專利名稱：：流感復(fù)合多表位dna疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及流感疫苗，特別是涉及以流感病毒基因抗原表位為基礎(chǔ)的DNA疫苗。
背景技術(shù)：
：流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是由流感病毒(Influenzavirus,IV)引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并引起表面炎癥，表現(xiàn)為急性上呼吸道炎和全身中毒癥狀。20世紀(jì)30年代人類就開始了對流感病毒的認(rèn)知及疫苗的開發(fā)，然而時至今曰流感病毒依然是威脅人類和動物健康的重要病原。數(shù)年來，流感病毒的流行造成了巨大的人力資源和物力資源的損失。依據(jù)其內(nèi)部蛋白抗原性的不同，流感病毒可分為A、B、C三個型。A型在廣譜的溫血動物中存在(禽類和哺乳動物)中存在，而B和C型主要是人類的病原，C型也可在豬上分離到。依據(jù)其表面抗原血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)不同，又可分為若干不同的亞型。其中，A型流感病毒是對人和禽危害最為嚴(yán)重的流感類型。其某些亞型變異迅速，致病力強(qiáng)，曾造成過多次世界性大流行，在造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時，還會造成人和禽的大量死亡。數(shù)年來，人流感的流行一直以A型H3、Hl亞型，以及B型流感為主。據(jù)世衛(wèi)組織(WHO)發(fā)布的公告，全球每年流感病例為6億~12億例，死亡50萬100萬人，其中重癥流感病例300萬~500萬例，重癥流感的病死率為8%~10%。在美國每年因流感造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)30~50億美元。20世紀(jì)中流感造成了四次全球性大流行，包括1918-1919年的西班牙流感(H1N1),1957年的亞洲流感(H2N2),1968年的中國香港流感(H3N2)和1977年的俄國流感(H1N1)，給人類帶來了災(zāi)難性的損失。僅1919年西班牙大流感就奪去了2100萬條生命，超過第一次世界大戰(zhàn)死亡人數(shù)，而全球感染人數(shù)達(dá)到6億，而其它幾次大流行造成的人類死亡數(shù)量也數(shù)以百萬計。禽流感(Avianinfluenza,AI)病原為A型流感病毒，血清型以H5、H7、H9亞型為主。目前，禽流感廣泛分布于世界范圍內(nèi)的許多家禽和野禽中，自遷徙水禽分離到的病毒較多，而對雞和火雞的危害則最為嚴(yán)重。其中，高致病力禽流感(HPAI)對禽類危害最為嚴(yán)重，其主要血清型為H5和H7亞型。HPAI常以突然死亡和高死亡率為主要特征，常常導(dǎo)致感染雞群的全群覆沒，已經(jīng)給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被國際獸疫局列為A類烈性傳染病，同時被列入國際生物武器公約動物類傳染病名單。一直以來，人們普遍認(rèn)為高致病性禽流感的發(fā)生比較罕見，因?yàn)樵?959-1998年的40年間，世界范圍內(nèi)一共只報道了17次HPAI。但自1999年開始，HPAI的爆發(fā)變的非常頻繁，1997-2004的七年中就發(fā)生了8次HPAI，而且涉及的范圍更加廣泛，尤其是2004年禽流感的爆發(fā)最為嚴(yán)重。距不完全統(tǒng)計，亞洲各國死亡或淘汰的禽只總數(shù)近1億只，超過歷史數(shù)次HPAI感染/淘汰禽數(shù)的總量。在其數(shù)次流行的過程中，更發(fā)生了數(shù)起HPAI感染人類并造成死亡的病例，引起了民眾的極大恐慌。禽流感尤其是HPAI展示向人流感進(jìn)化的趨勢，這令環(huán)境中流感的流行情況變得更為復(fù)雜，并可能再次引發(fā)流感大流行。由于尚缺乏可有效治療流感的藥物，疫苗的使用依然是阻止流感感染和傳播的有效手段。當(dāng)前，人流感和禽流感的預(yù)防主要依賴于滅活疫苗以及減毒活疫苗，長期的使用經(jīng)歷證明它們是安全有效的，并發(fā)揮了巨大的作用。但是，滅活疫苗和弱毒疫苗，都存在著一些自身無法避免的缺陷。滅活疫苗存在著激發(fā)的細(xì)胞免疫水平低下，僅能對抗原相配病毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)，佐劑添加引起的應(yīng)激反應(yīng)，生產(chǎn)成本偏高，感染免疫監(jiān)測等不足。而減毒活疫苗則有突變?yōu)楦咧虏⌒粤鞲械目赡?。且這兩種疫苗均無法有效應(yīng)對現(xiàn)在流感病毒變異迅速、多亞型流感并存流行、種屬界限曰益模糊的趨勢。開發(fā)高效、安全的流感疫苗一直是各國研究的焦點(diǎn)。隨著生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的飛速發(fā)展，以疫苗等生物制品為中心的生物技術(shù)研究已成為全球進(jìn)步最快的領(lǐng)域之一?；蚬こ碳夹g(shù)的不斷應(yīng)用，新型佐劑的涌現(xiàn)，更是加速了疫苗研發(fā)的腳步。不斷研究更為安全有效的禽流感疫苗，克服傳統(tǒng)疫苗的諸多缺陷，更好的防控禽流感，成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前流感疫苗主要分為以下幾種。滅活全病毒疫苗傳統(tǒng)的禽流感的預(yù)防主要采用滅活全病毒疫苗。其一般是用甲醛滅活雞胚尿囊液增殖的禽流感病毒，并輔以佐劑，實(shí)驗(yàn)證明其具有良好的免疫保護(hù)作用。滅活全病毒疫苗制備工藝簡單，免疫效果確實(shí)，免疫持續(xù)期長，安全性好，不會出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異現(xiàn)象。目前，禽流感滅活疫苗主要針對亞型包括H5N1亞型、H7N1亞型和H9N2亞型3種，我國主要以H5N1和H9N2亞型為主。在我國，應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)的毒株包括H9亞型的SS株、F株、LG1株、Re-2株、SD696株，H5亞型的N28、Re-1株。2006年，H5、H9亞型二價滅活苗研制成功，并開始在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行應(yīng)用。最近，禽流感(H9)四聯(lián)滅活疫苗取得中華人民共和國新獸藥注冊證書，并獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)上巿。該疫苗主要針對禽流感(H9)、雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征等4種禽類傳染病。亞單位疫苗亞單位疫苗是指釆用理化學(xué)或基因工程手段制備的病原體的亞單位成分。它只含有病原體的一部分，不會引起病原體所致的動物發(fā)病，因此在安全性和純度方面大大提高。但由于其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，導(dǎo)致了使用其成本昂貴。而且一些亞單位疫苗雖然有一定的免疫保護(hù)力，但受限于難以維持或恢復(fù)天然免疫原的三維結(jié)構(gòu)，因此其總體免疫效果不佳，可能需要輔以佐劑配伍使用。釆用基因工程手段，可以將保護(hù)性抗原基因連接到載體質(zhì)粒，然后導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，通過這樣的方法可以獲得大量的保護(hù)性抗原蛋白。以這種方式生產(chǎn)的蛋白，不僅產(chǎn)量高，而且成本低，具有良好的開發(fā)和發(fā)展前景。重組活載體疫苗基因工程重組活疫苗是用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因(目的基因)轉(zhuǎn)移到載體中使其表達(dá)的活疫苗。因此，在接種攜帶這種保護(hù)性抗原基因的重組疫苗后，除獲得對載體的免疫外，還可通過外源基因的表達(dá)獲得對插入基因相關(guān)疾病的保護(hù)力。而且可以用較大的載體同時插入多種病毒的抗原基因構(gòu)建多價疫苗，從而大大減少疫苗接種的次數(shù)和勞動量。重組痘病毒載體疫苗痘病毒具有許多優(yōu)點(diǎn)，目前是應(yīng)用最廣泛的載體病毒。但是痘苗病毒有著廣泛的宿主范圍，使其易在自然界中傳播，而且個別人接種痘苗病毒后產(chǎn)生副反應(yīng)，因此出于生態(tài)學(xué)和安全學(xué)的考慮，目前的研究傾向于使用構(gòu)建的痘苗病毒宿主限制性突變株和其他限制性痘病毒成員為載體。這樣的載體主要包括雞痘病毒載體、金絲雀痘病毒載體和鴿痘病毒載體等。釆用對禽類致病性較弱的禽痘病毒或痘苗病毒為載體，構(gòu)建成表達(dá)HA的重組病毒，用其作為疫苗，能在禽體內(nèi)復(fù)制，并不斷表達(dá)HA蛋白、誘導(dǎo)免疫保護(hù)力。重組新城疫載體疫苗重組新城疫病毒rL-H5株，是釆用新城疫病毒LaSota株為載體，表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA基因的重組病毒。疫苗可以同時預(yù)防禽流感和新城疫這兩種OIE規(guī)定的A類烈性禽類傳染病，它的使用大大降低了疫苗制造和使用成本，為提高我國禽流感免疫質(zhì)量、加大免疫密度提供技術(shù)保證。其可同時誘導(dǎo)粘膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對新生雛雞無不良反應(yīng)。但是該疫苗受新城疫母源抗體影響較大，臨床應(yīng)用中應(yīng)把握好免疫時機(jī)。此外該疫苗在鵝群中使用時，免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果并不理想。DNA疫苗DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(有時也可是RNA)，一般認(rèn)為核酸疫苗被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，被周圍的組織細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞(APCs)或其他炎性細(xì)胞攝取，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白質(zhì)抗原，經(jīng)加工后形成的多肽抗原可與宿主細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物MHCI和MHCII分子結(jié)合，并被遞呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)，從而引起特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而起到免疫保護(hù)作用?？躬?dú)特型抗體疫苗抗獨(dú)特型抗體疫苗是根據(jù)Jeme的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說研制的。一些抗獨(dú)特型抗體能夠和抗體的補(bǔ)位結(jié)合并且在空間結(jié)構(gòu)上模擬抗原表位，這類抗體可以替代抗原作為診斷抗原檢測機(jī)體抗體的水平，還可以作為疫苗免疫動物，使動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抵抗相應(yīng)病原體的侵襲。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供以流感抗原表位為基礎(chǔ)的DNA疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是釆用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提供的流感復(fù)合多表位DNA疫苗，所述DNA疫苗編碼蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亞型流感病毒HA蛋白為載體骨架分子，并以ER信號肽作為引導(dǎo)序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒HA基因和NP、NA、NS1、M基因中高度保守的免疫優(yōu)勢表位，其中包括來源于上述亞型的流感CTL表位17個，來源于上述亞型的流感Th和B細(xì)胞表位12個；共29個表位的流感復(fù)合多表位DNA疫苗。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可以釆用以下的技術(shù)措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的DNA疫苗，其中所述的Th和B細(xì)胞表位為下表所列表位18-29(請參閱序列表SEQIDNo.22至SEQIDNo.33所示)；所述CTL表位為流感HA基因組中17個高度保守的CTL免疫優(yōu)勢表位，如下表1-17所示(請參閱序列表SEQIDNo.5至SEQIDNo.21所示)序號<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表位之間采用柔性小分子linker連接。前述的DNA疫苗，其中所述柔性小分子linker為KAA、KAAA、AAA、NAAA或AAY。前述的DNA疫苗具有抗原性。前述的DNA疫苗具有免疫原性。前述的DNA疫苗在預(yù)防流感中的應(yīng)用。前述的DNA疫苗的應(yīng)用，其中所述疫苗同時預(yù)防多種亞型流感病毒，所述疫苗為注射劑。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還釆用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提供的一種H3/H1主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴(kuò)增H3和HI亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提供的一種H3/H5主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其釆用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴(kuò)增H3和H5亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還釆用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提供的一種H5/H7主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式從前述的DNA疫苗中擴(kuò)增H5和H7亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。前述的DNA疫苗編碼蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亞型流感病毒HA蛋白為載體骨架分子，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜引導(dǎo)信號肽(ER)作為引導(dǎo)序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒HA基因和NP、M、NA、NS1基因中高度保守的免疫優(yōu)勢表位，其中包括來源于多種亞型的流感CTL表位17條，來源于多個亞型的流感Th和B細(xì)胞表位12條，共29個表位的流感復(fù)合多表位DNA疫苗。同時，對基因啟始密碼子ATG的前后堿基序列作了設(shè)計和調(diào)整，使其符合Kozak規(guī)則；考慮到宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白時對密碼子的偏愛性，還對密碼子進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整，以期獲得最佳的免疫效果。本發(fā)明的流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其中所述DNA疫苗CTL表位的選擇釆用SYFPEITHI、Bimas、Multipre對參考毒株序列進(jìn)行分析，對其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位進(jìn)行預(yù)測，篩選得分較高，排名靠前的CTL表位，綜合評價各軟件預(yù)測結(jié)果分析得到所需表位。Th表位預(yù)測釆用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYFPEITHI和Multipre。主要對HLA-DRB1*04、HLA-DRB1*07、HLA-DRB1*08、HLA-DRBl"l、HLA-DRB1*13、HLA-DRB1*15限制性Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，并綜合參考其他HLA-DR親和力評分。B細(xì)胞表位預(yù)測釆用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Bcepred對線性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。篩選時依據(jù)親水性好(hydrophilicity)，可及性高(accessibility),可塑性好(flexibility),抗原性強(qiáng)(antigenicity),分子極性強(qiáng)(polarity),表面暴露(exposedsurface)和轉(zhuǎn)角(turns)可能性大的為候選B細(xì)胞表位。所有預(yù)測優(yōu)先篩選位于HA主要抗原區(qū)HA1上的表位。隨后，匯總各項(xiàng)表位預(yù)測結(jié)果，以Th表位預(yù)測為基礎(chǔ)，使預(yù)測表位區(qū)盡量覆蓋與B細(xì)胞表位預(yù)測交集區(qū)，以獲得兼有Th與B細(xì)胞表位功能的預(yù)測表位。通過PDB(http:〃www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載、流感HA及NA蛋白分子構(gòu)象，應(yīng)用InsightII軟件進(jìn)行分子建模，分析候選表位空間構(gòu)象。排除位于oc-螺旋和(3-片層不易形成表位的序列，將位于轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處且表面暴露好的序列確定為候選細(xì)胞表位。將候選表位序列與已發(fā)表的HA蛋白序列比較，分析其特異性(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。最后，綜合各項(xiàng)結(jié)果確定細(xì)胞表位。CTL表位盒設(shè)計，在預(yù)測和搜集CTL表位的基礎(chǔ)上，添加合適的Linker連接各CTL表位，并通過蛋白酶體裂解預(yù)測軟件PAProC優(yōu)化CTL表位盒的構(gòu)成和Linker的選擇。Th及B細(xì)胞表位盒設(shè)計，在預(yù)測和搜集Th與B細(xì)胞表位的基礎(chǔ)上，添加柔性及可裂解Linker連接各表位。而后，在此基礎(chǔ)上在表位盒中均加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號引導(dǎo)序列和通用Th表位，以輔助表位更好突破MHC限制性而發(fā)揮功能。根據(jù)設(shè)計的表位盒，復(fù)原其核苷酸序列，并參照真核優(yōu)勢密碼子規(guī)則進(jìn)行優(yōu)化。在搜集已發(fā)表的表位基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)測所得表位，對CTL表位盒和ThB表位盒進(jìn)行分子設(shè)計，并釆用理論結(jié)合軟件模擬的方式進(jìn)行表位盒組成的優(yōu)化。最終，設(shè)計獲得了理論上具有良好功能的CTL表位盒和ThB表位盒，隨后進(jìn)行人工合成。前述的DNA疫苗，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，證明目的基因有效表達(dá)且具有抗原性。前述的DNA疫苗，通過小鼠免疫試驗(yàn)，表明該疫苗可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，證明其具有免疫原性。前述的DNA疫苗，通過轉(zhuǎn)染人外周血來源DC細(xì)胞并與自體人T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對所選表位的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，表明該疫苗在人體中應(yīng)用的可行性。前述的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)在兩個表位盒的設(shè)計中均添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜引導(dǎo)信號(ER)以促進(jìn)表位多肽更高效的合成與折疊。設(shè)計中，本發(fā)明還在表位盒摻入了多個通用輔助性T細(xì)胞表位(HTL)。通用輔助性T細(xì)胞表位，具有與大多數(shù)人的HLA-DR分子、小鼠MHCII類分子高親和力結(jié)合的能力，可以有效地激活CD4+T淋巴細(xì)胞，使其分泌IL-2、IL-12等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子以旁路分泌方式作用于流感抗原特異性T細(xì)胞，從而可大大提高疫苗的免疫效力。已證實(shí)其摻入可以有效改善表位遞呈過程中受MHC限制性的影響，并已廣泛應(yīng)用于表位疫苗的設(shè)計與構(gòu)建中。我們以此來輔助組建的表位盒更好克服種屬和個體MHC限制性的問題而發(fā)揮功能。在搜集已發(fā)表的流感表位的基礎(chǔ)上，釆用生物信息學(xué)方法，對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感的HA和NA的T和B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測和篩選。隨后，通過體外實(shí)驗(yàn)，分析了預(yù)測的Th和B細(xì)胞表位的抗原性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了復(fù)合多表位DNA疫苗的設(shè)計與構(gòu)建，該DNA疫苗重組體轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，RT-PCR及間接免疫熒光檢測表明，目的蛋白成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以分別被標(biāo)準(zhǔn)各亞型HA陽性血清及M，NS，NA陽性血清所識別。該疫苗免疫BALB/c小鼠、雞、豬的免疫實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)的檢測，結(jié)果顯示這該疫苗可刺激小鼠、雞、豬、產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。最后，我們通過小鼠、雞、豬的免疫實(shí)驗(yàn)，對復(fù)合多表位DNA疫苗的免疫原性進(jìn)行了研究。本發(fā)明可同時預(yù)防多種亞型流感病毒，可對多種動物免疫保護(hù)，該疫苗可以與任何藥物(抗病毒藥物、治療性抗體等)核酸疫苗質(zhì)粒PVAX1-H3-EHA-H1-M2構(gòu)建流程示意圖2為本發(fā)明較佳實(shí)施例核酸疫苗質(zhì)粒pVAXl-H5-EHB-H3-M2構(gòu)建流程示意圖3為本發(fā)明較佳實(shí)施例核酸疫苗質(zhì)粒pVAXl-H5-EHC-H7-M2構(gòu)建流程示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明綜合利用分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)、分子免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)等不同學(xué)科知識、技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)模擬、分子設(shè)計、表位選擇以及基因重組技術(shù)，綜合考慮流感的特性、基因組結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)以及與感染和免疫緊密相關(guān)的問題，在分子水平上構(gòu)建了三個主導(dǎo)型的針對不同亞型、不同流行株均有預(yù)防作用的新型流感復(fù)合多表位基因工程預(yù)防疫苗pVAXl-AHI、pVAXl-BHI、pVAXl-CHI、pVAXl-ACI、pVAXl-BCI、pVAXl-CCI。該疫苗通過接種機(jī)體，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防病毒感染目的，既可以作為預(yù)防性疫苗用于雞群和豬群的免疫接種，同時對人群的流感預(yù)防也有積極作用。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質(zhì)粒的篩選與鑒定、PCR擴(kuò)增反應(yīng)等參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版相關(guān)章節(jié)進(jìn)行。實(shí)施例l流感多表位DNA疫苗的建立搜集已發(fā)表的流感表位，參考本發(fā)明之前已有研究的基礎(chǔ)上，從NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上分別下載獲得H1、H3、H5、H7、H9亞型流感HA基因和NA基因的氨基酸序列。生物信息學(xué)MHCI類分子預(yù)測釆用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYPEITHI(http:〃syfpeithi.bmi-heidelberg.com)、Bimas(http:〃www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla—bind)、Multipre(http:〃antigen.i2r.a-star.Edu.sg);生物信息學(xué)MHCII類分子預(yù)測釆用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYFPEITHI和Multipre;生物信息學(xué)B細(xì)胞表位預(yù)測釆用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Bcepred(http:〃www.intech.res.in/raghava/bcepred)和生物分子模擬軟件InsightII(Accelrys，2005);蛋白酶體切割預(yù)測采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器PAProC(http:〃www.paproc.de)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感HA和NA相關(guān)的CTL功能表位進(jìn)行分析，綜合各項(xiàng)結(jié)果篩選獲得CTL相關(guān)表位17條(請參閱序列表SEQIDNo.5至SEQIDNo.21所示)；對多亞型(Hl、H3、H5、H7、H9)流感HA的Th和B細(xì)胞表位進(jìn)行了共預(yù)測分析，綜合各項(xiàng)結(jié)果篩選獲得ThB相關(guān)表位12條(請參閱序列表SEQIDNo.22至SEQIDNo.33所示)。根據(jù)針對物種和目的不同，設(shè)計了三種主導(dǎo)型的復(fù)合多表位核酸疫苗，包括H3和H1亞型一對人類主要感染流感亞型預(yù)防的同時，通過多表位基因盒的加入對H5、H7、H9亞型實(shí)現(xiàn)共預(yù)防保護(hù)，目標(biāo)主要集中于人群；H3和H5亞型一對可能造成潛在大流行禽流感H5亞型和人流感H3亞型實(shí)現(xiàn)共預(yù)防的同時，通過多表位基因盒的加入對H1、H7、H9亞型實(shí)現(xiàn)共保護(hù)，目標(biāo)主要集中豬和人群；H5和H7亞型一對禽流感主要兩個高致病性亞型進(jìn)行共預(yù)防的同時，輔以多表位基因盒對H1、H3、H9亞型實(shí)現(xiàn)共保護(hù)，目標(biāo)主要集中于禽和人群。由于單獨(dú)的多表位基因盒，片段較小，形成空間構(gòu)型相對簡單，免疫原性較低。因此，本發(fā)明釆用復(fù)合多表位疫苗的形式以結(jié)構(gòu)基因嵌合多表位基因盒，來提高表位盒的免疫原性。依據(jù)表位盒功能的不同將其連接入不同結(jié)構(gòu)基因下游，如介導(dǎo)CTL功能為主的表位盒連接于NP基因下游；介導(dǎo)體液免疫的ThB表位盒和M2表位盒則連接入HA基因骨架內(nèi)。依據(jù)不同主導(dǎo)型的需要，釆用PCR方式從人工合成總表位盒中分別擴(kuò)增含有所需的不同功能表位盒。為了使融合基因能夠有效表達(dá)，在兩基因間添加柔性linker(G4S)3，以促進(jìn)表達(dá)蛋白進(jìn)行正確的空間構(gòu)象折疊，減少由于空間構(gòu)象間相互影響而可能產(chǎn)生的對抗原性的影響，此外還加入了具有自裂解功能口蹄疫2A蛋白linker。在翻譯起始的"ATG"處均添加Kozak序列，以促進(jìn)融合蛋白的更高效的表達(dá)。1、流感CTL表位盒和ThB表位盒的合成將所設(shè)計的表位盒序列交由上海旭冠生物工程有限公司進(jìn)行合成，CTL-1表位盒(如SEQIDNo.l所示)、M2表位盒(如SEQIDNo.4所示)按原有序列合成，CTL-2BOX(如SEQIDNo.2所示)和ThBBOX(如SEQIDNo.3所示)合成時主要合成表位的核心區(qū)域，以滿足后期DNA疫苗組建的需要。2、質(zhì)粒pVAXl畫H3-EHA-Hl-M2、pVAXl-H5畫EHB-H3畫M2、pVAXl畫H5隱EHC-H7畫M2、pVAXl-NP-ETA、pVAXl-NP-ETB、pVAXl-NP-ETC的構(gòu)建(1)H5HA、H1HA1、NP基因的獲得①模板制備將所得的A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)、A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的尿囊液，應(yīng)用TRIZOLLSReagent按說明書方法提取總RNA,用于病毒基因組反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。.流程如下取400pl病毒尿囊液于1.5ml離心管，加800fillTRIZOLLSReagent,混勻，室溫孵育10min;加入200nl氯仿，混勻，室溫孵育15min;12000g離心15min。吸取上層水相并加入500jil異丙醇，室溫孵育10min;417°C12000g離心10min;沉淀用1ml75%乙醇漂洗，干燥，溶于20^1DEPC處理雙蒸水，-70°(3凍存?zhèn)溆?。②引物設(shè)計應(yīng)用Prime引物設(shè)計軟件，參考Genbank登錄的相關(guān)序列，設(shè)計3對引物，分別由A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)擴(kuò)增H5HA基因，從A/NewCaledonia/20/99(H1N1)擴(kuò)增H1HA1和NP基因，引物由TaKaRa公司合成。③反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的RNALAPCRTMKit(AMV)對病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說明依次加入RNaseFreedH205.5(il、dNTPMixture2|il、RNaseInhibiter0.5(il、AMVReverseTranscriptaselfji、特異上游引物l(il、病毒RNA4(al，混勻后42。C孵育90min，-20"保存?zhèn)溆谩＂躊CR反應(yīng)用TaKaRa公司ExTaqTMKit擴(kuò)增HA和NP基因，按試劑盒說明加入10xExTaqBuffer(Mg2+plus)5[il、dNTPMixture(2.5mM)4|il、上游引物lpl、下游引物lfil、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3pl、TaKaRaExTaq酶0.25(il、滅菌蒸餾水35.75nl。PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定為94。C預(yù)變性5min,94°Clmin，55°C1min，72°C2min,35個循環(huán)，最后72°C延伸10min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物連接與陽性克隆質(zhì)粒的鑒定將上述H5N1亞型AIVHA基因，H1N1亞型IVHA和NP基因的PCR產(chǎn)物與pMD18-Tsimple載體連接，構(gòu)建pMD18-Tsimple-H5HA、pMD18-Tsimple-HlHA、pMD18-Tsimple-NP。按照載體試劑盒說明進(jìn)行操作。T載體1^1，T4連接酶l(il，回收DNA片段適量并加ddH20補(bǔ)至10|il，于16。C反應(yīng)14~16h。轉(zhuǎn)化后挑菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計相同者進(jìn)一步鑒定，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即為陽性重組質(zhì)粒。質(zhì)粒純化后由大連寶生物公司進(jìn)行序列測定。..(2)H3HA和H7HA基因的人工合成以A/AfricanStarling/983/79(H7N1)病毒株的HA基因?yàn)槟０?，人工合成完整HAORF核苷酸序列，克隆于pMD18-T上，構(gòu)建DNA重組體pMD18-H7HA。以A/Wisconsin/67/2005(H3N2)病毒株的HA基因?yàn)槟０澹斯ず铣赏暾鸋AORF核苷酸序列，并以簡并堿基突變掉序列內(nèi)部部分酶切位點(diǎn)，克隆于pMD18-T載體上，構(gòu)建DNA重組體pMD18-H3HA。(3)不同主導(dǎo)型多表位基因盒的獲得由于各主導(dǎo)型的DNA疫苗含有相關(guān)流感亞型完整HA或HA1組分，因此在表位盒中可以省略相關(guān)亞型的HA來源表位。根據(jù)不同主導(dǎo)型的需要，對人工合成的CTLBOX-2和ThBBOX進(jìn)行PCR改造，通過引物在片段兩端引入合適的酶切位點(diǎn)和linker或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜引導(dǎo)引號(ER),通用Th(HTL)表位一TT、PAN-DR、Gag,用于進(jìn)一步DNA疫苗構(gòu)建的需要。與pMD18-Tsimple載體連接，并獲得陽性克隆，純化質(zhì)粒送至大連寶生物公司進(jìn)行序列測定。將改造好的CTLBOX-2通過SpeI和SalI雙酶切，與以經(jīng)過相同雙酶切的含各流感通用Ml、NA1、NA2、NS1CTL表位的CTLBOX-1偶聯(lián)，構(gòu)建成各主導(dǎo)型所需CTL功能表位盒。改造好的H3/H1主導(dǎo)型CTL表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-ETA,其ThB表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EHA。H5/H3主導(dǎo)型CTL表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-ETB,其ThB表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EHB。H5/H7主導(dǎo)型CTL表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-ETC，其ThB表位盒陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EHC。0)HA及NP基因的改造根據(jù)不同主導(dǎo)型的需要，對獲得的HA和NP基因進(jìn)行PCR改造，19通過引物在片段兩端引入合適的酶切位點(diǎn)及l(fā)inker部分，用于進(jìn)一步DNA疫苗構(gòu)建的需要。與pMD18-Tsimple載體連接，獲得陽性克隆，純化質(zhì)粒送至大連寶生物公司進(jìn)行序列測定。獲得的含H5HA基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-H5HA，含H7HA1基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-H7HAl，含H3HA基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-H3HA,含H3HA1基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-H3HAl，含H1HA1基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-HlHAl,含NP基因陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-NP。再分別設(shè)計引物，PCR分別擴(kuò)增可直接用于在pVAXl表達(dá)的H1HA1、H3HA1、H7HA1基因。與pMD18-Tsimple載體連接，并獲得陽性克隆，純化質(zhì)粒送至大連寶生物公司進(jìn)行序列測定。將含有H1HA1基因的陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EHlHAl，將含有H3HA1基因的陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EH3HAl，將含有H7HA1基因的陽性質(zhì)粒命名為pMD18S-EH7HAl。(5)流感病毒復(fù)合多表位DNA重組體的構(gòu)建■H3/H1主導(dǎo)型相關(guān)DNA重組體的構(gòu)建(請參閱圖l所示)①DNA重組體pVAXl-H3的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-H3HA,獲得基因片段H3HA,與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-H3HA(pVAXl-H3)重組體質(zhì)粒。②DNA重組體pVAXl-EHl的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel和HindIII消化質(zhì)粒pMD18S-EHlHAl,獲得基因片段H1HA1，與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-HlHAl(pVAXl-EHl)重組體質(zhì)粒。③DNA重組體pVAXl-NP的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-NP,獲得基因片段NP，與以KpnI和XhoI消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-NP重組體質(zhì)粒。④DNA重組體pVAXl-H3-Hl的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H3和pMD18S-HlHAl，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H3中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H3-HlHAl(pVAXl-H3-Hl)。DNA重組體pVAX1-ETA的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-ETA,獲得基因片段ETA,與以EcoRI和Xhol消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-ETA重組體質(zhì)粒。DNA重組體pVAX1-EHA的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-EHA，獲得基因片段EHA，與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-EHA重組體質(zhì)粒。⑦復(fù)合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETA的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-NP和pMD18S-ETA,回收ETA基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質(zhì)粒pMD18S-NP-ETA。再用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化重組質(zhì)粒pMD18S-NP-ETA，與Kpnl和Xhol消化真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETA重組體質(zhì)粒。⑧復(fù)合多表位DNA重組體pVAX1-H3-EHA-H1-M2的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H3和pMD18S-EHA,回收EHA基因片段，定向克隆到pVAXl-H3中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H3-EHA。用限制性內(nèi)切酶Sphl和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-HlHAl和pMD18-M2,回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-HlHAl中，獲得重組質(zhì)粒pMD18S-HlHAl-M2。用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H3-EHA和pMD18S-HlHAl-M2，回收H1HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H3-EHA中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H3-EHA-H1HA1-M2(pVAXl-H3-EHA-Hl-M2)?！鯤5/H3主導(dǎo)型相關(guān)DNA重組體的構(gòu)建(請參閱圖2所示)①DNA重組體pVAXl-H5的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-H5HA，獲得基因片段H5HA，與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-H5HA(pVAXl-H5)重組體質(zhì)粒。②DNA重組體pVAX1-EH3的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel和HindIII消化質(zhì)粒pMD18S-EH3HA1，獲得基因片段H3HA1,與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-H3HAl(pVAXl-EH3)重組體質(zhì)粒。③DNA重組體pVAXl-H5-H3的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5和pMD18S-H3HAl，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H5-H3HAl(pVAXl-H5-H3)。④復(fù)合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETB的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-NP和pMD18S-ETB,回收ETB基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質(zhì)粒pMD18S-NP-ETB。再用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化重組質(zhì)粒pMD18S-NP-ETB，與Kpnl和Xhol消化真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETB重組體質(zhì)粒。復(fù)合多表位DNA重組體pVAXl-H5-EHB-H3-M2的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5和pMD18S-EHB,回收EHB基因片段，定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H5-EHB。用限制性內(nèi)切酶Sphl和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-H3HAl和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H3HAl中，獲得重組質(zhì)粒pMD18S-H3HAl-M2。用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5-EHB和pMD18S-H3HAl-M2,回收H3HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H5-EHB中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H5隱EHB-H3HA1-M2(pVAXl-H5-EHB畫H3-M2)。■H5/H7主導(dǎo)型相關(guān)DNA重組體的構(gòu)建(請參閱圖3所示)①DNA重組體pVAXl-EH7的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Nhel和HindIII消化質(zhì)粒pMD18S-EH7HAl，獲得基因片段H7HA1,與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-H7HAl(pVAXl-EH7)重組體質(zhì)粒。②DNA重組體pVAXl-H5-H7的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5和pMD18S-H7HAl，回收H7HA1基因片段定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H5-H7HAl(pVAXl-H5-H7)。③DNA重組體pVAXl-ETC的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-ETC,獲得基因片段ETC,與以EcoRI和XhoI消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-ETC重組體質(zhì)粒。DNA重組體pVAX1-EHC的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-EHC,獲得基因片段EHC，與以相同內(nèi)切酶消化的真核表達(dá)載體pVAXl連接，23經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-EHC重組體質(zhì)粒。復(fù)合多表位DNA重組體pVAXl-NP-ETC的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail消化質(zhì)粒pMD18S-NP和pMD18S-ETC,回收ETC基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，獲得重組質(zhì)粒pMD18SNP-ETC。再用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Sail消化重組質(zhì)粒pMD18SNP-ETC，與Kpnl和Xhol消化真核表達(dá)載體pVAXl連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒鑒定后獲得pVAXl-NP-ETC質(zhì)粒。復(fù)合多表位DNA重組體pVAX1-H5-EHC-H7-M2的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5和pMD18S-EHC，回收EHC基因片段，定向克隆到pVAXl-H5中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl-H5-EHC。用限制性內(nèi)切酶Sphl和Xhol消化質(zhì)粒pMD18S-H7HA1和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H7HAl中，獲得重組質(zhì)粒pMD18S-H7HAl-M2。用限制性內(nèi)切酶Clal和Xhol消化上述試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-H5-EHC和pMD18S-H7HAl-M2，回收H7HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAXl-H5-EHC中，獲得重組質(zhì)粒pVAXl陽H5陽EHC-H7HA1隱M2(pVAXl-H5-EHC-H7-M2)。3、流感病毒復(fù)合多表位DNA重組體的鑒定(1)流感復(fù)合多DNA重組體的酶切鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，取200(id涂于LB瓊脂平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落接種于2ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，小量制備質(zhì)粒DNA。選擇12種合適的限制性內(nèi)切酶單獨(dú)或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計相同者進(jìn)一步鑒定，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，為陽性重組質(zhì)粒。(2)流感復(fù)合多DNA重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞計數(shù)取細(xì)胞懸液0.5ml，加入臺盼蘭溶液0.5ml,充分振蕩后，置室溫5-10min，用移液器滴入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，按白細(xì)胞計數(shù)24法計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(N)。將四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)按公式換算成每亳升細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)n(n-N/4xl0000K,式中K為稀釋倍數(shù))。細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，稀釋細(xì)胞為5xl05/ml個裝瓶培養(yǎng)。每25ml容量小瓶裝4ml，置37'C孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞在l-2h貼壁，幾小時至十幾個小時后開始生長，24-48h長成單層。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染于6x30mm的培養(yǎng)板中接種傳代的BHK細(xì)胞lxl()S3xl0S個/m1,當(dāng)細(xì)胞長至60~80%單層時，將培養(yǎng)液棄掉，用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，備用。與在室溫下作用15-30min的轉(zhuǎn)染試劑LipofectatimeTM2000和重組質(zhì)粒的混合物共轉(zhuǎn)染。即在500^1MEM中，加入10jilLipofectatimeTM200，輕輕混勻，將重組質(zhì)粒DNA10pg加入到另取的500^1MEM中，混句；然后將后者滴加于前一液體中，吹氣混勻，溫室作用15-30min。轉(zhuǎn)染后4.5h,更換新鮮配制的含2%FCS的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲細(xì)胞。此步設(shè)pVAXl空白質(zhì)粒和細(xì)胞對照。(3)流感病毒復(fù)合多表位DNA重組體RT-PCR檢測釆用RT-PCR法，分別根據(jù)復(fù)合多表位重組質(zhì)粒pVAX1-NP-ETA，pVAXl-H3-EHA隱Hl隱M2、pVAXl隱NP隱ETB、pVAXl-H5畫EHB-H3-M2、pVAXl-NP-ETC、pVAXl-H5-EHC-H7-M2序列，對重組質(zhì)粒全序列進(jìn)行擴(kuò)增。收集轉(zhuǎn)染72h后表達(dá)質(zhì)粒及空載體細(xì)胞，2000r/min離心10min,提取細(xì)胞總RNA。按常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C5min;94。Clmin，58。Clmin,72。C3min,30個循環(huán)；72°C10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。分別轉(zhuǎn)染了pVAXl-NP-ETA、pVAXl-NP-ETB、pVAXl-NP-ETC的BHK細(xì)胞，經(jīng)RT-RCR擴(kuò)增，可見2400bp左右的條帶，與預(yù)計大小相符。分別轉(zhuǎn)染了pVAXl-H3-EHA-Hl-M2、pVAXl-H5-EHB-H3-M2、pVAXl-H5-EHC-H7-M2的BHK細(xì)胞，經(jīng)RT-RCR擴(kuò)增，可見4600bp左右的條帶，與預(yù)計大小相符。上述結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)，所構(gòu)建的復(fù)合多表位重組質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄。(4)流感病毒復(fù)合多表位DNA重組體間接免疫熒光法(IFA)PBS漂洗一次細(xì)胞板上細(xì)胞，冷丙酮固定10-15min。PBS洗滌3次，與兔抗不同亞型流感HA1陽性血清(1:300稀釋)反應(yīng)1.5小時，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG反應(yīng)1.5h。PBS洗滌3次，在板中滴一滴甘油緩沖液(50%甘油PBS)，置于熒光顯微鏡下，波長495nm處觀察和拍照(加入二抗后操作步驟均應(yīng)避光進(jìn)行，一般情況下，盡量在較短時間內(nèi)完成拍照，以免熒光淬滅)。復(fù)合多表位DNA疫苗轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，通過不同陽性血清進(jìn)行間接免疫熒光結(jié)果檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了各重組質(zhì)粒的BHK細(xì)胞均出現(xiàn)特異性綠色的熒光，特異性熒光分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均有分布，正常BHK細(xì)胞和空載體對照未出現(xiàn)特異性熒光，呈陰性反應(yīng)。說明重組質(zhì)粒各抗原組分可以獲得有效表達(dá)，抗原性良好。實(shí)施例2H3/H1主導(dǎo)型復(fù)合多表位核酸疫苗小鼠實(shí)驗(yàn)免疫研究1、實(shí)驗(yàn)分組、小鼠免疫及采樣將BALB/c雌性小鼠20只隨機(jī)分2組，每組10只，分別為pVAXl空質(zhì)粒對照組、pVAX-MEGNp24質(zhì)粒免疫組。免疫分三次進(jìn)行，間隔14d。每次向小鼠的雙側(cè)脛前肌注射lOOpgrDNA(溶于100pL無菌生理鹽水中)。于二免后2周取血，置4。C過夜，5000rpm離心10min，收集血清，-20匸保存?zhèn)錂z測用。第3次免疫后第10d摘眼球取血，頸推脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測細(xì)胞因子；同時無菌取其脾臟制備脾細(xì)胞懸液，分別用于特異性CTL活性測定、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和Thl/Th2類細(xì)胞因子檢測。26將6-8周齡雌性BALB/c小鼠100只隨機(jī)分10組，每組10只，包括8個免疫組，以及2個對照組空質(zhì)粒和PBS對照組。分別于0d、21d、35d,免疫三次。首次免疫小鼠的雙側(cè)脛前肌注射200(igrDNA(溶于100)Lil無菌ddH20中)。以后每次免疫IOO嗎rDNA。三免后10天眼動脈釆血，置4。C過夜，5000r/min離心10min,收集血清，2(TC保存?zhèn)淇贵w檢測用。取血結(jié)東后頸椎脫臼處死，同時無菌取其脾臟制備脾細(xì)胞懸液，用于檢測細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測——淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、IFNY-ELISPOT檢測和T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量分析。2、免疫小鼠血清ELISA抗體檢測將AIVH5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)抗原及H1、H3亞型滅活病毒，4。C過夜包被ELISA板并編號。甩掉包被物，洗滌5次，每孔加封閉液IOO37°C孵育lh。洗滌液充分洗滌5次，每孔加入lOOjul免疫鼠血清(l:IOO倍稀釋)，輕輕震蕩混勻，37'C溫育1.5h。甩干孔內(nèi)液體，用洗滌5遍，扣干。每空加入l:2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100ul，37°C孵育lh。甩干孔內(nèi)液體，洗滌5遍，扣干。加入新配制的顯色溶液OPD,輕輕震蕩混勻，37'C避光顯色15min。最后，加入終止液50pl，輕輕震蕩混勻，終止反應(yīng)，于492nm測定各孔吸光值。所得數(shù)據(jù)以AX士SD表示，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(t檢驗(yàn))。從抗H3亞型流感病毒特異性ELISA抗體檢測結(jié)果分析，各免疫組ELISA抗體自免疫一周后開始出現(xiàn)，并逐步上升，二免之后穩(wěn)步提高，三免后迅速提高并達(dá)到頂峰，45d時所有免疫組抗體水平均顯著高于對照組(p<0.01)。3、免疫小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測①脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備脫頸處死小鼠，消毒液浸泡5min，無菌條件下取出脾臟，置于盛有4mlHank's液的六孔板中，取出脾臟用雙層玻片研磨，lml大槍柔和吹勻混液。紗網(wǎng)輕柔過濾至含有4ml分離液(TDB)的10ml離心管，2000r/min離心15min。小心吸取中間層(淋巴細(xì)胞層)2-4ml至新10ml離心管中。加入5ml5%血清1640，輕柔反復(fù)洗滌二次，2000r/min離心10min。加入lml5%1640重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)細(xì)胞數(shù)至lxl。7個/ml，備用。②脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(WST法)操作步驟于96孔板中每孔分別加入用10%1640稀釋好的ConA(4ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50(il,同時設(shè)細(xì)胞中不加刺激物孔，而以加入與剌激劑等體積的10%1640作為組內(nèi)對照，每樣本各種刺激均設(shè)3個復(fù)孔。然后向每孔中加混勻后脾淋巴細(xì)胞懸液50^d,使每孔中培養(yǎng)液總體積為lO(Hil,細(xì)胞濃度為2xl04/100W,隨后置于5。/。37。C培養(yǎng)72h。每孔加入10|ilwst，繼續(xù)培養(yǎng)4h。用酶標(biāo)儀測定450nm吸光值，取3個孔平均值，計算刺激指數(shù)(SI)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(數(shù)據(jù)的描述釆用5C土SD，組間比較采用非配對t檢驗(yàn))。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組SI指數(shù)顯著高于對照組(p<0.05)和其它幾個免疫組，說明該組小鼠整體細(xì)胞免疫水平最高。證實(shí)表位盒的添加可以發(fā)揮相應(yīng)功能，引起全面的免疫應(yīng)答，有效提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能。③脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測取制備好的脾臟T淋巴細(xì)胞懸液取2xl(^個淋巴細(xì)胞于EP管中，加入lml的熒光洗液，1500r/min離心10min，洗滌2次。每管加入FITC標(biāo)記Anti-MouseCD4單克隆抗體(0.5mg/ml)、PE標(biāo)記Anti-MouseCD8a單克隆抗體(0.2mg/ml)、CY5/PE標(biāo)記Anti-MouseCD3e(0.2mg/ml)的熒光洗液200|il重新懸浮細(xì)胞，各抗體濃度均按1嗎/106個淋巴細(xì)胞?；靹蚝?。C避光孵育30min。熒光洗液1500r/min離心10min,洗滌2次。最后以用500jLil熒光保存液重懸，上樣檢測。相同方法，同時分別制備各染色抗體單染對照管和空白管。FACS檢測lxl()4個細(xì)胞，分別得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞的28數(shù)量，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組無論CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均最高，且復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組(pO.Ol),說明該組小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫水平最優(yōu)，可以推斷表位盒的加入顯著增進(jìn)了CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，有助于調(diào)節(jié)機(jī)體整體免疫水平，證實(shí)復(fù)合多表位的策略是具有顯著優(yōu)勢4、IFN-yELISPOT檢測每只鼠設(shè)3個刺激孔和3個對照孔，刺激孔每孔用50jal流感病毒液(1M0I)刺激，每孔總體積為200nl，細(xì)胞數(shù)為lxl0V孔，37°C，5。/。C02培養(yǎng)72h。去除培養(yǎng)液，加預(yù)冷的去離子水200nl/孔，培養(yǎng)板置冰上10min。lxWashingbuffer洗板5-7次，每次30s,最后一次，在吸水紙上扣干。加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，37。C孵育lh。lxWashingbuffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水紙上扣干。加入稀釋好的酶標(biāo)抗親和素，37。C孵育lh。1xWashingbuffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水紙上扣干。加入顯色劑AEC液，避光顯色，室溫避光靜置20min;去離子水清洗培養(yǎng)板2次，扣干。放于通風(fēng)處，室溫靜置10-30min,讓膜自然晾干。ELISPOT板斑點(diǎn)計數(shù)，并統(tǒng)計分析。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組ELISPOT斑點(diǎn)數(shù)均顯著多于對照組(p<0.01),復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組斑點(diǎn)數(shù)最多，說明該組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IFN-y的能力最強(qiáng)。實(shí)施例3H5/H3主導(dǎo)型復(fù)合多表位核酸疫苗豬實(shí)驗(yàn)免疫研究1、實(shí)驗(yàn)分組、豬免疫及釆樣將50日齡長白豬30只隨機(jī)分6組，每組5只。分為5個免疫組，l個空質(zhì)粒對照組，組間以不同耳號進(jìn)行標(biāo)記。分別于0d、21d、35d，免疫三次。首次免疫每只豬頸部肌肉注射2mgrDNA-殼聚糖納米粒懸29液。以后每次免疫lmgrDNA。分別于0d、14d、21d、35d、45d腹下靜脈釆血，5000r/min離心10min,收集血清，用于ELISA抗體的測定。三免后10天腹下靜脈無菌收集抗凝血用于外周血淋巴細(xì)胞分離，檢測細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測一淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量分析。收集的正常血液進(jìn)行血清分離后，用于血清細(xì)胞因子含量的測定和HI抗體的測定。2、免疫豬血清ELISA抗體水平檢測將AIVH5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)抗原及H1、H3亞型滅活病毒，4。C過夜包被ELISA板并編號。甩掉包被物，洗滌5次，每孔加封閉液IOOMl，37°C孵育lh。洗滌液充分洗滌5次，每孔加入100^1免疫豬血清(l:IOO倍稀釋)，輕輕震蕩混勻，37'C溫育1.5h。甩干孔內(nèi)液體，用洗滌5遍，扣干。每空加入l:2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100jul，37°C孵育lh。甩干孔內(nèi)液體，洗滌5遍，扣干。加入新配制的顯色溶液OPD，輕輕震蕩混勻，37。C避光顯色15min。最后，加入終止液50pl，輕輕震蕩混勻，終止反應(yīng)，于492nm測定各孔吸光值。所得數(shù)據(jù)以AX士SD表示，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(t檢驗(yàn))免疫組ELISA抗體自免疫一周后開始出現(xiàn)，并逐步上升，二免之后穩(wěn)步提高，三免后迅速提高并達(dá)到頂峰，45d時所有免疫組抗體水平均顯著高于對照組(p<0.01)。結(jié)果證實(shí)，復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組(pVAXl-H5-EHB-H3-M2+pVAXl-NP-ETB)誘生了與單獨(dú)表達(dá)H5HA的pVAXl-H5組相當(dāng)?shù)腍5亞型ELISA抗體水平。3、豬血清細(xì)胞因子檢測取出預(yù)包被ELISA板，依照順序?qū)?yīng)加入100^1的標(biāo)準(zhǔn)樣品于空白微孔中。分別標(biāo)記不同組別豬血清樣品，力口lOOpl于空白微孔中，每樣本均設(shè)2個復(fù)孔。隨后，在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加入50pl的酶標(biāo)記溶液。37匸下孵育60min。棄去孔內(nèi)液體，加入200^1洗滌液洗板5次，每次靜置l-2min。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入底物A、B液各50pL,37。C下孵育15min。最后，每孔加入50(il終止液，終止反應(yīng)。于450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔OD值。根據(jù)試劑盒說明分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算各樣品的細(xì)胞因子含量。所得數(shù)據(jù)以AX土SD表示，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。三免后10d，釆集免疫豬外周血，釆用細(xì)胞因子ELISA試劑盒檢測血清中IFN-y和IL-4含量。各免疫組IFN-y水平均顯著高于對照組(p<0.01)。其中雙亞型聯(lián)合免疫組IFN-y水平最高，顯著高于H3免疫組、H5免疫組和雙亞型免疫組(pO.05或0.01)，說明與NP聯(lián)合免疫，有效刺激了T淋巴細(xì)胞IFN-y分泌。而與復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組相比，差異不顯著。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組血清IL-4水平顯著高于雙亞型聯(lián)合免疫組(p<0.05)和其它免疫組(p<0.01),說明該組豬Th2細(xì)胞功能顯著增強(qiáng)。4、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答檢測外周血淋巴細(xì)胞懸液制備無菌條件下取10ml豬抗凝血，在其中加入10ml無血清1640,混句。將混合好的豬血緩慢移入已有20ml豬淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000r/min離心15min。小心吸取中間層(淋巴細(xì)胞層)5-8ml至滅菌的10ml離心管中，加入5ml含5%血清1640培養(yǎng)液混勻，1500rpm離心10min,洗滌2次。棄上清，加入2ml5。/。1640重懸細(xì)胞。計數(shù)，調(diào)細(xì)胞數(shù)至lxl(^個/ml，備用。②外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(WST法)于96孔板中每孔分別加入用10%1640稀釋好的ConA(2.5ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50ul，同時設(shè)細(xì)胞中不加刺激物孔,而以加入與刺激劑等體積的10%1640作為組內(nèi)對照,每樣本各種刺激均設(shè)3個復(fù)孔。然后向每孔中加混勻后豬外周血源淋巴細(xì)胞懸液50ul，使每孔中培養(yǎng)液總體積為lOOul,細(xì)胞濃度為2xl0Vl00ul，隨后置于5。/。37。C培養(yǎng)72h。每孔加入10ulwst，繼續(xù)培養(yǎng)4h。用酶標(biāo)儀測定450nm吸光值，取3個孔平均值，計算刺激指數(shù)(SI)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組SI指數(shù)最高，說明該組豬整體細(xì)胞免疫水平最高。其SI指數(shù)顯著高于雙亞型免疫組、H5免疫組、免疫組H3(p<0.05),但與雙亞型聯(lián)合免疫組差異不顯著，證明與NP聯(lián)合免疫策略，可以引起更為全面的免疫應(yīng)答，有效提高了機(jī)體整體細(xì)胞免疫水平。③外周血T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測制備好的豬外周血T淋巴細(xì)胞懸液取2"06個淋巴細(xì)胞于EP管中，加入lml的熒光洗液，1500r/min離心10min，洗滌2次。每個樣品分為兩份，一份加入PEConjugatedMouseAnti-PigCD8a和FITCConjugatedMouseAnti-PigCD3e，一份加入PEConjugatedMouseAnti-PigCD4a和FITCConjugatedMouseAnti-PigCD3e。均以熒光洗液200ul重新懸浮細(xì)胞，各抗體濃度均按lug/106個淋巴細(xì)胞?；靹蚝?，4"C避光孵育30min。熒光洗液1500r/min離心10min,洗滌2次。最后以用500)al熒光保存液重懸，上樣檢測。相同方法，同時分別制備各染色抗體單染對照管和空白管。FACS檢測lxl(^個細(xì)胞，分別得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。復(fù)合多表位聯(lián)合免疫組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于雙亞型聯(lián)合免疫組(P<0.05),說明該組豬機(jī)體細(xì)胞免疫水平最優(yōu)。而其CD3+CD4+與CD3+CD8+比值低于雙亞型聯(lián)合免疫組，可以推斷表位盒的加入顯著增進(jìn)了CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，在提高了機(jī)體整體免疫水平的同時，展示了Th2細(xì)胞免疫傾向的上調(diào)作用。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明設(shè)計的流感復(fù)合多表位DNA疫苗具有良好的抗原性和免疫原性，能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位及衣殼蛋白P24的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。同時，該疫苗轉(zhuǎn)染人外周血來源DC細(xì)胞后，與自體人T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，可刺激細(xì)胞產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明疫苗在人體中應(yīng)用的可行性。本發(fā)明所制備的復(fù)合多表位疫苗無論在誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫方面都具有顯著的優(yōu)勢的，而表位組分的加入在增進(jìn)表位亞型特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)上顯示了優(yōu)勢。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所<120〉流感復(fù)合多表位DNA疫苗及其應(yīng)用<130〉KHP09112908.0<160〉33<170>Paterrtlnversion3.5<210>1<211>426<212>DNA<213〉人工序列<400〉1gccgccaccatggg肌tgcaggtgc卿tccagagcctgtttctgctcctcctgtgggtg60cccggctccatctgggatttgtgttcacactcgccgcatacattctggga120tttgtgttcacactcaccgtgaaagctgctgccaagttcgtcgctgcctggaccctgaag180gctgccgctaaagcagcctgtgtg肌tggctcttgcttcactgtgaaagcsgccgcacaa240attgccatcttgataactactgtgacagctgcatacattacaggatttgcacctttttct300aaggctgccgcctctctctgtcctatccgctaggcgcagcagcctctatc360atcccttcaggccccctc犯agccgctgcaatC3tgga/taagaacatcat3ctg犯ggca420gccgcc426<210〉2〈211〉561〈212>腿<213〉人工序列<400〉2tacatttggggagttcaccaccctgttgcagcagcc肌attggc獄郷gatgcgg肌t60gtg犯ggcagccgccaacgtgacta/tgccaaa犯ggctgccgcatgtctg120"tagCCCCELCtgaatgccgccgctgaactgagggagcaattgagttcagtg180aaagccgccgctgtgacagcagcatgctcccatgccgg犯aagctgccgccacactgaca240tccctgtgaatgctgctgcatacatcgtcgcgccgttaaa300gccgctgcaaatgtgtcttacagtgg肌caagcaaagccgcagccacactgactgaaaga360ggagtgg肌gttaaggccgctgccaaactgt3Cggg3gtggaagcaagctg犯agccgca420gctac兆tggagcggacaaacattcctagagcagcagctacaatcatggaaaagaacgtt480actgttgccgcatacaccatcgggg犯tgccccaaa/tatgtg犯tgctgctgccacactg540tggtgccaaa561〈210>3<211〉1356<212〉DNA<213〉人工序列<400>3gccaccatgggcagatccagagcctgtttctgctcctcctgtgggtgccc60gggtcc卿ggaaaaagatggataatcctgggatt犯a/taaatgtatgga120cccgggcctggcaatgtacc郞agaaac犯3Ct3g鄧gC6Ltatttggcgc組cgcgggt180gacccgggcctg'gcagca犯gcctacagcaactgttacccttatgatgtg240ccggattatgcctcccttggacccgggcctggctgtcccagc犯犯cact300ctgaaattggggccggacccgggcctggcagggccctcta360aatgcttatgtctctgtagtgtcttcacattatggacccgggcctggcaaggaatcatgg420tcctacattg"tagaaacaccaMggacccgggcctggc朋ccacaccgta柳accggagtatcagcatcatgctcccataatggg犯ggccggacccgggcctggctcaggc540cccctcaaagccgagatcgcgcagagacttcccgggcctggccc600g卿tcgcgcagatgtcaaggccggacccgggcctggcga660aaaatacaaaattctctttcaactgaatggtccccatgtagtgt犯ctggscccgggcct720ggc組gtgtcttacagtgggcatgttcagattcattctac鄉(xiāng)agcgga780cccgggcctggcggagg犯aatggtcctacatcgtcgaaagaccatcggccgttaatgga8403tgtgtgg3Cccgggcctggccacaatgggatgctgtgtgcaacaaatctgggacatcct900ctcattctaaacaccaaggccggacccgggcctggcgacccagctctgat組ctgggga960atccatcactctggatcaaccgcag鄉(xiāng)gacccgggcctggctctatggggattcagagt1020gatgteic犯gttgatgccaattgtgaaggacccgggcctggccagaccaaattatacggg1080agctaataacagttgggaaggccggacccgggcctggcccctcctttttt1140tatggcttatggcctggcaca_ct￡La3cca<g1200agattggtactectagatccggggacccgggcctggctgc1260cccaaatstgtga犯tcaaacagattagtccttgcaacagggggacccgggcctggcgcc1320犯gttcgtggctgcctggaccctgaaggctgccgct1356〈210〉4<211〉681〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉4atgagccttct肌CCg3ggtcgaaacgcctaatgggggtg60gattcaagtgacggacccgggcctggcatg3gcctt;ct肌ccgaggtcgaaacgcctatc120agaaacg犯tgggggtgcagatgc犯cgattC肌gtg3Cggacccgggcctggcatgagc180cttctaaccgaggtcgaaacaacgaatgggggtgc卿tgcaacga/ttca240ccgggcctggcatgagccttcta^ccg兆gtcgaaacgcctatcagaaBc300g組gggggtgcagatgcaacgattcaagtgacggacccgggcctggcatgagccttcta360accg郷tcg犯acgcctatcagaaacgaatgggggt,gatgcaacgattc犯gtgac420ggacccgggcctggcatgagccttctaaccgaggtcgaaacgcctatcaga犯Cg33tgg480gggtgcagatgc犯cgattcaagtgacggacccgggcctggcatgagccttctaaccgag540gtcg犯acgcctatcagaaacg犯tgggggtgcagatgcaacgattcetagtgacggaccc600gggcctggcatgagccttctaaccgaggtcgaa^cgcctatcagaaacgaatgggggtgc660agstgcaacgattcaagtgac681<210>5<2U〉9<212>PRT〈213>人工序列<400〉5CysLeuLeuLysGlylieAlaProLeu15<210〉6〈211〉9<212>PRT<213>人工序列<400>6GluLeuArgGluGinLeuSerSerVal15<210〉7<211>9<212〉PRT<213>人工序列〈400〉7SerValValSerSerHisTyrSerArg15<210>8<211〉9<212>PRT<213〉人工序列<400〉8ThrLeuThrGluArgGlyValGluVal15<210>9<21D9〈212〉PRT<213>人工序列〈400〉9LysLeuTyrGlySerGlySerLysLeu15<210〉10<211〉9<212>PRT<213〉人工序列<400〉10ThrValGluArgThrAsnlieProArg15<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>11ThrLeuThrGluAsnAsnValProVal15<210〉12<211>9<212>PRT<213〉人工序列<400>12TyrlieValGluArgProSerAlaVal15<210〉13<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>13AsnValSerTyrSerGlyThrSerLys15〈210〉14<211>9<212>PRT'<213〉人工序列<400〉14TyrlieTrpGlyValHisHisProVal15<210〉15<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>15LysLeuAlaThrGlyMetArgAsnVal15■<210〉16<211>9〈212〉PRT<213〉人工序列<400>16AsnValThrMetProAsnAsnGluLys15<210>17<211>9<212〉PRT<213>人工序列<400>17ThrlieMetGluLysAsnValThrVal15<210>18<211>9<212〉PRT<213〉人工序列<400〉18ThrlieGlyGluCysProLysTyrVal15<210〉19〈211〉9<212〉PRT<213〉人工序列<400>19ThrLeuAsnGinArgLeuValProLys15<210>20<211〉10〈212〉PRT<213〉人工序列<400>20GinLeuAlalieLeulieThrThrValThr1510<210>21<211〉9<212>PRT〈213〉人工序列<400>21lieThrGlyPheAlaProPheSerLys15<210〉22〈211〉18<212〉PRT<213〉人工序列〈400〉22ArgAlaLeuTyrHisThrGluAsnAlaTyrValSerValValSerSer151015HisTyr<210〉23<211>15<212>PRT<213>人工序列〈400>23AsnHisThrValThrGlyValSerAlaSerCysSerHisAsnGly151015〈210〉24<211>15<212>PRT<213>人工序列〈400〉24ThrGluSerTrpSerTyrlieValGluThrProAsnProGluAsn151015<210>25<211>15<212〉PRT<213>人工序列<400〉25ProSerPhePheArgAsnValValTrpLeulieLysLysAsnSer151015〈210>26<211〉18<212>PRT〈213〉人工序列〈400〉26ThrLeuAsnGinArgLeuValProLyslieAlaThrArgSerLysVal151015AsnGly<210〉27<211>15〈212〉PRT<213〉人工序列<400>27CysProLysTyrValLysSerAsnArgLeuValLeuAlaThrGly151015〈210〉28〈211>16<212>PRT<213>人工序列〈400>28AspProAlaLeulielieTrpGlylieHisHisSerGlySerThrAla151015<210>29<211>15<212〉PRT<213〉人工序列<400>29GinThrLysLeuTyrGlySerGlySerLysLeulieThrValGly151015<210〉30<211>15<212〉PRT<213>人工序列〈400〉30SerMetGlylieGinSerAspValGinValAspAlaAsnCysGlu151015<210〉31<211>18<212〉PRT<213>人工序列〈400〉31AsnValSerTyrSerGlyThrSerLysAlaCysSerAspSerPheTyr151015ArgSer<210>32<211>18<212>PRT〈213>人工序列〈400〉32GlyGlyLysTrpSerTyrlieValGluArgProSerAlaValAsnGly151015MetCys〈210〉33<211>18<212〉PRT<213>人工序列<400〉33HisAsnGlyMetLeuCysAlaThrAsnLeuGlyHisProLeulieLeu151015AsnThr權(quán)利要求1、流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗編碼蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亞型流感病毒HA蛋白為載體骨架分子，并以ER信號肽作為引導(dǎo)序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒HA基因和NP、M、NA和NS1基因中高度保守的免疫優(yōu)勢表位，其中包括來源于上述亞型的流感CTL表位17個，來源于上述亞型的流感Th和B細(xì)胞表位12個；共29個表位的流感復(fù)合多表位DNA疫苗。2、如權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，所述Th和B細(xì)胞表位為下表所列表位18-29;所述CTL表位為流感HA基因組中17個高度保守的CTL免疫優(yōu)勢表位，如下表1-17所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>表位之間釆用柔性小分子linker連接。3、如權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，所述柔性小分子linker為KAA、KAAA、AAA、NAAA或AAY。4、如權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有抗原性。5、如權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有免疫原性。6、權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)所述的DNA疫苗在預(yù)防流感中的應(yīng)用。7、如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述疫苗同時預(yù)防多種亞型流感病毒，所述疫苗為注射劑。8、一種H3/H1主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其特征在于，釆用PCR方式從權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的DNA疫苗中擴(kuò)增H3和Hl亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。9、一種H3/H5主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其特征在于，釆用PCR方式從權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的DNA疫苗中擴(kuò)增H3和H5亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。10、一種H5/H7主導(dǎo)型流感復(fù)合多表位DNA疫苗，其特征在于，釆用PCR方式從權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的DNA疫苗中擴(kuò)增H5和H7亞型流感病毒HA基因并添加相應(yīng)的表位基因，獲得重組體質(zhì)粒。全文摘要本發(fā)明涉及流感復(fù)合多表位基因及利用其構(gòu)建的DNA疫苗。本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和相關(guān)軟件，對流感主要保護(hù)性抗原相關(guān)的HA和NA功能表位進(jìn)行了預(yù)測，共獲得了來源于多種亞型的流感CTL表位17條，來源于多個亞型的流感Th和B細(xì)胞表位12條。在兩個表位盒的設(shè)計中均添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜引導(dǎo)信號(ER)以促進(jìn)表位多肽更高效的合成與折疊。設(shè)計中，本發(fā)明還在表位盒摻入了多個通用輔助性T細(xì)胞表位(HTL)。利用流感多表位基因構(gòu)建的DNA疫苗同時預(yù)防多種亞型流感病毒，可對多種動物免疫保護(hù)。文檔編號A61K48/00GK101628118SQ20091009122公開日2010年1月20日申請日期2009年8月12日優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日發(fā)明者南文龍,張金雙,昌李,霄李,田明堯,磊譚,趙翠青,金寧一,金擴(kuò)世,魯會軍申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所