專利名稱：：小飛蓬總黃酮提取物及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：小飛蓬為菊科飛蓬屬植物E.canadensisL.的全草，為一年生草本，生于山坡、草地或田野、路旁。分布與東北地區(qū)及山西、內(nèi)蒙古、浙江、福建、江西、山東、河南、湖北、廣西、四川、云南、陜西和臺灣。飛蓬屬植物含有多種化學(xué)成分，迄今從該屬植物中獲得的天然產(chǎn)物有苯丙素類、黃酮類、萜類、炔類、香豆素類化合物等。研究發(fā)現(xiàn)苯丙素和黃酮類化合物是飛蓬屬主要的特征成份，也是目前研究較集中的部分。中藥大辭典記載，小飛蓬全草含揮發(fā)油，其中地上部分含檸檬烯，松油醇，二戊烯，枯牧烯、齊墩果酸等；花中含有倍半萜烯，乙酸亞油醇酯及醛類，母菊酯，去氫母菊酯，還含有香草酸，丁香酸等。藥理研究方面尚無關(guān)于小飛蓬的藥理作用的文獻(xiàn)報道。中國植物志記載，小飛蓬具有止血、利尿的功效。國外文獻(xiàn)記載，小飛蓬用于治療腹瀉、痢疾、水腫、咳血。中藥大辭典記載，小飛蓬地上部分石油醚和乙醇提取物具有抗炎活性，新鮮生藥的水提取液具有抗菌活性。小飛蓬全草總黃酮水溶性部分對心血管系統(tǒng)也有明顯作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種小飛蓬總黃酮提取物及其制備方法和藥物用途。本發(fā)明小飛蓬總黃酮提取物是由下述方法得到的-a.取小飛蓬干燥全草，加入4~8倍量的40%95%乙醇或甲醇回流提取2~4次，每次1~3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解、過濾，將濾液加于已處理好的大孔樹脂柱上；或干品加甲醇或乙醇溶解后用大孔樹脂拌樣，加于已處理好的大孔樹脂柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用47個柱裝體積的10%90%乙醇洗脫，回收洗脫液、濃縮至干，得小飛蓬總黃酮提取物。一種制備上述小飛蓬總黃酮提取物的方法。大孔吸附樹脂柱采用DM301、DlOl、AB8、DM130、HPDIOO、HPD600或DA201。本發(fā)明在制備抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供用本發(fā)明的小飛蓬總黃酮提取物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑。這些藥物制劑選自以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射劑，注射乳劑、凍干粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑。本發(fā)明的含有小飛蓬總黃酮提取物的藥物制劑，在制備藥物制劑時可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體來自抗氧劑、鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、濕潤劑、溶劑、緩釋材料、腸溶材料、pH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鈉、硅衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等。該發(fā)明的有益效果填補了制備小飛蓬總黃酮提取物的空白并擴展了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，從而提高了該類制劑在國際市場的競爭力。用量為每天8001000毫克。具體實施例方式以下通過試驗例來進(jìn)一步闡述發(fā)明所述藥物的有益效果，這些試驗例包括了本發(fā)明藥物的藥效學(xué)試驗。本發(fā)明藥物對小鼠多種移植實驗性腫瘤的抑制作用本發(fā)明藥物經(jīng)藥效學(xué)實驗證明對小鼠多種移植實驗性腫瘤有明顯的抑制作用，500、250mg/kg受試物對小鼠肉瘤(S18。)、肝癌A22(H印A22)、艾氏腹水癌(ESC)、肺癌(Lewis)均有明顯的抑制作用。實驗?zāi)康臋z測受試物對小鼠移植性腫瘤生長的影響影響。4實驗材料1.藥物及試劑受試物，為黃色，由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供，含量67%，批號070717。環(huán)磷酰胺，為上海華聯(lián)制藥有限公司(批號000705)和上海第十二制藥廠(批號071015)產(chǎn)品，PRMI—1640培養(yǎng)基(Gibco)USA，胎牛血清(FCS)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所購進(jìn)(批號200004)，曲拉通(Triton-X100)Sigma，還原型輔酶I(CoI,NADH)Sigma，其余試劑均為市售。2.動物及瘤株昆明種小白鼠，購自長春生物制品研究所，C57BL/6純系小鼠，合格證號10-1025，由白求恩醫(yī)科大學(xué)實驗動物室提供，體重18-22g，雌雄兼用。S18。、H印.A22、ESC、Lewis均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)。3.儀器C02培養(yǎng)箱(SANYO,MCO—175M)Japan，超凈工作臺(CJ-1)蘇州長橋凈化設(shè)備廠，紫外光度計(TU-1221)北京瑞利分析儀器廠，自動酶標(biāo)儀(CliniBio)EC，倒置顯微鏡(OLYPUS)Japan,96/24孔培養(yǎng)板(Costar)USA。實驗方法及結(jié)果1.受試物對S18。、H印A22、ESC、Lewis實體瘤抑瘤作用取荷瘤傳代鼠脫頸椎處死，固定于板上。用碘酊及酒精消毒動物皮膚，切開皮膚，選擇腫瘤生長良好、無壞死或液化的瘤組織，加入無菌生理鹽水，用組織勻漿器制成含3000萬/ml左右的細(xì)胞懸液，于小鼠腋窩皮下接種0.2ml/只，接種部位皮膚先用碘酊及酒精消毒。每個瘤株，每次試驗接種60只小鼠，接種后次日隨機分組，每組12只，試驗設(shè)高、中、低三個劑量(500，250，125mg/kg)及試驗對照組(生理鹽水)和陽性藥組(環(huán)磷酰胺20mg/kg)。小鼠灌胃給藥，每天一次，給藥10天后處死，稱體重，摘瘤稱重，計算抑瘤率，實驗結(jié)果見表1一4。給藥組平均瘤重(T)瘤重抑制率=(1--~"-)xioo%對照組平均瘤重(Q上述實驗結(jié)果表明受試物對小鼠Sw。、fep.A22、ESC及Lewis等實體瘤均有明顯的抑制作用。表1受試物對小鼠S,8。的抑制作用三次重復(fù)實驗結(jié)果(X土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與對照組比較，"PO.001,P〈0.01,表2、3、4同表2受試物對小鼠H印.A22的抑制作用三次重復(fù)實驗結(jié)果(X土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3受試物對小鼠ESC的抑制作用三次重復(fù)實驗結(jié)果(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明藥物對小鼠免疫功能的影響受試物對荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和體液免疫功能均有明顯的增強作用，并可顯著提高NK細(xì)胞活性，40mg/kg受試物既可促進(jìn)脾細(xì)胞淋轉(zhuǎn)，又可明顯提高白細(xì)胞介素-2(IL-2)活性。一、受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響動物昆明種小白鼠60只，體重20土lg，雌雄各半，由長春生物制品研究所提供。小鼠移植性肝癌(H22)瘤株由中國醫(yī)科學(xué)院藥物研究所腫瘤室提供。儀器和試劑顯微鏡；雞紅細(xì)胞；丙酮；甲醇；生理鹽水；Gienisa染色液；玻片；注射器。環(huán)磷酰胺(CP，上海第十二制藥廠生產(chǎn)，批號011015);受試物(Rh2)由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供，批號070117。實驗分組實驗隨機分成六組，正常對照組；無菌操作取荷肝癌(H22)小鼠腹水，用0.9y。生理鹽水稀釋至含lX107ml，每只右腋皮下接種0.2ml(2X107只)隨機分成1荷瘤對照組(H22);H22荷瘤陽性對照組(H22CP);仏2荷瘤受試物(H22Rh2)高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。給藥方法小鼠接種瘤細(xì)胞24小時后開始給藥，正常對照組(灌胃等體積的生理鹽水)；H22荷瘤對照組(灌胃等體積的生理鹽水)；H22陽性對照組(灌胃CP，20mg/kgXl，連續(xù)給予);H22受試物高劑量組(0.5g/kg)、中劑量組(0.25g/kg)、低劑量組(0.125g/kg)，每日灌胃給與一次，連續(xù)給藥10天，免疫動物后繼續(xù)給藥5天，體積均為0.2ml/10g。細(xì)胞懸液制備取雞血置于有玻璃珠的錐形瓶中，朝一個方向充分搖動，以脫纖維，用生理鹽水洗滌3次，離心2000轉(zhuǎn)/分鐘，10min，棄上清，用生理鹽水配成20%(V/V)的雞紅細(xì)胞懸液。吞噬功能測定末次給藥后，次閂清晨每只鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液化1ml，輕柔腹部，30min后，頸椎脫臼處死動物，立即開腹吸取腹腔液滴在玻片上約0.2ral，玻片置入37'C,孵育30min后，再用生理鹽水中漂洗，除去未貼片細(xì)胞，晾干，以1:10l丙酮甲醇溶液固定，4%(V/V)Gienisa-磷酸緩沖液染色3min，蒸餾水漂洗晾干。顯微鏡下結(jié)果判定油鏡下計數(shù)巨噬細(xì)胞，每張計數(shù)100個，按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)吞噬％=-X100%計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)-計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)實驗結(jié)果(見表l)表l、受試物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響("X土s)分組劑量(g/kg)動物數(shù)吞噬百分率(％)吞噬指數(shù)對照組_1033.2±3.0141.7±3.47H221025.70±4.59A37.7±5.40H22+CP0.021022.3士3.80"31.4±6.60AAJ"b+本品0.51043.1±4.53**67.0±4.67***0.251040.6±2.59**62.2±5.65***0.1251038.7±3.27*58.4±2.68***&2受試物各劑量組與H22組比較有明顯差異，*P<0.05，**<0.0I，***P<0.001，&2和H22CP組與正常對照組比較顯著降低AP0.05,"P0.01。實驗結(jié)果表明受試物各劑量組能明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，而環(huán)磷酰胺明顯抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。二、受試物對小鼠體液免疫的影響一血清溶血素測定血凝法動物昆明種小白鼠60只，雌雄各半，體重20士lg，，由長春生物制品研究所提供。H22肝癌瘤株由中國醫(yī)科學(xué)院藥物研究所腫瘤室提供。試劑和儀器受試物由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供，批號070117;陽性對照藥:環(huán)磷酰胺(CP，上海第十二制藥廠，批號071015);C02培養(yǎng)箱(SANYO,MCO—175M，Japan);超凈工作臺(CJ-1，蘇州長橋凈化設(shè)備廠)；微量血凝計數(shù)板，離心機。實驗方法(一)、實驗分組同前。(二)、給藥方法同前。(三)、SRBC:綿羊頸靜脈取血，將羊血放入在玻璃珠的滅菌稚形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入《C冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。(四)、免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心(2000轉(zhuǎn)/分，10min，將壓積SRBC用生理鹽水配成2M(V/V)的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.21111進(jìn)行免疫，5天后，摘除眼球取血于離心管中內(nèi)，放置約lh，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000轉(zhuǎn)/分，10min，收集血清。(五)、凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋濃度的血清分別置于微量試驗板內(nèi)，每孔100(il，再加入100pl0.5。/。(v/v)的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37。C溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度?？贵w積數(shù)=(Sl+2S2+3S3+….nSn)1、2、3、....n稀釋倍數(shù)，S代表凝集程度的級別。實驗結(jié)果(見表2)表2、對荷瘤小鼠體液免疫的影響一血清溶血素測定血凝法Ot土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>H22受試物高、中劑量組和低劑量組與H22荷瘤對照組比較顯著升高+P〈0.05，**P<0.01，***P<0.001;H22CP組.、H22與正常對照組比較有顯著降低作用"Ap〈0.001,AP<0.05。實驗結(jié)果表明受試物各劑量組抗體數(shù)明顯高于對照組和CP組，說明受試物組有明顯促進(jìn)荷瘤小鼠體液免疫功能的作用，而環(huán)磷酰胺組則明顯抑制體液免疫功能的作用。三、受試物對荷瘤小鼠NK細(xì)胞毒活性、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、白細(xì)胞介素的影響動物和細(xì)胞株昆明種小白鼠60只，體重20土lg，雌雄各半，由長春生物制品研究所提供。H22肝癌瘤株由中國醫(yī)科學(xué)院藥物研究所腫瘤室提供。淋巴細(xì)胞(YAC-1，購自武漢大學(xué)菌種保藏中心)。試劑和儀器PRMI—1640培養(yǎng)基(Gibco，USA);胎牛血清(FCS，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所購進(jìn)，批號200004);曲拉通(Triton-XIOO，Sigma);還原型輔酶I(CoI，NADH，Sig脇);陽性對照藥環(huán)磷酰胺(CP，上海第十二制藥廠，批號011015);受試物由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供，批號070717;C02培養(yǎng)箱(SANY0，MC0—175M，Japan);超凈工作臺(CJ-1，蘇州長橋凈化設(shè)備廠)紫外光度計(TU-1221，北京瑞利分析儀器廠)；自動酶標(biāo)度儀(CliniBio，EC);倒置顯微鏡(OLYPUS，Japan);96/24孔培養(yǎng)板(Costar，USA)。實驗方法(一)、接種方法和實驗分組實驗隨機分成六組，正常對照組；模型組無菌操作取荷肝癌(H22)小鼠腹水，用0.9%生理鹽水稀釋至含1X107ml，每只右腋皮下接種0.2ral(2X107只)隨機分成荷瘤對照組，陽性對照組(H22CP);受試物(H22Rh2)高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組io只。(二)、給藥方法小鼠接種瘤細(xì)胞24小時后開始給藥，正常對照組灌胃等體積的生理鹽水)。荷瘤對照組(灌胃等體積的生理鹽水)、陽性對照組(灌胃CP，20mg/kg，每天一次)、受試物高劑量組(500mg/kg)、中劑量組(250mg/kg)、低劑量組(125mg/kg)，連續(xù)給藥10天，每R灌胃一次，體積均為20ml/kg，于停藥次日清晨斷頭處死小鼠，13無菌取脾，檢測NK細(xì)胞活性、IL-2的能力和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。(三)、脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，放置在無血清的PRMI—1640培養(yǎng)液中，將脾剪成lmm3，用注射器芯研磨至單個細(xì)胞，過200目尼龍網(wǎng)，1000轉(zhuǎn)離心10min，按文獻(xiàn)制備成細(xì)胞懸液，備實驗用。(四)、NK細(xì)胞毒活性一胞漿乳酸脫氫酶(LDH)釋放法各實驗組脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞O.lml(2Xl(f細(xì)胞/管)，加靶細(xì)胞(YAC-1)懸液0.ltnl(2.0X105細(xì)胞/管)，加小牛血清O.lml，補加培養(yǎng)液至lml，每組設(shè)5個平行。自然釋放管加YAC-1細(xì)胞懸液0.lml，小牛血清0.lml，補加培養(yǎng)液0.8ml。最大釋放管每管加YAC-1細(xì)胞懸液0.lml，小牛血清0.lml，補加l%Triton-X1000.8ml。上述各試驗組置37。C，5%C02的培養(yǎng)箱中，飽和濕度培養(yǎng)18h，1000轉(zhuǎn)/分，離心5min，取全部上清液。加LDH反應(yīng)液3ml，用分光光度計以340nm，32'C恒溫測定吸光度值。(五)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)一MTT比色法按上述方法制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107L。將此細(xì)胞懸液每樣品分成品1份至24孔培養(yǎng)板中，每孔加lml，一份ConA10mg/L，另一份作為對照。置C02培養(yǎng)箱68h后，換成不完全培養(yǎng)液，并將細(xì)胞移至96孔板，每孔100yl。再加10ylMTT(5g/L溶液)。繼續(xù)培養(yǎng)4h。后加入100y1酸性異丙醇(O.04mol/L—異丙醇)，自動酶標(biāo)光度計上570nm處讀OD.值。結(jié)果以轉(zhuǎn)化指數(shù)表示。(六)、IL一2的制備和活性檢測IL一2的誘生無菌制脾細(xì)胞懸液方法同前，用P脂I一1640培養(yǎng)液洗滌2次，配成lX10Vml細(xì)胞懸液，每孔100ul加入96孔培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)胞為5X106個。離心收集上清液，置一2(TC冰箱保存?zhèn)溆?。制備活化的脾?xì)胞懸液無菌制脾細(xì)胞懸液方法同前，制成5X106個/ml細(xì)胞懸液，加入ConA使其濃度5ul/ml，置37'C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，離心兩次，重懸于PRMI—1640培養(yǎng)液中，作為IL一2活性檢測細(xì)胞。IL一2活性檢測取一2(TC保存的IL—2上清液和檢測小鼠脾細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入IL一2上清液和反應(yīng)細(xì)胞各100ul，陰性對照組加100y1PRMI—1640培養(yǎng)液，各設(shè)4個平行樣。置37。C，5XC02飽和濕度培養(yǎng)48h，每孔加入MTT(5mg/ml)10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入酸化異丙醇100w1，充分振蕩后靜置20min，全自動酶標(biāo)儀MTT法比色分析法測定IL一2活性(0D值)。表3、受試物對荷瘤H22小鼠NK細(xì)胞活性的^"向(5T士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>受試物高、中劑量組與荷瘤H22組比較tP0.05,**P<0.01。表5、受試物對荷瘤H22小鼠脾細(xì)胞IL--2活性的影響(X—±S)分組齊懂(mg/kg)動物數(shù)IL-2活性(OD值)對照組—100.134土0.021一100.075±0.029AH22+CP20100.060±0.017aH22+本品500100.123±0.032*H22+本品250100.089±0.019H22+本品125100.070±0.022受試物高劑量與荷瘤H22組比較*<0.05，H22和H22+CP與正常對照組比較^<0.05。NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫中非特異部分，很多研究發(fā)現(xiàn)荷瘤H22機體NK細(xì)胞活性明顯降低，本實驗也得到同樣的結(jié)果。即荷肝癌(H22)模型組小鼠的NK細(xì)胞活性處于嚴(yán)重低下狀態(tài)，而受試物高、中劑量組與荷瘤組比較NK細(xì)胞活性有明顯增強，高劑量組同時促進(jìn)脾細(xì)胞淋轉(zhuǎn)。IL一2主要是由活化的輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，IL一2具有自身正向免疫調(diào)節(jié)作用，但在大多數(shù)荷瘤機體，IL一2系統(tǒng)處于明顯的抑制或紊亂。實驗結(jié)果表明，荷瘤小鼠的IL一2活性低于正常組，而受試物高劑量組IL一2活性顯著高于荷瘤組。受試物通過調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能，發(fā)揮其抗腫瘤作用。本發(fā)明藥物的抗炎作用實驗試驗材料動物Wistar雄性大鼠，購自長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心，合格10-5112，體重220-260g。昆明種小鼠19-21g，雌雄均用，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，許可證號SCXK-(吉)2003-0001。藥物藥名、來源、批號、配制方法。試驗方法與結(jié)果1.對大鼠角叉菜膠性足腫脹取大鼠50只，隨機分為五組對照組，0.2g/kg陽性藥阿司匹林組，0.35、0.175、0.875g/kg受試藥三個給藥組，共五組。連續(xù)給藥5天，于末次給藥l小時后于大鼠右后足腱膜下注入0.05。/。角叉菜膠0.15ml/只，然后于注射后l、2、3、4、5、6小時測其足腫脹(先于注射前測正常大鼠足周長)，以于正常足值之差作為腫脹度。結(jié)果見表1。表l.對大鼠角叉菜噴性組腫脹的影響組別劑量足腫脹程度g/kglh2h3h4h5h6h對照組7.7±1.316.7±1.820.5±2.620.5±2.319.9±1.917.8±1.0陽性藥3.26.6±1.514.8±2.0*17.8±2.2*18.6±2.517.2±2.217.6±1.8受試藥0.355.8±1.4**13.4±2.4**17.5±1.8**17.8±2.1*17.8±2.2*16.3±1.6*受試藥0.1756.2±1.0**13.9±2.4**18.1±1.7*.18.4±1.6*18.2±1.6*17.3±1.9受試藥0.8756.4±1.4*14.3±2.9*18.9±2.520.0±0.519.3±1.717.6±2.1與對照組比較tp〈0.05。2.對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響取雄性小鼠50只，隨機分為對照，阿司匹林0.2g/kg，0.35、0.175、0.875g/kg受試藥三個給藥組，共五組，每組10只，每天給藥1次，連續(xù)5日，于末次給藥lh后，與小鼠右耳涂二甲苯20W，20min后處死小鼠，利用9mm鐵沖下動物左右耳，以動物左右耳差作為腫脹度，進(jìn)行"t"檢驗，結(jié)果見表2。_表2.對小鼠二甲i苯耳腫脹的影響_組別劑量(g/kg)腫脹程度(Amm)對照組13.32±3.34陽性藥4.69.80±3.04*受試藥0.359.59±2.32**受試藥0.17510.45±2.56*受試藥0.87510.96±5.79*與對照組比較木p〈0.05。從表l、2可見，受試藥具有明顯的抗炎作用。本發(fā)明藥物的動物急性毒性實驗資料摘要受試物的LDs。為2.4485g/kg，U為2.39522.5018g/kg。實驗?zāi)康挠^察受試物一次性給予饑餓小鼠后產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)和死亡情況。受試藥物受試物，長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供，含量67%。批號070717。動物昆明種小鼠，雌雄各半。購自長春衛(wèi)生部生物制品研究所，合格證號為SCXK-2002-0001。方法取小鼠60只，按體重及性別隨機分為6組，每組10只，雌雄各半。各組分別按附表所示劑量灌胃給藥1次，給藥容積為0.2ml/10g。觀察給藥14日內(nèi)小鼠急性毒性反應(yīng)情況及死亡分布，給與受試物組24h左右后動物出現(xiàn)死亡，并根據(jù)各劑量組死亡情況，依Bliss計算半數(shù)致死量(LD5。)及其95%可信限(Us)。結(jié)果-灌胃給藥后小鼠不動或少動、深呼吸、強直性抽搐而死亡，死亡時間多數(shù)在給藥24h后，偶有48h后死亡的，肉眼尸檢未發(fā)現(xiàn)主要臟器有異常改變。表l.受試物小鼠LDs。的測定劑量(g/kg)對數(shù)劑量(x)動物數(shù)(只)死亡動物數(shù)(只)死亡率(％)4.0000.602110101003.2000.5051108802.5600.4082105502.0480.3113103301.6380.2144101101.310720.11751000LD50=2.4485g/kgU=2.39522.5018g/kg,實施例la.取小飛蓬干燥全草，加入4倍量的40%乙醇回流提取2次，每次分別1小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解，過濾，濾液加于己處理好的大孔樹脂D101柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂DIOI柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用10%乙醇洗脫，再將該10%乙醇洗脫液濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。18實施例2a.取小飛蓬干燥全草，加入6倍量的70%乙醇回流提取3次，每次分別l小時、2小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解，過濾，濾液加于巳處理好的大孔樹脂DM301柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂DM301柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用70%乙醇洗脫，再將該70%乙醇洗脫濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。實施例3a.取小飛蓬干燥全草，加入8倍量的90%乙醇回流提取4次，每次分別1小時、2小時、2小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解，過濾，濾液，加于已處理好的大孔樹脂AB8柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂AB8柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用90%乙醇洗脫，再將該90%乙醇洗脫濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。實施例4a.取小飛蓬干燥全草，加入5倍量的50%甲醇回流提取2次，每次分別1小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，干品加甲醇溶解后用大孔樹脂HPD600拌樣，加于己處理好的大孔樹脂HPD600柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂HPD600柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用50%乙醇洗脫，再將該50%乙醇洗脫濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。實施例5a.取小飛蓬干燥全草，加入6倍量的30%甲醇回流提取3次，每次分別l小時、2小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，干品加乙醇溶解后用大孔樹脂HPD100拌樣，加于已處理好的大孔樹脂HPD100柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂HPD100柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用30%乙醇洗脫，再將該30%乙醇洗脫濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。實施例6a.取小飛蓬干燥全草，加入7倍量的60%甲醇回流提取4次，每次分別1小時、2小時、2小時和3小時；b.合并提取液，濃縮至干，干品加乙醇溶解后用適量大孔樹脂DM130拌樣，加于已處理好的大孔樹脂DM130柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂DMBO柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用60%乙醇洗脫，再將該60%乙醇洗脫濃縮干燥，得小飛蓬總黃酮提取物。本發(fā)明提取物還可能通過下述方法獲得(1).加熱回流提取法取小飛蓬干燥全草(粉碎24cm)4份，每份各50g，分別加入有機溶劑乙酸乙酯、丙酮，250350ml，溶劑量為藥材量的57倍，加熱回流提取24次，每次l3小時；合并提取液，6080'C回收溶劑，608(TC減壓干燥得干品。(2).超聲法提取法取小飛蓬干燥全草(粗粉)4份，每份各50g，分別加入4090%有機溶劑乙醇、甲醇，或乙酸乙酯、丙酮250350ml，溶劑量為藥材量的57倍，超聲3060KHz提取24次，每次0.51小時。合并提取液，608CTC回收溶劑，608(TC減壓干燥得干品。(3).超臨界提取法取小飛蓬干燥全草(粗粉)50g，投入萃取釜中，設(shè)置分離釜I溫度4(TC、分離釜I壓力7.0MPa、分離釜II壓力6MPa，溫度35'C，在萃取壓力2050Mpa，萃取溫度3050。C，萃取時間13小時，CO2流量2030L七，萃取級數(shù)12，乙醇夾帶劑濃度2570%條件提取總黃酮。萃取達(dá)到預(yù)定時間后，收集提取物，除去水分。(4).浸漬提取法取小飛蓬干燥全草(2060目)4份，每份各50g，分別加入40100°/。有機溶劑:乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮等250350ml，溶劑量為藥材量的57倍，浸泡提取24次，每次1248小時。合并提取液，608(TC回收溶劑，608(TC減壓干燥得干品。(5).滲漉提取法取小飛蓬千燥全草(40100目)4份，每份各50g，分別加入40100%有機溶劑乙醇、甲醇、乙酸乙酯或丙酮50100ml，溶劑量為藥材量的12倍，浸泡24小時，裝入滲漉器中，緩緩從滲漉器頂部加上述有機溶劑250350ml(溶劑量為藥材量的57倍)，放置2448小時后打開下口開關(guān)，使?jié)B漉液緩緩流出。6080°C回收溶劑，6080'C減壓干燥得干品。(6).微波提取法取小飛蓬干燥全草(40100目)4份，每份各50g，分別加入40100%有機溶劑乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮40005000ml，使用微波提取器提取，微波功率190250W，提取24次，每次525min。合并提取液，過濾，6080。C回收溶劑，608(TC減壓干燥得干品。本發(fā)明實施例中所用大孔樹脂的性能指標(biāo)表:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求1、一種小飛蓬總黃酮提取物，其特征在于是由下述方法得到的a.取小飛蓬干燥全草，加入4～8倍量的40％～95％乙醇或甲醇回流提取2～4次，每次1～3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解、過濾，將濾液加于已處理好的大孔樹脂柱上；或干品加甲醇或乙醇溶解后用大孔樹脂拌樣，加于已處理好的大孔樹脂柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用4～7個柱裝體積的10％～90％乙醇洗脫，回收洗脫液、濃縮至干，得小飛蓬總黃酮提取物。2、如權(quán)利要求1所述的小飛蓬總黃酮提取物的制備方法，其特征在于包括下列步驟a.取小飛蓬干燥全草，加入48倍量的40%95%乙醇或甲醇回流提取2~4次，每次1~3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解、過濾，將濾液加于己處理好的大孔樹脂柱上；或干品加甲醇或乙醇溶解后用大孔樹脂拌樣，加于已處理好的大孔樹脂柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用47個柱裝體積的10%90%乙醇洗脫，回收洗脫液、濃縮至干，得小飛蓬總黃酮提取物。3、如權(quán)利要求2所述的小飛蓬總黃酮提取物的制備方法，其特征在于步驟b中大孔吸附樹脂柱采用DM301、DlOl、AB8、DM130、HPDIOO、HPD600或DA201。4、如權(quán)利要求1所述的小飛蓬總黃酮提取物在制備抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種小飛蓬總黃酮提取物及其制備方法和藥物用途，屬于中藥領(lǐng)域。a.取小飛蓬干燥全草，加入4～8倍量的40％～95％乙醇或甲醇回流提取2～4次，每次1～3小時；b.合并提取液，濃縮至干，將所得干品加水溶解、過濾，將濾液加于已處理好的大孔樹脂柱上；或干品加甲醇或乙醇溶解后用大孔樹脂拌樣，加于已處理好的大孔樹脂柱上，經(jīng)過大孔吸附樹脂柱洗脫，先用水洗脫，至洗脫液無色，再用4～7個柱裝體積的10％～90％乙醇洗脫，回收洗脫液、濃縮至干，得小飛蓬總黃酮提取物。該發(fā)明的有益效果填補了制備小飛蓬總黃酮提取物的空白并擴展了其在制備抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。文檔編號A61K36/28GK101474230SQ20091006648公開日2009年7月8日申請日期2009年1月23日優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日發(fā)明者嚴(yán)銘銘,何曉紅,威劉,畢勝男,趙大慶,帥邵申請人:長春中醫(yī)藥大學(xué)