng)癥如新生兒血管瘤，Peyronie, s病等，還有實(shí)體瘤都需要在病灶局部注 射一定量的干擾素才能達(dá)到治療目的，為此需要有高濃度小體積的干擾素；再有就是目前 提倡個(gè)性化治療和單劑給藥，雖然市售干擾素有注射筆，但是無法單劑給藥，針頭太短不利 于局部注射，價(jià)格昂貴，另外反復(fù)使用保存也不方便。綜上所述目前臨床需要低裝量高濃度，且高純度高穩(wěn)定性低副反應(yīng)的液體干擾 素。而現(xiàn)有干擾素的工藝如果要縮小裝量提高濃度則內(nèi)毒素和副反應(yīng)也會(huì)加大，這是一個(gè) 普遍的矛盾，另外保持高活性，穩(wěn)定性也是一個(gè)難題。針對(duì)這種情況我們通過改良菌種提 高目的蛋白表達(dá)量和活性，比活性可以達(dá)到2. 9X108IU/mg，合理組合純化系統(tǒng)提高收率，增 加監(jiān)控環(huán)節(jié)保證高純度，應(yīng)用獨(dú)特的穩(wěn)定劑系統(tǒng)等措施研制了高濃度，高純度，高生物學(xué)活 性，高穩(wěn)定性，低裝量，低副反應(yīng)的干擾素液體制劑，并將其分裝在管制抗生素瓶或者預(yù)充 式注射器中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高濃度低裝量重組人干擾素a 2b注射液制劑，成品終濃度為 1000萬IU/ml，純度大于98%，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，比活性可達(dá)2. 9X108IU/ mg 蛋白，規(guī)格有 0. 3ml (300 萬 IU)，0. 5ml (500 萬 IU)，0. 6ml (600 萬 IU)，1. 0ml (1000 萬 IU) 等，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)高于藥典(10EU/300萬單位)，低于0. 25EU/1000萬單位，副反應(yīng)低于國內(nèi)同 類產(chǎn)品，穩(wěn)定性達(dá)36個(gè)月以上。
本發(fā)明中的干擾素是以攜帶干擾素a 2b基因的質(zhì)粒pADUA-4轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿 菌K-12LE392經(jīng)發(fā)酵表達(dá)。本發(fā)明是以高壓勻質(zhì)機(jī)為破碎系統(tǒng)，能達(dá)到破碎完全，包涵體回收充分，高回收率 保證了純化效果，適于工業(yè)化生產(chǎn)的目的。本發(fā)明是以色譜層析為純化系統(tǒng)，并在純化中使用反相高效液相和觸手型離子 色譜柱保證高純度產(chǎn)品，外源DNA殘留小于lng/1000萬IU，宿主菌殘留蛋白量低，不高于 0. 001%。本發(fā)明應(yīng)用反相高效液相監(jiān)控干擾素注射液的純度，純度控制在98%以上，如此 才可以提高成品濃度而副反應(yīng)低，并有良好的穩(wěn)定性。本發(fā)明中的干擾素注射液是以一種以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩(wěn)定劑系統(tǒng)，此 穩(wěn)定劑系統(tǒng)可以保持不含人血白蛋白的液態(tài)重組人干擾素a 2b穩(wěn)定性在36個(gè)月以上。本發(fā)明中的干擾素注射液可以裝在管制抗生素瓶中，也可以裝在預(yù)充式注射器 中，有利于醫(yī)生根據(jù)具體情況使用，也可以使需要長(zhǎng)期注射的患者自行注射，利于保存和單 劑給藥。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)工藝，適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下1、工程菌種PADUA-4/K_12LE392，為古巴工藝菌種，由攜帶干擾素a 2b基因的質(zhì) 粒pADUA-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12LE392構(gòu)建的工程菌經(jīng)發(fā)酵后，目的蛋白表達(dá)量達(dá)30%以上， 經(jīng)過復(fù)性及后續(xù)的純化工藝后純度高，無聚合體存在，比活性可以達(dá)到2. 9X108IU/mg蛋白， 穩(wěn)定性好。這是要做到高濃度低裝量高純度重組人干擾素很關(guān)鍵的一個(gè)技術(shù)點(diǎn)。2、包涵體提取采用高壓勻質(zhì)機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分階段連續(xù)破碎，離心回收包涵體。3、純化通過一系列色譜層析提純，得到重組人干擾素a 2b原液，并使最終外源 DNA殘留小于lng/1000萬IU (藥典10ng/劑)，宿主菌殘留蛋白不高于0. 001 % (藥典不 高于總蛋白量的0. 1% ) 3、純度監(jiān)控原液以RP-HPLC檢測(cè)監(jiān)控，要求純度大于98%。4、穩(wěn)定劑以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩(wěn)定劑系統(tǒng)，兩種組分的濃度比例約為 50 1，此穩(wěn)定劑系統(tǒng)可以保證液體干擾素的穩(wěn)定性在36月以上。5、緩沖液以磷酸鹽做為緩沖液。6、分裝容器可以是管制抗生素瓶和預(yù)充式注射器兩種。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)1、為液體干擾素的一種，除了有一般液體干擾素的特點(diǎn)外，還具有濃度高，裝量 低，純度高，副反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)。2、濃度高，裝量低，給藥方便，疼痛感小，順應(yīng)性好。分裝在預(yù)充式注射器中，慢性 丙型肝炎患者可以腹部皮下每日自行注射0. 3ml (300萬IU)，痛感輕微且不會(huì)因?yàn)樗幬矬w 積大而外泄或腫脹；實(shí)體瘤患者在瘤周注射1000萬IU的干擾素，其他產(chǎn)品需注射2ml，這 在臨床很難實(shí)現(xiàn)，而本產(chǎn)品只有1ml，可以滿足臨床需要；新生兒血管瘤患者，可以采取瘤 內(nèi)注射的方式，在病灶部位每3天注射600萬IU干擾素，新生兒個(gè)體小，而現(xiàn)有產(chǎn)品要大于 1.2ml,不適用在新生」L和局部注射，本發(fā)明產(chǎn)品僅0. 6ml，解決了此矛盾。3、純度高，本發(fā)明對(duì)純度的要求為大于98%，高于國家規(guī)定的95%。4、比活性高，
4本發(fā)明在經(jīng)過一系列純化后，比活性可達(dá)到2. 9X108IU/mg蛋白，遠(yuǎn)高于同類產(chǎn)品。5、外源DNA殘留低，小于lng/1000萬IU，生物安全性更高。6、宿主菌殘留蛋白量低，不高于0.001% (藥典不高于總蛋白量的0. 1%)，生物
安全性更高。7、穩(wěn)定性好，本發(fā)明中以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩(wěn)定劑系統(tǒng)，可以保證液體 干擾素的穩(wěn)定性在36月以上。8、副反應(yīng)小，此點(diǎn)為區(qū)別于國內(nèi)同類產(chǎn)品的一大特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例10. 6ml (600萬IU)重組人干擾素a 2b注射液1、發(fā)酵培養(yǎng)、包涵體提取采用搖床培養(yǎng)的方式擴(kuò)增種子液，發(fā)酵培養(yǎng)基以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的綜合培養(yǎng)基， 當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)率和目的蛋白的合成量達(dá)到高峰時(shí)采用低溫離心法收集菌體。采用高壓勻質(zhì)機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，破碎率可達(dá)到100%。2、包涵體溶解及復(fù)性用變性液(Tris，NaCl，鹽酸胍)溶解包含體，加入還原劑，在2_6°C將變性液緩慢 地連續(xù)加入到復(fù)性緩沖液(TriS，NaCl，CUS04)中，復(fù)性過夜，蛋白復(fù)性液分別使用深度濾器 和筒式濾器進(jìn)行澄清過濾。3、層析純化回收目的蛋白，并且濃縮，樣品的比活性可達(dá)2. 9X108IU/mg蛋白，外源DNA殘留小 于lng/1000萬IU，然后經(jīng)0. 2 y m纖維素膜過濾后分裝后保存于_70°C冰箱。4、管制抗生素瓶分裝本品稀釋合并后，每支管制抗生素瓶中分裝0. 6ml本品。2_8攝氏度保存。5、使用時(shí)，從2-8攝氏度保存狀態(tài)下取出，用注射器吸取，注射使用。實(shí)施例2預(yù)充式0. 6ml (600萬IU)重組人干擾素a 2b注射液1、發(fā)酵培養(yǎng)、包涵體提取采用搖床培養(yǎng)的方式擴(kuò)增種子液發(fā)酵，培養(yǎng)基以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的綜合培養(yǎng)基， 當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)率和目的蛋白的合成量達(dá)到高峰時(shí)采用低溫離心法收集菌體。采用高壓勻質(zhì)機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，破碎率可達(dá)到100%。2、包涵體溶解及復(fù)性用變性液(Tris，NaCl，鹽酸胍)溶解包含體，加入還原劑，在2_6°C將變性液緩慢 地連續(xù)加入到復(fù)性緩沖液(TriS，NaCl，CUS04)中，復(fù)性過夜，蛋白復(fù)性液分別使用深度濾器 和筒式濾器進(jìn)行澄清過濾。3、層析純化回收目的蛋白，并且濃縮，樣品的比活性可達(dá)2. 9X108IU/mg蛋白，外源DNA殘留小 于lng/1000萬IU，然后經(jīng)0. 2 y m纖維素膜過濾后分裝后保存于_70°C冰箱。4、預(yù)充式注射器分裝本品稀釋合并后，每支預(yù)充式注射器中分裝0.6ml本品，2-8攝氏度保存，使用時(shí)，打開 包裝即可注射使用。
權(quán)利要求
一種高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液及其制備方法。其特征在于，由攜帶干擾素α2b基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵表達(dá)，提取包涵體，再經(jīng)過系列層析提純，以RP-HPLC檢測(cè)并監(jiān)控純度，得到重組人干擾素α2b原液，以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩(wěn)定劑系統(tǒng)，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，稀釋合并，分裝于容器中，成品終濃度為1000萬IU/ml，規(guī)格有0.3ml(300萬IU)，0.5ml(500萬IU)，0.6ml(600萬IU)，1.0ml(1000萬IU)等，。
2.權(quán)利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于表達(dá)干擾素的工程菌為大腸桿 菌 K-12LE392。
3.權(quán)利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于攜帶干擾素α 2b基因的是質(zhì) 粒為 pADUA-4。
4.權(quán)利要求3的質(zhì)粒，其特征在于質(zhì)粒帶有色氨酸啟動(dòng)子，質(zhì)粒大小3.50Kb。
5.權(quán)利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于提取采用高壓勻質(zhì)機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行破碎。
6.權(quán)利要求1的重組α2b人干擾素注射液，其特征在于以RP-HPLC檢測(cè)并控制純度。
7.權(quán)利要求1的重組人干擾素α2b注射液，其特征在于原液純度大于98%。
8.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于以苯甲醇-聚山梨醇酯80做 為穩(wěn)定劑系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求8的穩(wěn)定劑系統(tǒng)，其特征在于苯甲醇的濃度為5-12mg/ml。
10.權(quán)利要求8的穩(wěn)定劑系統(tǒng)，其特征在于聚山梨醇酯80的濃度為0.01mg/ml-0. 2mg/ml ο
11.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于所述pH值為7. 00-7. 60。
12.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝后的成品終濃度為1000 萬 IU/ml。
13.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的比活性可達(dá)到 2. 9X108IU/mg 蛋白。
14.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的外源DNA殘留小于 lng/1000 萬 IU0
15.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品的宿主菌殘留蛋白不高 于 0. 001%。
16.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝容器是管制抗生素瓶。
17.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于分裝容器是預(yù)充式注射器。
18.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品內(nèi)毒素含量低于 0.25EU/1000 萬 IU0
19.權(quán)利要求1的重組人干擾素a2b注射液，其特征在于成品規(guī)格有0.3ml (300萬 IU)，0. 5ml (500 萬 IU)，0. 6ml (600 萬 IU)，1. Oml (1000 萬 IU)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高濃度低裝量重組人干擾素α2b注射液及其制備方法。其特征在于，由攜帶干擾素α2b基因的質(zhì)粒pADUA-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12LE392的工程菌經(jīng)發(fā)酵表達(dá)，再經(jīng)過提取及一系列層析提純，以RP-HPLC檢測(cè)并控制純度，得到重組人干擾素α2b原液，以苯甲醇-聚山梨醇酯80做為穩(wěn)定劑系統(tǒng)，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，稀釋合并，分裝于容器中，成品終濃度為1000萬IU/ml，規(guī)格有0.3ml(300萬IU)，0.5ml(500萬IU)，0.6ml(600萬IU)，1.0ml(1000萬IU)等。本發(fā)明產(chǎn)品具有高純度高穩(wěn)定性，副反應(yīng)小的特點(diǎn)，裝量體積小更有利于大劑量或皮下或病灶局部注射，為臨床應(yīng)用尤其是一些特殊疾病或慢性需長(zhǎng)期注射干擾素患者的治療提供了多種給藥方式及達(dá)到更佳藥效的可能。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101843896SQ20091013250
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者郭德本 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春海伯爾生物技術(shù)有限責(zé)任公司