專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制癌細(xì)胞侵襲性的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及抑制癌細(xì)胞侵襲性的方法和試 劑。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤病人致死的一個(gè)重要的原因。腫瘤轉(zhuǎn)移要經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程 首先原發(fā)腫瘤細(xì)胞侵入相鄰組織并進(jìn)入淋巴管或血管，即進(jìn)入血管內(nèi)滲(Intravasation)； 然后通過(guò)血管遷移到遠(yuǎn)端毛細(xì)管中；轉(zhuǎn)移出血管，即外滲(Extravasation)，最終經(jīng)過(guò)增殖 從微小轉(zhuǎn)移(Micrometastases)變?yōu)槿庋劭梢?jiàn)的轉(zhuǎn)移瘤。目前已鑒定了一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相 關(guān)的因子，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、血管形成因子前體、胞外基質(zhì)重塑分子和某些 轉(zhuǎn)錄因子。但到目前為止，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制的了解還很有限。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的一個(gè)重要過(guò)程是細(xì)胞遷移能力的變化，該過(guò)程包含肌 動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重塑，其中各種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABPs)起著重要的作用。 Profilin-K簡(jiǎn)寫(xiě)為Pfnl，肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)就是其中的一員，它是一種廣泛存在的球形 肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。近些年來(lái)的研究表明Pfnl參與了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遷移過(guò)程。Pfn家族 蛋白大小約為14-17kDa，廣泛存在于脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、原生生物、真菌、植物及某些病 毒中。大多數(shù)真核生物含有多種Pfn基因，而且通過(guò)選擇性剪切可以產(chǎn)生多種異構(gòu)體。到目 前為止鑒定出了四種不同的Pfn基因Pfnl、Pfn2 (主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，存在兩種剪切 異構(gòu)體)、Pfn3(特異性存在于腎臟和睪丸中)和Pfn4(特異性存在于睪丸中)。生化分析 表明Pfn家族蛋白能和眾多的配體結(jié)合，如肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(Arp)2，管蛋白結(jié) 合蛋白G印hyrin，二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)以及一些含多聚脯氨酸的蛋白質(zhì)。正因?yàn)槟芘c 多種配體結(jié)合，Pfnl能參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞內(nèi)吞、mRNA剪切以及基 因轉(zhuǎn)錄。最初顯示Pfn在細(xì)胞遷移中發(fā)揮功能的證據(jù)來(lái)源于阿米巴變形蟲(chóng)(Dictyostelium amebae)中的研究。Pfn I和Pfn II缺陷的阿米巴蟲(chóng)突變體表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)障礙和細(xì)胞漿移動(dòng) 缺陷。在chickadee (—種Pfn同源基因)突變的果蠅(Drosophila)中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的發(fā)育 缺陷。在細(xì)胞遷移過(guò)程中首先會(huì)有一基于肌動(dòng)蛋白的突觸伸出過(guò)程，許多病理模型的研究 也表明Pfnl在這一過(guò)程中發(fā)揮作用。最近在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的證據(jù)直接表明了 Pfnl在 細(xì)胞遷移過(guò)程中的起促進(jìn)作用。然而另外一些研究表明Pfnl在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起負(fù)調(diào)控作 用，如在人類(lèi)乳腺癌組織和細(xì)胞系、胰腺癌和肝癌中發(fā)現(xiàn)Pfnl表達(dá)水平顯著降低。在乳腺 癌細(xì)胞CAL51中過(guò)表達(dá)Pfnl能阻止該細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤。此外，在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞 系BT474中過(guò)表達(dá)Pfnl也能減弱其遷移能力，而通過(guò)RNAi技術(shù)沉默Pfnl基因表達(dá)能增強(qiáng) 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力和侵襲能力。從這一點(diǎn)上Pfnl被認(rèn)為是抑癌蛋白質(zhì)。 因此，目前認(rèn)為Pfnl在細(xì)胞遷移中的作用比較復(fù)雜，具體起什么作用因細(xì)胞種類(lèi)而異。近些年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明在腫瘤的形成過(guò)程中有一類(lèi)被稱(chēng)之為 microRNA(miRNA)的小分子調(diào)控RNA起著重要的作用。成熟的miRNA是體內(nèi)自然產(chǎn)生的一 種單鏈RNA分子，長(zhǎng)約21-24個(gè)核苷酸。在哺乳動(dòng)物中，成熟的miRNA能進(jìn)入一種RISC復(fù)合體(即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)中，引導(dǎo)該復(fù)合體與特異的靶mRNA結(jié)合從而阻滯以該 mRNA為模板的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程或是促使mRNA降解。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA能調(diào)控眾 多的細(xì)胞活動(dòng)，如分化、代謝、增殖以及凋亡。目前，一些能有著致癌或抑癌功能的miRNA已 被鑒定出來(lái)，然而關(guān)于miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用的研究剛剛起步。近來(lái)已鑒定了一 些和腫瘤遷移相關(guān)的miRNA，如miR-10b、miR-373、miR-520c和miR-21能促進(jìn)腫瘤遷移，而 let-7、miR-335和miR-126能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。MiRNA是通過(guò)抑制一些與細(xì)胞遷移、侵襲和增 殖相關(guān)的靶基因而調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。例如，miR-lOb的一個(gè)已鑒定的靶基因是H0XD10，該基因 編碼的一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子能抑制一些在細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)，如小G 蛋白質(zhì)RhoC。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，miR-373誘發(fā)的轉(zhuǎn)移是通過(guò)直接抑制⑶44(已知在 結(jié)腸癌和前列腺癌中能抑制轉(zhuǎn)移)而實(shí)現(xiàn)的。目前通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)的技術(shù)已發(fā)現(xiàn)miR-320在許多的人類(lèi)腫瘤中異常表達(dá)， 如結(jié)腸癌、視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、膽管癌、乳腺癌、前列腺癌和惡性轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞。此外， 在人類(lèi)的其它一些疾病中也發(fā)現(xiàn)了 miR-320的異常表達(dá)，如神經(jīng)退行性病變和鐮刀形紅細(xì) 胞貧血病。然而，目前本領(lǐng)域?qū)τ趍iR-320在腫瘤發(fā)生、遷移、侵襲中的作用還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供癌細(xì)胞遷移性和侵襲性相關(guān)的靶點(diǎn)，以及抑制癌細(xì)胞遷移 和侵襲的方法和試劑。在本發(fā)明的第一方面，提供一種miR-320a的抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì) 胞的組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)Pfnl蛋白的細(xì)胞；更佳的，所述的腫瘤 細(xì)胞是Pfnl蛋白表達(dá)后遷移性和/或侵襲性降低的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞或肺癌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于提高腫瘤細(xì)胞中Pfnl的表達(dá)水平。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是(高)表達(dá)miR_320a的腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的miR-320a的抑制劑是miR-320a的反義核苷酸。在另一優(yōu)選例中，miR-320a的反義核苷酸選自(a)序列如SEQ ID NO=I所示的反義核苷酸；或者(b)序列與SEQ ID NO :1所示的序列具有80%以上的相同性、且具有(a)指定的 反義核苷酸功能的反義核苷酸；或者(c)序列與SEQ ID NO 1所示的序列在嚴(yán)格條件下雜交、且具有(a)指定的反義 核苷酸功能的反義核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的反義核苷酸是包括但不限于甲氧基化修飾、鎖核酸修飾、 肽核酸修飾、硫代修飾以及磷酸骨架由磷脂連接代替的反義核苷酸。更優(yōu)選地，所述的反義核苷酸是甲氧基化修飾的反義核苷酸，即核糖骨架2位羥 基上的氫用甲基取代。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制腫瘤細(xì)胞包括抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或侵襲。在本發(fā)明的另一方面，提供一種Pfnl抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組 合物。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)Pfnl蛋白的細(xì)胞；更佳的，所述的腫瘤 細(xì)胞是Pfnl蛋白表達(dá)被抑制后遷移性和/或侵襲性降低的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的Pfnl的抑制劑選自⑴序列如 SEQ ID NO 2 所示的 miRNA (miR_320a)；或者(ii)序列與SEQ ID NO :2所示的序列具有80%以上的相同性、且具有⑴指定的 miRNA功能的miRNA ；或者(iii)序列與SEQ ID NO :2所示的序列在嚴(yán)格條件下雜交、且具有(i)指定的 miRNA 功能的 miRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制腫瘤細(xì)胞包括抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或侵襲。在另一方面，本發(fā)明還提供一種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包 括(1)在測(cè)試組中，向表達(dá)miR_320a的體系中添加待篩選的候選物，并檢測(cè) miR-320a的表達(dá)或活性；并且，在對(duì)照組中，在不添加所述候選物的、表達(dá)miR_320a的體系 中，檢測(cè)miR-320a的表達(dá)或活性；(2)將步驟(1)測(cè)試組中miR-320a的表達(dá)或活性與對(duì)照組中miR_320a的表達(dá)或 活性進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中miR-320a的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，較佳的低 20%或更低；更佳的低40%或更低；進(jìn)一步更佳的低60%或更低)對(duì)照組，就表明該候選 物是抑制腫瘤的潛在物質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明還提供一種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包 括(a)在測(cè)試組中，向包含miR-320a和Pfnl mRNA的體系中添加待篩選的候選物， 并檢測(cè)miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合情況；并且，在對(duì)照組中，在不添加所述候選物的、包含 miR-320a和Pfnl的體系中，檢測(cè)miR-320與PfnlmRNA的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合情況與對(duì)照組中miR-320 與Pfnl mRNA的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，較 佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；進(jìn)一步更佳的低60%或更低)對(duì)照組，就表明 該候選物是抑制腫瘤的潛在物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的體系是腫瘤細(xì)胞體系。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于抑制腫瘤有用的物質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。


圖1、在PfnlmRNA的3，UTR的第20_41位核苷酸是miR_320a的靶位點(diǎn)。(a)預(yù)測(cè)到的miR-320a的靶位點(diǎn)的位置。miR-320a的5，的第2_8位核苷酸配對(duì)的區(qū)域(即種子區(qū)域)以粗體字母表示，非配對(duì)的核苷酸分列在上下行。(b)九種不同物種中(從上到下依次為人、大鼠、小鼠、恒河猴、黑猩猩、果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、馬和狗)的miR-320a的種子配對(duì)區(qū)的序列比較。圖2、在不同腫瘤細(xì)胞系中的MiR_320a和Pfnl的蛋白質(zhì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。(a)Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞中的Pfnl蛋白質(zhì)。(b)Western blot 電泳圖的灰度掃描定量(FUJIFILM-Multi Gauge V3. 0)。以 Pfnl/β-Actin的比值做柱形圖。(c)以實(shí)時(shí)定量RT-PCR法(qRT_PCR)測(cè)定Pfnl的mRNA在各種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá) 水平。(d)以實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定miR-320a在各種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。圖3、Pfn 1的3，UTR是miR_320a的有效作用靶位。(a)插入了 Pfnl-3，UTR的報(bào)告基因示意圖。Wt 含有野生型的Pfnl 3'UTR ；Mut 種子區(qū)有3個(gè)核苷酸突變(以斜體并帶下劃線(xiàn)的字母標(biāo)出)的Pfnl3’ UTR0(b)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)分析。20ng的Wt或Mut報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染IXlO5 的293T細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染50nM的control_miR、或miR_320a、或再同時(shí)轉(zhuǎn)染50nM的對(duì)照反義 核酸(control anti-miR)或是miR_320a的反義核酸(anti_miR-320a)，均為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。24 小時(shí)后用Dual luciferaseassay system(Promega)檢測(cè)熒光素酶活性。柱形圖表示的值 代表3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 SE。Wt UTR 含有野生型Pfnl-3，-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒；Mut UTR 含有突變型Pfnl-3，-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒。miR-n. c.表示用作負(fù)對(duì)照的control-miR。(c)Flag標(biāo)記的Pfnl蛋白編碼區(qū)(ORF)和野生型(Wt)或突變的(Mut)的3，UTR 插入ρ⑶NA3. 1載體。IOng的上述載體轉(zhuǎn)染IXlO5的293T細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染不同劑量的 control-miR或miR-320a，均為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后用westernblot檢測(cè)外源表達(dá)的Pfnl 蛋白質(zhì)的水平。pcDNA3. I-Pfnl/wt 含有野生型Pfnl_3，-UTR的Pfnl mRNA的蛋白編碼區(qū) 質(zhì)粒。miR-n. c.表示用作負(fù)對(duì)照的control-miR。(d) IOOnM 的 con_miR 或 miR_320a 或其反義核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 DU-145、PC-3、Hela 和 95D細(xì)胞，48小時(shí)后用western blot檢測(cè)內(nèi)源表達(dá)的Pfnl蛋白質(zhì)的水平。miR-n. c.表示 用作負(fù)對(duì)照的control-miR。圖4、MiR-320a能正向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移性和侵襲性。(a) qRT-PCR檢測(cè)miR_320a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞能高水平表達(dá)miR_320a， con-miR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞作為對(duì)照。(b) Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR_320a或con_miR的MCF-7細(xì)胞以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 IOOnM miR-320a反義核酸或?qū)φ辗戳x核酸的MDA-MB-231細(xì)胞的Pfnl蛋白質(zhì)表達(dá)量。(c-f)傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染anti-miR-320a或anti-con-miR的 MDA-MB-231細(xì)胞的遷移性(c，d)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR_320a或con-miR的MCF-7細(xì)胞的遷移性 (e，f)。細(xì)胞圖片(c、e 標(biāo)尺200μπι)，柱形圖(d，f)表示3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。(g-j) Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 anti_miR-320a 或 anti-con-miR 的 MDA-MB-231細(xì)胞的遷移性(g，h)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR_320a或con-miR的MCF-7細(xì)胞的遷移性 (i，j)。細(xì)胞圖片(g、i 標(biāo)尺200μπι)，柱形圖(h，j)表示3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。(k-n) Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 anti_miR-320a 或 anti-con-miR 的MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲性(k，1)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR_320a或con_miR的MCF-7細(xì)胞的侵襲性 (m, η)。細(xì)胞圖片(k、m 標(biāo)尺200 μ m)。柱形圖(1，η)表示3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。圖5、MiR-320a對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響部分是由下調(diào)Pfnl介導(dǎo)的。 IOOnM 的 anti-miR-320a 或 anti-con_miR 轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231 細(xì)胞，或再同時(shí)轉(zhuǎn)染 IOOnM 的對(duì) 照組 siRNA(si-con)或 Pfnl 特異性 siRNA(si-Pfnl)，均為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用 western blot 檢 測(cè)Pfnl的表達(dá)量(a)，用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移性和侵襲性(b)。柱形圖表示三組 的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。圖6、傷口愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染anti-miR_320a或anti-con-miR的95D細(xì)胞的 遷移性(a)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-320a或con-miR的DU145細(xì)胞的遷移性(b)。細(xì)胞圖片(標(biāo)尺 200 μ m)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次揭示了 miR-320a與腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲的相 關(guān)性，其能夠調(diào)控(促進(jìn))腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。所述的腫瘤細(xì)胞特別是表達(dá)Pfnl蛋白 的細(xì)胞，更特別是Pfnl蛋白表達(dá)后遷移性和/或侵襲性降低的細(xì)胞。本發(fā)明為腫瘤的防治 提供了新的靶點(diǎn)。miR-320a 及其用途miR-320a為一種本領(lǐng)域已知的microRNA(miRNA)小分子，其對(duì)于調(diào)控RNA是有用 的。然而，對(duì)于miR-320a結(jié)合的靶點(diǎn)和其與腫瘤的遷移性和/或侵襲性之間的關(guān)系目前并 不清楚。miR-320a具有如SEQ ID NO :2所示的序列。其可以被分離自細(xì)胞，或者可通過(guò) 人工合成的方式獲得。在得知了 miR-320a的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得 miR-320ao基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，提供了一種miR-320a的用途，用于制備抑制Pfnl蛋白表 達(dá)的組合物。在本領(lǐng)域中，Pfnl蛋白在腫瘤細(xì)胞中的作用已經(jīng)有所揭示，在一些腫瘤細(xì)胞 (如乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞)中，Pfnl蛋白的高表達(dá)抑制的腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；而本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在另一些腫瘤細(xì)胞(如前列腺癌細(xì)胞)中，Pfnl蛋白的高表達(dá)促進(jìn)的腫瘤細(xì) 胞的遷移和侵襲。因此很顯然，miR-320a可通過(guò)抑制Pfnl蛋白的表達(dá)而調(diào)控這些腫瘤細(xì) 胞的遷移和侵襲。PfnlProfilin-l(簡(jiǎn)寫(xiě)為Pfnl)屬于Profilin家族的成員，廣泛存在于脊椎動(dòng)物、無(wú)脊 椎動(dòng)物、原生生物、真菌、植物及某些病毒中。已有研究表明Pfnl參與了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遷 移過(guò)程。Pfnl蛋白的序列可以與GenBank登錄號(hào)NP 005013所示的序列基本上相同，其編 碼分子可以與GenBank登錄號(hào)匪005022所示的序列基本上相同。Pfnl蛋白或基因可以被 分離自細(xì)胞，或者可通過(guò)人工合成的方式獲得。在得知了 Pfnl蛋白或編碼基因的序列后， 本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得Pfnl蛋白或基因。miR-320a抑制劑及其用途本發(fā)明人從鑒定miR-320a的靶基因入手，通過(guò)一種基于免疫共沉淀的方法純化出RISC復(fù)合體從而進(jìn)一步鑒定出miR-320a的一個(gè)靶基因?yàn)镻fnl基因。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，本 發(fā)明人以乳腺癌細(xì)胞為模型進(jìn)一步研究了 miR-320對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。結(jié) 果表明miR-320a能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這種作用部分是通過(guò)miR-320a直接抑 制Pfnl而實(shí)現(xiàn)的。因此，miR-320a可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。更具體地，本發(fā)明人的研究表明在PfnlmRNA的3’ -UTR(即3’端非翻譯區(qū))的第 20至第41個(gè)核苷酸區(qū)域?yàn)閙iR-320a的識(shí)別靶位點(diǎn)，該靶位點(diǎn)在多個(gè)物種的Pfnl mRNA中 保守存在。將Pfnl的3’ UTR克隆到熒光素酶報(bào)告基因的3’非翻譯區(qū)后與miR-320a共 轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，24小時(shí)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-320a能顯著抑制報(bào)告基因的表達(dá)。在一些 腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)miR-320a后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)源的Pfnl蛋白水平被下調(diào)。而在乳腺癌細(xì) 胞MDA-MB-231 (本身高表達(dá)內(nèi)源的miR-320a)轉(zhuǎn)染miR-320a的反義核酸抑制其功能時(shí) Pfnl蛋白水平被上調(diào)。上述結(jié)果充分證明了 Pfnl是miR-320a的靶基因。已有研究表明 Pfnl能對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性起負(fù)調(diào)控作用，因此本發(fā)明人接著研究了 miR-320a和乳腺 癌細(xì)胞侵襲性的關(guān)系。MCF-7本身內(nèi)源表達(dá)的miR-320a很少，過(guò)表達(dá)miR-320a后，其遷移 性和侵襲性都得到增強(qiáng)。而在本身高表達(dá)miR-320a的MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)入其反義核 酸后，不僅Pfnl的蛋白表達(dá)上調(diào)，該細(xì)胞的遷移性和侵襲性都被減弱；但當(dāng)再轉(zhuǎn)入Pfnl的 特異性siRNA將Pfnl的水平回復(fù)到原先的水平后，該細(xì)胞的遷移性和侵襲性也都部分回 復(fù)。上述結(jié)果表明，miR-320a能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而且該作用部分是由 于miR-320a能靶向調(diào)控Pfnl蛋白的表達(dá)?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種miR-320a的抑制劑的用途，用于 制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物。所述的抑制腫瘤細(xì)胞更特別地是指抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/ 或侵襲。所述的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)Pfnl蛋白的細(xì)胞，更特別是指Pfnl蛋白表達(dá)后遷移性和 /或侵襲性降低的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的腫瘤細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。如本文所用，所述的miR-320a抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。 任何可下調(diào)miR-320a的表達(dá)、加速miR-320a降解、下調(diào)miR-320a的活性、阻止miR-320a 與靶分子結(jié)合的物質(zhì)，均可作為miR-320a的抑制劑，用于通過(guò)抑制miR-320a來(lái)抑制腫瘤細(xì) 胞的遷移和侵襲。在得知了 miR-320a對(duì)于腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用后，本領(lǐng)域人員可以方 便地得知miR-320a抑制劑可以通過(guò)抑制miR-320a來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。因此， 任何miR-320a的抑制劑都可用于本發(fā)明。根據(jù)miR-320a的特性，本領(lǐng)域人員可以獲得多 種miR-320a的抑制劑。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的miR-320a的抑制劑是miR-320a的反義核苷酸。如本文所用，“反義核苷酸”又稱(chēng)為“反義核酸”或“反義寡核苷酸(AS-ONs， antisense-oligonucleotides) ”或“反義藥物”，是指長(zhǎng)度約為15-24個(gè)堿基的DNA分子、 RNA分子它們的經(jīng)修飾的形式或它們的類(lèi)似物，可與mRNA互補(bǔ)。從理論上來(lái)講，根據(jù)反義技 術(shù)獲得的反義分子可用于治療任何由基因表達(dá)或者基因缺失引起的疾病，比如病毒感染、 癌癥和炎癥。本領(lǐng)域人員均了解，根據(jù)本發(fā)明提供的反義核苷酸，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓⒈Ａ?其活性，這些變化形式均可用于本發(fā)明。任何可起到抑制或沉默miR-320a的作用的反義核 苷酸都是可用于本發(fā)明的，其類(lèi)型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miR-320a的反義核苷酸具有與SEQ ID NO 1所示的序列在嚴(yán)格條件下雜交的序列；或者所述的miR-320a的 反義核苷酸與SEQ ID NO :1所示的序列具有80%以上的相同性，較佳地具有85%以上的相 同性，更佳地具有90 %以上的相同性，最佳地具有95 %以上的相同性，如具有96 %、97 %、 98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-320a的反義核苷酸是SEQ ID NO=I所示序列 的片段。它們均具有SEQ ID NO :1所示序列的反義核苷酸相同的功能。現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)指出了一些反義核苷酸的變化形式是可取的，它們也可以針對(duì)相 應(yīng)的革巴序列發(fā)揮抑制作用。如 Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleo tides (2294-2304 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34,No. 8)文獻(xiàn)中提到，在反義核酸 的兩個(gè)末端截短1個(gè)堿基是可以保留其活性的。又如Designand delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and human cells (NATURE PROTOCOLS ；VOL. 3 NO. 10 ；2008 ；1537-1549)文獻(xiàn)綜述了多個(gè)研究，認(rèn)為一 般而言，在反義核酸的兩邊延長(zhǎng)一些堿基是可以的。而在反義核酸和miRNA間親和性很高 (如鎖核酸修飾)時(shí)，反義核酸可以被截短到約2/3長(zhǎng)度。如本文所用，所述的“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交 和洗脫，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C ；或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺， 0. 小牛血清/0. 1% Ficoll, 420C^ ；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以 上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID Ν0:1所 示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的miR-320a的反義核苷酸具有SEQ IDNO 1所 示的序列。在本發(fā)明中，所述的“反義核苷酸”還包括經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本 不改變反義核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核苷酸的活性、穩(wěn)定性或治療效 果。對(duì)反義核苷酸的修飾包括但不限于甲氧基化修飾、鎖核酸修飾、肽核酸修飾、硫代修 飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替，這些修飾均是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，所 述的修飾為甲氧基化修飾，即在核糖骨架的2位羥基上的氫被甲基取代。Pfnl抑制劑及其用途本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，Pfnl在一些細(xì)胞中表達(dá)或活性的下調(diào)(例如以miR-320a下 調(diào)其表達(dá))可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移或侵襲。所述的細(xì)胞是Pfnl蛋白表達(dá)被抑制后遷移 性和/或侵襲性降低的細(xì)胞，如前列腺癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了 Pfnl抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物。如本文所用，所述的Pfnl的抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任 何可降低Pfnl蛋白的活性、降低Pfnl蛋白的穩(wěn)定性、抑制Pfnl蛋白的表達(dá)、減少Pfnl蛋白 有效作用時(shí)間、抑制Pfnl蛋白的分泌、或抑制Pfnl的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明， 作為可用于抑制腫瘤細(xì)胞的有效物質(zhì)。所述的Pfnl的抑制劑也可以是經(jīng)過(guò)修飾的形式。在Pfnl蛋白或核酸序列已知的情況下，本領(lǐng)域人員能夠根據(jù)一般的手段來(lái)獲得 Pfnl的抑制劑。所述的抑制劑例如包括但不限于特異性結(jié)合Pfnl蛋白的抗體或配體；特 異性干擾Pfnl表達(dá)的小干擾分子，如siRNA分子、miRNA分子等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Pfnl的抑制劑是miR-320a ；或是序列與miR-320a 的序列具有80%以上的相同性(較佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95 %以上的相同性，如具有96 %、97 %、98 %或99 %以上的相同性)的 miRNA ；或是序列與miR-320a序列在嚴(yán)格條件下雜交的miRNA ；它們均具有miR_320a相同 的功能。篩選方法在得知了所述的miR-320a對(duì)于調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和/或侵襲的用途后，可以基 于該特征來(lái)篩選調(diào)節(jié)miR-320a的表達(dá)或活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和/或侵襲的物 質(zhì)；或者，可以篩選調(diào)節(jié)miR-320a的表達(dá)或活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)Pfnl的表達(dá)或活性，最終調(diào)節(jié)腫 瘤細(xì)胞的遷移和/或侵襲的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于抑制腫瘤(特別是抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和/或 侵襲)的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達(dá)miR-320a的體系接觸；和 檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)miR-320a的影響；若所述候選物質(zhì)可降低miR_320a的表達(dá)或活性，就表明 該候選物是抑制腫瘤的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察 到miR-320a的表達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選 物質(zhì)的表達(dá)miR-320a的體系。本發(fā)明還提供一種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括將候選物質(zhì) 與包含miR-320a和Pfnl mRNA的體系接觸，并檢測(cè)miR-320與PfnlmRNA的結(jié)合情況；如 果miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑制腫瘤的潛 在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到miR-320與Pfnl mRNA 的結(jié)合的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的包含miR-320 與PfnlmRNA的體系。所述的體系包括(但不限于)溶液體系、亞細(xì)胞體系、細(xì)胞體系、組織體系、器官 體系、或動(dòng)物體系。優(yōu)選地，所述的體系是腫瘤細(xì)胞體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于抑制腫瘤真正有用的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于抑制腫瘤的潛在物 質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以從中篩選出真正有用 的物質(zhì)。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的反義核 苷酸，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如 毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所
接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋 劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的 毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在 組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的反義核苷酸的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而 變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò) 臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于反義核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、 代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通 常，當(dāng)本發(fā)明的反義核苷酸每天以約0. 001-100mg/kg (優(yōu)選的為0. 01-20mg/kg)動(dòng)物體 重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿(mǎn)意的效果，較佳地每天以2-4次分開(kāi)的劑量給予，或以緩 釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為0. 005-100mg,較佳地約為 0. 008-50mgo可調(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每 天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌 肉給予、局部給予、植入、緩釋給予、腫瘤內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I、材料和方法材料，抗體和細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 和胎牛血清購(gòu)自 Invitrogen/Gibco (Karlsruhe，Germany)。24 孔 Transwell小室和基質(zhì)膠包被的小室(8 μ m孔徑)購(gòu)自BD Biosciences (Bedford,MA, USA)。 對(duì)照的 miRNA(control-miR，Ambion 貨號(hào)AM17110)、miR320a(序列為 5，-AAAAGCUGGCiUUG AGAGGGCGA-3，(SEQ ID NO :2))、對(duì)照的 2’ 甲氧基化修飾的反義核酸(control-anti-miR 或anti-control-miR，Ambion貨號(hào)AM17010)、miR-320a的甲氧基化修飾的反義核酸 (anti-miR-320a，序列為 5，-UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU-3，(SEQ ID NO :1)，修飾位點(diǎn)為核 糖的 2 位羥基)、對(duì)照 siRNA (si-con 或 control-siRNA，Ambion 貨號(hào)4390843)和 Pfnl 特 異的 siRNA(si-Pfnl，Ambion 貨號(hào)AM16810，SiRNA ID :S10375)購(gòu)自 Ambion (Austin，TX, USA)。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的過(guò)表達(dá)miR-320的慢病毒載體構(gòu)建所用引物L(fēng)mi320a+(SEQ ID NO 7)GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGCCTTCTCTTCCCGGTTCTTCCCGGAGTCGG ；Lmi320a-(SEQ ID NO 8)GGGAAGAACCGGGAAGAGAAGGCGGAGGGGAGCGAAGCG ；Lmi320b+(SEQ ID NO 9)GAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC ；Lmi320b-(SEQ ID NO: 10)
TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTTCCCGACTCC ；Lmi-con-a+(SEQ ID NO: 11)GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGGCGTCTCTTGCGTGGTCTTCCCGGAGTCGG ；Lmi-con-a-(SEQ ID NO: 12)GGGAAGACCACGCAAGAGACGCCGGAGGGGGCGAAGCG ；Lmi-con-b+(SEQ ID NO: 13)GAACACCACGCTTGAGACGCCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC ；Lmi-con-b-(SEQ ID NO: 14)TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGGCGTCTCAAGCGTGGTGTTCCCGACTCC。Pfnl的抗體購(gòu)自Abcam，β -actin的抗體和Flag的抗體購(gòu)自Sigma，GAPDH的抗 體購(gòu)自康成生物公司。細(xì)胞系293，293T，Hela, HFL1, HL-7702, BEL-7404,肝癌細(xì)胞株L02， 肝癌細(xì)胞株H印G2，肺癌細(xì)胞株A549，肺癌細(xì)胞株95-D，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231，乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435S，前列腺癌細(xì)胞株DU-145和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。3’ -UTR-熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及pLenti慢病毒穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和報(bào)告基因表 達(dá)檢測(cè)方法Pfnl全長(zhǎng)的3，-UTR通過(guò)PCR擴(kuò)增得到以MCF-7細(xì)胞的cDNA為模板(用 Trizol試劑抽提MCF-7細(xì)胞的總RNA。用oligo dT(即連續(xù)20個(gè)dT核苷酸)作反轉(zhuǎn) 錄引物，用Superscript III(Invitrogen)按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成出cDNA)，引物 為上游引物 5，-TCACATATGTCTGTCCCTTCCCCTTCACCGCTCC-3’ (SEQ ID NO :3)，下游引 物 5，-TCACATATGAACAAAAGTTT TCCAACCACACACG-3，(SEQ ID NO 4),擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pGL3 (Promega,Madison, WI，USA)的Xba I位點(diǎn)，構(gòu)建野生型Pfnl-3，-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒。 miR-320a Pfnl-3' -UTRM Quick change-mutagenesis kit (Stratagene, Heidelberg,Germany)試劑盒產(chǎn)生，突變所用的引物為 5，-CTTCCCCTTCACCGCTCCCCACTGATC TGCACCCCTTTCCTCCCCATAC-3，(SEQ ID NO: 15) ；5'-GTATGGGGAGGAAAGGGGTGCAGATCAGTGGGGA GCGGTGAAGGGGAAG-3，(SEQ ID NO: 16)。擴(kuò)增Pfnl的Pfnl mRNA的蛋白編碼區(qū)(ORF)加上3，-UTR所用引物5，-CCTGCT AGCATGGACTACAAAGACGATGACGATAAAATGGCCGGGTGGAACGCCTAC-3’ (SEQ ID N0:17)和 SEQ ID NO :4，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pcDNA3. I(Invitrogen)的Nhe I和Xba I位點(diǎn)，獲得攜帶Pfnl mRNA 的蛋白編碼區(qū)加上3，UTR區(qū)的ρ⑶NA3. 1載體。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pLenti_320a及pLenti-control質(zhì)粒的構(gòu)建分別把Lmi320和 Lmi-con中a+和a-，b+和b_退火形成雙鏈。退火后，a片段和b片段之間有互補(bǔ)的粘性 位點(diǎn)，a片段的另一端有BamH I粘性位點(diǎn)，b片段另一端有Xho I粘性位點(diǎn)。把pLenti空 載體(參見(jiàn) Ge 等的文獻(xiàn)PCAF Acetylates β -Catenin andlmproves Its Stability. Mol Biol Cell. 2009 January 1 ；20(1) :419_427)用 BamH I 和 Xho I 酶切后，分別將 Lmi320 的a，b片段和Lmi-con的a，b片段和載體連接，轉(zhuǎn)化后，鑒定正確的克隆。報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)方法將含有野生型或突變型Pfnl-3’ -UTR的報(bào)告基因 質(zhì)粒(20ng)與轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40 (20ng) (Promega)以及miRNA或反義核酸用脂 質(zhì)體 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入 293T 細(xì)胞(2-5X IO5) ο 24 小時(shí)后用 Dual luciferaseassay system(Promega)檢測(cè)熒光素酶活性。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的前一天把細(xì)胞用胰酶消化分散后，按IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔接種于12孔 板。單獨(dú)轉(zhuǎn)染合成的小RNA分子或反義核酸分子、共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和合成的小RNA分子或反義 核酸分子均按Lipofectamine 2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)行遷移性、侵襲性實(shí) 驗(yàn)分析。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，進(jìn)行WesternBlot分析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按2X IO6個(gè)細(xì)胞/皿接種于IOcm細(xì)胞 培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染含miR-320a或?qū)φ誱iRNA的pLenti載體過(guò)程按Lipofectamine 2000的說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀篩選出GFP陽(yáng)性的細(xì)胞。篩選出的GFP陽(yáng)性細(xì)胞 再次接種于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿。等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，再次用流式細(xì)胞儀篩選出GFP陽(yáng)性的細(xì)胞。 之后再重復(fù)一次培養(yǎng)/篩選。三次富集所得的細(xì)胞即為用作實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞裂解制備蛋白樣品及Western Blot分析細(xì)胞用磷酸緩沖液(PBS)洗滌后，裂解于Laemmli Sample Buffer(BIO-RAD, Hercules，CA，USA)。蛋白質(zhì)濃度用 RC DC Protein Assay kit (BIO-RAD)測(cè)定。約取 40 μ g 總蛋白于15% SDS-PAGE進(jìn)行電泳并電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用相應(yīng)抗體對(duì)膜進(jìn)行雜交，最后 用化學(xué)發(fā)光法(SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate，Thermo，Rockford， USA)檢測(cè)雜交信號(hào)。RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及實(shí)時(shí)定量PCR用Trizol試劑(Invitrogen)抽提細(xì)胞的總RNA。以總RNA為模板用NCodemiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 禾口 SuperScript III CellDirect cDNASynthesis Kit(Invitrogen)合成出相應(yīng)的 cDNA。實(shí)時(shí)定量 PCR 在 AppliedBiosystems 7500 Fast Real Time PCR system儀器上進(jìn)行，miR_320a定量時(shí)所用上游引物為miR_320a特異 性引物(即miR-320a的對(duì)應(yīng)DNA序列)，下游引物為試劑盒中的通用引物，所用試劑為 SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Invitrogen) 。 Ij Pfn 白勺弓LM Primer premier v5. O 軟件設(shè)計(jì)，序列為5，-GCCATCGTGGGCTACAAGG-3，(上游引物，SEQ ID NO 5) 和 5，-CCATCAGCAGGACTAGCGTCTT-3，(下游引物，SEQ ID NO :6)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變 性4min，然后是45步循環(huán)反應(yīng):95°C變性3sec.，60°C退火并延伸40sec.。最后，miR_320a 和Pfnl的定量按照T一法計(jì)算，分別以U6 snRNA和GAPDH為內(nèi)參。細(xì)胞遷移性和侵襲性檢測(cè)傷口愈合實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn) Ding Z 等，Silencing profilin-1 inhibits endothelialcell proliferation,migration and cord morphogenesis. Journal of cell science2006 ；119 (Pt 19) :4127_37中所述。測(cè)定3_4個(gè)不同視野下的傷口寬度。傷口閉 合的定量是測(cè)量傷口寬度的變化數(shù)值，一般每孔細(xì)胞測(cè)3個(gè)視野，取平均值。Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)參見(jiàn)文獻(xiàn) Roy P, Jacobson K. Overexpression ofprofilin reduces the migration of invasive breast cancer cells. Cell motility and thecytoskeleton 2004 ；57 (2) :84_95中所述。簡(jiǎn)而言之，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75-80%匯合 度時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，血清饑餓24小時(shí)。胰酶消化下來(lái)后，用PBS洗滌3次，重 懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，取5 X IO4個(gè)細(xì)胞加入Transwell的上室中，下室加入完全培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清)。培養(yǎng)12小時(shí)后，用棉簽擦去上室底膜上方的細(xì)胞，而穿到膜下方的細(xì)胞則固定后用結(jié)晶紫染色，并于顯微鏡下拍照，取3個(gè)不同視野用FUJIFILM Colony VI. 1軟件 對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。用包被了基質(zhì)膠的小室按照同樣的方法進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析方法數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)作圖用軟件Sigma Plot 10. 0進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均值士SE。組間差 異用Student，s t-test分析，P < 0. 05時(shí)為顯著差異。II、實(shí)施例實(shí)施例1、Pfnl3，UTR含有保守的miR_320a的靶位點(diǎn)為了研究miR-320a在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用，本發(fā)明人首先用最近報(bào)道的一種 生化方法(參見(jiàn) Karginov FV et al. A biochemical approach to identifyingmicroRNA targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 2007 ； 104(49) :19291_6)鑒定了 miR_320a的靶基因，該方法的主要原理是用抗 RISC核心組分Ago2的抗體免疫共沉淀出RISC中的miRNA和其靶基因mRNA，然后鑒定出相 應(yīng)的miRNA的靶基因的種類(lèi)。結(jié)果，本發(fā)明人鑒定到Pfnl是miR-320a的候選靶基因。然后，本發(fā)明人用 miRanda (http //www. microrna. org/microrna/home. do)、 TargetScan (http://www.targetscan.org/)禾口 PicTar(http://www. pictar.org/)等 miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件也預(yù)測(cè)到Pfnl是miR-320a的靶基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在Pfnl mRNA(NM_005022)的3，UTR區(qū)第20-41個(gè)核苷酸存在 一個(gè)靶位點(diǎn)，如圖 la，通過(guò) mFold 軟件(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/)分析可得 Pfnl 3，UTR和miR-320a結(jié)合自由能為-17.6kCal/mol，這符合miRNA與靶基因結(jié)合的原則。而 且，該靶位點(diǎn)的序列，特別是種子區(qū)(即與miRNA 5’端2-8位核苷酸配對(duì)的區(qū)域)在9種 物種中保守存在，如圖lb。實(shí)施例2、Pfnl蛋白表達(dá)量和miR_320a表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性首先，本發(fā)明人檢測(cè)了在一些細(xì)胞系中miR_320a與Pfnl表達(dá)量的關(guān)系，如圖 2a-d。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95-D中，95-D細(xì)胞中的Pfnl mRNA表達(dá)水平比A549高5倍， 而95-D細(xì)胞中Pfnl蛋白水平比A549低，這表明在95-D中Pfnl的蛋白翻譯過(guò)程可能受 阻。與此相比較，95-D細(xì)胞中miR-320a表達(dá)水平比A549細(xì)胞高6倍。在前列腺細(xì)胞PC-3 和DU-145中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果?？偠灾跈z測(cè)的這些細(xì)胞中都能觀察到Pfnl的蛋 白表達(dá)水平與miR-320a的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。上述這些結(jié)果提示，miR-320a在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平對(duì)Pfnl的蛋白表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。實(shí)施例3、MiR-320a能作用于Pfnl mRNA的3，UTR,抑制Pfnl的表達(dá)為了進(jìn)一步證實(shí)miR-320a能直接靶向調(diào)控Pfnl，本發(fā)明人接著檢測(cè)了 miR-320a 是否能結(jié)合到Pfnl mRNA的3’UTR并阻止蛋白質(zhì)翻譯。為此本發(fā)明人構(gòu)建了如下的報(bào)告基 因載體將人的Pfnl全長(zhǎng)的3’UTR克隆到熒光素酶報(bào)告基因的3’UTR區(qū)(Wt UTR，圖3a)， 同時(shí)還構(gòu)建了一個(gè)對(duì)照載體，即在miR-320a的靶位點(diǎn)的種子區(qū)有3個(gè)核苷酸突變的載體 (Mut UTR，圖3a)以去除miR_320a與該位點(diǎn)的結(jié)合。將上述載體與miR-320a或?qū)φ誱iRNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，或在此基礎(chǔ)上再轉(zhuǎn)染 miR-320a的反義核酸(anti_miR-320a)或?qū)φ盏姆戳x核酸(Controlanti-miR)以抑制 miR-320a的功能，均為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。結(jié)果如圖3b所示，與對(duì)照的miRNA相比，miR-320a能顯著降低報(bào)告基因的表達(dá)，而3’ UTR帶有突變的報(bào)告基因的表達(dá)幾乎不受miR-320a的影響。 當(dāng)用反義核酸抑制了 miR-320a的功能后，報(bào)告基因的表達(dá)得到恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)表明在293T 細(xì)胞中Pfnl的3，UTR區(qū)含有miR-320a的有效的作用靶點(diǎn)?？紤]到靶基因mRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響miRNA的結(jié)合，本發(fā)明人接著又將Pfnl mRNA的蛋白編碼區(qū)加上3’ UTR區(qū)一起克隆到了 ρ⑶NA3. 1載體(購(gòu)自Invitrogen公司) 里，同樣構(gòu)建了一份miR-320a靶位點(diǎn)種子區(qū)帶有突變的質(zhì)粒作為對(duì)照。將不同濃度的上述 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果如圖3c所示，miR-320a能劑量依賴(lài)性的特異下調(diào)人為構(gòu)建 的野生型Pfnl的表達(dá)，而帶有突變位點(diǎn)的Pfnl則不受miR-320的影響。這些結(jié)果進(jìn)一步 證明在293T細(xì)胞中，miR-320a能調(diào)控Pfnl的表達(dá)。為了研究miR-320a能否調(diào)控內(nèi)源的Pfnl蛋白的表達(dá)，本發(fā)明人將人工合成的 miR-320a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細(xì)胞系中。結(jié)果如圖3d所示，轉(zhuǎn)染miR-320a48小時(shí)后， DU-145、PC-3和Hela細(xì)胞中的內(nèi)源Pfnl蛋白被顯著下調(diào)。綜上所述，miR-320能于轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)與Pfnl mRNA 3’ UTR的結(jié)合而下調(diào)其表達(dá)。實(shí)施例4、MiR-320a能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲最近有研究表明Pfnl能負(fù)調(diào)控乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲性，在結(jié)腸癌中miR-320與腫 瘤轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)相關(guān)。這些研究結(jié)果促使本發(fā)明人推測(cè)miR-320a可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲 性，因此本發(fā)明人接著在兩株乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中檢驗(yàn)該假設(shè)。MCF-7是公 認(rèn)的遷移性和轉(zhuǎn)移性很低的細(xì)胞，而MDA-MB-231是具有轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)圖 2d，表明了 miR-320a在MDA-MB-231中表達(dá)遠(yuǎn)高于MCF-7。因此，本發(fā)明人在MCF-7中過(guò)表 達(dá)miR-320a，然后再檢測(cè)細(xì)胞遷移性和侵襲性的變化。為此，用病毒載體表達(dá)miR_320a的 前體，即pre-miR-320a，然后轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，如圖4a所示，穩(wěn)轉(zhuǎn)的 MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)miR-320a，而Pfnl蛋白的水平受到下調(diào)(圖4b)。隨后，本發(fā)明人首先用傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞遷移性的變化。在MCF-7細(xì)胞中， 過(guò)表達(dá)miR-320a能導(dǎo)致細(xì)胞遷移性上升40% (圖4e，4f)。Transwell細(xì)胞遷移測(cè)試和基 質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)也表明過(guò)表達(dá)miR-320a后MCF-7細(xì)胞的遷移性增加60% (圖4i和4j)，侵 襲性約增強(qiáng)3-4倍(圖4m和4η)。這些結(jié)果表明，miR_320a能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移性和侵 襲性。實(shí)施例5、MiR_320a的反義核苷酸提高Pfnl表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲MDA-MB-231是具有轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞，在MDA_MB_231中用miR_320a的反義 核酸(anti-miR-320a)抑制miR_320a的功能，然后再檢測(cè)細(xì)胞遷移性和侵襲性的變化。 miR-320a的反義核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231，結(jié)果Pfnl蛋白水平上調(diào)(圖4b)。隨后，本 發(fā)明人首先用傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞遷移性的變化。轉(zhuǎn)染miR-320a的反義核酸后， MDA-MB-231細(xì)胞的遷移性下降60% (圖4c，4d)。Transwell細(xì)胞遷移測(cè)試和基質(zhì)膠侵襲 實(shí)驗(yàn)也表明，抑制miR-320a活性后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移性減弱40% (圖4g和4h)，侵 襲性則被減弱60% (圖4k和41)。這些結(jié)果表明，miR-320a反義核酸能抑制腫瘤細(xì)胞的 遷移性和侵襲性。實(shí)施例6、MiR_320a對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲的作用是通過(guò)調(diào)控Pfnl蛋白表達(dá) 而實(shí)現(xiàn)的
為了驗(yàn)證miR-320a對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移性和侵襲性的影響是否是通過(guò)Pfnl來(lái)介 導(dǎo)的，本發(fā)明人又采用了 Pfnl特異性的SiRNA(Si-Pfnl)來(lái)抵消由miR-320a反義核酸在 MDA-MB-231細(xì)胞中引起的Pfnl蛋白質(zhì)表達(dá)的上升作用，然后檢測(cè)該細(xì)胞的遷移性和侵襲 性是否能恢復(fù)到原來(lái)的水平。結(jié)果如圖5a所示，如前所述miR-320a反義核酸能引起Pfnl 蛋白質(zhì)水平的上升，但當(dāng)加入Pfnl特異的siRNA (si-Pfnl)后，Pfnl蛋白質(zhì)被重新降回到原 來(lái)的水平。而此時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移性和侵襲性被部分的恢復(fù)(圖5b)，非特異性的 對(duì)照siRNA (control-siRNA, si-con)則沒(méi)有這種作用。這些數(shù)據(jù)表明Pfnl介導(dǎo)了 miR-320a 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移性和侵襲性的調(diào)控作用。實(shí)施例7、MiR-320a的反義核苷酸提高Pfnl表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的遷移95D是高遷移的肺癌細(xì)胞株，本發(fā)明人將miR-320a的反義核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染95D肺癌 細(xì)胞，結(jié)果如圖3d所示，轉(zhuǎn)染miR-320a的反義核酸后，95D細(xì)胞的Pfnl蛋白水平上調(diào)。用傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移性的變化，將miR-320a的反義核酸以及對(duì)照分別 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染95D高遷移的肺癌細(xì)胞株，結(jié)果如圖6a所示，miR-320a的反義核酸可以明顯抑制 肺癌細(xì)胞的遷移性。實(shí)施例8、過(guò)表達(dá)MiR-320a能抑制前列腺癌細(xì)胞Pfnl的表達(dá)，并抑制前列腺癌細(xì) 胞的遷移DU-145是高遷移前列腺癌細(xì)胞株，本發(fā)明人將人工合成的miR-320a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 DU-145前列腺癌細(xì)胞，結(jié)果如圖3d所示，轉(zhuǎn)染miR-320a 48小時(shí)后，DU-145細(xì)胞中的內(nèi)源 Pfnl蛋白被顯著下調(diào)。用傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移性的變化，將miR-320a及對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 DU-145細(xì)胞，結(jié)果如圖6b所示，過(guò)表達(dá)miR-320a可以明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移性。實(shí)施例9、篩選方法方法1 設(shè)置測(cè)試組乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (其中高表達(dá)miR-320a)，并給予候選物質(zhì)； 對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (其中高表達(dá)miR-320a)，不給予候選物質(zhì)。分別檢測(cè)測(cè)試組和對(duì)照組中miR-320a的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。如果測(cè)試組中 miR-320a的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(如低50%或更低)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制腫瘤 的潛在物質(zhì)。將miR-320a的反義核苷酸miR-320a和對(duì)照control-anti-miR分別作為候選物 質(zhì)，加入到乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)物中，觀察胞內(nèi)miR-320a的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-320a可有效地降低miR-320a的表達(dá)，而control-anti-miR不能有效地降低miR-320a 的表達(dá)。方法2:如前所述構(gòu)建報(bào)告基因載體，其中將人的Pfnl全長(zhǎng)的3’ UTR克隆到熒光素酶報(bào) 告基因的3，UTR區(qū)。將上述載體與miR-320a共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得包含miR-320a以及 Pfnl mRNA的細(xì)胞。設(shè)置測(cè)試組上述包含miR-320a以及Pfnl mRNA的細(xì)胞，并給予候選物質(zhì)；對(duì)照 組上述包含miR-320a以及Pfnl mRNA的細(xì)胞，不給予候選物質(zhì)。分別檢測(cè)測(cè)試組和對(duì)照組中miR-320a以及Pfnl mRNA的結(jié)合情況，并進(jìn)行比較。如果測(cè)試組中miR-320a以及Pfnl mRNA的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(如低50%或更低)對(duì)照 組，就表明該候選物是抑制腫瘤的潛在物質(zhì)。將miR_320a的反義核苷酸miR_320a和對(duì)照control-anti_miR分別作為候選物 質(zhì)，分別加入到上述包含miR-320a以及Pfnl mRNA的細(xì)胞中，觀察胞內(nèi)miR_320a以及Pfnl mRNA的結(jié)合情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-320a可有效地減少miR_320a以及Pfnl mRNA的結(jié)合，而 control-anti-miR不能有效地減少miR_320a的表達(dá)。討論腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤病人致死的主要原因之一，然而對(duì)其中的分子機(jī)制還知之甚少。 已有研究表明一些在原發(fā)腫瘤中表達(dá)的基因與腫瘤治療后的轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)密切相關(guān)。但是關(guān) 于導(dǎo)致這些基因異常表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面的了解還很有限。miRNA由于能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào) 控一系列基因的表達(dá)，因此是腫瘤遷移性發(fā)生過(guò)程中的上游調(diào)控因子的理想的候選因子。 目前已經(jīng)報(bào)道了一些miRNA在致癌或抑癌方面的功能，然而關(guān)于miRNA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中 的作用的研究剛剛起步。本發(fā)明關(guān)于與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的一個(gè)蛋白質(zhì)Pfnl是miR-320a的一 個(gè)靶基因。本發(fā)明人的研究表明了 miR-320a能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的遷 移性和侵襲性，而這一作用部分是由于miR-320a對(duì)Pfnl的調(diào)控引起的。作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，Profilin參與了許多肌動(dòng)蛋白相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)，如運(yùn) 動(dòng)、細(xì)胞連接、細(xì)胞漿移動(dòng)和細(xì)胞形態(tài)變化和維持。遺傳學(xué)的研究表明了 Profilin在正常 細(xì)胞的增殖和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Profilin基因缺陷會(huì)導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和胞 漿移動(dòng)出現(xiàn)障礙甚至胚胎致死。此外，近年在乳腺癌中的研究表明Pfnl能作為抑癌基因并 能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性。用siRNA沉默Pfnl能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的移動(dòng) 性和侵襲性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 Pfnl的一個(gè)內(nèi)源的調(diào)控小分子RNA，即miR-320a。這本身就 提示了 miR-320a可能調(diào)控細(xì)胞的遷移和侵襲。本發(fā)明人的研究也發(fā)現(xiàn)了 miR-320a在高遷 移性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中高表達(dá)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)用反義核酸抑制了 miR_320a功 能后，MDA-MB-231的遷移和侵襲都被抑制。而相反，在低遷移乳腺癌細(xì)胞MCF-7中過(guò)表達(dá) miR-320a能促進(jìn)該細(xì)胞的遷移和侵襲。這與前人關(guān)于Pfnl抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲性的研究 結(jié)論正好吻合?？偠灾景l(fā)明人的研究表明，Pfnl是miR-320a的靶基因，而且，11^1 -320￡1能促 進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的遷移性和侵襲性。在高侵襲的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中用反義核酸抑制miR-320a能有效抑制其遷移性和侵襲性，這意味著抑制miR-320a的活 性這種方法能成為遏制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的治療方案。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>抑制癌細(xì)胞侵襲性的方法和試劑<130)093922<160>17<170>PatentIn version 3. 3
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>寡核苷酸 <400>1
ucgcccucuc aacccagcuu uu22
<210>2 <211>22 <212>RNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>寡核苷酸 <400>2
aaaagcuggg uugagagggc ga22
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>3
tcacatatgt ctgtcccttc cccttcaccg ctcc 34
<210>4 <211>34 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>4
tcacatatga acaaaagttt tccaaccaca cacg
<210>5
<211>19
34
CN 10
88
89
90
96
丨200
201 202
203
204
205 丨206
丨207
丨208
丨20
0 1
O 1 2 3 4 5 6 11111111112222222 111111111111222222 2 2 2 2 22222222222222^^^
<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>5gccatcgtgg gctacaagg19<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>6ccatcagcag gactagcgtc tt22<210>7<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>7gatccgcttc gctcccctcc gccttctctt cccggttctt cccggagtcg g 51<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>8gggaagaacc gggaagagaa ggcggagggg agcgaagcg39<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature <223>引物 <400>9
gaaaagctgg gttgagaggg cgaaaaagga tgaggttttt tc42
<210>10 <211>54 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>10
tcgagaaaaa acctcatcct ttttcgccct ctcaacccag cttttcccga ctcc 54 <210>11 <211>51 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>11
gatccgcttc gctcccctcc ggcgtctctt gcgtggtctt cccggagtcg g51
<210>12 <211>38 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>12
gggaagacca cgcaagagac gccggagggg gcgaagcg38
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>13
10
CNgaacaccacg cttgagacgc cgaaaaagga tgaggttttt tc42<210>14<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>14tcgagaaaaa acctcatcct ttttcggcgt ctcaagcgtg gtgttcccga ctcc54<210>15<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>15cttccccttc accgctcccc actgatctgc acccctttcc tccccatac49<210>16<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>16gtatggggag gaaaggggtg cagatcagtg gggagcggtg aaggggaag49<210>17<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>17cctgctagca tggactacaa agacgatgac gataaaatgg ccgggtggaa cgcctac5權(quán)利要求
一種miR 320a的抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)Pfnl蛋白的細(xì)胞； 更佳的，所述的腫瘤細(xì)胞是Pfnl蛋白表達(dá)后遷移性和/或侵襲性降低的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞或肺癌細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于提高腫瘤細(xì)胞中Pfnl 的表達(dá)水平。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-320a的抑制劑是miR-320a的反 義核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，miR-320a的反義核苷酸選自(a)序列如SEQID NO 1所示的反義核苷酸；或者(b)序列與SEQID NO :1所示的序列具有80%以上的相同性、且具有(a)指定的反義 核苷酸功能的反義核苷酸；或者(c)序列與SEQID NO :1所示的序列在嚴(yán)格條件下雜交、且具有(a)指定的反義核苷 酸功能的反義核苷酸。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制腫瘤細(xì)胞包括抑制腫瘤細(xì)胞的 遷移和/或侵襲。
8.—種Pfnl抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是表達(dá)Pfnl蛋白的細(xì)胞； 更佳的，所述的腫瘤細(xì)胞是Pfnl蛋白表達(dá)被抑制后遷移性和/或侵襲性降低的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，Pfnl的抑制劑選自⑴序列如SEQ ID NO 2所示的miRNA ；或者(ii)序列與SEQID NO :2所示的序列具有80%以上的相同性、且具有(i)指定的 miRNA功能的miRNA ；或者(iii)序列與SEQID NO :2所示的序列在嚴(yán)格條件下雜交、且具有⑴指定的miRNA功 能的miRNA。
12.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的抑制腫瘤細(xì)胞包括抑制腫瘤細(xì)胞 的遷移和/或侵襲。
13.—種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)在測(cè)試組中，向表達(dá)miR-320a的體系中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)miR_320a 的表達(dá)或活性；并且，在對(duì)照組中，在不添加所述候選物的、表達(dá)miR-320a的體系中，檢測(cè) miR-320a的表達(dá)或活性；(2)將步驟(1)測(cè)試組中miR-320a的表達(dá)或活性與對(duì)照組中miR-320a的表達(dá)或活性 進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中miR-320a的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑 制腫瘤的潛在物質(zhì)。
14.一種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)在測(cè)試組中，向包含miR-320a和Pfnl mRNA的體系中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合情況；并且，在對(duì)照組中，在不添加所述候選物的、包含miR-320a和Pfnl的體系中，檢測(cè)miR-320與PfnlmRNA的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合情況與對(duì)照組中miR-320與 Pfnl mRNA的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中miR-320與Pfnl mRNA的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物 是抑制腫瘤的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制癌細(xì)胞侵襲性的方法和試劑。公開(kāi)了一種miR-320a的抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物；還公開(kāi)了一種Pfn1抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤細(xì)胞的組合物；還公開(kāi)了一種篩選抑制腫瘤的潛在物質(zhì)的方法。本發(fā)明首次揭示了miR-320a與腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲的相關(guān)性，并且Pfn1參與介導(dǎo)了該過(guò)程，從而為腫瘤的防治提供了新的靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101987197SQ20091005569
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者史毅, 趙波濤, 金由辛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院