專利名稱：一種治療腫瘤的藥物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性和代謝穩(wěn)定性的含有血管內(nèi)皮抑制素的 復(fù)合物和緩釋制劑以及它的制備方法'本發(fā)明還提供含有這種血管內(nèi)皮抑 制素復(fù)合物和緩釋制劑的藥物組合物以及含有這種血管內(nèi)皮抑制素復(fù)合物 的試劑盒。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明中的血管內(nèi)皮抑制素復(fù)合物、緩釋制 劑、藥物紐合和試劑盒來(lái)預(yù)防、診斷、治療肝瘤，及制備抗腫瘤藥物的方 法。
背景技術(shù)：
新生血管形成是指新的毛細(xì)血管在原有的血管上的生成。腫瘤的生長(zhǎng)和 遷移依賴于新生血管的生成，將腫瘤中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為癌癥治療的 靶點(diǎn)為治療腫瘤提供了 一種治療方式(Folkman J. N Engl J Med 1971; 285:182-186)。
血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)是膠原XVDI羧基端的一段分子量大小為20 kDa的酶切產(chǎn)物。1997年美國(guó)哈佛大學(xué)Judah Fo!kman教授等人在血管內(nèi)皮 瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)此蛋白，它具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，和 體內(nèi)血管生成的活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組血管內(nèi)皮抑制素可以抑制老鼠 體內(nèi)多種胂瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，甚至能完全治愈腫瘤，而且不產(chǎn)生耐藥性。 其發(fā)揮活性的機(jī)理在于它通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制了腫瘤組織 附近的新生血管的生成，使得腫瘤組織得不到生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)和氧 氣，最后停止生長(zhǎng)或壞死(Folkman丄et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。通過(guò)基因工程制備的重組人血管內(nèi)皮抑制 素可以作為腫瘤治療藥物，其臨床試-瞼表明它可以有效的抑制肝瘤生長(zhǎng)。 在中國(guó)，以非小細(xì)胞肺癌為主要適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)表明它對(duì)于腫謝的治療 效果比較突出。
發(fā)明概述多肽和蛋白質(zhì)類藥物相比于化學(xué)藥具有毒副作用小，不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu) 點(diǎn)。為了達(dá)到最高的體內(nèi)活性，提高生物利用度，減少藥物體內(nèi)降解，通 常蛋白藥物采用靜脈給藥方式。但是對(duì)于分子量小的蛋白來(lái)說(shuō)，通常靜脈 給藥以后的體內(nèi)半衰期4艮短。除了體內(nèi)的蛋白降解過(guò)程以外， 一個(gè)重要的 方面是小分子蛋白能夠通過(guò)腎過(guò)濾的途徑從體內(nèi)很快的被消除。在血液中，
水力半徑超過(guò)白蛋白或是分子量大于約66,000道爾頓(66 kDa)的蛋白通 ?？梢苑€(wěn)定的保留在循環(huán)系統(tǒng)中.但是小分子卻會(huì)通過(guò)腎小球過(guò)濾被很快 的從血液中消除。所以，為了維持小分子量蛋白在血液中的有效治療濃度， 需要進(jìn)行頻繁的注射或點(diǎn)滴。這種治療方式雖然能達(dá)到治療的目的，但是 卻給病人帶來(lái)了嚴(yán)重的不便與痛苦，提高了用藥成本，對(duì)某些藥物長(zhǎng)期的 使用還有可能產(chǎn)生一些副作用，例如免疫反應(yīng)。
作為蛋白藥物的血管內(nèi)皮抑制素同樣存在半衰期短，體內(nèi)清除率高的缺 點(diǎn)。目前的臨床用藥手段主要為頻繁的靜脈注射或點(diǎn)滴，通常為每天給藥， 而且需要長(zhǎng)期用藥，這使得病人的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)都比較大。本發(fā)明的目 的就在于改善該蛋白的體內(nèi)代謝特征，使其具有更高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的體 內(nèi)半衰期，甚至具有更高療效，從而達(dá)到可以減少用藥頻率，降低用藥成 本，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的目的。
用高分子聚合物對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，它是改變和控制藥物的動(dòng)力學(xué)特性如 半衰期、免疫學(xué)特征、毒理特性的常用方法。用來(lái)修飾蛋白的高分子聚合 物具有水溶性好、生物相容性好、無(wú)或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇 (polyethyleneglycol, PEG)是應(yīng)用最為普遍的一種蛋白修飾分子。聚乙二醇 分子具有兩親性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多數(shù)的有機(jī)溶劑，具 有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性質(zhì)，是被包括美國(guó)FDA、 中國(guó)SFDA在內(nèi)的很多國(guó)家的藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的可用于藥物制備的高分 子。將蛋白質(zhì)與親水性的高分子如聚乙二醇偶聯(lián)，可增加蛋白穩(wěn)定性、減 少非特異性吸附和抗原性。當(dāng)偶聯(lián)物達(dá)到一定分子量時(shí)，可大大降低腎臟 的排除效率，是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的有效方法(Frokjaer S. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 2005 Apr 4(4): 298-306; Harris JM. et al, Nat. Rev. Drug Discov. 2003 Mar 2(3): 214-21)。最初的聚乙二醇修飾都是以氨基作為反應(yīng)位 點(diǎn)，主要包括蛋白的N端a-氨基和賴氨酸殘基側(cè)鏈上的s-氨基。這一類反 應(yīng)的產(chǎn)物是一個(gè)蛋白分子與一個(gè)或多個(gè)PEG分子偶聯(lián)。對(duì)于賴氨酸殘基側(cè)鏈e-氨基上的修飾也往往因?yàn)榉磻?yīng)位點(diǎn)不特異而產(chǎn)生修飾后的同分異構(gòu)體。 目前，針對(duì)蛋白N端a-氨基和賴氨酸殘基側(cè)鏈e-氨基的等電點(diǎn)差異，又新 開發(fā)出了只針對(duì)蛋白N端修飾的聚乙二醇修"飾試劑，^使得修飾位點(diǎn)一致， 修飾產(chǎn)物組成均一.另一種可用于聚乙二醇修飾的蛋白位點(diǎn)是半胱氨酸的 巰基。由于巰基在蛋白中的數(shù)目通常少于氨基，所以這類修飾的位點(diǎn)更加 特異。利用基因工程技術(shù)，現(xiàn)在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作為特 異的修飾位點(diǎn)。但是此類引入半胱氨酸作為修飾位點(diǎn)也是有一定的局限性， 因?yàn)閷?duì)某些本身帶有半胱氨酸的蛋白可能會(huì)造成二硫鍵的錯(cuò)配或無(wú)法復(fù) 性。另外蛋白的羧基也是一種常用的修飾位點(diǎn)(Veronese FM et al. Drug Discov. Today. 2005 Nov 1;10(21):1451-8.)。聚乙二醇修飾技術(shù)已經(jīng)成功地運(yùn) 用在許多蛋白類藥物上，比較成功的包括PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)(Graham ML Adv. Drug Ddiv. Rev. 55， 1293—1302 Avramis Vassilios I. et al. W09939732 and US6689762)、 PEG-腺酐脫氨酶(PEG-adenosine deaminase)( Levy Y et al. J. Pediatr. 113， 312—317; Davis S et al. ClinExp. Immunol, 46: 649-652; Hershfield MS et al. N Engl J Med 316: 589-596)和PEG-干擾素(PEG-interferon a2a、 PEG-interferon a2b等)(Bailon P et al. C. Bioconjug. Chem. 12， 195—202， Wang YS et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54， 547—570, Meng Xiantai et al. WO2005077421, Van Vlasselaer Peter et al. WO2004076474, Ballon Pascal Sebastian et al. US2004030101, Karasiewicz Robert etal.EP0593868)等等。
其他代表性的高分子修飾劑有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二 酸和丙二酸的共聚物、羧曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚l，3-乙二醇次甲 基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
將血液蛋白或其片段作為載體，與藥用蛋白偶聯(lián)或融合表達(dá)，從而起到 增加蛋白分子量的目的，是另一種延長(zhǎng)藥用半衰期的方法，例如用免疫球 蛋白的Fc片段和目的蛋白偶聯(lián)以延長(zhǎng)其半衰期，例如將此方法用在Notch 1 受體蛋白(Kitajewsky Jan et al. WO2005U1072)、促紅細(xì)胞生成素(EPO) (Gillies Stephen D et al. WO2005063808)、人生長(zhǎng)激素(Kim Young Min et al. WO2005047337)等蛋白上。血漿白蛋白也是一種常用的偶聯(lián)載體，可以運(yùn) 用在抗生素類，消炎類，抗氧化物等蛋白上(EzrinAlanMetal. WO0117568, Otagiri Masaki et al. EP1571212)。
10對(duì)于某些血液栽體蛋白除了在體外將其與藥物蛋白偶聯(lián)在一起外，還可 以先將蛋白藥物在體外進(jìn)行修飾，使之具有化學(xué)反應(yīng)的活性或是對(duì)體內(nèi)其 他分子具有較高的親和力，能夠在進(jìn)入體內(nèi)以后和血液某些成分進(jìn)行反應(yīng)， 形成半衰期較長(zhǎng)的大分子或是復(fù)合物。 一個(gè)實(shí)例是將此技術(shù)運(yùn)用在抗病毒
的小肽分子anti-RSV上，將其修飾上帶有馬來(lái)酰亞胺的活性基團(tuán)，它可以 和血液蛋白或是細(xì)月包表面蛋白中的巰基反應(yīng)(Bridon Dominique P et al. WO0069卯2)。另一個(gè)實(shí)例是利用?；磻?yīng)，在蛋白表面的氨基酸殘基上引 入脂肪酸，增加蛋白對(duì)體內(nèi)白蛋白的親和力，使得蛋白進(jìn)入血液后可以和 白蛋白形成較大的復(fù)合物，從而達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的目的，這一方法曾用于 長(zhǎng)效胰島素上(Kurtzhals P et al. Biochem. J. (1995) 312, 725-731; Frokjaer S et al. Nat Rev Drug Discov. 2005 Apr;4(4):298-306)。
另一種延長(zhǎng)蛋白體內(nèi)半衰期的方法是將蛋白做成緩釋劑型。將蛋白藥物 放入一種藥用栽體中，使得蛋白從栽體中緩慢釋放，在體內(nèi)維持一種穩(wěn)定 的藥物濃度。常用的方法有水凝膠、微膠囊、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體 等(Peppas NA et al. Eur.丄Pharm. Bioph咖.50， 27~46 (2000); Packhaeuser CB et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58， 445~455 (2004); Metselaar JM et al. Mini Rev. Med. Chem. 4， 319~329 (2002))。脂質(zhì)體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的空球形 態(tài)的超顯微粒子。該雙層膜由兩親分子多為磷脂構(gòu)成并有水性的內(nèi)腔。將 親水性的蛋白藥物包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)腔中，在體內(nèi)緩'It釋放，可以維持蛋 白的血藥濃度，達(dá)到增加半衰期的作用， 一些實(shí)例包括用在神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (Hou Xinpu et al. CN1616087)、血紅蛋白(Farmer Martha C et al. US4911929) 等。
本發(fā)明結(jié)合現(xiàn)有的一些主要藥物修飾技術(shù)，提供一種具有較長(zhǎng)半衰期的 血管內(nèi)皮抑制素產(chǎn)品，其在保持抑制血管生成的活性的同時(shí)，比未修飾的 血管內(nèi)皮抑制素在代謝上具有更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，本發(fā)明 中的血管內(nèi)皮抑制素優(yōu)選人血管內(nèi)皮抑制素。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及一種修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù) 合物。血管內(nèi)皮抑制素與修飾物通過(guò)共價(jià)鍵相連，或是通過(guò)非共價(jià)鍵相互 作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。修飾物可以是通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法連接到血管內(nèi) 皮抑制素上的，也可以是通過(guò)融合表達(dá)的方式和血管內(nèi)皮抑制素連接到一 起的。優(yōu)選的方案中這種修飾是位點(diǎn)特異性的，不會(huì)影響血管內(nèi)皮抑制素的生物活性，例如與受體的結(jié)合。該修飾產(chǎn)物具有抗新生血管生成的活性 但相比于未修飾的血管內(nèi)皮抑制素在代謝上更穩(wěn)定，具有更長(zhǎng)的血液半衰 期，可以作為抗新生血管生成或抗腫瘤的藥物。用于修飾的分子可以是一 種或多種生物相容，能增加血管內(nèi)皮抑制素的血液半表期的高分于聚合物、 蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、或者是其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。
這里的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以沒有生物活性。 合適的聚合物包括，但不僅限于聚烯醇類化合物、聚醚類化合物、聚乙烯
吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚與馬來(lái)酸酐的共聚物、N-(2-幾丙基-甲基 丙烯酰胺(N- (2-Hydroxypropyiymethacrylamide)、多聚糖類、聚氧乙基多醇 (polyoxyethylatedpolyol)、肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚 烴基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酰胺 (a，P-Poly ((2勿droxyethyl)"DL-aspartamide))、 聚羧酸月旨(polycarboxylates)、 氧化乙烯和曱醛的共聚物(poly oxyethylene"oxymethylenes)、聚丙烯酰嗎啉 (polyacryloyl morpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透明質(zhì)酸、 聚環(huán)氧化物(polyoxiranes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚1,3-乙二醇次甲基 醚、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
上述的聚烯醇類化合物包括，但不僅限于聚乙二醇(包括單甲基聚乙二 醇、單羥基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及它們的衍 生物。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，修飾物是聚乙二醇， 一個(gè)更優(yōu)選的方案中， 聚乙二醇選用單甲基聚乙二醇。
上述的聚醚類化合物包括，但不僅限于聚烷撐二醇(HO((CH2)xO)。H)、聚
丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)等以及它們
的4汙生物。
上述的聚氨基酸包括，但不僅限于同種氨基酸的聚合物，兩種或兩種以 上的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸。
上述的多聚糖類包括，但不僅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚 糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括曱基纖維素和羧曱基纖維素)、淀粉 及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
這里適合用作修飾栽體的蛋白分子優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段，包 括但不僅限于甲狀腺結(jié)合蛋白(thyroxine-binding protein )、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白 (transthyretin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring纖維蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它們的片段。上述的栽體蛋白優(yōu)選為人源的。上述蛋白的片段是 指任何比該蛋白小但是保持了栽體功能的部分。
血管內(nèi)皮抑制素與上述修飾物直接或間接共價(jià)相連，直接連接指的是血 管內(nèi)皮抑制素的某一個(gè)氨基酸和栽體蛋白的某一氨基酸直接相連，可以通 過(guò)肽鍵或二石克鍵。間接相連指的血管內(nèi)皮抑制素和載體蛋白通過(guò)一定的化 學(xué)基團(tuán)或幾個(gè)基團(tuán)的組合連接。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素，其特 征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)。偶聯(lián)的位
點(diǎn)是蛋白的N端a-氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈的e-氨基、半胱氨酸的巰基、天 冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一種或是他們的組合。 所有用于偶聯(lián)的聚乙二醇分子可以是線性的，也可以是分叉的，分子量位 于1,000到100,000道爾頓之間，優(yōu)選5,000到40,000道爾頓。本發(fā)明中所 述的聚乙二醇的分子量是指大約的平均的分子量. 一個(gè)優(yōu)選的方案是用聚 乙二醇特異的修飾血管內(nèi)皮抑制素N端的a-氨基，形成單一位點(diǎn)修飾的產(chǎn) 物。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及血管內(nèi)皮抑制素和蛋白或肽鏈的偶聯(lián)， 其特征為血管內(nèi)皮抑制素與 一個(gè)或多個(gè)蛋白或肽鏈直接或間接相連，當(dāng)與 多個(gè)栽體蛋白相連時(shí)，所選的栽體蛋白之間可以相同也可以是不同的。其 中的栽體蛋白優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段。 一個(gè)優(yōu)選的方案中用于修 飾的栽體蛋白為人血清白蛋白或其片段，在另一個(gè)優(yōu)選的方案中的栽體蛋 白為人免疫球蛋白IgG的Fc片段.
本發(fā)明的另 一個(gè)具體實(shí)施方案中的修飾物為小分子或是小肽或是其他化 合物，其特征為能使含有內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物具有和血液某些成分反應(yīng)的 能力或是和血液某些成分有較強(qiáng)的親和力. 一種具體化的產(chǎn)物是它具有一 個(gè)反應(yīng)活性的基團(tuán)，可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵， 另一個(gè)具體化產(chǎn)物的活性基團(tuán)是一個(gè)馬來(lái)酰亞胺，它可以和血液蛋白，例
如白蛋白中的巰基反應(yīng).另一個(gè)具體化產(chǎn)物是具有和血液某些成分，例如 白蛋白、免疫球蛋白等有較強(qiáng)的親和力，可以與之形成一種更大的復(fù)合體。 本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中的復(fù)合物，是其他小分子或是小肽修飾 的血管內(nèi)皮抑制素，可以是血管內(nèi)皮抑制素被糖基化、磷酸化、?；?后的產(chǎn)物。其中修飾的位點(diǎn)可以是原來(lái)蛋白序列中存在的氨基酸，也可以是通過(guò)突變產(chǎn)生的氨基酸殘基。該復(fù)合物雖然沒有很大的分子量，但是因 為修飾改變了血管內(nèi)皮抑制素的性質(zhì)從而延長(zhǎng)了其半衰期。
本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及一種含有內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物，它 是由血管內(nèi)皮抑制素和其他分子通過(guò)非共價(jià)鍵形成的具有特定組成的復(fù)合 物分子，其中的修飾物可以是蛋白，小分子等。該復(fù)合物具有抑制血管生 成的活性，并且在體內(nèi)有比血管內(nèi)皮抑制素更長(zhǎng)的半衰期。
本發(fā)明的另 一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及一種含有血管內(nèi)皮抑制素的緩釋制 刑，它是由血管內(nèi)皮抑制素或上迷的任一復(fù)合物和生物相容的物質(zhì)形成的。 該組合物中的血管內(nèi)皮抑制素仍然具有生物活性，但是卻可以依靠該載體 改變藥物代謝特征達(dá)到延長(zhǎng)體內(nèi)保留時(shí)間的目的。所述的緩釋制劑為但不 僅限于微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體等。
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物或緩釋制劑與藥學(xué) 上可接受的栽體形成的藥物組合物。本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮 抑制素的復(fù)合物或緩釋制劑和使用說(shuō)明組成的試劑盒。
本文4吏用的藥學(xué)上可接受的栽體包括對(duì)于以所用劑量和濃度與其接觸的 細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒的藥用上可接受的栽體、賦形劑、或穩(wěn)定劑。通常生
理學(xué)上可接受的栽體是含水的pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的栽體的例子 包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有;f幾酸在內(nèi)的緩沖液；包括抗壞血酸 在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明 膠、或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖、二糖和 包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖類；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘 露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；和/或諸如TWEEN^、聚乙二 醇(PEG)、和？0;110> 05*等非離子表面活性劑.賦形劑優(yōu)選是無(wú)菌的且一 般不含不良物質(zhì).這些組合物可通過(guò)常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌.
本發(fā)明還涉及到制備上述血管內(nèi)皮抑制素產(chǎn)品的方法。特別的，制備聚 乙二醇^^飾的血管內(nèi)皮抑制素的方法，即將活化的聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑
制素混合，在適當(dāng)?shù)娜芤?、溫度、pH、摩爾比下反應(yīng)，并用陽(yáng)離子柱或是 分子篩純化偶聯(lián)產(chǎn)物.其中反應(yīng)的pH優(yōu)選pH 3-10之間。
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑、藥物 組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療腫瘤中的用途。本方法適合的癌癥包說(shuō)明書第8/19頁(yè)
括但不僅限于肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、 口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、 肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤等.
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、藥物組合物或緩 釋制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途，
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑、藥物 組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療其他疾病和制備治療這些疾病的藥物 中的用途，所述疾病的特征為但不限于新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織 或器官病變。
在上述的治療腫瘤或其他疾病的用途中，其中的給藥方式選自靜脈注射、 靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮吸收、皮下包埋、肝動(dòng) 脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道 給藥或其他臨床給藥方式.
本發(fā)明還提供一種延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將 修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成復(fù)合物的步驟和制備含有血管內(nèi)皮抑制素的 緩釋制劑的步驟。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中的一個(gè)產(chǎn)品聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端 偶聯(lián)的復(fù)合物，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小鼠腫瘤生長(zhǎng)的活性，與未 修飾的人血管內(nèi)皮抑制素相比，活性明顯提高，并且體內(nèi)藥代學(xué)研究表明 修飾產(chǎn)物能有效的減緩藥物在體內(nèi)的代謝，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期.
本發(fā)明中提到的血管內(nèi)皮抑制素，除了特別說(shuō)明以外，其來(lái)源可以是人， 鼠，或其他哺乳動(dòng)物，其中的優(yōu)選方案是人血管內(nèi)皮抑制素.發(fā)明中提到 的血管內(nèi)皮抑制素，除特殊說(shuō)明以外，包括野生型的血管內(nèi)皮抑制素，即 體內(nèi)自然存在的形式，或是其具有活性的突變體、片^:、異構(gòu)體、衍生物 等或是它們的組合.血管內(nèi)皮抑制素的來(lái)源可以是但不僅限于動(dòng)物細(xì)胞表 達(dá)的，也可以是從酵母或大腸肝菌中發(fā)酵純化而來(lái)的。其中來(lái)源于動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)的野生型的人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示； 來(lái)源于酵母表達(dá)的重組人血管抑制素具有SEQ ID NO.l的序列，或是在此 序列的N端有IO個(gè)氨基酸以內(nèi)的增加或缺失；來(lái)源于大腸肝菌表達(dá)的重組 人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID NO.2的序列，但其N末端的Met在表達(dá)后 有時(shí)會(huì)-皮部分刪除，若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)
15皮抑制素將具有SEQIDNO.l的序列。
血管內(nèi)皮抑制素的突變體指的是通過(guò)氨基酸的取代、缺失、增加而得到 的血管內(nèi)皮抑制素分子。血管內(nèi)皮抑制素的片段是指序列屬于SEQ ID NO.l 或SEQ ID NO.2的任何更小的部分，可以是但不限于通過(guò)酶切得到的，或 是基因工程表達(dá)的，或是通過(guò)多肽合成的方法得到的。例如具有SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO.5序列的片段曾被報(bào)道具有抑制小鼠實(shí)體 瘤的活性(Cattaneo MG et al. Experimental Cell Research 283 (2003) 230~236; Tjin Tham Sjin RM et al. Cancer Research (2005) 65(9) 3656-3663 )。血管內(nèi)皮 抑制素的異構(gòu)體是指具有和野生型血管內(nèi)皮抑制素相同的氨基酸序列或分 子式，但是卻有不一樣的構(gòu)象，包括蛋白二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的不同或是局部 氨基酸旋光性的改變，異構(gòu)體的來(lái)源可以是天然存在的突變或是通過(guò)人為 設(shè)計(jì)而得到的.血管內(nèi)皮抑制素的衍生物是指在野生型血管內(nèi)皮抑制素的 基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾的產(chǎn)物，其中的修飾是指在蛋白上共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)其 他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是20個(gè)氨基酸以內(nèi)的小肽鏈，連 接位點(diǎn)可以是蛋白內(nèi)的任意一個(gè)氨基酸.在一個(gè)優(yōu)選的方案中，可以是N 端附加一段9個(gè)氨基酸組成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH的人血管 內(nèi)皮抑制素，其具有SEQ ID N0.6的序歹'J (Luo Yongzhang et al. US2004110671)，當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時(shí)其N末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部 分刪除。血管內(nèi)皮抑制素具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體、衍生物的組 合是指同時(shí)具有兩種或兩種以上上述特征的變化的產(chǎn)物，例如但不僅限于 片段的突變體、突變體的修飾產(chǎn)物等.
附圍說(shuō)明


圖1:顯示野生型人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列SEQIDNO.l, 圖2:顯示一種大腸桿菌表達(dá)的野生型重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸 序列SEQIDN0.2。這里N末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪除'若此 情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)皮抑制素將具有SEQ ID NO.l的序列。
圖3:顯示一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQIDNO.3. 圖4:顯示一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQIDNO.4. 圖5:顯示一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQIDNO.5,圖6:顯示一種具有活性的N端附加氨基酸的重組人血管內(nèi)皮抑制素 的氨基酸序列SEQ ID NO. 6。這里N末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪 除.
圖7: 20 kDa聚乙二醇與具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑 制素的N端的偶聯(lián)。反應(yīng)前后溶液用SDS-PAGE檢測(cè)，泳道l: 20kDa聚 乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道2:未修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn).
圖8: 20 kDa聚乙二醇與具有SEQ ID NO.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑 制素的N端的偶聯(lián)。修飾前后溶液用SDS-PAGE檢測(cè)，泳道1:未修飾血 管內(nèi)皮抑制素；泳道2: 20kDa聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn).
圖9: 20 kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID NO.2序列的重組人血管內(nèi)皮 抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化，使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯 化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。泳道1:純化前； 泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脫液。
圖10: 20kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDNO.6序列的重組人血管內(nèi)皮 抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化，使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯 化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果，泳道1:純化前； 泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 8:分布收集的洗脫液，
圖11: 40kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDNO.2序列的重組人血管內(nèi)皮 抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化.使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯 化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。泳道1:純化前； 泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脫液.
圖12: 20kDa聚乙二醇與重組Ajk管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性.SEQ2:具有SEQIDN0.2的血管內(nèi)皮抑制素； PEG-SEQ 2: 20 kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID NO.2的血管內(nèi)皮抑制素； SEQ6:具有SEQIDNO,6的血管內(nèi)皮抑制素；PEG-SEQ6: 20kDa聚乙二 醇修飾的具有SEQIDNO.6的血管內(nèi)皮抑制素。
圖13: 20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制 小鼠S180肉瘤的活性.SEQ2:具有SEQ ID NO.2的血管內(nèi)皮抑制素每天 給藥；PEG-SEQ2-1: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ 2-2: 20 kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每?jī)商旖o藥；PEG-SEQ2-3: 20kDa聚乙二醇 修飾的具有SEQIDN0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每三天給藥；SEQ6:具有 SEQIDN0.6的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-1: 20kDa聚乙二醇 修飾的具有SEQIDN0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-2: 20 kDa聚乙二醇^^飾的具有SEQ ID NO.6序列的血管內(nèi)皮抑制素每?jī)商旖o 藥；PEG-SEQ6-3: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.6序列的血管內(nèi) 皮抑制素每三天給藥。
圖14: 20 kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID NO.6序列的重組人血管內(nèi)皮 抑制素賴氨酸殘基側(cè)鏈的e-氨基后用分子篩純化，泳道1:上樣；泳道2 10: 分布收集的洗脫液.
圖15: 20kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮 抑制素賴氨酸殘基側(cè)鏈的e-氨基后用陽(yáng)離子柱CM純化。泳道l:上樣；泳 道2:穿透；泳道3 8:分布收集的洗脫液。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、 20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端的偶聯(lián)。
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素，具體實(shí)施方式
為將重組人血管內(nèi)皮 抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計(jì)在280 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到2 mg/ml。與20 kDa的特異修飾 蛋白N端的聚乙二醇偶聯(lián)時(shí)，取20ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg)，加 入20 kDa聚乙二醇固體80 mg，并室溫?cái)嚢?，直到完全溶解，使得聚乙?醇與血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為2:1.加入還原劑CH3BNNa，濃度為20 mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5,室溫靜置10小時(shí)以后大于80%的血 管內(nèi)皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)血管內(nèi)皮抑制 素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素N端的a-氨基，少量血管 內(nèi)皮抑制素會(huì)被非特異性的多位點(diǎn)修飾。這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化。 反應(yīng)前后溶液電泳結(jié)果如附圖7和8所示.
實(shí)施例2、 20 kDa聚乙二醇修飾重組AA管內(nèi)皮抑制素N端后用陽(yáng)離 子柱SP純化.本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。
具體實(shí)施方式
為將20 kDa聚乙二 醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素用SP層析柱(Amersham)純化。將反應(yīng)后的混合 液調(diào)節(jié)pH為6,層析柱用含有10 mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液 平衡后上樣。上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.0的洗脫 緩沖液梯度洗脫，未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗 的過(guò)程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素、單修飾的血 管內(nèi)皮抑制素、未修飾的血管內(nèi)皮抑制素.根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收 集不同的分離組分。純化結(jié)果如附圖9和IO所示。
實(shí)施例3、 40kDa聚乙二酵與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端的偶聯(lián)，
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素.具體實(shí)施方式
為將重組人血管內(nèi)皮 抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計(jì)在280 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到2.5mg/m1.與40kDa的特異修飾 蛋白N端的聚乙二醇偶聯(lián)時(shí)，取20 ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg),加 入40kDa聚乙二醇固體160mg,并室溫?cái)嚢?，直到完全溶解，使得聚乙?醇與血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為2:1.加入還原劑CH3BNNa,濃度為20 mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.室溫靜置10小時(shí)以后大于80%的血 管內(nèi)皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個(gè)聚乙二醇與 一個(gè)血管內(nèi)皮抑制 素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點(diǎn)是蛋白N端的a-氨基，少量血管內(nèi)皮抑制素 會(huì)被非特異性的多位點(diǎn)修飾.這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化。
實(shí)施例4、 40kDa聚乙二醉修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素N端后用陽(yáng)離 子柱SP純化.
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素.具體實(shí)施方式
為將40kDa聚乙二 醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用SP層析柱(Amersham)純化.將反應(yīng)后的混合 液調(diào)節(jié)pH為6.層析柱用含有10 mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液 平衡后上樣。上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.0的洗脫 緩沖液梯度洗脫，未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗 的過(guò)程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素、單修飾的血 管內(nèi)皮抑制素、未修飾的血管內(nèi)皮抑制素.根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素純化 結(jié)果如附圖11所示，具有SEQIDN0.6序列的純化結(jié)果與SEQIDNO,2序 列的純化結(jié)果類似，在此省略。
實(shí)施例5、 20 kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物 在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)。
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素.測(cè)量聚乙二醇修飾和未修飾的 重組人血管內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)的半衰期來(lái)檢驗(yàn)聚乙二醇修飾后的長(zhǎng)效 效益。選用6只25g左右體重的健康昆明種小鼠，分為兩組，每組3只， 分別尾靜脈注射未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素和20 kDa聚乙二醇與重組 人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物，劑量為15mg/kg體重。按照2、 10、 30分鐘、1、 2、 4、 8、 16、 24、 36、 48、 72小時(shí)的時(shí)間間隔尾靜脈取血. 收集血漿，用夾心法ELISA分別測(cè)血管內(nèi)皮抑制素和聚乙二醇修飾的血管 內(nèi)皮抑制素的濃度。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)顯示20 kD聚乙二醇修飾后，具有SEQ IDNO,2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)的半衰期從平均4.8小時(shí) 增加到平均16小時(shí).具有犯QIDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素經(jīng)修 飾以后在小鼠體內(nèi)的半衰期從平均7.5小時(shí)增加到平均16小時(shí)這表明偶聯(lián) 高分子量的聚乙二醇能有效的增加重組人血管內(nèi)皮抑制素的體內(nèi)代謝的半 衰期，達(dá)到長(zhǎng)效的目的.
實(shí)施例6、 20 kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性.
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素.具體實(shí)施方案為將人血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HMEC )在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.然后饑餓 細(xì)胞12小時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化以后，加入測(cè)細(xì)胞遷移的Jtt中，每孔細(xì) 胞數(shù)10000個(gè).遷移條件為DMEM培養(yǎng)基、1%血清、10ng/ml bFGF和雙 抗，對(duì)于加藥組分別加入血管內(nèi)皮抑制.素和修飾后的血管內(nèi)皮抑制素，濃 度為30ug/ml。 37。C培養(yǎng)8小時(shí)以后，取出小皿，用1%戊二醛固定細(xì)胞， 刮掉膜上層的未遷移細(xì)胞，用蘇木精對(duì)下層細(xì)胞染色.最后在顯微鏡下， 取相同大小視野數(shù)細(xì)胞數(shù)，同一塊皿中選取三個(gè)不同視野，最后算出抑制 率。結(jié)果顯示具有SEQ ID NO,2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率為42%, f斧飾后對(duì)細(xì)月包遷移的抑制率達(dá)到90%。具有SEQIDNO.6 序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率為45%,修飾后對(duì)細(xì)胞 遷移的抑制率達(dá)到88%。以上結(jié)果表明經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾后的血管內(nèi)皮抑 制素不僅保持而且還大大增強(qiáng)了生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。
實(shí)施例7、 20 kDa聚乙二酵與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物 在小鼠腫瘤模型治療中的活性.
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQIDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。實(shí)驗(yàn)觀察了 20kDa聚乙二醇 修飾的血管內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠S180腫瘤的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用20 g體重的昆明小鼠，分別腋下接入S180肉瘤細(xì)胞，每只接入細(xì)胞數(shù)2xi06 個(gè)。第二天隨機(jī)分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性 對(duì)照組(血管內(nèi)皮抑制素1.5mg/kg體重，每天給藥)、三組給藥組(聚乙 二醇修飾的血管內(nèi)皮細(xì)胞1.5mg/kg體重，分別為每天，每?jī)商欤咳旖o 藥)。分組后開始給藥，給藥方式為尾靜脈注射.給藥周期為10天，第11 天處死小鼠，稱瘤重，以抑瘤率來(lái)評(píng)價(jià)藥效，計(jì)算方法為抑瘤率-(陰性 對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/陰性對(duì)照組瘤重x 100°/。.對(duì)于具有SEQ IDN0.2 序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率為 34%,給藥組每天，每?jī)商?，每三天給藥的抑瘤率分別為47%, 53%， 40%. 對(duì)于具有SEQ ID NO.6序列的N端附加氨基酸的重組人血管內(nèi)皮抑制素， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率為40°/。，給藥組每天，每?jī)商?，每?天給藥的抑瘤率分別為45%, 57°/。， 50%.表明修飾后的重組人血管內(nèi)皮 抑制素具有體內(nèi)的抑瘤活性，而且由于其體內(nèi)代謝速度減慢，使得藥效優(yōu) 于未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素，并且在延長(zhǎng)給藥間隔的情況下仍能保 持藥效優(yōu)于未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示。
實(shí)施例8、 20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴氨酸殘基側(cè) 鏈的e-氨基。
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。
具體實(shí)施方式
為將重組人血管內(nèi)皮 抑制素透析到pH 7.8的30 mM磷酸緩沖液中。用紫外分光光度計(jì)在280nm 波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到2mg/ml。加入20kDa的修飾賴氨 酸殘基側(cè)鏈e-氨基的聚乙二醇分子，使得聚乙二醇分子與蛋白的摩爾比分別為8: 1。室溫放置，重組人血管內(nèi)皮抑制素能被較快的修飾，30分鐘以 后80%的血管內(nèi)皮抑制劑能被修飾，隨著反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，修飾物產(chǎn)量增多， 但反應(yīng)速度在1小時(shí)以后減慢。反應(yīng)產(chǎn)物主要有單分子聚乙二醇修飾和多 分子聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素.這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化，
實(shí)施例9、 20kDa聚乙二酵修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴氨酸殘基側(cè) 鏈的s-氨基后用分子篩純化.
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素.具體實(shí)施方式
為將20 kDa聚乙二 醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用分子篩純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為7.4, 層析柱用含有20 mM磷酸鹽，100 mM氯化鈉，pH值為7.4的平衡緩沖液 平衡后上樣，根據(jù)280nrn的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素的修飾產(chǎn)物的純化結(jié)果如附圖14所示。
實(shí)施例10、 20 kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴氨酸殘基 側(cè)鏈的E-氨基后用離子柱純化.
本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。
具體實(shí)施方式
為將20 kDa聚乙二 醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用CM層析柱純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為 6.5。層析柱用含有10mM磷酸鹽，pH值為6.5的平衡緩沖液平衡后上樣。 上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.5的洗脫緩沖液梯度洗 脫.未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過(guò)程中出現(xiàn)， 洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素，單修飾的血管內(nèi)皮抑制素， 未修飾的血管內(nèi)皮抑制素.根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組 分.具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素的修飾產(chǎn)物的純化結(jié)果如附 圖15所示.
22序列表
<160> 6
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens)
<400> 1
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn
1 5 10
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly 20 25
Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly 35 40
Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie 50 55 60
Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp 65 70 75
Pro Ser Ti:p Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly 85 90
Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val 100 105
Ala Asp 30
Thr Phe 45
15
Phe Gin Arg Als
Val Arg Arg Ala
Glu Leu
Pro Leu
Leu Phe 80
Lys Pro 95
Leu Arg His Pro 110
Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gljr Ser Asp Pro Asn Gly Arg
115 120
Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr 130 135
Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu 145 150
Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr 165
Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 2
125
Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser 140
Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin 155 160
lie Val Leu Cys lie Glu Asn 170 175<211〉 184 <212〉 PRT
<213〉 人(Homo sapiens) < 2
Met His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Uu His Leu Val Ala Uu 15 10 15
Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe 20 25 30
Gn Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg 35 40 45
Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg 50 55 60
Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu 65 70 75 80
Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys 85 90 95
Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe、sp Gly Lys Asp Val Leu Arg His 100 105 110
Pro Thr T卬Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly 115 120 125
Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp—Arg Thr Glu Ala Pro 130 135 M0
Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu Gly Gly Arg Uu Leu Gly 145 150 155 160
Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr lie Val Leu Cys'lie Glu 165 170 175
Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 3 <211> 44 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <400〉 3
Phe Glrv Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly 15 10 15Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala
20 25 30
Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe 35 40
<210〉 4 <211〉 45 <212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens) <400〉 4
Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala 15 10 15
Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys 20 25 30
His His Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe 35 40 45
<210〉 5 <211〉 27 <212〉 PRT
<213〉 人(Homo sapiens) <400> 5
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 15 10 15
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg 20 25
<210> 6 <211> 192 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <德6
Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe Gin 15 10 15
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met 20 25 30Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala 35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Uu Ser Ser Arg Leu Gin 50 55 60
Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie 65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe 85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe 100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val 115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser 145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His 165 170 175
Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180 185 190
2權(quán)利要求
1.一種修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù)合物，所述復(fù)合物具有比血管內(nèi)皮抑制素更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。
2. 權(quán)利要求l的復(fù)合物，所述修飾物與血管內(nèi)皮抑制素通過(guò)共價(jià) 鍵連接。
3. 權(quán)利要求2的復(fù)合物，所述修飾物選自高分子聚合物、蛋白質(zhì) 分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學(xué)物質(zhì)。
4. 權(quán)利要求3的復(fù)合物，所述高分子聚合物選自聚烯醇類化合 物、聚醚類化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸(包括聚丙氨酸)、 二乙烯基醚與馬來(lái)酸酐的共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺 (N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、葡聚糖及葡聚糖衍生物如疏酸 葡聚糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括甲基纖維素和羧甲基纖維素)、 淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、 肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇和其衍生 物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酰胺 (a,P-Poly((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸月旨(polycarboxylates)、 氧化乙烯和甲醛的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯醜嗎 淋(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透 明質(zhì)酸，聚環(huán)氧化物(polyoxiranes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚l， 3-乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán) 糊精或其他藥學(xué)上可接受的高分子聚合物。
5. 權(quán)利要求4的復(fù)合物，所迷聚醚類化合物選自聚烷撐二醇 (HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯 醇((CH2CHOH) J或它們的衍生物。
6. 權(quán)利要求4的復(fù)合物，所述聚烯醇類化合物選自聚乙二醇(包 括單甲基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁 烯醇或它們的衍生物。
7. 權(quán)利要求6的復(fù)合物，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇。
8. 權(quán)利要求7的復(fù)合物，所述聚乙二醇優(yōu)選單甲基聚乙二醇。
9. 權(quán)利要求7或8的復(fù)合物，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子 和一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)。
10. 權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的復(fù)合物，血管內(nèi)皮抑制素與聚乙二 醇偶4笑的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素的N-末端oc-氨基、賴氨酸殘基側(cè)鏈 的s-氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷 氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、C-末端羧基中的一種或是它們的組合。
11. 權(quán)利要求7-IO任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑 制素分予與一個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點(diǎn)為血管內(nèi)皮抑制素N-末端的a-氨基。
12. 權(quán)利要求7-IO任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征為血管內(nèi)皮抑制素分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素 分子N-末端的a-氨基或野生型血管內(nèi)皮抑制素75、 95、06、 117、 183位的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的s-氨基或其組合。
13. 權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征為血管內(nèi)皮抑制素 分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)方法為在血管內(nèi)皮抑制素 分子內(nèi)部或其N-末端或C-末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽 鏈，使得偶聯(lián)位點(diǎn)為附加的半胱氨酸殘基側(cè)鏈上的巰基。
14. 權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征為血管內(nèi)皮抑制素 分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸殘基側(cè)鏈上的羧基或C-末端的羧基。
15. 權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)的復(fù)合物，所述聚乙二醇分子是線性 的或是分叉的。
16. 權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)的復(fù)合物，所述聚乙二醇分子的平均 分子量位于1,000到IOO，OOO道爾頓之間，優(yōu)選5，000到40,000道爾頓 之間。
17. 權(quán)利要求3的復(fù)合物，所述蛋白選自血管內(nèi)皮抑制素、白 蛋白、免疫球蛋白、甲狀腺結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖 維蛋白原或它們的片段及其組合。
18. 權(quán)利要求17的復(fù)合物，所述復(fù)合物是血管內(nèi)皮抑制素和一 個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)形成二聚體或多聚體，該偶聯(lián)物可以是通過(guò)化學(xué)修飾得到的，或是通過(guò)融合表達(dá)得到的，或是通過(guò)其他方法 得到的，其中的血管內(nèi)皮抑制素優(yōu)選人血管內(nèi)皮抑制素或其片段。
19. 權(quán)利要求17的復(fù)合物，所述復(fù)合物是白蛋白偶聯(lián)的血管內(nèi) 皮抑制素，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)白蛋白偶 聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過(guò)化學(xué)修飾得到的，或是通過(guò)融合表達(dá)得到的， 或是通過(guò)其他方法得到的，其中的白蛋白優(yōu)選人血清白蛋白或其片段。
20. 權(quán)利要求17的復(fù)合物，所述復(fù)合物是免疫球蛋白Fc片段 偶聯(lián)的血管內(nèi)皮抑制素，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或 多個(gè)免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過(guò)化學(xué)修飾得到的， 或是通過(guò)融合表達(dá)得到的，或是通過(guò)其他方法得到的，其中的Fc片 段優(yōu)選人免疫球蛋白IgG中的Fc區(qū)域的片段。
21. 權(quán)利要求3中的復(fù)合物，所述復(fù)合物是小分子或是小肽或 是其他化合物修飾的血管內(nèi)皮抑制素，其特征是該復(fù)合物具有同體內(nèi) 其他分子或成分反應(yīng)或結(jié)合的活性，使得該聚合物可以在體內(nèi)和其他 成分形成更大的復(fù)合物。
22. 權(quán)利要求20中的復(fù)合物，所述復(fù)合物帶有具有反應(yīng)活性的 基團(tuán)，可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵。
23. 權(quán)利要求21中的復(fù)合物，所迷具有反應(yīng)活性的基團(tuán)是馬來(lái) 酰亞胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巰基反應(yīng)。
24. 權(quán)利要求20中的復(fù)合物，和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有較強(qiáng)的親和力，能相互形成更大的復(fù)合物。
25. 權(quán)利要求3中的復(fù)合物，所迷復(fù)合物是其他分子或是小肽 修飾的血管內(nèi)皮抑制素，例如血管內(nèi)皮抑制素被糖基化、磷酸化或酰 基化的產(chǎn)物，其中修飾的位點(diǎn)是原來(lái)蛋白序列中存在的氧基酸殘基， 或是通過(guò)突變產(chǎn)生的氨基酸殘基。
26. 權(quán)利要求l的復(fù)合物，所述修飾物與血管內(nèi)皮抑制素通過(guò) 非共價(jià)鍵相互作用，該復(fù)合物具有特定的組成式，其中的修飾物可以 是蛋白、小分子或其他化學(xué)物質(zhì)。
27. 血管內(nèi)皮抑制素或4又利要求1 -26任一項(xiàng)的復(fù)合物和生物相容的物質(zhì)形成的緩釋制劑。
28. 權(quán)利要求27的緩釋制劑，所述的緩釋制劑選自微膠嚢、水 凝膠、徵球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。
29. 權(quán)利要求28的緩釋制劑，其中所述的水凝膠包括 P(MAA-g-EG)水凝膠(由甲基丙烯酸methacrylic add (MAA)和 poly (ethylene glycol) ether monomethacryiate (PEGMA)組成)或由水溶性 聚合物chitosan與deacylated gellan gum組成的聚合物(DGG)形成的原 位(yn"to)水凝膠，且該種水凝膠可在生物體內(nèi)緩慢降解。
30. 權(quán)利要求28的緩釋制劑，其中所述的微膠嚢包括由納米材 料及其他生物相容物組成的"f效膠囊，且該種微膠嚢可在生物體內(nèi)緩慢
31. 權(quán)利要求28的緩釋制劑，其中所述的微球包括由 poly(ethylene glycol) (PEG)和生物可降解聚合物如polylactide (PLA)、 polyglycolide (PGA) 、 PLGA、 poly(-capi:olactone) (PCL) 、 poly oi:tho esters (POE)或poly(ethylene terephthakte) (PET)以任意組合方式形成的原位(hs/fti)共聚物微球體，且該種微球體可在生物體內(nèi)緩慢降解。
32. 權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)中的復(fù)合物以及4又利要求27-31任一 項(xiàng)中的緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素是人、鼠、或其他哺乳動(dòng)物來(lái) 源的。
33. 權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)中的復(fù)合物以及權(quán)利要求27-31任一 項(xiàng)中的緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素是野生型的人血管內(nèi)皮抑制 素，其天然形式具有SEQIDNO. l所示的序列。
34. 權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)中的復(fù)合物以及4又利要求2"7-31任一 項(xiàng)中的緩釋制劑，其中所述血管內(nèi)皮抑制素當(dāng)由大腸肝菌表達(dá)時(shí)，其 野生型的人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID NO. 2的序列，其中N末 端的Met在大腸肝菌表達(dá)時(shí)有時(shí)會(huì)被部分刪除。
35. 權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)中的復(fù)合物以及4又利要求27-31任一 項(xiàng)中的緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素可以是血管內(nèi)皮抑制素的具有 活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。
36. 權(quán)利要求35中的復(fù)合物或緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素片,殳是具有SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、或SEQ ID NO. 5序列的肽鏈。
37. 權(quán)利要求35中的復(fù)合物或緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素 衍生物是在野生型血管內(nèi)皮抑制素的N端或C端附加一段長(zhǎng)度為 1-15個(gè)氨基酸的肽鏈形成的。
38. 權(quán)利要求37中的復(fù)合物或緩釋制劑，其中血管內(nèi)皮抑制素 衍生物是在野生型人血管內(nèi)皮抑制素的N端附加一段9個(gè)氦基酸組 成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH ，該衍生物具有SEQ ID No. 6 的序列，當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時(shí)其N末端的Met有時(shí)會(huì)被部分刪除。
39. 權(quán)利要求l-38中任一項(xiàng)的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物或 緩釋制劑與藥學(xué)上可接受的載體形成的藥物組合物。
40. 權(quán)利要求39的藥物組合物，其中的藥學(xué)上可接受的載體為 含水的pH緩沖溶液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、或其他有機(jī)酸的緩沖 液、抗壞血酸或其他抗氧化劑，低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽、血 清白蛋白、明膠、免疫球蛋白或其他蛋白質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮或其他 親水性多聚體、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸或其 他氨基酸、單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖類、EDTA 或其他螯合荊、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、鈉離子或其他成鹽反離 子、TWEEN 、聚乙二醇(PEG)、 PLURONICS⑧或其他非離子表面 活性劑。
41. 一種試劑盒，其包含權(quán)利要求l-40的含有血管內(nèi)皮抑制素 的復(fù)合物、緩釋制劑或藥物組合和使用說(shuō)明。
42. —種試劑盒，其包含權(quán)利要求7-16的聚乙二醇修飾的血管 內(nèi)皮抑制素和使用說(shuō)明。
43. 制備權(quán)利要求7-16中的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物的方 法，其特征是用活化的聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素混合，在適當(dāng)?shù)娜?液、溫度、pH、摩爾比下反應(yīng)。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中pH為pH3-10。
45. 制備權(quán)利要求7-16中的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物的方 法，其特征是將偶聯(lián)產(chǎn)物用陽(yáng)離子柱純化。
46. 制備權(quán)利要求7-16中的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物的方 法，其特征是將偶聯(lián)產(chǎn)物用分子篩純化.
47. 權(quán)利要求1-42的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制齊'J、 藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療腫瘤中的用途。
48. 4又利要求47的用途，所述肺瘤選自肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、 結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、 淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡 性黑色素胂瘤或其他胂瘤。
49. 權(quán)利要求1-42的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑、 藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、it斷或治療其他疾病中的用途，所述疾 病的特征為新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變。
50. 權(quán)利要求47-49的用途，其中的給藥方式選自靜脈注射、 靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、 肝動(dòng)脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給 藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式。
51. 權(quán)利要求l-40的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑 或藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
52. 權(quán)利要求l-40的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑 或藥物組合物在制備治療其他疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征 為新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變。
53. —種延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將 修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成復(fù)合物的步驟。
54. —種延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將 血管內(nèi)皮抑制素或含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物與生物相容的物質(zhì) 形成緩釋制劑的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤藥物及含有這種藥物的藥物組合物和試劑盒，同時(shí)也公開了制備這種抗腫瘤藥物的方法。本發(fā)明中的抗腫瘤藥物具有體內(nèi)代謝的穩(wěn)定性，可用于治療腫瘤或制備抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101596320SQ20091013221
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者彥 付, 常國(guó)棟, 羅永章, 雷清新, 慶 韓 申請(qǐng)人:清華大學(xué);北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司