專(zhuān)利名稱(chēng)：一種組織工程化的人工視神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化的人工視神經(jīng)導(dǎo)管及其制 備方法。
背景技術(shù)：
視神經(jīng)疾病是眼科臨床中常見(jiàn)的一大類(lèi)疾病，由于損傷后的視神經(jīng)修復(fù)能力很 差，常常造成不可逆的后果，導(dǎo)致嚴(yán)重的視力減退和喪失。臨床治療手段有限，治療效果較 差，是目前臨床上的一大難題。隨著神經(jīng)科學(xué)和材料學(xué)的發(fā)展，各種組織工程化的人工神經(jīng) 移植物被應(yīng)用于促進(jìn)外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)再生的研究中，用于促進(jìn)視神經(jīng)損傷修復(fù)或再生 的組織工程化導(dǎo)管即人工視神經(jīng)的研究得到了越來(lái)越多的關(guān)注。所謂人工視神經(jīng)，是將能促進(jìn)神經(jīng)再生的種子細(xì)胞輔以神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子填充到支架 材料上，構(gòu)成的一個(gè)立體管道狀結(jié)構(gòu).人工視神經(jīng)并非解剖意義的神經(jīng)組織，其主要作用 是為視神經(jīng)再生提供一個(gè)良好的環(huán)境，從而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床研究中促進(jìn)視神經(jīng)的再生或 損傷的修復(fù)。研究顯示，損傷后的外周神經(jīng)之所以能夠再生，雪旺細(xì)胞起了主要的作用.雪旺 細(xì)胞是外周神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，據(jù)研究報(bào)道，周?chē)窠?jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞功能通過(guò)以下幾個(gè)方 面的作用來(lái)促進(jìn)神經(jīng)的再生分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等；產(chǎn)生促突起生長(zhǎng)因子(NPF)；釋放軸突誘導(dǎo)因子等，以上物質(zhì)均具有 營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)受損神經(jīng)元、促進(jìn)軸突再生和出芽等作用。其次，雪旺細(xì)胞可以作為再生軸突的 機(jī)械性導(dǎo)管樣引導(dǎo)物，支持和引導(dǎo)軸突再生。此外，雪旺細(xì)胞還可以抑制膠質(zhì)瘢痕形成，協(xié) 助形成神經(jīng)內(nèi)膜，清除細(xì)胞碎片，促進(jìn)軸突髓鞘化，是理想的種子細(xì)胞。聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)是目前臨床上最常用的生物可降解縫線的材料， 有可靠的組織相容性和生物安全性，其物理特性根據(jù)聚乳酸和聚乙醇酸的比例變化而變 化，PLGA(PLG/PLA 90/10)在體內(nèi)2個(gè)月左右可自行降解，以其細(xì)絲編織而成的中空導(dǎo)管彈 性和硬度適宜，既滿足眼眶手術(shù)特殊解剖位置的操作需求，又為視神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)維持一 定的空間，是理想的人工視神經(jīng)支架材料。現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的有關(guān)人工視神經(jīng)的研究，多為將營(yíng)養(yǎng)因子直接填充到可吸收材料 細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管中，但由于營(yíng)養(yǎng)因子的半衰期一般較短，尤其是目前唯一證實(shí)的具有 促進(jìn)視神經(jīng)再生的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子CNTF，其半衰期很短，在眼內(nèi)持續(xù)時(shí)間有限，直接的蛋 白填充不能為神經(jīng)軸突再生提供持久的營(yíng)養(yǎng)支持，這無(wú)疑是影響人工神經(jīng)作用效果的的一 大瓶頸。有研究嘗試用病毒轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子到雪旺細(xì)胞，但是病毒轉(zhuǎn)染的生 物安全性問(wèn)題也限制了其臨床的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組織工程化的人工視神經(jīng)導(dǎo)管。尤其涉及一種安全可降
3解的，能持續(xù)、有效地為神經(jīng)再生軸突提供營(yíng)養(yǎng)支持的人工視神經(jīng)。本發(fā)明提供的組織工程化的人工視神經(jīng)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，可以成功移植到 SD大鼠損傷視神經(jīng)斷端，改變抑制軸突再生的微環(huán)境，同時(shí)轉(zhuǎn)染了 CNTF基因的雪旺細(xì)胞能 持續(xù)分泌包括CNTF在內(nèi)的多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為損傷視神經(jīng)的再生軸突提供有效的營(yíng)養(yǎng) 支持，促進(jìn)軸突再生。本發(fā)明人工視神經(jīng)導(dǎo)管采用的是生物可降解材料，具有良好的組織相 容性，移植后異物反應(yīng)小，其在體內(nèi)可逐漸自行降解，避免了二次手術(shù)的損傷性操作，安全 性好。本發(fā)明組織工程化的人工視神經(jīng)包括PLGA細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管(1)、填充在導(dǎo) 管中的PGA細(xì)絲(2)、填充在導(dǎo)管中的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞(3)。所述的PLGA細(xì)絲編織成的中空導(dǎo)管作為人工視神經(jīng)的外部支架，導(dǎo)管內(nèi)徑為 0. 8mm-6mm，外徑為lmm_6. 5mm，長(zhǎng)為ll_50mm，可根據(jù)不同移植對(duì)象的需要，制備不同尺 寸的導(dǎo)管，如用于大鼠的視神經(jīng)移植可選用內(nèi)徑為0.8mm，外徑為1mm，長(zhǎng)為Ilmm(短導(dǎo) 管)/23mm(長(zhǎng)導(dǎo)管)的人工視神經(jīng)。為增加導(dǎo)管的組織相容性并中和其降解時(shí)形成的酸性微環(huán)境，本發(fā)明在導(dǎo)管⑴ 表面涂布生物可降解的殼聚糖聚合體(4)。。本發(fā)明中所述的導(dǎo)管(1)表面涂布2層殼聚糖聚合體。所述的導(dǎo)管內(nèi)填充生物可降解的PGA細(xì)絲作為人工視神經(jīng)的內(nèi)部支架。該P(yáng)GA細(xì) 絲取材于常用4-0手術(shù)縫線，每根細(xì)絲直徑10 μ m,細(xì)絲長(zhǎng)度與導(dǎo)管長(zhǎng)度一致。本發(fā)明將體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液與等體積的基質(zhì)膠混合，取8-200ul填 充PGA細(xì)絲的PLGA導(dǎo)管，制成完整的人工視神經(jīng)。為延長(zhǎng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用時(shí)間，本發(fā)明用電穿孔的方法，采用適合的電穿孔參 數(shù)，在體外將CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到雪旺細(xì)胞，再將其填充、培養(yǎng)到導(dǎo)管中，這種轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞 能夠持久而有效的分泌包括CNTF，從而長(zhǎng)期促進(jìn)再生神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一目的是提供上述人工視神經(jīng)的制備方法。本發(fā)明采用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)細(xì)絲編織成中空導(dǎo)管，作為人工視神 經(jīng)的外部支架，表面涂布?xì)ぞ厶蔷酆衔?，其?nèi)填充生物可降解材料聚乳酸細(xì)絲作為人工視 神經(jīng)的內(nèi)部支架。利用電穿孔技術(shù)在體外將CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中，再將 這種轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞填充、培養(yǎng)到中空導(dǎo)管內(nèi)，制成人工視神經(jīng)。本發(fā)明方法包括如下步驟，以1. Icm長(zhǎng)度的大鼠視神經(jīng)導(dǎo)管為例(1)構(gòu)建CNTF質(zhì)粒。按本領(lǐng)域常規(guī)方法，通過(guò)PCR法從pNUT_hCNTF_DT質(zhì)粒中分 離出 CNTF 外顯子片段，引物為:P1 :5，-ATG GCT TTC ACA GAG CAT TC_3，，P2 :5，-TTG TTC AGG CCC TGA TGC TTC ACA TAG GAT TCC GTA AGA GCA GTC A_3’，P3 5'-TGA CTG CTC TTA CGG AAT CCT ATG TGA AGC ATC AGG GCC TGA ACA A-3'禾PP4 -CTA CAT TTT CTT GTT GTT AGC AA-3，。然后將其兩段外顯子連接成CNTFcDNF，并將該cDNA片段插入pcDNA3. 1/ NT-GFP-T0P0 質(zhì)粒的 TOPO 酶位點(diǎn)(Invitrogen)，構(gòu)建 pcDNA3. 1/NT-GFP-CNTF 質(zhì)粒，將該質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，按Endofree Plasmid Purification Maxi試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增抽提質(zhì) 粒，保存?zhèn)溆谩?2)通過(guò)電穿孔的方法將CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞在6孔板中加入DMEM/10% FBS培養(yǎng)液，將雪旺細(xì)胞以5 X IO6密度接種其中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，吸出培養(yǎng)液，PBS液洗3遍，然后每孔加入lOOmlD-Hank’ s溶液，其中 含有12. 5 μ g CNTF質(zhì)粒，靜置10分鐘后，加入900mlD-Hank，s溶液，然后將Petri Pulser PP35-2P電極插入孔板，使部分電極浸入液面，放于細(xì)胞表面，連接電穿孔儀(ECM-830， BTX)進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為電壓192v，時(shí)間20ms，間隔500ms，脈沖5次的方波。電擊完畢， 靜止5分鐘，吸凈D-Hank’ s液，再加入DMEM/FBS細(xì)胞培養(yǎng)液置37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(3)制備 PLGA 導(dǎo)管將PLGA細(xì)絲根據(jù)需要編織成內(nèi)徑0. 8mm、外徑1. Omm的中空導(dǎo)管，導(dǎo)管表面涂布?xì)?聚糖聚合物，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌。顯微鏡下將手術(shù)用4-0PGA可吸收縫線拆成PGA細(xì)絲，取 80根PGA細(xì)絲(細(xì)絲直徑為10 μ m)均勻填充到PLGA中空導(dǎo)管中，作為人工視神經(jīng)的內(nèi)部 支架。將該導(dǎo)管放入75%酒精消毒半小時(shí)后，PBS沖洗3遍，在超凈臺(tái)中自然風(fēng)干后填充細(xì) 胞。(4)將轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞填充到PLGA導(dǎo)管中電穿孔24小時(shí)后，用胰酶消化轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞并制成l-2X107cellS/mL細(xì)胞密 度的單細(xì)胞懸液，然后加入等體積的Matrigel (BD)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附性并提供細(xì)胞生存的 營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。取8μ 1上述轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液注入填充了 PGA細(xì)絲的1. Icm PLGA導(dǎo)管中， 然后將該導(dǎo)管放入雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)的六孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移植。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)該人工視神經(jīng)移植到損傷視神經(jīng)斷端以后，轉(zhuǎn)基 因雪旺細(xì)胞會(huì)持久而有效的釋放各種促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的營(yíng)養(yǎng)因子，從而為視神經(jīng)再生軸 突提供強(qiáng)大的營(yíng)養(yǎng)支持，修復(fù)損傷，能較好的促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生，且安全性較高。本發(fā)明的人工視神經(jīng)，可進(jìn)一步在形態(tài)上進(jìn)行改良，應(yīng)用于臨床，作為一種神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)治療方法促進(jìn)損傷視神經(jīng)的再生修復(fù)。本發(fā)明組織工程化的人工視神經(jīng)的優(yōu)點(diǎn)在于(1)結(jié)構(gòu)新現(xiàn)有技術(shù)的人工神經(jīng)均采用生物可降解材料構(gòu)成的中空導(dǎo)管，PLGA 是其中最為常用的材料，但是無(wú)論是在該中空導(dǎo)管中填充種子細(xì)胞還是直接注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子，因?qū)Ч苤醒霟o(wú)細(xì)胞附著的支架，種子細(xì)胞容易往周?chē)墓鼙诰奂L(zhǎng)，不利于種子細(xì) 胞更合理地分布，從而影響促軸突再生的效果；本發(fā)明在傳統(tǒng)的中空導(dǎo)管中均勻填充了生 物可降解的PGA細(xì)絲，一方面增加了轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞黏附的面積，使其能均勻分布在導(dǎo)管 中，另一方面也對(duì)再生的神經(jīng)軸突起到一個(gè)引導(dǎo)作用，使軸突沿細(xì)絲的方向生長(zhǎng)。(2)方法新現(xiàn)有技術(shù)的人工神經(jīng)多為在中空導(dǎo)管中填充可分泌營(yíng)養(yǎng)因子的種子 細(xì)胞或直接填充營(yíng)養(yǎng)因子，或用病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因來(lái)增強(qiáng)種子細(xì)胞的再生能力； 本發(fā)明在選用經(jīng)典的促神經(jīng)再生的種子細(xì)胞-雪旺細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用特定電穿孔條件， 用電穿孔法將CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到雪旺細(xì)胞中，使其能夠持久有效地分泌CNTF，為再生軸突的 持續(xù)生長(zhǎng)提供了保障，能進(jìn)一步增強(qiáng)其促視神經(jīng)再生的能力。本發(fā)明采用了物理轉(zhuǎn)染方法， 轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞的損傷小，避免了病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性，安全、有效、簡(jiǎn)便。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要 特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文 說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本 發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1為本發(fā)明組織工程化的人工視神經(jīng)結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1是PLGA細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管；2是PGA細(xì)絲；3是轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液；4是殼聚糖聚合體。圖2為電穿孔后雪旺細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，其中顯示，A，B 電穿孔24h后，超過(guò)90%的雪旺細(xì)胞顯示綠色熒光，表明該轉(zhuǎn)染方 法的轉(zhuǎn)染率高；C 轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞既顯示綠色熒光；D 免疫組化染色顯示轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì) 胞表達(dá)CNTF。圖3為將轉(zhuǎn)染了 CNTF的雪旺細(xì)胞行RT-PCR檢測(cè)雪旺細(xì)胞分泌CNTF的情況，其中，1為CNTF-GFP轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞組，2為GFP轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞組，3為未轉(zhuǎn)染雪旺細(xì) 胞組，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染CNTF-GFP的雪旺細(xì)胞有大量CNTF的表達(dá)，而對(duì)照組無(wú)，說(shuō)明雪旺細(xì)胞 所分泌的CNTF是外源性基因表達(dá)的。圖4顯示了制備的人工視神經(jīng)在培養(yǎng)皿中，在其中填充的細(xì)絲之間有大量的雪旺 細(xì)胞粘附。圖5是轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞填充到PLGA導(dǎo)管中24小時(shí)后的人工視神經(jīng)的掃描電鏡照 片，其中可見(jiàn)大量健康的雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)在細(xì)絲之間。圖6是實(shí)施例3中人工視神經(jīng)一端移植到視神經(jīng)斷端，另一端包埋在皮下。圖7是實(shí)施例3中人工視神經(jīng)移植4周后，可見(jiàn)導(dǎo)管已經(jīng)部分降解，導(dǎo)管被膜性組 織包被。圖8是實(shí)施例3中人工視神經(jīng)冰凍切片行GAP43免疫組化染色的結(jié)果，其中8A 移植的空導(dǎo)管內(nèi)則未見(jiàn)到相似的再生神經(jīng)纖維；8B 填充單純雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)導(dǎo)管；8C，8D 填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)，內(nèi)有表達(dá)GAP43的再生神經(jīng)軸突。圖9是實(shí)施例3中人工視神經(jīng)移植4周后，在導(dǎo)管末端行DiI逆行標(biāo)染軸突再生 的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)，其中，9A顯示為移植轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管的視網(wǎng)膜鋪片中DiI標(biāo)染陽(yáng)性的RGCs，9B顯示為移植單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管的視網(wǎng)膜鋪片中DiI標(biāo)染陽(yáng)性的RGCs，9C顯示為移植空導(dǎo)管的視網(wǎng)膜鋪片上，很少可見(jiàn)DiI標(biāo)染陽(yáng)性的RGCs，可見(jiàn)移植 轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管后軸突再生的RGCs明顯多于移植單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管后軸突再生的 RGCs,而單純空導(dǎo)管移植組幾乎看不到軸突再生的RGCs。圖10是實(shí)施例4中人工視神經(jīng)一端移植到視神經(jīng)斷端，另一端插入對(duì)側(cè)上丘。圖11是實(shí)施例4中人工視神經(jīng)移植8周后已完全吸收，可見(jiàn)人工視神經(jīng)變成一神 經(jīng)樣組織。圖12是實(shí)施例4中人工視神經(jīng)冰凍切片行GAP43免疫組化染色的結(jié)果，其中，填 充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)顯示綠色熒光的細(xì)絲即為表達(dá)GAP43的神經(jīng)絲。圖13是實(shí)施例4中人工視神經(jīng)移植8周后透射電鏡照片，其中可見(jiàn)雪旺細(xì)胞⑶ 大量存活，并且看上去很健康，并可見(jiàn)到很多再生的神經(jīng)軸突(箭頭指)；13A，13B:新生軸 突沒(méi)有髓鞘)；圖13C，13D 軸突被雪旺細(xì)胞包繞并重新髓鞘化。
具體實(shí)施例方式下面以本發(fā)明的實(shí)施例為基礎(chǔ)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，將更有助于本領(lǐng)域的研究人員理 解本發(fā)明的內(nèi)容，但不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1制備組織工程化的人工視神經(jīng)(填充普通雪旺細(xì)胞)將體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞以5XlO6ceIVml密度接種到6孔板中，加入10% FBS/ DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)，用胰酶消化并進(jìn)行移植.將PLGA細(xì)絲根據(jù)需要編織成的中空導(dǎo)管，導(dǎo)管表面涂布一層殼聚糖聚合物，環(huán)氧 乙烷熏蒸滅菌。顯微鏡下將手術(shù)用4-0PGA可吸收縫線拆散成PGA細(xì)絲，取PGA細(xì)絲(細(xì)絲 直徑為ΙΟμπι)均勻填充到PLGA中空導(dǎo)管中，作為人工視神經(jīng)的內(nèi)部支架。然后將該導(dǎo)管 放入75%酒精中消毒半小時(shí)，然后用PBS沖洗3遍，在超凈臺(tái)中自然風(fēng)干后填充細(xì)胞.雪旺細(xì)胞用胰酶消化并制成1-2Χ IO7ceIlsAiL細(xì)胞密度的單細(xì)胞懸液，然后加入 同等體積的Matrigel (BD)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附性并提供細(xì)胞生存的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。取適量上述轉(zhuǎn) 基因雪旺細(xì)胞懸液輕輕注射到填充了 PGA細(xì)絲的PLGA導(dǎo)管中，然后將該導(dǎo)管繼續(xù)放入雪旺 細(xì)胞生長(zhǎng)的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后移植。實(shí)施例2制備組織工程化的人工視神經(jīng)(填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞)將體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞以5X 106cell/ml密度接種到6孔板中，加入10 % FBS/DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到90 %時(shí)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS液洗3遍，然 后每孔加入IOOmlD-Hank' s溶液，其中含有12. 5yg CNTF質(zhì)粒，靜置110分鐘后，加入 900mlD-Hank，s溶液，然后將Petri Pulser PP35-2P電極輕輕插入六孔板，使部分電極浸 入液面，輕放于細(xì)胞表面，連接電穿孔儀(ECM-830，BTX)進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為電壓192v， 時(shí)間20ms，間隔500ms，脈沖5次的方波。電擊完畢后，靜止5分鐘，然后吸凈電轉(zhuǎn)液，重新 加入10% FBS/DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)放入在37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞以 5X106cell/ml密度接種到6孔板中，加入DMEM和FBS培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)， 在6孔板中加入CNTF質(zhì)粒，然后輕輕插入Petri Pulser PP35-2P電極，并將電極連接到 BTX公司的ECM-830電穿孔儀，以電壓192v，時(shí)間20ms，間隔500ms，脈沖5次的方波電擊細(xì) 胞表面。電擊以后繼續(xù)將雪旺細(xì)胞培養(yǎng)在上述培養(yǎng)液中。將PLGA(PLG/PLA 90/10)細(xì)絲編織成內(nèi)徑為0. 8mm,外徑為1mm，長(zhǎng)為23mm的中
空導(dǎo)管，作為人工視神經(jīng)的外部支架，導(dǎo)管表面涂布二層殼聚糖聚合物，以增強(qiáng)其組織相容 性。顯微鏡下將手術(shù)用4-0縫線拆散為直徑為ΙΟμπι的PGA細(xì)絲，取80根細(xì)絲填充到上述 PLGA中空導(dǎo)管中，作為人工視神經(jīng)的內(nèi)部支架。將前述轉(zhuǎn)染CNTF基因的雪旺細(xì)胞用胰酶消化并制成1-2Χ 107cellS/mL細(xì)胞密度 的單細(xì)胞懸液，然后加入同等體積的Matrigel (BD)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附性并提供細(xì)胞生存的 營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。取8μ 1上述轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液輕輕注射到填充了 PGA細(xì)絲的PLGA導(dǎo)管中， 然后將該導(dǎo)管繼續(xù)放入雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后移植。實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8_10周的SD大鼠(200_250g) 16只，購(gòu)于中科院動(dòng)物所，按照復(fù)旦大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)的要求飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)方法全麻下手術(shù)分離大鼠左眼視神經(jīng)，切開(kāi)視神經(jīng)鞘膜，在視乳頭后0. 5mm 切斷軸突，并切除遠(yuǎn)側(cè)斷端約3mm長(zhǎng)的軸突，過(guò)程中避免損傷到鞘膜上的血管，將上述Ilmm長(zhǎng)的人工視神經(jīng)的一端用10-0縫線縫合到視神經(jīng)近側(cè)端的鞘膜上，另一端用8-0縫線縫合 在頭皮下(圖6)，手術(shù)后檢查眼底，確認(rèn)未損傷到視神經(jīng)鞘膜上的血管而影響視網(wǎng)膜的血 供，人工視神經(jīng)移植后4周，常規(guī)處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取人工視神經(jīng)，分別通過(guò)Dil逆行標(biāo)染、免 疫組織化學(xué)染色、視網(wǎng)膜鋪片計(jì)數(shù)RGC密度觀察再生視神經(jīng)軸突的情況。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)空導(dǎo)管移植組(僅移植導(dǎo)管支架，其內(nèi)未填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞)、雪 旺細(xì)胞導(dǎo)管移植組(PLGA導(dǎo)管內(nèi)填充的為普通雪旺細(xì)胞)為對(duì)照，方法同上。結(jié)果顯示將人工視神經(jīng)的冰凍切片(縱行)用再生軸突的標(biāo)記物GAP43免疫組化染色標(biāo)記 再生的神經(jīng)軸突，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，移植空導(dǎo)管組內(nèi)則未見(jiàn)到GAP43標(biāo)染的再生神經(jīng) 纖維(圖8A)，填充單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管內(nèi)可見(jiàn)GAP43標(biāo)染的再生軸突(圖8B)，但轉(zhuǎn)基因雪 旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)則可見(jiàn)更多的標(biāo)染GAP43的再生軸突(圖8C和圖8D)。人工視神經(jīng)經(jīng)DiI 3天逆行標(biāo)染后，制作視網(wǎng)膜鋪片，觀察DiI標(biāo)染的軸突再生的 RGCs.以視乳頭為原點(diǎn)，四個(gè)象限分別取離距原點(diǎn)lmm、2mm、3mm共12個(gè)區(qū)域行共聚焦掃描， 計(jì)數(shù)每平方毫米內(nèi)DiI標(biāo)染的RGCs密度，從而反應(yīng)其再生的效果(圖9)。空導(dǎo)管組再生 RGCs密度為58 士 23/mm2，而單純雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)組再生RGCs密度為323 士65/mm2， 填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)的組再生RGCs密度為432 士93/mm2，(各組兩兩T檢驗(yàn)P < 0. 05)，說(shuō)明單純雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)移植可以達(dá)到促進(jìn)視神經(jīng)再生的效果，而轉(zhuǎn)基因 雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)可達(dá)到更好的促再生效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的組織工程化的人工視神經(jīng)組織相容性和安全性較好，移 植以后未見(jiàn)免疫排斥反應(yīng)，并且移植4周后可以觀察到明顯的視神經(jīng)再生軸突長(zhǎng)入其中， 說(shuō)明改變了抑制神經(jīng)再生的微環(huán)境，同時(shí)予以持續(xù)有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可以更好的促進(jìn) 視神經(jīng)再生的，該人工視神經(jīng)能夠很好的輔助視神經(jīng)再生的研究。實(shí)施例4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取17只8-10周的SD大鼠(200_250g)，按照復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)的要求 飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房。常規(guī)處理分離實(shí)驗(yàn)大鼠左眼視神經(jīng)和視神經(jīng)鞘膜，在視乳頭后0. 5mm 切斷軸突，并切除遠(yuǎn)側(cè)斷端約3mm長(zhǎng)的軸突，過(guò)程中避免損傷到鞘膜上的血管。然后將上述 23mm長(zhǎng)的人工視神經(jīng)的一端用10-0縫線縫合到視神經(jīng)近側(cè)端的鞘膜上，另一端插入右側(cè) 上丘。手術(shù)后檢查眼底，確認(rèn)沒(méi)有損傷到視神經(jīng)鞘膜上的血管而影響視網(wǎng)膜的血供。人工 視神經(jīng)移植后2個(gè)月，按常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取得人工視神經(jīng)。同上方法，設(shè)空導(dǎo)管移植組(僅移植PLGA導(dǎo)管，其內(nèi)未填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞)、單 純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管移植組(PLGA導(dǎo)管內(nèi)填充的為普通雪旺細(xì)胞)為對(duì)照。結(jié)果顯示移植8周后的人工視神經(jīng)，可見(jiàn)人工視神經(jīng)管已基本吸收，變成神經(jīng)樣組織(圖 11)；將移植8周后的人工視神經(jīng)的冰凍切片行GAP43免疫組化染色標(biāo)記再生視神經(jīng)纖 維，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)，填充轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)有表達(dá)GAP43的神經(jīng) 絲(圖12)，而移植的空導(dǎo)管內(nèi)則未見(jiàn)到相似的再生神經(jīng)纖維。將移植8周后的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的人工視神經(jīng)行掃描電鏡觀察人工視神經(jīng)內(nèi)的 超細(xì)結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)人工視神經(jīng)內(nèi)仍存活大量健康的雪旺細(xì)胞和再生的神經(jīng)軸突，部分軸突呈
8無(wú)髓鞘狀態(tài)(圖13A，圖13B)，但可見(jiàn)部分軸突被雪旺細(xì)胞重新髓鞘化(圖13C，圖13D)，說(shuō) 明雪旺細(xì)胞不但可以促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生，同時(shí)還可以使再生軸突重新髓鞘化，有利于新 生軸突的功能恢復(fù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的組織工程化的人工視神經(jīng)組織相容性和安全性較好，移 植以后未見(jiàn)免疫排斥反應(yīng)，移植8周后可見(jiàn)明顯的視神經(jīng)再生軸突長(zhǎng)入其中，并使再生軸 突髓鞘化，說(shuō)明本人工視神經(jīng)能長(zhǎng)時(shí)間為再生神經(jīng)軸突生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持，有明確促再生 效果?？蛇M(jìn)一步研究再生神經(jīng)絲沿人工視神經(jīng)與對(duì)側(cè)上丘建立聯(lián)系，最終實(shí)現(xiàn)視功能的重建。
權(quán)利要求
一種組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，其包括，PLGA細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管(1)、PGA細(xì)絲(2)和轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液(3)，所述的導(dǎo)管(1)表面涂布?xì)ぞ厶蔷酆象w(4)。
2.按權(quán)利要求1所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的PLGA細(xì)絲編織成 的中空導(dǎo)管(1)為人工視神經(jīng)的外部支架，其內(nèi)徑為0. 8mm 6mm，外徑為Imm 6. 5mm，長(zhǎng) 為 11 50mm。
3.按權(quán)利要求1所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的PGA細(xì)絲⑵為人 工視神經(jīng)的內(nèi)部支架，其填充、分布在上述中空導(dǎo)管(1)中。
4.按權(quán)利要求3所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的PGA細(xì)絲(2)其直 徑為10 μ m,數(shù)量為80-500根。
5.按權(quán)利要求1所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞 轉(zhuǎn)染CNTF質(zhì)粒。
6.按權(quán)利要求2所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞 通過(guò)電穿孔輔助CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞內(nèi)。
7.按權(quán)利要求1所述的組織工程化的人工視神經(jīng)，其特征是，所述的導(dǎo)管(1)表面涂布 2層殼聚糖聚合體。
8.權(quán)利要求1所述的組織工程化的人工視神經(jīng)的制備方法，其特征是，包括下述步驟(1)通過(guò)電穿孔的方法將CNTF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞內(nèi)；(2)制備PLGA細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管，表面涂布?xì)ぞ厶蔷酆象w，導(dǎo)管內(nèi)填充PGA細(xì)絲；(3)將轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞的懸液填充到PLGA導(dǎo)管中。
9.按權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液為轉(zhuǎn)染了 CNTF質(zhì)粒的雪旺細(xì)胞以1-2X IO7ceIlsAiL的密度培養(yǎng)在10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，并加 入同等體積的基質(zhì)膠。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，涉及一種組織工程化的人工視神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法。本發(fā)明包括PLGA細(xì)絲編織的中空導(dǎo)管、PGA細(xì)絲和轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞懸液，所述的導(dǎo)管表面涂布?xì)ぞ厶蔷酆象w。其中PLGA中空導(dǎo)管構(gòu)成人工視神經(jīng)的外部支架；PGA細(xì)絲填充在其內(nèi)構(gòu)成人工視神經(jīng)的內(nèi)部支架。本發(fā)明能有效促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突的再生，具有持久提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持和對(duì)再生神經(jīng)軸突起到引導(dǎo)作用等優(yōu)點(diǎn)，所述導(dǎo)管的組織相容性和安全性均較好，轉(zhuǎn)染的基因和導(dǎo)管的規(guī)格可根據(jù)需要調(diào)整，能用于視神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究，有望在臨床上用于促進(jìn)損傷視神經(jīng)的再生修復(fù)。
文檔編號(hào)A61B17/00GK101966090SQ20091005546
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者孫興懷, 張佩華, 方媛, 王艷, 莫曉芬, 郭文毅, 郯志清 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院;東華大學(xué)