專利名稱：：川芎嗪和丹酚酸b的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物及其在心腦血管方面的藥理活性研究。
背景技術(shù)：
：丹參為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。中國藥典(2005年版)規(guī)定丹參為唇形科植物丹參5"a7Wa則'J"o/T^'zaBge.的干燥根及根莖。丹參具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功能，用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛。川芎為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。中國藥典(2005年版)規(guī)定川芎為傘形科植物川芎"^ric訓(xùn)c/7認(rèn)m:z'o"gHort.的干燥根莖。川穹具有活血行氣，祛風(fēng)止痛等功能，用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕腹痛，胸脅刺痛，跌撲腫痛，頭痛，風(fēng)濕痹痛。冠心寧注射液由丹參和川芎組成，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心等功能，用于冠心病心絞痛[衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)，第十七冊174頁]。丹酚酸B是丹參中的主要活性成份，川芎嗪是川芎中的主要活性成分，二者具有多方面的藥理作用，有相同的藥理作用，也有不同的藥理作用。由于二者分子結(jié)構(gòu)差異較大，故藥理作用的不同是必然的；即使相同的藥理作用，其作用機制也可能是不同的。將二者組合在一起，能起到互相彌補，取長補短的作用，使藥效更好。丹酚酸B的化學(xué)結(jié)構(gòu)<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>川芎嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物及其藥理活性或在治療疾病方面的應(yīng)用未見報到。本發(fā)明公開了一種以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物，并提供藥理實驗證明了該藥物組合物的藥理活性；藥理實驗表明，川芎嗪和丹酚酸B組合物的藥理活性好于川芎嗪的藥理活性和丹酚酸B的藥理活性，有顯著性差異。丹酚酸B的藥理作用銀杏葉提取物EGb761已經(jīng)成為美國市場上最暢銷的保健品之一，在歐洲一些國家已經(jīng)作為處方藥來治療一些與衰老相關(guān)的疾病，如AD(早老性癡呆)。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所張均田教授對丹酚酸B和EGb761的藥理作用進行了比較，無論是抗氧化、清除自由基、各種原因致細(xì)胞損傷的保護以及抗細(xì)胞凋亡等等，丹酚酸B的有效劑量為0.0070.7ug/ml，而EGb761為50100ug/ml，相差1001000倍，在MCAO模型二者均顯示抗腦缺血作用，丹酚酸B的有效劑量比EGb761低十幾倍之多。丹酚酸B對P-AP神經(jīng)毒性(AD的主要病因)的抑制作用強于EGb761，也強于褪黑素。丹酚酸B具有如此好的活性可能源于兩點強抗氧化活性和鈣拮抗作用。丹酚酸B的抗氧化活性是維生素E、甘露醇和EGb761的100倍。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度過高和自由基生成過多是神經(jīng)元損傷、死亡的關(guān)鍵因素；丹酚酸B是一個強抗氧化劑，并且能消除細(xì)胞內(nèi)鈣超載，將其開發(fā)成治療老年癡呆藥物，無疑具有重要的理論意義和使用價值?？梢哉J(rèn)為丹酚酸B是繼青蒿素、人參之后的又一個有國際影響的中藥[中國藥理通訊，2006;23(4):第十二屆全國神經(jīng)精神藥理學(xué)學(xué)術(shù)交流會大會報告。藥學(xué)學(xué)報，2006;41(8):706711。醫(yī)藥導(dǎo)報，2007;26(2):107110]。一、保護腦血管(1)鐵依賴性脂質(zhì)過氧化(IDLPO)在腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起極其重要的作用。丹酚酸B對大鼠腦勻漿鐵依賴性脂質(zhì)過氧化有影響，能抑制大鼠腦勻漿丙二醛的生成，呈量效關(guān)系，提示作用機理與鐵鰲合有關(guān)(中華老年學(xué)雜志，1997年6月第17巻)。(2)谷氨酸(Glu)和P-淀粉樣蛋白[A^,]可以引起神經(jīng)元NO的釋放增加，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，丹酚酸B能顯著增加神經(jīng)細(xì)胞損傷時的細(xì)胞活力，減少乳酸脫氫酶(LDH)釋放率，減少NO的釋放，達到保護神經(jīng)細(xì)胞的作用，有望治療老年癡呆[藥學(xué)學(xué)報，2000，35(12):881885]。(3)線粒體是供應(yīng)生物體內(nèi)能量的主要來源，腦缺血再灌注所引起的能量障礙主要與線粒體的功能損傷有關(guān)。丹酚酸B具有良好的抗氧化作用，可縮小局灶性腦缺血后梗賽面積。丹酚酸B可明顯抑制腦缺血再灌注所引起的腦線粒體內(nèi)SOD活性下降和GSH含量下降，同時降低線粒體損傷，發(fā)揮保護腦功能的作用(中國藥理通訊，2003年第二十巻第一期)。(4)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可引起腦血管通透性升高，丹酚酸B可顯著抑制VEGF的血管通透作用，提示其對腦血管有一定的保護作用(解放軍藥學(xué)學(xué)報，2002年2月第18巻第l期)。二、保護肝臟(1)丹酚酸B可促進肝細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的膠原生成，可抑制體外培養(yǎng)HSC(肝星狀細(xì)胞)的增生，這種抑制作用與抗氧化作用有一定的關(guān)系，提示丹酚酸B有一定的抗肝纖維化作用[中華肝臟病雜志，1996年12月第4巻第4期；世界華人消化雜志，2002，10(3):317319]。(2)丹酚酸B抗肝纖維化的部分機理在于抑制了活化貯脂細(xì)胞增殖，并通過抑制貯脂細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)而減少了膠原纖維在肝內(nèi)的沉積及干擾了狄氏間隙基底膜的形成而減輕了肝竇毛細(xì)胞血管化(中華肝臟病雜志，1996年6月第4巻第2期)。(3)丹酚酸B對于肝粘附性細(xì)胞，有促進其PGl2生成的作用，而對于肝粘附性細(xì)胞勻漿液中的環(huán)加氧酶則呈抑制作用，可能與丹酚酸B作為色氨酸樣輔助因子的作用有關(guān)。PGl2對肝血竇的微循環(huán)狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用，而環(huán)加氧酶的抑制與抗炎癥作用有關(guān)，可部分說明丹酚酸B抗肝損傷的機制(中國中藥雜志，1994年第19巻第2期)。(4)四氯化碳體外損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的fH]胸腺嘧啶核苷摻入量顯著降低，培養(yǎng)液中ALT活性顯著增高，丹酚酸B能有效地阻抑細(xì)胞的這種病理變化(中國中藥雜志，1997年第22巻第5期)。(5)在人身上試驗表明，丹酚酸B可有效逆轉(zhuǎn)慢乙肝肝纖維化(組織學(xué)逆轉(zhuǎn)率達36.67%)，對血清HA含量的改善，4項纖維化血清學(xué)指標(biāo)的綜合下降及B超積分變化優(yōu)于IFN-r。丹酚酸B和IFN-r均可改善慢乙肝患者癥狀體征和肝功能；未發(fā)現(xiàn)丹酚酸B的臨床不良反應(yīng)(醫(yī)學(xué)研究通訊，2003年第32巻第2期)。(6)丹酚酸B抗大鼠D"半乳糖胺肝損傷，可顯著降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，減輕肝細(xì)胞壞死。提高肝非實質(zhì)細(xì)胞花生四烯酸代謝產(chǎn)物6-酮基-前列腺素Fia(6-keto-PGFia)、前列腺素D2(PGD2)及前列腺素總的生成量。表明丹酚酸B可能是丹參抗肝損傷的主要成分，其提高肝非實質(zhì)細(xì)胞前列腺素(PGs)總的生成量可能是其抗肝損傷的機制之一(中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1993年第13巻第6期)。三、保護心血管1、動脈粥樣硬化(1)VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)可增強血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，可能在動脈粥樣硬化(AS)的形成和發(fā)展過程中起一定作用。丹酚酸B對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮通透性升高有顯著的抑制作用，提示丹酚酸B對AS有治療作用[中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2003，17(1):1923]。(2)泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細(xì)胞，在AS斑塊組織中，VEGF的表達明顯升高，在體外培養(yǎng)的U937泡沫細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可呈劑量依賴性的抑制泡沫細(xì)胞VEGF的表達，為丹酚酸B臨床應(yīng)用于AS的預(yù)防和治療提供了進一步依據(jù)[藥學(xué)學(xué)報，2002，37(2):8689]。(3)丹酚酸B對腫瘤壞死因子a(TNF一a)損傷的大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)具有直接保護作用，其作用可能與其穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)[天津中醫(yī)，2002;19(6):3839]。2、心肌缺血再灌注(1)心肌缺血再灌注對心肌細(xì)胞可產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，誘發(fā)心律失常，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。心肌缺血再灌注性損傷可以產(chǎn)生大量的氧自由基，進而導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，而這種過氧化作用是導(dǎo)致心肌細(xì)胞再灌注損傷的重要原因之一。丹酚酸B具有很強的抗氧化作用，可以清除氧自由基，故對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用(中國藥學(xué)雜志，2003年第38巻第8期；遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004年第6巻第1期)。(2)也有實驗表明，心肌細(xì)胞鈣超載和氧自由基增多是造成心肌缺血再灌注損傷的最主要原因之一，丹酚酸B可以抑制心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中的02+超載，是其發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷心肌保護作用的機制之一[現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004;13(1)]。(3)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)是心臟缺血缺氧時首先和最易損傷的部位，因此，CMEC的保護作用研究在防治心肌缺血性疾病中具有十分重要的意義。丹酚酸B預(yù)處理可激活CMEC內(nèi)源性延遲保護機制，發(fā)揮了拮抗心肌缺血缺氧損傷效應(yīng)[天津中醫(yī)，2002;19(1):4142]。(4)丹酚酸B能改善缺氧復(fù)氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮,放。丹酚酸B提高一氧化氮合成的這種機制可能與其改善內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷有關(guān)[ActaPharmacolSin2002;23(10):930936]。(1)丹酚酸B對犬心肌梗死有治療作用(中成藥，2004年第26巻第3期)。(2)丹酚酸B對大鼠心肌梗死過程中病理形態(tài)學(xué)有影響，可以減少心肌梗死面積，促進毛細(xì)血管的生長，加速梗死灶的修復(fù)，其減少心肌梗死灶的可能機制為提高細(xì)胞內(nèi)SOD的含量，減少自由基對心肌細(xì)胞的毒害作用，丹酚酸B是一種有效的抗氧化劑(天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004年第23巻第1期)。4、血液流變學(xué)基礎(chǔ)及臨床研究顯示，缺血性心腦血管疾病患者血液粘度升高，降低血液粘度是防治缺血性心腦血管疾病的重要手段之一。丹酚酸B對家兔全血粘度、紅細(xì)胞壓積和聚集指數(shù)有明顯的降低作用(微循環(huán)學(xué)雜志，2003年01期)。川萼嗪的藥理作用川芎嗪注射液在我國應(yīng)用已有三十多年，主要用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等缺血性心臟病，也用于缺血性腦血管疾病，療效顯著，且無明顯副作用，深受醫(yī)患的推崇，成為目前臨床最為常用的中藥制劑之一。一、心血管藥理作用[中國微循環(huán)；2003，7(4):257259]1、藥理學(xué)研究表明川芎嗪具有確切的抗心肌缺血作用。川芎嗪對家兔注射垂體后葉素引起的心肌缺血缺氧有明顯抵抗作用，對結(jié)扎冠狀動脈造成犬實驗性心肌梗死有縮小梗死范圍、減輕病變程度、減少心肌壞死量的作用。電鏡觀察對心肌細(xì)胞線粒體有一定的保護作用。隨著溶栓療法、冠脈搭橋術(shù)、體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)等缺血心肌再灌注醫(yī)療技術(shù)的應(yīng)用，挽救了大量心肌缺血患者的生命，但再灌注本身也可引起心肌損傷而影響療效。大量的藥理學(xué)實驗證明川芎嗪可使缺血心肌免受缺血再灌注損傷。川芎嗪能抑制缺血再灌注損傷所致心律失常、縮短心律失常持續(xù)時間、降低室顫和室速的發(fā)生率、降低缺血再灌注損傷后ST段的抬高、縮短竇律恢復(fù)時間、改善心臟血流動力學(xué)異常、增大左心室室內(nèi)壓峰值及其最大正負(fù)變化速率、抑制缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞攣縮、提高損傷細(xì)胞生存率、抑制心肌細(xì)胞內(nèi)K+7Na+濃度比的降低、減輕缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡。2、川芎嗪抗心肌缺血機理有擴張冠脈、保護冠脈內(nèi)皮、改善微循環(huán)、增加心肌營養(yǎng)血流量、抗血小板聚集和血栓形成、降低血液黏滯度、改善血液流變性、降低心肌耗氧、抑制氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、改善心肌細(xì)胞的代謝抑制狀態(tài)、阻滯心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流，調(diào)節(jié)鉀外流等方面。(1)擴張冠脈川芎嗪擴張冠狀血管，增加冠脈流量，改善心肌供氧而保護心臟。川芎嗪對內(nèi)皮素一1所致犬冠脈收縮有明顯拮抗作用。(2)保護冠脈內(nèi)皮血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷不僅是動脈粥樣硬化的始動因素，且對冠心病的發(fā)展起重要作用，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治這類疾病的新途徑。川芎嗪通過保護冠脈內(nèi)皮，提高機體內(nèi)NO水平和降低機體內(nèi)ET水平，減輕缺血及再灌注損傷。(3)改善微循環(huán)川芎嗪能使微循環(huán)血流速度和微血管開放數(shù)目增加。對金黃地鼠去甲腎上腺素造成的微循環(huán)障礙不論在口徑、流速、流量及毛細(xì)血管數(shù)等方面均有明顯改善，其中對微動脈作用最明顯。(4)抗血小板聚集和血栓形成川芎嗪對冠心病患者己聚集的血小板有解聚作用，并能降低血小板表面活性。其作用機理如下a:調(diào)節(jié)TXA2/PGI2系統(tǒng)TXA2/PGl2的平衡調(diào)節(jié)著血小板功能和血栓形成。川芎嗪具有抑制血小板花生四烯酸代謝的作用，可通過抑制血小板TXA2產(chǎn)生，同時促進血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生PGl2，維持TXA2/PGl2的平衡。b:"鈣拮抗劑"效應(yīng)川芎嗪能使血小板cAMP含量升高近一倍，活化細(xì)胞膜上的"鈣泵"，使血小板內(nèi)C^+濃度降低，阻斷C^+對血小板激活和前列腺素代謝。(5)降低血液黏滯度川粵嗪有提高紅細(xì)胞和血小板表面電荷、提高紅細(xì)胞變形能力、促進纖溶活性、降低血液黏度、改善血液流變性作用。(6)降低心肌耗氧降低心肌耗氧量有利于缺血性冠心病的治療。川芎嗪有負(fù)變頻效應(yīng)，離體竇房結(jié)灌流表明，川芎嗪(12)X10—3g/ml濃度能迅速使結(jié)周自律纖維的起博頻率降低，并呈劑量依賴性負(fù)變頻效應(yīng)。川芎嗪通過這種適度的負(fù)性變時性，減少了心肌耗氧量。(7)抑制氧自由基作用川芎嗪通過減少氧自由基的生成、直接清除氧自由基、提高機體清除氧自由基能力、減少脂質(zhì)過氧化物的形成等機制對缺血心肌有保護作用。在多種動物實驗及陳舊性心肌梗死、體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)的臨床研究中均已證實川芎嗪可使缺血心肌組織中MDA明顯降低，且伴隨超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽過氧化物酶/脂質(zhì)過氧化物(GSH-Px/LPO)明顯增高。(8)改善心肌細(xì)胞的代謝抑制狀態(tài)川芎嗪可提高培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧缺糖時3H—亮氨酸和3H—尿嘧啶核苷的摻入率，促進蛋白質(zhì)、RNA合成，誘導(dǎo)一氧化氮合酶mRNA在缺氧缺糖心肌細(xì)胞的表達，從而改善心肌細(xì)胞的代謝抑制狀態(tài)，增強細(xì)胞對缺血缺氧的耐受能力。(9)阻滯鈣內(nèi)流阻滯鈣內(nèi)流可擴張冠脈、減輕缺血心肌"鈣超載"損害。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)證實川芎嗪對豚鼠心室肌L—型鈣通道電流有濃度依賴性阻滯效應(yīng)。對成年大鼠心室肌L一型鈣通道電流也具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性和電壓依賴性，其機理可能為川芎嗪以高親和力與失活狀態(tài)的鈣通道結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)。二、腦血管藥理作用[現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志；2006，15(10):13981399〗臨床上缺血性腦血管病約占全部腦血管病的70%80%，川芎嗪對腦神經(jīng)組織的保護作用，除了舒張血管、抑制血栓形成外，還包括(1)提高紅細(xì)胞變形能力，降低血液黏度。(2)減少大鼠缺血腦組織中脂質(zhì)過氧化物(LPO)的生成，增加超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH""Px)的含量，從而減輕自由基損傷。(3)抑制c^jun蛋白表達，下調(diào)腦缺血一再灌注時c一fos的表達，上調(diào)bcl—2的表達，具有神經(jīng)保護作用。且川芎嗪能與(^2+通道受體可逆地結(jié)合，調(diào)節(jié)C^+的細(xì)胞內(nèi)流量，保持神經(jīng)元線粒體的完整性。川芎嗪與bcl—2可能均作用于神經(jīng)元線粒體上，保護腦組織，減輕腦缺血再灌注時的腦損傷，提高神經(jīng)元對缺血缺氧的耐受性。(4)能夠抑制(^2+超載，川芎嗪阻斷細(xì)胞Ca"內(nèi)流，解除血管的痙攣，減少神經(jīng)元中毒死亡，阻斷自由基引起的細(xì)胞破壞。川芎嗪還可通過抑制(^2+超載，減少自由基的產(chǎn)生等與bcl--2發(fā)生協(xié)同作用，也可通過抑制促凋亡基因如c一fos、p53等發(fā)揮抗凋亡作用。(5)腦缺血再灌注時白細(xì)胞介素一8(IL—8)水平升高，川芎嗪可抑制IL—8的合成和釋放，從而阻斷IL一8與炎癥反應(yīng)及氧自由基之間的惡性循環(huán)及連鎖反應(yīng)。(6)加速缺血神經(jīng)細(xì)胞HSP70基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達，進而使HSP70合成增多，使神經(jīng)細(xì)胞對缺血產(chǎn)生耐受，從而起到對神經(jīng)細(xì)胞的保護作用。
發(fā)明內(nèi)容1、本發(fā)明提供了一種以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物，其重量比為1:1010:1，優(yōu)選重量比為1:22:1，1:1.51.5:1，1:1.21.2:1，1:1。2、該藥物組合物中，川芎嗪可以是鹽酸川芎嗪和磷酸川芎嗪，丹酚酸B可以以鹽的形式存在，優(yōu)選為鈉鹽和鎂鹽。3、該藥物組合物中，川芎嗪和丹酚酸B的純度大于或等于8(m;優(yōu)選川芎嗪和丹酚酸B的純度大于或等于90%;進一步優(yōu)選川芎嗉和丹酚酸B的純度大于或等于98%。4、該藥物組合物可用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦血栓、動脈粥樣硬化、心肌缺血或心肌梗死，慢性乙肝肝纖維化、脂肪肝、老年癡呆癥、癌癥等。5、該藥物組合物可制成注射劑、口服制劑和外用制劑。注射劑包括水針劑、粉針劑和輸液劑；口服制劑包括片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、口服液、膠丸、水丸；外用制劑包括透皮吸收制劑；也可制成控釋制劑和緩釋制劑。6、本發(fā)明所述的川芎嗪和丹酚酸B可以用任何一種方法制備，對制備方法沒有任何限制。7、本發(fā)明進行了藥理試驗，證明了以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物在治療心腦血管疾病方面的醫(yī)藥用途。具體實施例方式下述各實施例僅用于說明本發(fā)明而非對本發(fā)明的限制實施例一磷酸川芎嗪(合成品)購于北京市燕京藥業(yè)有限公司；產(chǎn)品批號070707;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合《中國藥典》2005年版。大她們一丹酚酸B的制備按專利方法制備，丹酚酸B純度大于或等于98%。專利申請?zhí)?00710166155.2
專利名稱：丹酚酸B純品的制備方法丹參個子貨3kg，加鹽酸水溶液(PH值小于1.5)20倍量，浸漬20次，每次10小時，過濾，濾液上聚酰胺(60~100目，1kg)柱，上完各次酸水浸漬液后，用2—3%乙醇水溶液洗聚酰胺柱除雜質(zhì)，然后用水洗色譜柱，將醇洗凈后，用0.03。/。碳酸氫鈉水溶液洗色譜柱，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)洗脫液使PH值小于2，上大孔吸附樹脂(AB—8，2kg)柱，上完大孔吸附樹脂柱后，用10%乙醇水溶液洗樹脂柱除雜質(zhì)，再用95%乙醇洗樹脂柱，收集95%乙醇洗脫液，回收至干，得干粉A。取干粉A，加丙酮15倍量溶解，過濾，回收濾液至千，得干粉B;取干粉B，加乙酸乙酯15倍量溶解，過濾，回收濾液至干，得干粉C。取干粉C，加50%甲醇水溶液適量溶解，上SephadexLH-20柱，用50%甲醇水溶液洗色譜柱，根據(jù)TLC合并洗脫液，回收至干，得干粉D(丹酚酸B含量為99.35%)。實施例三制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的凍干粉針取川芎嗪40g，丹酚酸B40g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成每支含川芎嗪40mg，丹酚酸B40mg的凍干粉針。實施例四制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪80g，丹酚酸B80g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例五制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的凍干粉針取川芎嗪13g，丹酚酸B65g，溶于5000ml注射用水屮，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成每支含川芎嗪13mg，丹酚酸B65mg的凍干粉針。實施例六制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的凍干粉針取川芎嗪65g，丹酚酸B13g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)m值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成每支含川芎嗪65mg，丹酚酸B13mg的凍干粉針。實施例七制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的凍干粉針取川芎嗪17g，丹酚酸B68g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成每支含川芎嗪17mg，丹酚酸B68mg的凍干粉針。實施例八制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的凍干粉針取川芎嗪68g，丹酚酸B17g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成每支含川芎嗪68mg，丹酚酸B17mg的凍干粉針。實施例九制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪40g，丹酚酸B120g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪120g，丹酚酸B40g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十一制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪46g，丹酚酸B115g,淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十二制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪115g，丹酚酸B46g,淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，60。C以下千燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十三制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪80g，丹酚酸B88g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十四制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪88g，丹酚酸B80g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下千燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十五制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪70g，丹酚酸B91g,淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十六制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪91g，丹酚酸B70g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十七制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪65g，丹酚酸B91g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十八制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪91g，丹酚酸B65g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例十九制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪60g,丹酚酸B96g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十li制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪96g，丹酚酸B60g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十一制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪60g，丹酚酸B102g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十二制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪102g，丹酚酸B60g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十三制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪55g，丹酚酸B99g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十四制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪99g，丹酚酸B55g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十五制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪60g，丹酚酸B114g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十六制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪114g，丹酚酸B60g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十七制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪50g，丹酚酸B105g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十八制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪105g，丹酚酸B50g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，60。C以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例二十九制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪50g，丹酚酸B110g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪110g，丹酚酸B50g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十一制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪50g，丹酚酸B115g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十二制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪115g，丹酚酸B50g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下千燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十三制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪45g,丹酚酸B108g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十四制備以川穹嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪108g，丹酚酸B45g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成10O0片，包糖衣，即得。實施例三十五制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪45g，丹酚酸B117g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十六制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪117g，丹酚酸B45g，淀粉160g,糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，60'C以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十七制備以川考嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪40g，丹酚酸B108g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例三十八制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪108g，丹酚酸B40g，淀粉160g，糊精(粉)20g，粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣實施例三十九制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪40g，丹酚酸B112g，淀粉160g,糊精(粉)20g，粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣實施例四十制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪112g，丹酚酸B40g，淀粉160g，糊精(粉)20g，粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣實施例四十一制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪40g，丹酚酸B116g，淀粉160g，糊精(粉)20g，粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣實施例四十二制備以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的片劑取川芎嗪116g，丹酚酸B40g，淀粉160g，糊精(粉)20g，粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣實施例四十三丹酚酸B的制備丹參3kg，加鹽酸水溶液(PH值小于1.5)20倍量，浸漬20次，每次IO小時，過濾，濾液上聚酰胺(60—100目，lkg)柱，上完各次酸水浸漬液后，用2"~3%乙醇水溶液洗聚酰胺柱除雜質(zhì)，然后用水洗色譜柱，將醇洗凈后，用0.03%碳酸氫鈉水溶液洗色譜柱，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)洗脫液使PH值小于2，上大孔吸附樹脂(AB—8，2kg)柱，上完大孔吸附樹脂柱后，用10%乙醇水溶液洗樹脂柱除雜質(zhì)，再用50%乙醇洗樹脂柱，收集50%乙醇洗脫液，回收至干，得千粉A。取千粉A，加丙酮15倍量溶解，過濾，回收濾液至干，得干粉B;取干粉B，加乙酸乙酯15倍量溶解，過濾，回收濾液至干，得干粉C，丹酚酸B含量為91.16%。實施例四十四丹酚酸B的制備丹參3kg，加鹽酸水溶液(PH值小于1.5)20倍量，浸漬20次，每次IO小時，過濾，濾液上聚酰胺(60—100目，lkg)柱，上完各次酸水浸漬液后，用2—3%乙醇水溶液洗聚酰胺柱除雜質(zhì)，然后用水洗色譜柱，將醇洗凈后，用0.03%碳酸氫鈉水溶液洗色譜柱，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)洗脫液使PH值小于2，混勻，制成顆，即得?；靹?，制成顆，即得。混勻，制成顆，即得?；靹?，制成顆，即得?；靹?，制成顆，即得。上大孔吸附樹脂(AB—8，2kg)柱，上完大孔吸附樹脂柱后，.用10%乙醇水溶液洗樹脂柱除雜質(zhì)，再用70%乙醇洗樹脂柱，收集70%乙醇洗脫液，回收至干，得干粉A，丹酚酸B含量為82.95M。實施例四十五制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為82.95。/。)為活性成分的片劑取川芎嗪80g，丹酚酸B80g，淀粉160g,糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例四十六制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為91.16n/。)為活性成分的凍干粉針取川芎嗪13g，丹酚酸B65g，溶于5000ml注射用水屮，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成凍干粉針。實施例四十七制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為82.95%)為活性成分的片劑取川芎嗪80g，丹酚酸B100g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例四十八制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為91.16。/。)為活性成分的凍干粉針取川芎嗪17g，丹酚酸B68g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成凍干粉針。實施例四十九制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為91.16W)為活性成分的片劑取川芎嗪40g，丹酚酸B108g，淀粉160g，糊精(粉)20g，混勻，制成顆粒，6(TC以下干燥，加入硬脂酸鎂6g，壓制成1000片，包糖衣，即得。實施例五十制備以川芎嗪和丹酚酸B(丹酚酸B含量為82.95M)為活性成分的凍干粉針取川芎嗪17g，丹酚酸B68g，溶于5000ml注射用水中，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入氫氧化鈉調(diào)PH值至47之間，超濾，得到無熱源的澄清液，凍干，制成凍干粉針。藥理試驗藥物B是丹酚酸B，純度是99.35%，由北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供；藥物C是磷酸川芎嗪，純度是100.0%，購于北京市燕京藥業(yè)有限公司。試驗例一藥物C與B不同配比對大鼠離體心臟冠脈流量的影響151.實驗材料1.1實驗儀器及試劑Powerlab/8spLangendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，ADInstrumentPtyLtd(澳大利亞)。Krebs-Henseleit液，其組成為(腿ol/L):NaCl118，KC14.7，MgS047H201.2，CaCl22.0，NaHCO320，KH2P041.2，Glucose11.1，PH值7.2-7.4。1.2受試藥物及配制藥物川芎嗪(以C表示)、丹酚酸B(以B表示)，由北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。實驗前藥物C、B用Krebs-Henseleit液配成C:B分別為lOmg:10mg/ml、6.66mg:13.33mg/ml、5mg:15mg/ml、13.33mg:6.66mg/ml、15mg:5mg/ml、20mg:0mg/ml、0mg:20mg/ml的藥液，按C:B分別為2mg:2mg、L33mg:2.66mg、lmg:3mg、2.66mg:1.33mg、3mg:lmg、4mg:0mg、0mg:4mg/心臟給藥，給藥體積為0.21111。1.3實驗動物健康Wistar大鼠，雄性，體重350g土30g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。2.實驗方法2.1分組方法實驗分為藥物C組、藥物B組和C+B藥物組，C+B藥物組包括1:1配比組、1:2配比組、1:3配比組、2:1配比組、3:1配比組。共設(shè)7組，每組14只大鼠。分組方法、藥物劑量及給藥濃度見表1。表l實驗分組方法<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.2實驗操作方法大鼠斷頭處死，迅速取出心臟，置于4°CK-H液中，輕輕排出殘留血液，將心臟連接到灌流裝置并固定，開始灌流，灌流液維持37°C，并通入95%的氧氣。待心電平穩(wěn)后，將灌注壓調(diào)節(jié)在60-70mmHg進行穩(wěn)壓灌流，穩(wěn)定后記錄給藥前冠脈流量，經(jīng)給藥孔緩慢注入0.2ml/心臟配制好的藥液，給藥完畢后立即記錄h述各項指標(biāo)，持續(xù)觀察6分鐘。'2.3檢測指標(biāo)灌注壓力(mmHg);心率(次/分)；給藥前及給藥后即刻、1、2、3、4、5分鐘冠脈流量(ml/min)、冠脈流量變化率(％)。2.4統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(；±s)表示，采用SPSS1O.0統(tǒng)計軟件，組間變化率比較采用one-wayANOVA分析，前后實測值采用配對/檢驗，戶<0.05為有顯著性差異。3.結(jié)果3.1各組藥物對大鼠離體心臟心率的影響一實驗前將灌注壓調(diào)節(jié)在60-70nnnHg進行穩(wěn)壓灌流，藥物對大鼠離體心臟心率無顯著影響，結(jié)果見表2。表2給藥前后各組大鼠離體心臟灌注壓力、心率組別藥物配比劑量(mg/心)灌注壓力(mmHg)心率(次/分)c藥—41465.55±9.44145.22±29.62B藥_41463.66±10.68134.22±24.37C+B藥1:14(2+2)1463.55±12.86133.72±32.56C+B藥1:24(1.33+2.66)1468.76±10.42136.52±32.72C+B藥h34(1+3)1464.33±11.33132.73±36.61C+B藥2:14(2.66+1.33)1466.13±10.44144.13±21.72C+B藥3:14(3+1)1467.25±11.21131.53±21.383.2各組藥物對冠脈流量的影響給藥前各組之間冠脈流量無顯著性差異(Z〉0.05);給藥后各組大鼠離體心臟冠脈流量均有不同程度的升高，與給藥前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(尸<0.05或尸<0.01);給藥后各配比組與單用藥物C、B相比有顯著性差異(P<0.05或尸<0.01)，C+B藥l:1配比組有優(yōu)于其它組的趨勢；結(jié)果見表3。4.結(jié)論在升高大鼠離體心臟冠脈流量方面，由C、B兩個藥物組成的5個配比(l:l、1:2、1:3、2:1、3:1)組中，以1:1配比組為優(yōu)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>試驗例二藥物C與B不同配比對小鼠常壓耐缺氧的影響摘要目的觀察川芎嗪、丹酚酸B的常壓耐缺氧作用。方法采用小鼠常壓耐缺氧模型。結(jié)果川芎嗪在72mg/kg劑量下，與空白對照組比較，有明顯延長小鼠常壓耐缺氧時間作用。兩藥聯(lián)合用藥實驗中，與空白對照組比較，在1:1配比的72mg/kg、36mg/kg劑量組及2:1配比的72mg/kg劑量組均不同程度延長小鼠常壓耐缺氧時間，延長率分別為35.96%、22.0%、19.0%。并且，按1:1配比的72mg/kg組的效果明顯優(yōu)于單用川芎嗪的72mg/kg劑量組的效果(P<0.05)。結(jié)論川芎嗪有明顯的耐缺氧作用，與丹酚酸B按1:1比例聯(lián)合用藥時效果更優(yōu)。1.實驗材料1.1動物KM小鼠，雌雄各半，22-24g。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號SCXK(京)2005-0013。1.2藥品磷酸川芎嗪(以C表示)、丹酚酸B(以B表示)由北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。心得安(10mg/片)，天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)。1.3試劑凡士林，天津市石油化學(xué)實驗廠。鈉石灰，上海市納輝干燥試劑廠。2.實驗方法2.1C、B藥單味給藥對小鼠常壓耐缺氧的影響小鼠120只，雌、雄各半，按體重、性別隨機分為10組，每組12只。分別設(shè)空白對照組，C、B藥單味藥給藥組，劑量分為72mg/kg、36mg/kg、18mg/kg、9mg/kg組，陽性對照藥心得安50mg/kg組。C、B藥組在實驗前用0.9%的氯化鈉配制成相應(yīng)濃度的溶液，濃度分別為3.6mg/ml、1.8mg/ml、0.9mg/ml、0.45mg/ml，心得安濃度為2.5mg/ml。按體重0.2ml/10g腹腔給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天，空白對照組給予等體積的0.9%氯化鈉。于末次給藥后0.5h，取各組體重相近小鼠各一只，作為同批檢測動物。將小鼠迅速放入盛有15g鈉石灰的250ml廣口磨口瓶內(nèi)，每瓶一只(密封)，立即秒表計時，記錄小鼠因缺氧而死亡時間。以最后一次張口喘氣為死亡時間，觀察小鼠的存活時間，計算存活時間延長百分率[11:#gW^S^>帛=給藥組平均存活時間-對照組平均存活時間::對照組平均存活時間2.2C、B藥不同配比對小鼠常壓耐缺氧的影響以及與單用C藥的比較小鼠180只，雌、雄各半，按體重、性別隨機分為15組，每組12只。分別設(shè)空白對照組、C+B給藥組、陽性對照藥心得安50mg/kg組及單用C藥72mg/kg組。給藥組劑量設(shè)置C+B藥按3個配比給藥，每個配比各設(shè)四個劑量組，1:1配比，給藥劑量為72(36+36)mg/kg、36(18+18)mg/kg、18(9+9)mg/kg、9(4.5+4.5)mg/kg。1:2配比，給藥劑量為72(24+48)mg/kg、36(12+24)mg/kg、18(6+12)mg/kg、9(3+6)mg/kg。2:1配比，給藥劑量為72(48+24)mg/kg、36(24+12)mg/kg、18(12+6)mg/kg、9(6+3)mg/kg組。C藥組在實驗前用0.9%的氯化鈉配制成溶液，濃度為3.6mg/ml。C+B藥在實驗前用0.9%的氯化鈉配制成相應(yīng)濃度的溶液，四個劑量組給藥濃度分別為3.6mg/ml、1.8mg/ral、0.9mg/ml、0.45mg/ml，心得安濃度為2.5mg/ml。按體重0.2ml/10g腹腔給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天，空白對照組給予等體積的0.9%氯化鈉(檢測方法同上)。2.3統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差6±0表示，組間比較采用t檢驗，顯著水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。3.實驗結(jié)果3.1G、B藥單味給藥對小鼠常壓耐缺氧的影響C藥高劑量組，單味腹腔給藥7天，與空白對照組比較，能明顯延長小鼠常壓耐缺氧時間，延長率為21.35%CP<0.05)。結(jié)果見表l。3.2C、B藥不同配比對小鼠常壓耐缺氧的影響以及與單用C藥的比較與空白對照組比較，在l:l配比的72mg/kg、36mg/kg劑量組及2:1配比的72mg/kg劑量組均不同程度延長小鼠常壓耐缺氧時間，延長率分別為35.96%、22.0%、19.0%。并且，按l:l配比的72mg/kg組的效果明顯優(yōu)于單用川芎嗪的72mg/kg劑量組的效果(AP0.05)。心得安能夠明顯延長小鼠常壓耐缺氧時間，延長率為65.5%。結(jié)果見表2。表lC、B藥單味給藥對小鼠常壓耐缺氧的影響(X±S)(n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注與空白對照組比較，*尸<0.05,**尸<0.01表2C、B藥不同配比對小鼠常壓耐缺氧的影響(X±S)(n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注與空白對照組y匕較，*P<0.05，**P<0.01;與C組比較，AP〈0.05。4、結(jié)論川芎嗪單味給藥時，高劑量下對小鼠常壓耐缺氧存活時間有一定延長作用；而與丹酚酸B按1:1比例聯(lián)合給藥后，延長小鼠耐缺氧存活時間的作用能明顯增強，提示兩藥存在協(xié)同作用，可能是由于兩藥作用環(huán)節(jié)或靶點不同所致。參考文獻1.陳奇主編中藥藥理研究方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1996;783-784.試驗例三C與B藥物1:1配比對大鼠心肌缺血的影響摘要目的觀察藥物川芎嗪和丹酚酸B在1:1配比時聯(lián)合用藥對大鼠心肌缺血的影響。方法采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支造成心肌缺血模型，給藥7天。結(jié)果72mg/kg、36mg/kg劑量組能夠減輕心肌缺血程度，與模型組比較差異顯著(PO.Ol，P〈0.05)。結(jié)論川與嗪和丹酚酸B聯(lián)合用藥能夠降低心肌梗死程度，具有明顯的抗心肌缺血作用。1.目的觀察C與B藥物1:1配比組對大鼠心肌缺血的影響在離體罐流心臟實驗以及對小鼠耐缺氧實驗中的結(jié)果提示，川芎嗪和丹酚酸B在1:1比例時效果顯著。因此，本實驗在上述兩個實驗基礎(chǔ)上，觀察了川芎嗪和丹酚酸B兩藥物在1:1配比時聯(lián)合用藥對大鼠心肌缺血的保護作用。2.材料與方法2.l動物實驗動物成年健康SD大鼠，雄性，體重(260±20)g。飼養(yǎng)于室內(nèi)通風(fēng)柜內(nèi)，恒溫(22±2)°C，自然晝夜，自由食水。動物合格證編號SCXK(京)2004一OOOl。2.2分組及給藥藥物兩種，分別是川芎嗪(以C表示)和丹酚酸B(以B表示)，由北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。大鼠按體重分組，隨機分為6組，每組10只。1)正常對照組；2)假手術(shù)組；3)模型組；4)受試藥高劑量組C+B二36mg/kg+36mg/kg5)受試藥中劑量組C+B=18mg/kg+18mg/kg6)受試藥低劑量組C+B=9mg/kg+9mg/kg給藥方法術(shù)前禁食過夜，自由飲水。術(shù)后給藥7天，末次給藥后lh取材。2.3動物模型制備動物以戊巴比妥腹腔注射麻醉(30mg/kg)，仰位固定，以標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測動物心電圖；切開氣管，插入氣管插管，接動物人工呼吸機行人工呼吸(90次/分，呼吸比值1.5:1);左側(cè)第45肋間開胸，破開心包膜，暴露心臟，于冠狀動脈前降支根部穿線(3/8弧帶針縫合線，0/3尼龍線)，備結(jié)扎用；穿線后穩(wěn)定10分鐘，結(jié)扎(無ST段及T波改變者淘汰)，縫合胸壁，恢復(fù)自然呼吸。2.4主要儀器16道生理記錄儀(MP-150,美國BI0PAC);AE200型電子分析天平(上海，梅特勒-托利多儀器有限公司)。2.5統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用(i±0表示，組間比較應(yīng)用t檢驗，P〈0.05為顯著性差異，P〈0.01為非常顯著性差異。2.6指標(biāo)檢測大鼠心肌梗塞面積的測定末次給藥后lh取材，摘取心臟，放置-2(TC冰箱30min后取出，沿心臟結(jié)扎線以下橫切6片，置1%紅四氮唑010磷酸緩沖液中染色10-15min(37。C水浴)。肉眼觀察，梗死區(qū)呈灰白色，未梗死區(qū)呈紅色。沿壞死組織邊緣分離將梗死心肌組織與未梗死心肌組織分別稱重，以梗死心肌占整個心臟重量的百分比表示梗死范圍。3.結(jié)果對大鼠心肌梗塞面積的影響大鼠結(jié)扎冠狀動脈前降支后心肌缺血明顯，模型組大鼠心肌壞死區(qū)重量分別占左心室和全心臟重量的18.82%，14.10%，給予受試藥物7天后，與模型組比較，高、中劑量組的心肌缺血情況均有不同程度的改善(P〈0.01;P<0.05)。見表1，表2。表1受試藥物對大鼠心肌梗塞面積的影響(X±S，N=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表2受試藥物對大鼠心肌梗塞面積的影響(X±S，N=10)組別劑量(mg/kg)壞死區(qū)/左心室(％)壞死區(qū)/全心臟(％)正常對照組一———假手術(shù)組————一模型組——18.82士5.9114.10±5.11高劑量組7211.57±2.02**8.72±2.12**中劑量組3612.64±3.55*腦5±3.11*低劑量組1815.89±2.1112.42±2.55注與模型組比較*P<0.05;**P<0.01。4.小結(jié)采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支造成心肌缺血模型，灌胃給受試藥物(1-1配比)7天(按著72mg/kg、36mg/kg、18mg/kg劑量)。結(jié)果顯示藥物在72mg/kg、36mg/kg劑量下都能夠減輕心肌缺血程度，與模型組比較差異顯著(P〈0.01;P〈0.05)。5.結(jié)論川芎嗪和丹酚酸B在1:l配比下聯(lián)合用藥，能夠減輕實驗鼠心肌梗死面積，具有明顯的抗大鼠心肌缺血作用。試驗例四川芎嗪和丹酚酸B組合物對大鼠局灶性腦缺血影響的實驗研究被面調(diào)安采用三氯化鐵局部貼敷大鼠大腦中動脈造成局灶性腦缺血損傷模型，通過對模型大鼠神經(jīng)癥狀和腦梗塞范圍的測定，探討受試藥對模型大鼠的保護作用。結(jié)果表明，川芎嗪和丹酚酸B組合物于術(shù)后30分鐘靜脈注射、術(shù)后2小時和23小時腹腔注射可以明顯改善造模后6小時和24小時的神經(jīng)癥狀，明顯縮小模型動物腦血栓形成24小時的腦梗塞范圍(PO.Ol)。結(jié)論川芎嗪和丹酚酸B組合物可通過抑制腦血栓形成，減輕局灶性腦缺血損傷，其療效好于川芎嗪組和丹酚酸B組。實驗?zāi)康挠^察川芎嗪和丹鼢酸B組合物對大鼠大腦中動脈阻斷造成的大鼠局灶性腦缺血的影響。實驗材料SD大鼠，雄性，體重200-220g，合格證號SCXK(京)2004-0001，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。二、藥品與試劑受試藥C是川芎嗪，B是丹酚酸B，C+B組中C:B=1:1。受試藥由北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。試劑紅四氮唑(TTC)，為淡黃色粉末，北京馬氏精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。三、儀器XTT實體顯微鏡，云南光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；AEG-220型電子分析天平，日本Shimadzu公司產(chǎn)品；307-6臺式牙科車，上海齒科醫(yī)械廠產(chǎn)品；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。實驗方法和結(jié)果一、分組及給藥實驗動物按體重隨機分為4組，即生理鹽水組、C組、B組、C+B組。各組動物均于術(shù)后30分鐘舌下靜脈給藥，術(shù)后2小時和23小時腹腔注射給藥二次。注射劑量采用0.4ml/100g體重。二、大腦中動脈血栓模型制作大鼠腹腔注射10X水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一弧形切口，長約1.5cm,夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，于實體顯微鏡下，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側(cè)lmm處作一直徑2.5mm的骨窗，清理殘渣，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)，置一小片塑料薄膜保護血管周圍組織。將吸有50%氯化鐵溶液IOmL的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠詞養(yǎng)。室溫控制在24-C。三、神經(jīng)癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)對試驗動物在術(shù)后24h，進行行為檢測。評分標(biāo)準(zhǔn)①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱前伸，記為0分；如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或兼具，記為1分。②將動物置于平面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢査阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力，記為0分；如手術(shù)對側(cè)阻力下降，記為1分。③將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察肌張力。雙側(cè)肌張力對等且有力為0分；手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降記為1分。④提鼠尾，動物有不停地向手術(shù)對側(cè)旋轉(zhuǎn)者，記為1分。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)評分，滿分為4分，分?jǐn)?shù)越高，動物的行為障礙越嚴(yán)重。四、腦梗塞范圍的測定動物經(jīng)行為評分后，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位腦干后的剩余部分在4°C以下冠狀切成5片，并迅速將腦片置于TTC染液中(每5ml染液中含4%TTC1.5ml，lMK2HP040.1ml，其余加蒸餾水至刻度)，37。C避光溫孵30分鐘，取出后置于10%甲醛液中避光保存24h。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。將白色組織仔細(xì)挖下稱重，以梗塞組織重量占全腦重量及患側(cè)腦重量的百分比作為腦梗塞范圍。五、結(jié)果上述實驗結(jié)果用l表示，統(tǒng)計學(xué)檢驗采用組間配對比較f檢驗，結(jié)果見表l和表2?！?受試藥對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響(±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2受試藥對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響G±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01小結(jié)從上表可以看出，C+B、C、B于術(shù)后30分鐘靜脈注射、術(shù)后2小時和23小時腹腔注射均可以明顯改善造模后6小時和24小時的神經(jīng)癥狀；且C+B、C、B還可以明顯縮小模型動物腦血栓形成24小時的腦梗塞范圍(P<0.01，P<0.05，P<0.05)。結(jié)論C+B、C、B均可通過抑制腦血栓形成，減輕局灶性腦缺血損傷，而且C+B組的療效好于C組和B組。權(quán)利要求1、一種以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物，其特征在于，重量比為1∶10～10∶1。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，優(yōu)選重量比為1:22:1。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，優(yōu)選重量比為1:1.51.5:1。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，優(yōu)選重量比為1:1.21.2:1。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，優(yōu)選重量比為l:l。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，川芎嗪可以是鹽酸川芎嗪和磷酸川芎嗪，丹酚酸B可以以鹽的形式存在。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，丹酚酸B鹽優(yōu)選為鈉鹽和鎂鹽。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，川芎嗪和丹酚酸B的純度大于或等于80%。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，川彎嗪和丹酚酸B的純度大于或等于90%。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，川考嗪和丹酚酸B的純度大于或等于98%。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，可用于治療冠心病，心絞痛，缺血性腦血栓，動脈粥樣硬化，心肌缺血或心肌梗死，慢性乙肝肝纖維化，脂肪肝、老年癡呆癥和癌癥。12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，可制成藥劑學(xué)上所說的任何一種劑型可制成注射劑、口服制劑和外用制劑；注射劑包括水針劑、粉針劑和輸液劑，口服制劑包括片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、口服液、膠丸，水丸。外用制劑包括透皮吸收制劑。也可制成控釋制劑和緩釋制劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種以川芎嗪和丹酚酸B為活性成分的藥物組合物，川芎嗪和丹酚酸B的純度大于或等于80％，該藥物組合物可用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦血栓、動脈粥樣硬化、心肌缺血或心肌梗死，慢性乙肝肝纖維化、脂肪肝、老年癡呆癥和癌癥等。文檔編號A61P35/00GK101590060SQ200910119199公開日2009年12月2日申請日期2009年3月9日優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日發(fā)明者峰魏申請人:北京科士藍(lán)醫(yī)藥技術(shù)有限公司