專利名稱：微小rna在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微小RNA及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及微小RNA-15a (miR-15a)和微小 RNA-16-1 (miR-16-l)在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
miRNA是基因表達(dá)和蛋白翻譯過程中的調(diào)節(jié)分子，在腫瘤的發(fā)生過程起到調(diào)控的樞紐 作用。某些miRNA可能是潛在的癌基因或者抑癌基因，通過尋找具有癌基因和抑癌基因性 質(zhì)的imRNA，不僅可為腫瘤的診斷也能為腫瘤的生物治療提供新的耙標(biāo)。miRNA相關(guān)的腫瘤基因治療包括敲除或敲減癌基因性miRNA，引入抑癌基因性miRNA 兩方面。 一方面引入與具有癌基因特性miRNA互補(bǔ)的合成反義寡核苷酸(Anti-miRNA Antisense Oligonucleotides, AMOs)，可有效的滅活腫瘤中的miRNA，延緩其生長(WeierJ, Hunziker J, Hall J. Anti2miRNA oligonucleotides (AMOs) : ammunition to target miRNAs implicated in human disease[J]. Gene Ther, 2006, 13 (6) : 496-502.)。使用與膽固醇耦聯(lián)的 AMOs注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miR-16, miR-122， miR-192和miR-194的活性 (Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R,et al. Silencing of microRNAs in vivo with"antagomirs" [J] .Nature, 2005 ， 438 (7068) :685-689.)，因而可能成為一種有希望的治療藥物。臨床上， 可以通過經(jīng)常的或者持續(xù)的2'-0-甲基化或者鎖定核酸(LNA)等修飾的反義寡核苷酸給藥 使rmRNA失活。這些修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定，比其他治療手段毒性更低。另一方面，過 表達(dá)那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNA，如let-7家族也可以用于治療某些特定的腫瘤。 利用病毒或者脂質(zhì)體的表達(dá)系統(tǒng)可以瞬時(shí)引入大量imRNA。這些技術(shù)可以保證在某些組織 特異性的啟動子控制之下，表達(dá)pre-miRNA及其兩側(cè)序列，并且刺激內(nèi)源性的miRNA加工， 產(chǎn)生正確的miRNA，抑制特定基因表達(dá)。miR-15a和miR-16-l位于13q14.3， 一個(gè)30kb的缺失區(qū)域，65。/。的B-CLL這兩種基因表達(dá) 水平下調(diào)(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (39) :13944-13949.)。下調(diào)的原因之 一是大約40X的腫瘤標(biāo)本發(fā)生13ql4區(qū)域缺失(Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 inchronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl cad Sci USA, 2002, 99 (24) : 15524-15529.)。 CLL
病例13ql4純合性或雜合性丟失是CLL最常見的染色體異常，50%的套細(xì)胞淋巴瘤，16~40% 的多發(fā)性骨髓瘤和60。/。的前列腺癌13ql4丟失。表明13ql4存在一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因， 與人類腫瘤的病原學(xué)發(fā)生有關(guān)。另一種可能的解釋是，部分白血病患者的miR-15a/nuR-16-l 前體下游7bp處發(fā)生C—T突變，這一突變影響miRNA的加工成熟(Calin GA, Ferracin M， Cimino A, et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J]. New Engl J Med， 2005, 353 (17) :1793-1801.)。 Amelia等(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005, 102 (39) :13944-13949.)發(fā)現(xiàn)，在CLL中，miR-15a和miR-16-l 的表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，兩種miRNA均可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)Bcl-2。 miR-15和 miR-16靠5'端的9個(gè)堿基序列相同，且這9個(gè)堿基與Bcl-2的3287-3279堿基互補(bǔ)。將 miR-15/miR-16轉(zhuǎn)染入MEG-01細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡，pro-caspase9和PARP的清除。
現(xiàn)有的研究表明mOl-15a/16-l可能與血液腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但目前還沒有此兩種微小 RNA可用于腫瘤，尤其是淋巴瘤治療和/或預(yù)防的證據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將miR-15a和imR-16-l用于制備預(yù)防或治療淋巴瘤的藥物。
為此，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案 一種微小RNA在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物
中的應(yīng)用，所述藥物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前
體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
優(yōu)選地，所述微小RNA或其前體經(jīng)過公知的改良性修飾。
作為上述應(yīng)用的一種具體化，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，該 組合物包括有效量的微小RNA和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，所述微小RNA為 微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中 兩種以上的混合物。
作為上述組合物的一種優(yōu)選還包括能夠誘導(dǎo)腫瘤凋亡的化療藥物。所述的化療藥物 更優(yōu)選能夠誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的藥物如阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素、甲氨 喋呤、三氧化二砷或它們中兩種以上的混合物等。
所述微小RNA或其前體可通過化學(xué)合成得到，為增強(qiáng)其穩(wěn)定性、生物利用度、組織靶 向性等藥學(xué)特征，可對其進(jìn)行公知的改良性修飾，如硫代修飾或甲氧修飾等；或者通過構(gòu) 建真核表達(dá)載體得到，也即藥物的活性成分中包括含有上述微小RNA序列的表達(dá)載體，該載體在體內(nèi)表達(dá)后起到相應(yīng)的藥效作用。所述真核表達(dá)載體可為質(zhì)粒載體或病毒載體，以 及其它可通過本領(lǐng)域公知手段獲得的載體形式。
優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。
本發(fā)明所述的藥物組合物適合用于預(yù)防和/或淋巴瘤，尤其Burkitt淋巴瘤的治療。 本發(fā)明的基本原理本發(fā)明首先化學(xué)合成miR-15a和miR-16-l寡核苷酸，檢測其對 Raji細(xì)胞有無凋亡誘導(dǎo)作用?；瘜W(xué)合成的寡核苷酸片段小，容易轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。為研究成熟 的miR-15a/16-l與其前體對Raji細(xì)胞的影響有無功能上的差異性。本發(fā)明還構(gòu)建了miR-15a 前體真核表達(dá)載體。通過將體外擴(kuò)增合成的imR-15a前體序列構(gòu)建于pGCSIL-GFP真核表 達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在U6啟動子的作用下轉(zhuǎn)錄為"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)的pre-miR-15a，通過細(xì)胞 內(nèi)自身的RNA聚合酶III D1Cer的作用下剪接加工成為成熟的nnR-15a，從而發(fā)揮對靶基因 的調(diào)控作用。
本發(fā)明采用熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)成熟miR-15a的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)證明 細(xì)胞內(nèi)miR-15a的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒后顯著增高，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而各組Bcl-2mRNA的表達(dá)水平未見顯著性差異，可見imR-15a 是在轉(zhuǎn)錄后水平對Bcl-2進(jìn)行調(diào)控，即抑制Bcl-2mRNA翻譯，從而下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)， 而不是直接降解Bcl-2 mRNA;進(jìn)而采用臺盼藍(lán)拒染法和CCK8法均檢測到miR-15a組、 miR-16-l組及pre-miR-15a組細(xì)胞48h和72h增殖活性顯著下降，Hoechst染色從形態(tài)學(xué)上 可見miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a處理組有明顯的凋亡小體；FCM結(jié)果也顯示該組 的細(xì)胞凋亡率要高于其他組，即miR-15a和miR-16-l促進(jìn)了 Raji細(xì)胞的凋亡。結(jié)果表明， miR-15a和miR-16-l可通過抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Raji細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞 的增殖活性，抑制細(xì)胞的生長，可用于制備相關(guān)的預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
許多化療藥物均是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而產(chǎn)生抗癌效應(yīng)的。Bcl-2家族是細(xì)胞凋 亡的重要調(diào)控基因，在細(xì)胞凋亡的過程中處于調(diào)控機(jī)制的終末部分，該基因家族在維持細(xì) 胞生理分化、發(fā)育和細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡中具有重要作用，其表達(dá)狀態(tài)在一定程度上影響 著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥性的產(chǎn)生。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡 的基因家族，Bcl-2是Bcl-2家族中研究最廣泛深入的成員之一，能夠抑制p53對基因損傷反 應(yīng)而誘導(dǎo)的凋亡，其過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞耐受不同的藥物。在Bcl-2過表達(dá)的細(xì)胞中藥物仍能 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，但這種損傷不能有效地轉(zhuǎn)換成凋亡信號,以致腫瘤細(xì)胞的生理性 凋亡受抑，增加了腫瘤細(xì)胞的生存時(shí)間，結(jié)果在化療期間表達(dá)BcI-2的腫瘤細(xì)胞仍能以較快 的速率重新生長。Bd-2的過表達(dá)在白血病細(xì)胞的凋亡中起重要作用，化療藥物本身抗凋亡的活性主要依賴于Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白過度表達(dá)還可明顯降低腫瘤細(xì)胞對阿糖 胞苷(Ara-C)、甲氨喋呤及環(huán)磷酰胺等多種化療藥物的敏感性。Ara-C是DNA多聚酶抑制 齊U，通過對DNA多聚酶的抑制，而影響DNA的復(fù)制。Ara-C是治療急性白血病首選且非常
有效的化療藥物，是核苷類抗代謝藥物的典范，其殺滅白血病細(xì)胞的能力與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞的凋亡有關(guān)。
在本發(fā)明中，我們以轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列(或陰性對照質(zhì)粒)的細(xì)胞作為參照物，比較在不 同濃度的Ara-C作用下，轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸(或表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒)的 Raji細(xì)胞與對照細(xì)胞之間細(xì)胞活力的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l (或表達(dá) pre-miR-15a重組質(zhì)粒)的Raji細(xì)胞，在不同濃度Ara-C (0 80pg/ml)作用下，細(xì)胞活力 的抑制明顯強(qiáng)于對照細(xì)胞，miR-15a/16-l+Ara-C組的IC50值明顯降低。CCK8法檢測顯示 miR-15a/16-1 (或表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒)與Ara-C聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 兩者分別單用的組別(PO.05) 。 Hoechst染色可見到經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l (或表達(dá) pre-miR-15a重組質(zhì)粒)的Raji細(xì)胞在使用Ara-C后出現(xiàn)大量凋亡小體。FCM檢測細(xì)胞凋 亡率結(jié)果顯示miR-15a/16-l+Ara-C組(或pre-miR-15a+Ara-C組)的細(xì)胞凋亡率明顯增高， 較單用Ara-C或隨機(jī)序列+Ara-C組(或陰性對照質(zhì)粒+Ara-C組)的細(xì)胞凋亡率有顯著性差 異(PO.05)。提示miR-15a/16-l可以通過調(diào)控Bcl-2的表達(dá)，而改變Raji細(xì)胞對Ara-C 的敏感性。由此，我們有足夠的理由相信miR-15a/16-l或其前體可與能夠誘導(dǎo)腫瘤凋亡的 化療藥物(例如Am-C)組成一種藥物組合物，用于更好預(yù)防或治療相關(guān)的腫瘤病癥。
本發(fā)明具有如下的有益效果首先是為預(yù)防或治療淋巴瘤提供了新的可選途徑，通過 大量的實(shí)驗(yàn)證明了部分微小RNA應(yīng)用于制備預(yù)防或治療淋巴瘤的藥物是切實(shí)可行的；其次 是證明了部分微小RNA可用作已知化療藥物的輔助性成分，或與己知的化療藥物聯(lián)用，能 在抑制腫瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮更好的療效。


圖l轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下圖(x100) A，B均為陰性對照質(zhì)粒組。
圖2轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-寡核苷酸RT-PCR測得Raji細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)水平；
M: marker, 1:空白對照組，2:隨機(jī)序列組，3: miR-15a組，4: miR-16-l組。
圖3轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒RT-PCR測得Raji細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)水平；
M: marker, 1:空白對照組，2:陰性對照質(zhì)粒組，3: pre-miR-15a組。
圖4轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l 48h流式細(xì)胞儀檢測Raji細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)；
A:空白對照組，B:隨機(jī)序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組。圖5轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒48h流式細(xì)胞儀檢測Raji細(xì)胞中BcI-2蛋白的表達(dá)；
A:空白對照組,B:陰性對照質(zhì)粒組，C: pre-miR-15a組。
圖6臺盼藍(lán)拒染法檢測miR-15a和miR-16-l對Raji細(xì)胞的生長抑制作用；
a:轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸 b:轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒
*與空白對照組和隨機(jī)序列組(或空白對照組和陰性對照質(zhì)粒組)相比，P < 0.05。
圖7轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l作用于Raji細(xì)胞48h的形態(tài)學(xué)改變(Hoechst熒光染色
x400);
A空白對照組；B隨機(jī)序列組；CmiR-15a組；DmiR-16-l組。
圖8轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒作用于Raji細(xì)胞48h的形態(tài)學(xué)改變(Hoechst熒光染色 x400);
A空白對照組；B陰性對照質(zhì)粒組；Cpre-miR-15a組。
圖9流式細(xì)胞儀檢測miR-15a和miR-16-1作用于Raji細(xì)胞48h的凋亡圖(Annexin V/PI雙
染法)；
A空白對照組；B隨機(jī)序列組；CmiR-15a組；DmiR-16-l組。
圖10流式細(xì)胞儀檢測miR-15a和miR-16-l作用于Raji細(xì)胞48h的凋亡圖(PI染色法)；
A空白對照組；B陰性對照質(zhì)粒組；Cpre-miR-15a組。
圖11 CCK8法檢測miRNA聯(lián)合Ara-C后Raji細(xì)胞活力的抑制；
a: miR-15a或miR-16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C; b:表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合Ara-C。
圖12 miR-15a和miR-16-l聯(lián)合Ara-C對Raji細(xì)胞的生長抑制作用；
*與其它組相比，P<0.05。
圖13表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合Ara-C對Raji細(xì)胞的生長抑制作用； *P<0.05 (與其它組相比)。
圖14轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l并聯(lián)合Ara-C作用于Raji細(xì)胞48h的形態(tài)學(xué)改變(Hoechst熒光 染色 x400);
A:空白對照組，B:隨機(jī)序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組，E: Ara-C組，F(xiàn):隨機(jī)序 歹lJ+Ara-C組，G: miR-15a+Ara-C組，H: miR-16-l+Ara-C組。
圖15轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒并聯(lián)合Ara-C作用于Raji細(xì)胞48h的形態(tài)學(xué)改變 (Hoechst熒光染色 x400); A:空白對照組，B:陰性對照質(zhì)粒組，C: pre-miR-15a組，D: Ara-C組，E:陰性對照質(zhì) 粒+Ara-C組，F(xiàn): pre-miR-15a+Ara-C組。圖16轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l并聯(lián)合Ara-C 48h后Raji細(xì)胞凋亡圖。(流式細(xì)胞儀一AnnexinV/PI 雙染法檢測)；
A:空白對照組，B:隨機(jī)序列組，C: miR-15a組，D: miR-16-l組，E: Ara-C組，F(xiàn):隨機(jī) 序列+Ara-C組，G: miR-15a+Ara-C組，H: miR-16-l+Ara-C組。
圖17轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒并聯(lián)合Ara-C 48h后Raji細(xì)胞凋亡圖。(流式細(xì)胞儀 —PI染法檢測)；
A:空白對照組，B:陰性對照質(zhì)粒組，C: pre-miR-15a組，D: Ara-C組，E:陰性對照 質(zhì)粒+Ara-C組；F: pre-miR-15a組+Ara-C組。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式并不局限于此。 一、實(shí)驗(yàn)方法
1. miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a (miR-15a前體)寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)MiRBase (http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列， 獲取人miR-15a、 miR-16-l和pre-miR-15a的序列。采用BLAST軟件進(jìn)行分析，確定隨機(jī)對照 序列，nuR-15a、 miR-16-l寡核苷酸是由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的單鏈全硫代
修飾。序列如下所示
化學(xué)合成的三條RNA:
miR-15a: 5,-uagcagcacauaaugguuugug-3' (22bp)
miR-16-l: 5，-uagcagcacguaaauauuggcg-3' (22bp)
scrambled sequence: 5'-cauuaaugucggacaacucaau-3' (22bp)
pre-miR-15a (對應(yīng)的基因序列) (83bp) 5，-ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttgtggattttgaaaaggtgcaggccatattgtgctgcctcaaaaatacaagg-3'
negative control sequence: (83bp)
5'-3gCttttCC3咖3ttCtCCg犯CgtgtC3CgttCtCttg犯3Cgtg3C3CgttCgg3g肌gggttctCCgMCgtgtC3Cgt-3'
2. 質(zhì)粒構(gòu)建
2.1獲得目的片段
(1)從"The miRNA Registry"數(shù)據(jù)庫(http:〃mk:rorna.sanger.ac.uk/)中獲得pre-miR-15a序 列，采用BLAST軟件進(jìn)行分析，確定陰性對照序列。設(shè)計(jì)并合成pre-miR-15a序列的獲得 片段(pre墨miR-15 a-1: 5 ， -cgggt^gg|ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttg tggattttgaaaaggtgc-3 ，； pre-miR-15a-2: 5，-ccggaattccttgtatttttgaggcagcacaatatg gcctgcaccttttcaaaatccac-3，)， 并弓i入v4ge
8/、&o7 /酶切位點(diǎn)。(2)PCR擴(kuò)增獲得目的片段反應(yīng)體系為pre-miR-15a-l,2各5pL, ddH20 6單，10xbuffer2nL， MgCl20,5pL， DNTPs (2.5mM) 0.8|aL， pfti polymerase 0.2pL。反 應(yīng)條件94。C30s; 94。C 30s; 55°C 30s; 72°C 30s; 72。C 2min， 20個(gè)循環(huán)。(3)酶切PCR 片段使用Jge//￡coR /進(jìn)行酶切消化，酶切反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物(100ng/^iL)5nL, 10xbuffer 5pL， 100xBSA0.5nL， (10卵)lpL， / (10 U爾L) lpL, ddH20定容至50pL。
置于37。C， lh。 2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
(1X4ge/和￡coi /酶切pGCSIL-GFP載體以使其線性化。酶切反應(yīng)體系純化的DNA 質(zhì)粒(1 lug/)Ltl) 2pL， 10xbuffer 5|iL, 100xBSA0.5(iL, ^ge/ (lOU/pL) 1^iL,fc(^/ (10 U/^L) lpL,ddH20定容至5(^L。置于37'C， lh。 (2)氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞。從于37^培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到含100mlLB的燒瓶中。 37。C劇烈振搖培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)到冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中，冰上放置10mm。 4 。C， 4000rpm， 10min，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，10 ml冰預(yù)冷的CaC2 (O.lmol/L)重懸每份 沉淀，4。C,4000rpm， 10mm，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，CaCl2 (O.lmol/L)重懸每份沉淀。 -70°(3凍存。(3)連接。反應(yīng)體系酶切回收的載體DNA (100ng/nl) lpL，退火的雙 鏈DNA (100 ng/|al) lpL， 10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液lpL, T4噬菌體DNA連接 酶lpL， ddH20定容至10pL。置于4'C 12h。 (4)轉(zhuǎn)化。無菌吸頭取感受態(tài)細(xì)胞懸液200pL 至無菌微量離心管，加入2^L連接液，混勻，置冰上30mm。 42'C溫浴90s,迅速冷卻2min。 加入800pL SOC培養(yǎng)基，37'C搖床溫浴45min。取150jiL轉(zhuǎn)移至含MgS04 (20 mmol / L) 和Amp抗性(100叫/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。37"培養(yǎng)16h。 2.3陽性克隆的PCR鑒定
利用載體上的序列作為引物進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆。引物序列為上游引物5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3，，下游引物5'- GTAATACGGTTATCCACGCG -3，。 PCR反應(yīng)體系:上、下游引物各0.4^L， 10xbuffer2^iL， MgCL2 0單，DNTPs (2.5 mM) 0.8(xL， Taq polymerase 0.2(iL， Template l(xL， ddH20定容至20pL。 2.4測序
挑選陽性克隆PGCSIL-GFP-pre-miR-15a菌液送測序(美季公司進(jìn)行ABI 3733型測序 儀進(jìn)行測序分析)。 3.從大腸桿菌中提取質(zhì)粒
使用商用試劑盒或公知常用的質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒。
94. 細(xì)胞培養(yǎng)
Raji細(xì)胞系購于上海細(xì)胞庫。將Raji細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10。/。新生牛血清、100U/mL 青霉素禾P100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在含體積分?jǐn)?shù)5%(:02的培養(yǎng)箱371:連續(xù)培養(yǎng)。
5. 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 5.1實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)在研究miR-15a/16-l寡核苷酸誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡部分分4組空白對照組、隨機(jī) 序列組、miR-15a組和miR-16-l組；
在研究表達(dá)pre-imR-15a重組質(zhì)粒誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡部分分3組空白對照組、陰性 對照質(zhì)粒組、pre-miR-l5a組；
在研究rmR-15a/16-l寡核苷酸增強(qiáng)Ara-C誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡部分分8組空白對照組、 隨機(jī)序列組、miR-15a組、miR-16-1組、Ara-C組、隨機(jī)序列+Ara-C組、miR-15a + Ara-C 組和miR-16-l + Ara-C組；
在研究表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒增強(qiáng)Ara-C誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡部分分6組空白對 照組、陰性對照質(zhì)粒組、pre-miR-15a組、Ara-C組、陰性對照質(zhì)粒+ Ara-C組和pre-miR-15a + Ara-C組 5.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
(1) 根據(jù)分組,在轉(zhuǎn)染前一天，以4-8xl()S/mL的細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板上；
(2) 溶液a的配制按每孔12.5pL無血清培養(yǎng)基+0.5^L Lipofectamine 2000進(jìn)行；
(3) 溶液b的配制按每孔12.5pL無血清培養(yǎng)基+0.2pg質(zhì)粒(或寡核苷酸)進(jìn)行,配 好后室溫下放置5min;
(4) 將溶液a與溶液b混合，室溫下置20min;
(5) 與此同時(shí)，將96孔板中的細(xì)胞換用無血清培養(yǎng)基，終體積為125^L;
(6) 將溶液a與溶液b的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37'C， 5%
的C02中保溫5-6h;
(7) 6h后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37。C, 5%的032培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染效率的檢測轉(zhuǎn)染24h后,在熒光顯微鏡下選10個(gè)200倍視野，每個(gè)視野中統(tǒng)計(jì)200
個(gè)細(xì)胞中帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算熒光細(xì)胞的百分比。
6. 半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平
將轉(zhuǎn)染48h的各組細(xì)胞在無菌條件下進(jìn)行離心收集。應(yīng)用細(xì)胞總RNA抽提純化試劑盒和RT-PCR試劑盒測定Bcl-2 mRNA的水平。 6.1細(xì)胞總RNA的提取和純化
1) 收集離心細(xì)胞，去其上清，用PBS洗兩次后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入1.5mL離心管中，每管 加Trizol試劑lmL，搖勻，室溫下置15min后，反復(fù)吹打裂細(xì)胞；
2) 將各管內(nèi)消化好的細(xì)胞裂液吸到一DEPC處理過的1.5mLEP管中，加氯仿0.2mL (Trizol:氯仿約為5: 1)，輕搖15s，并在冰上孵育15min;
3) 12， 000rpm， 15min， 4°C，離心。然后取上清無色水相到DEPC處理過的EP管， 加0.5mL異丙醇，室溫下置10min;
4) 12， 000ipm， 10min， 4'C，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清；
5) 加入用DEPC水新配制的經(jīng)預(yù)冷的75V。乙醇1.0mL，輕輕洗滌沉淀，12， OOOrpm， 5min， 4。C離心；
6) 去上清，時(shí)離心，用小Tip吸干液體；使沉淀自然干燥，DEPC處理水20-30pL加 入，混勻，55-60。C7乂浴10min溶總RNA;
7) 用紫外分光光度儀測總RNA純度和濃度，用瓊脂糖膠電泳鑒定RNA是否水， 鑒定后于-7(TC保存?zhèn)溆谩?br> 6.2細(xì)胞總RNA的鑒定
濃度分析和純度鑒定從提取的RNA中吸取lpL，以DEPC水稀釋至100juL，用紫外分 光光度儀分別測總RNA的濃度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。 6.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
取上述RNA樣品，將其稀釋成l嗎/jaL，在PCR管中加入下列試劑的混合物
RNA3pL (3)_ig)
Random Primer (lO^M)2|oL
dNTP Mixture (2,5岸)2^L
5xFirst- Strand Buffer化L
DTT (0.1M)l^L
RNase inhibitor (10U/)_iL)0.5^
M-MLV (200U)
RNase-free ddH20定容至50pL
在PCR儀上按照下列條件反應(yīng)42。C溫浴50min,95。C加熱5min, 時(shí)離心，-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 6.4 PCR擴(kuò)增
Bcl-2引物序列如下上游引物5'-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，下游引物5'-CT TCAGAGACAGCCAGGAG-3 ',產(chǎn)物長度212bp.內(nèi)對照卩-actin弓|物序列:上游弓|物5'-TGTA TGCCTCTGGTCGTACC AC-3 ，,下游5 ， - AC AGAGTACTTGCGCTC AGGAG-3 ，,產(chǎn)物長度 592bp。
取上述產(chǎn)物cDNA先擴(kuò)增內(nèi)參P-actin，然后根據(jù)p-actin的結(jié)果，確定cDNA合成是否成 功，對合成成功的標(biāo)本進(jìn)行PCR反應(yīng)，在擴(kuò)增管中依次加入下列試劑
cDNA (模板) 2jiL
上游引物(lOpM) lpL
下游引物(10nM) 2pL
dNTP Mixture (2.5mM) 4pL
10xTaq buffer (含MgCl2) 5jiL
Taq酶(2.5U爾L) l(aL
ddH20 36^L 上述試劑混勻，按如下擴(kuò)增條件PCR: 94°C變性lmin,55。C復(fù)性45s,72。C延伸lmin， 循環(huán)30次，72'C保溫5min。 PCR產(chǎn)物在3。/。的瓊脂糖凝膠上電泳觀察并照相，于Gel-DoclOOO 型紫外凝膠圖像分析儀上觀察、分析。
7.熒光定量PCR檢測法(Hairpin-it miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit)檢測
miR-15a的表達(dá)水平 7.1RNA提取(方法同前) 7. 2 RT反應(yīng)合成cDNA
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)為 20pL體系。
5 xRT Buffer 5^L DTT (0.1M) 2.5pL dNTP (10mM) 0.75jaL Mg2+ (25mM) 3|_iL miR-RT primers (l,) 1.25|^L 脂asin (40U/nL) 0.25pL
12MMLV Reverse Transcriptase (200U/nL) 0.5|iL RNA Sample (0.2 ng to 200 ng total RNA) XpL Rnase Free H2O to 20pL 在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前須將除了逆轉(zhuǎn)錄外的各種試劑和逆轉(zhuǎn)錄rmx混勻，用手指輕彈裝試 劑的管子。反應(yīng)條件為16。C30min， 42。C30min， 85°C10min。反應(yīng)產(chǎn)物于-20。C保存。 7.3 Real-Time PCR檢測miR-15a的表達(dá)情況
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)為
20laL體系。
2xReal-time PCR Buffer 1 O^L
miR specific Primer set (5jxM) O,L
miRNA RT product 2pL
Taq DNA polymerase (5U/(iL) 0.2nL dd H20 To 20pL
反應(yīng)條件為95。C預(yù)熱3min，如下反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95。C變性12s， 55。C復(fù)性25s,72T: 延伸25s。
8. 間接免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2蛋白表達(dá)情況
離心收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定30min,PBS洗后加體積分?jǐn)?shù) 30/oH2O2，室溫10min,PBS洗3次，每次5min,加10g/LTritonX-100,室溫10min,PBS洗后加血清 室溫封閉40min，甩去不洗，滴加鼠抗人Bcl-2抗體，4'C過夜，次日復(fù)溫30min, PBS洗,加入 2(^LCy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育細(xì)胞，室溫避光反應(yīng)30min,PBS洗3次，每次5min,PBS混勻 后上機(jī)，流式細(xì)胞儀(FCM)測定Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性率。
9. 臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法
將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于24，48和72h 收獲細(xì)胞,常規(guī)臺盼藍(lán)(0.5%)染色,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次.
10. CCK8法測細(xì)胞生長抑制率及IC50值 將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于37'C、飽和
濕度、5。/。C02條件下常規(guī)培養(yǎng)24、 48和72h后，向每孔內(nèi)加入30pL CCK8，再置于37。C孵 育4h。然后直接在聯(lián)檢測儀上450nm波長處測A柳值，以A45q間接反映細(xì)胞存活數(shù)量。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，據(jù)此可推算miR-15a和miR-16-l轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)對Raji細(xì)胞的抑制率。 按上述方法分組及轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，分別與不同濃度的Ara-C (0、 5、 10、 20、 40、80嗎/ml)孵育，24h后CCK8法測各組A45o值，并計(jì)算以下參數(shù)
藥物濃度為N時(shí)的OD值-空白孔OD值
① 細(xì)胞活力 X100%
藥物濃度為0時(shí)的OD值-空白孔OD值
② 半數(shù)抑制濃度(IC50):采用概率單位法PROBIT (Probability umt)。
11. Hoechst染色試劑盒觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)
收集經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞樣品于1.5ml離心管內(nèi)，加入0.5ml 固定液，混勻，固定10分鐘。離心去固定液，PBS洗兩遍。最后一次離心后吸去大部分液 體保留約50)^1液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，晾干.均勻滴上0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色5分鐘,晾干。PBS洗兩遍。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片匕蓋十.-潔 凈蓋玻片，避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。
12. 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率
12.1 AnnexinV/PI雙染法
離心收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心去上清，195|iL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5pL,避光孵育10min，離心去上清，190|iL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10pL碘化丙啶染色液，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞 儀檢測，用MULTCYCLE軟件分析處理結(jié)果.
12.2 PI染色法
離心收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細(xì)胞,PBS洗滌2次，離心去上清，用-2(TC預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù) 70。/。乙醇在4t:固定30min，然后棄去乙醇，力Q500nL PBS混勻細(xì)胞，然后加入碘化丙啶(PI)， 避光染色15min。置流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡率，用MULTICYCLE軟件分析處理結(jié)果。
13. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù) 據(jù)比較，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間的比較選用可進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù) 間每兩個(gè)均數(shù)比較的q檢驗(yàn)或Bonferroni檢驗(yàn)，IC50值計(jì)算采用Probit單位概率法。 二、 miR-15a和miR-16-l抑制Raji細(xì)胞生長 1、 pre-miR-15a重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建
質(zhì)粒測序結(jié)果如下GACCC，測序結(jié)果顯示所得重組質(zhì)粒成功插入pre-miR-15a序列。
2、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
將轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒24h后的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見到部分細(xì)胞呈現(xiàn) 綠色熒光(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中含有編碼綠色熒光蛋白的基因)，在熒光顯微鏡下選10個(gè)200倍視野 每個(gè)視野中統(tǒng)計(jì)200個(gè)細(xì)胞中帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算熒光細(xì)胞的百分比即轉(zhuǎn)染率，其值 為(39±2.4%)。后面的實(shí)驗(yàn)均按該轉(zhuǎn)染效率下的脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。圖l為轉(zhuǎn)染 24h后在倒置熒光顯微鏡下見到的圖片。
3、 熒光定量PCR法檢測miR-15a的表達(dá)水平
轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒24h后，各組Gr值及摩爾數(shù)見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， pre-miR-15a組的rmR-15a &值及摩爾數(shù)較空白對照組和陰性對照質(zhì)粒組明顯增加，差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表l轉(zhuǎn)染pre-miR-15a24h后Raji細(xì)胞中miR-15a的表達(dá)量i士 s ， n=3)
分組c丁值Moles (nmol)
空白對照組23.98±0.381.51e+001土0.64
陰性對照質(zhì)粒組23.16±0.423.02e+001±0.38
pre-miR-15a組19.06±0.35^0.93e+002±0.49*
*與其他組相比，P<0.05
4、 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后Bcl-2 mRNA表達(dá)水平
由Bcl-2擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳(圖2， 3)可見，內(nèi)對照P-actin在各處理組均有表達(dá),Bcl-2 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳區(qū)帶約在210bp位置，與設(shè)計(jì)引物的理論值一致。對電泳產(chǎn)物分析，計(jì)算Bcl-2 mRNA/(3-actin的光密度0D比值，反映各組相對豐度。轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸48h 后，各處理組Bcl-2表達(dá)的相對豐度依次為空白對照組0.985±0.006，隨機(jī)序列組 0.978±0.009， miR-15a組0.974士0.010， miR-16-l組0.989士0.003，各組間差異無顯著性 (P〉0.05)。轉(zhuǎn)染pre-miR-15a表達(dá)質(zhì)粒48h后，各處理組Bcl-2表達(dá)的相對豐度依次為空 白對照組0.976±0.005,陰性對照質(zhì)粒組0.985±0.007， pre-miR-15a組0.969士0.009，各組間亦無 顯著性差異(P〉0.05)。表明miR-15a和miR-16-l不降解Bcl-2mRNA。
5. 間接免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2蛋白表達(dá)情況(圖4,5)
圖4，5的結(jié)果顯示，Raji細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l (或pre-miR-15a表達(dá)質(zhì)粒)48h后,Bcl-2蛋白的表達(dá)量均降低，與空白對照組和隨機(jī)序列組(或空白對照組和陰性對照質(zhì)粒 組)比較,差異有顯著性(P<0.05);而空白對照組與隨機(jī)序列組(或空白對照組與陰性對 照質(zhì)粒組)間差異無顯著性(P〉0.05)，各組Bcl-2蛋白表達(dá)量見表2， 3。 表2轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸48hBc-2 表3轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒48h
蛋白表達(dá)量(iis， n=3) Bcl-2蛋白表達(dá)量(I±s， n=3)
分組/熒光陽性率 Bcl-2蛋白表達(dá)量(％) 空白對照組 95.8±0.6 隨機(jī)序列組 94.9±0.9 miR-15a組 65.6±1.1* miR-16-l組 63.8士1.3*
分組/熒光陽性率 Bcl-2蛋白表達(dá)量(。/。) 空白對照組 97.8±0.6 陰性對照質(zhì)粒組 96.8±0.9 pre-miR-15a組 58.4±1.1*
*與其它組相比，PO.05 *與其它組相比，PO.05
6、 臺盼藍(lán)拒染法檢測miR-15a和miR-16-l對淋巴瘤細(xì)胞Raji的生長抑制作用 結(jié)果顯示,終濃度為0.6pmolZL的miR-15a和miR-16-l寡核苷酸(或pre-miR-15a表達(dá)質(zhì)
粒)轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞后，24h作用效果不明顯，差異無顯著性(P>0.05) ,48h和72h可發(fā)揮 對細(xì)胞的生長抑制作用,且隨著作用吋間的增加,效果逐漸增強(qiáng)，48h作用效果明顯,有明顯的 時(shí)效關(guān)系(圖6)。
7、 CCK8法檢測miR-15a和miR-16-l對Raji細(xì)胞生長的影響
表4顯示轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸的Raji細(xì)胞增殖能力最差，其24h,48h 和72hOD值均明顯低于空白對照組和隨機(jī)序列組(P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染24h后，miR-15a 組與隨機(jī)序列組之間經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)即顯示差異有顯著性,P岣.005， miR-16-l組與隨機(jī)序 列組之間差異亦有顯著性，P=0.014;表5顯示pre-miR-15a組細(xì)胞的增殖能力較空白對照 組和陰性對照質(zhì)粒組弱，差異有顯著性(PO.05)，其中轉(zhuǎn)染24h后，pre-nnR-15a與陰性 對照質(zhì)粒組之間經(jīng)Bonferroni檢驗(yàn)顯示差異有顯著性,P二0.004;說明miR-15a和miR-16-l 能夠抑制Raji細(xì)胞的生長與增殖，且24h,48h和72h均可發(fā)揮作用,隨作用時(shí)間的增加,效果 逐漸增強(qiáng),72h作用效果最明顯,且有明顯的時(shí)效關(guān)系。
表4轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l后CCK8法檢測Raji細(xì)胞吸光度A值(7±、11=5)
分組_^_^_^_
空白對照組 1.209±0.029 1.419±0.018 1.599±0.015
隨機(jī)序列組 1.208±0.021 1.417±0.013 1.604±0.014
miR-15a組 1.115±0.015* 1.207士0.038* 1.242±0.035*
16miR陽16-l組 1.137±0.016* 1.211±0.040* 1.241±0.032
*與其他組相比^<0.05
表5轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒后CCK8法檢測Raji細(xì)胞吸光度A值(± s, ir分組 24h48h72h
空白對照組 1.432±0.0161.541±0.0131.652±0.010
陰性對照質(zhì)粒組 1.439±0.0131.543±0.0051.646±0.007
pre-miR-15a組 1.328±0.00741.298±0.005*1.288±0細(xì)*
*與其他組相比，PO.05 8、 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)
圖7， 8為轉(zhuǎn)染后48hHoechst染色圖。miR-15a組和miR-16-l組及pre-miR-15a組均可 見明顯的凋亡細(xì)胞核膜完整，體積變小，核質(zhì)固縮；而其他組未見明顯凋亡細(xì)胞。 9、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率
轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸后48h，流式細(xì)胞儀一AnnexinV/PI雙染法顯示 miR-15a組的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為9.74%和9.65%,， miR-16-1組的早期凋亡率 和晚期凋亡率分別為9.70%和9.34%，與空白對照組和隨機(jī)序列組比較差異有顯著性
(P<0.05)。而空白對照組和隨機(jī)序列組的凋亡率差異無顯著性(P>0.05)，見表6。轉(zhuǎn)染表 達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒后48h,pre-miR-15a組的凋亡率為12.43%，顯著高于空白對照組 和陰性對照質(zhì)粒組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照質(zhì)粒組間差異無顯著性(P〉0.05)， 見表7?？梢姡琺iR-15a和miR-16-1可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的凋亡(圖9， 10)。
表6轉(zhuǎn)染miR-153和1^11-16-1后48h流式細(xì)胞儀一AnnexinV/PI雙染法
_檢測Raji細(xì)胞的凋亡(7± s ， n=5)_
分組/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白對照組 0.70±0.2 1.73±0.3
隨機(jī)序列組 2.18±0.4 1.54±0.3
miR-15a組 9.74±0.5* 9.65士0.4"^
miR-16-l組_9,70±0.8*_9.34士0.6*_
永與其它組比,P0.05 表7轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒后48h流式細(xì)胞儀一PI染法
_檢測Raji細(xì)胞的凋亡(5土s， n=5)
分組/凋亡率 凋亡率/%空白對照組
陰性對照質(zhì)粒組
pre-miR-15a組
1.26±0,34.69±0,612.43±1.2*
*與其它組相比，PO.05三、miR-15a和miR-16-l可增強(qiáng)Raji細(xì)胞對阿糖胞苷敏感性1.CCK8法檢測IC50值變化
1.1轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji細(xì)胞后Ara-C IC50值的變化
轉(zhuǎn)染miR-15a的Raji細(xì)胞在0、 5、 10、 20、 40、 80jng/ml 6種濃度的Ara-C作用24h后，
細(xì)胞活力分別為(97.15±5.87 % ) 、 ( 67.0±3.96% ) 、 ( 37.23±2,98% ) 、 ( 20.15±2.24% )、(0.85±0.02%)、 (0.01±0.01%),轉(zhuǎn)染miR-16-l的Raji細(xì)胞活力分別為(96.85±6.14% )、(66.38±4.53%)、 (37.77±3.61%)、 (20.85±3.01%)、 ( 1.69±0.75%)、 (0.31±0.06%)，明顯低
于相應(yīng)Am-C濃度作用下，轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列的Raji細(xì)胞活力分別為(99.54±6.23 % )、(73.00±4.09%)、 (51.06±3.52%)、 (26.46±2.96%)、 (4.62±1.38%)、 (1.92±0.96%),尸值均
<0.05，見圖lla。可見，轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji細(xì)胞后可使Ara-C的IC50值
明顯降低，各組IC50值見表8。
1.2 轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒入Raji細(xì)胞后Ara-C IC50值的變化
轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒的Raji細(xì)胞在0、 5、 10、 20、 40、 80|ug/ml 6種濃度的Ara-C作用24h后，細(xì)胞活力分別為(96.08±6.3% )、 (67.85±4.9%)、 (38.46±2.1%)、
(14.62±2.4%)、 (1.00±0.4%)、 (0.08±0.08%),明顯低于相應(yīng)Ara-C濃度作用下，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的Raji細(xì)胞活力分別為(96.00±5.3 % ) 、 ( 72.00±4.8% ) 、 (51.38±4.4% )、
(26.00±3.8%)、 (8.00±2.1%)、 (2.23±1.6%),尸值均<0.05，見圖llb?？梢?，轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒入Raji細(xì)胞可使Ara-C的IC50值明顯降低，各組IC50值見表9。
表8轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸入
表9表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒入
Raji細(xì)胞Ara-C IC50值的變化Raji細(xì)胞Ara-C IC50值的變化組別IC50值(ug/mL)分組IC50值(ug/mL)
空白對照組15.43±1.21空白對照組15.37±0.69
隨機(jī)序列組14.92±1.08陰性對照質(zhì)粒組15.14±0.79
miR-15a組10.41±0.96*pre-miR-15a組10.02士0.84'
miR-16-l組10.86±0.78*
*與其它組相比，P<0.05
*與其它組相比，P<0.052. 臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞生長抑制情況
2.1 miR-15a/16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C后對Raji細(xì)胞的生長抑制作用
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，終濃度為0.6pmol/L的miR-15a/16-l寡核苷酸轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞后，miR-15a+Ara-C組和miR-16-l+Ara-C組的細(xì)胞數(shù)較單用miR-15a組、單用miR-16-l組、單用Ara-C組及隨機(jī)序列+Ara-C組明顯降低，miR-15a/16-l寡核苷酸作用24h時(shí)開始發(fā)揮作用，且隨著作用時(shí)間的增加，其效果逐漸增強(qiáng),72h作用效果明顯.(圖12)2.2表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合Ara-C后對Raji細(xì)胞的生長抑制作用
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合10嗎/ml的Ara-C后,Raji細(xì)胞的生長較其他組明顯受到抑制(P<0.05)，于24h開始發(fā)揮作用，且隨著作用時(shí)間的增加，其效果逐漸增強(qiáng),72h作用效果明顯.(圖13)
3. CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況
3.1 CCK8法檢測miR-15a/16-l寡核苷酸聯(lián)合Ara-C對Raji細(xì)胞生長的影響
CCK8結(jié)果(表10)顯示Raji細(xì)胞在經(jīng)miR-15a/16-l寡核苷酸和10嗎/mLAra-C聯(lián)合處理后，細(xì)胞增殖活性大大降低，并明顯低于其它組別(P<0.05);而Ara-C與隨機(jī)序列聯(lián)合作用導(dǎo)致的細(xì)胞增殖活力與單用Ara-C組相當(dāng)，無顯著差異(P>0.05)。這說明轉(zhuǎn)染miR-15a或miR-16-l寡核苷酸可以增強(qiáng)Ara-C對Raji細(xì)胞生長的抑制作用。
表10 miR-15a和miR-16-l寡核苷酸聯(lián)合Am-C CCK8法檢測Raji細(xì)胞吸光度A值
(x ± s,n=5)
組別24h48h72h
空白對照組1.414±0.0121.459±0條1.532±0.010
隨機(jī)序列組1.405±0.0041.457±0細(xì)1.535±0.007
miR-15a組1.291±0.0111.238±0遍1.201±0.006
miR-16-l組1.302±0.0081.251±0.0221.200±0.007
Ara-C組1.200±0.0121.151±0.0121.097士0.010
隨機(jī)序列+Ara-C組1.199±0.0091.163±0.0101.098±0.009
miR-15a+Ara-C組1.014±0.020*0.844±0.012*0.631士0.01(f
miR-16-l+Ara-C組1.010士0.03(f0.851±0.014*0.639±0.010*
承其他組相比，P《.05。3.2 CCK8法檢測表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合Ara-C對Raji細(xì)胞生長的影響
CCK8結(jié)果(表ll)顯示轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒并加用10嗎/mL Ara-C后
19的Raji細(xì)胞增殖能力最差，pre-miR-15a+Ara-C組的CCK8值要顯著低于空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組、pre-miR-15a組、Ara-C組、陰性對照質(zhì)粒+Ara-C組(PO.05);而Ara-C聯(lián)用陰性對照質(zhì)粒與單用Ara-C相比細(xì)胞增殖活性無明顯差別(P〉0.05)。這說明表達(dá)pre-nnR-15a重組質(zhì)粒與化療藥物Ara-C聯(lián)用后可以增強(qiáng)Ara-C對Ra力細(xì)胞生長的抑制作用。表11表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒聯(lián)合Ara-C CCK8法檢測Raji細(xì)胞吸光度A值
(x ± i1, n=5)
組別24h48h72h
空白對照組1.292±0.3811.436士0.2961.546±0.159
陰性對照質(zhì)粒組1.237±0.4261.396±0.3611.458±0.312
pre-miR-15a組1.189±0.5671.215±0.6231.314±0.432
Ara-C組1.098±0.1691.148±0.3981.159±0.231
陰性對照質(zhì)粒+Ara-C組0.967±0.3591.103±0.5781.116±0.553
pre-miR-15a+Ara-C組0.775±0.216*0.718±0.648*0.619±0.156*
求與其他組相比，PO，05。4. Raji細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變
經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸或表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒并聯(lián)合Ara-C組經(jīng)Hoechst
染色后均可見大量凋亡細(xì)胞核膜完整，體積變小，核質(zhì)固縮；而其他組未見或僅見少量凋亡細(xì)胞(圖14,15)。5.細(xì)胞凋亡率分析
5.1轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l寡核苷酸及聯(lián)用Ara-C (流式細(xì)胞儀一AnnexinV/PI雙染法)
各組細(xì)胞凋亡率見表12。 miR-15a或miR-16-l寡核苷酸與Ara-C (10嗎/mL)聯(lián)用時(shí)的細(xì)胞凋亡率最高，與單用miR-15a或miR-16-l寡核苷酸、單用Ara-C、隨機(jī)序列聯(lián)用Ara-C組相比有顯著性差異(PO.05);而隨機(jī)序列+Ara-C組與單用Ara-C組之間、miR-15a與miR-16-l之間比較細(xì)胞凋亡率未見顯著性差異(P>0.05)。表明miR-15a/16-l寡核苷酸與Ara-C聯(lián)用可顯著增加細(xì)胞的凋亡率。(圖16)
表12轉(zhuǎn)染miR-15a/16-l及并聯(lián)合Ara-C后48h流式細(xì)胞儀雙染法檢測Raj湖胞凋亡率
(7 ± s ， n=5 )
組別/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白對照組 0.25±0.3 0.65±0.1
隨機(jī)序列組 0.96±0.1 2.26±0.2miR-15a組miR-16-l組Ara-C組
隨機(jī)序列+Ara-C組miR-15a+Ara-C組miR-16-l+Ara-C組
6.99逸44.73±0.510.88±0.314.39±0.520.93±0,6 :20.69±0.8 '
10.08±0.3
10.64±0.4
11.83±0.2
11.93±0,4
25,27±0.5*
23.13±0.7*
承與其他組相比,P0.055.2轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒及聯(lián)用Ara-C (流式細(xì)胞儀一PI染法)
各組細(xì)胞凋亡率見表13。表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒與Ara-C (10嗎/mL)聯(lián)用的細(xì)胞凋亡率最高，與單用表達(dá)pre-rmR-15a重組質(zhì)粒、單用陰性對照質(zhì)粒、單用Am-C、陰性對照質(zhì)粒聯(lián)用Ara-C相比有顯著性差異(PO.05);而單用Am-C與陰性對照質(zhì)粒聯(lián)用Am-C之間細(xì)胞凋亡率未見顯著性差異(P>0.05)。表明表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒與Ara-C聯(lián)用可顯著增加細(xì)胞的凋亡率。(圖17)
表13轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-15a重組質(zhì)粒及聯(lián)合Ara-C后48h流式細(xì)胞儀單染法檢測Raji細(xì)胞凋亡率(i±s, n=5)
組別/凋亡率
凋亡率/%
空白對照組1.93±0.1
陰性對照質(zhì)粒組3.40±0.5
pre-miR-15a組12.24±1.0
Ara-C組20.87±0.5
陰性對照質(zhì)粒+Ara-C組21.76±1.2
pre-miR-15a+Ara-C組32.56±1,4*
*與其它組相比，PO.05上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110><120><130〉〈160〉〈170><210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<221〉<222〉〈223〉<400〉
序列表
暨南大學(xué)
微小RNA在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用
090612
13
Patentln version 3. 31
22RNA
人工序列
micro腿(l).. (22)miR-15a序列1
U3gcagcac3 im肌gguuug ug 22
<210> 2
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
<220〉
<221〉 microRNA〈222〉 (1).. (22)〈223〉 microRNA 16-1序列〈400> 2
U3gc3gcacg im幼U3Uugg eg 22
<210> 3
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
〈220〉
<221> misc—feature〈222〉 (1).. (22)<223〉隨機(jī)序列〈400〉 3
cauuaauguc ggacaacuca au 22
<210〉 4
<211〉 83
〈212> 鵬
<213> Homo sapiens
<220>
<221〉 gene
<222> (1). . (83)
<223> pre-raiR-15a前體基因序列〈400〉 4
ccttggagta aagtagcagc acataatggt ttgtggattt tgaaaaggtg caggccatat 60
tgtgctgcct c肌aaat3ca 3gg 83
<210〉 5
<211〉 83
<212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221〉 gene<222〉 (1). . (83)
〈223〉根據(jù)pre-miR-15a前體基因序列設(shè)計(jì)的陰性對照序列<400〉 5
agcttttcca aaaattctcc gaacgtgtca cgttctcttg aaacgtgaca cgttcggaga 60
agggttctcc gaacgtgtca cgt 83
<210〉 6
<211> 62
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature<222> (1).. (62)
<223> pre-miR-15a前體基因的獲得片段1<400〉 6
cgggtaccgg tccttggagt aaagtagcag cacataatgg tttgtggatt ttgaaaaggt 60gc
<210〉 7<211〉 59<212〉 DNA<213>人工序列<220>
<221〉 misc—feature<222> (l)..卿
<223〉 pre-miR-15a前體基因的獲得片段2<400〉 7
ccggaattcc ttgtattttt gaggcagcac aatatggcct gcaccttttc aaaatccac 59
<210> 8
<211〉 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc—feature<222> (1)..(24)
<223>包含pre-miR-15a前體基因序列的重組質(zhì)粒構(gòu)建過程所用陽性克隆鑒定引物1<400〉 8
cctatttccc atgattcctt cata 24
〈210> 9
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature〈222〉 (1). . (20)
〈223〉包含pre-miR-15a前體基因序列的重組質(zhì)粒構(gòu)建過程所用陽性克隆鑒定引物2
<400〉9
gt犯tacggt tatccacgcg〈210〉10
<211>19
<212〉DNA
<213〉人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l).. (19)
<223>Bcl基因檢測引物1
<400〉10
gtggccttct ttgagttcg<210〉11
<211>19
<212〉DNA
<213>人工序列
<220〉
<221〉misc—feature
<222〉(l).. (19)
<223>Bel基因檢測引物2
<400>11
CttC3gag3C 3gCC3gg3g<210>12
〈211〉22
〈212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l)..咖
<223〉P-actin引物1
<400>12
tgtatgcctc tggtcgtacc ac〈210〉13
〈211〉22
20
19
19
22
24<212> DNA<213>人工序列〈220〉
<221> misc—feature
<222〉 (1)..咖
<223> P-actin引物2
<400〉 13
acagagtact tgcgctcagg ag
權(quán)利要求
1、微小RNA在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述微小RNA在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在 于所述微小RNA或其前體經(jīng)過公知的改良性修飾。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述微小RNA在制備治療和/或預(yù)防淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在 于所述微小RNA或其前體為單鏈或由該單鏈和該單鏈的互補(bǔ)鏈構(gòu)成的雙鏈形式。
4、 一種治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于包括有效量的微小RNA和藥 學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，所述微小RNA為微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小 RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述藥物的 活性成分還包括能夠誘導(dǎo)腫瘤凋亡的化療藥物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述化療藥 物為阿糖胞苷、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素、甲氨喋呤、三氧化二砷或它們中兩種以上的 混合物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6中任一項(xiàng)所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所 述微小RNA或其前體經(jīng)過公知的改良性修飾。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所 述微小RNA或其前體通過化學(xué)合成得到；或者通過構(gòu)建真核表達(dá)載體得到。
9、 根據(jù)權(quán)利要求S所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述真核表達(dá)載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述治療和/或預(yù)防淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于所述淋巴瘤為Burkitt淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及微小RNA在制備治療和/或預(yù)防腫瘤藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。具體是將微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前體、微小RNA-16-1的前體或它們中兩種以上的混合物用于制備此類的藥物。本發(fā)明通過將上述寡核苷酸序列在淋巴瘤細(xì)胞中過表達(dá)，證明上述序列有抑制淋巴瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)其凋亡的作用，并進(jìn)一步揭示它們與化療藥物如阿糖胞苷等的聯(lián)用可增強(qiáng)原有藥物的效力，從而確證了上述寡核苷酸序列在制備治療和/或預(yù)防腫瘤藥物領(lǐng)域的應(yīng)用潛能。此類的藥物可以是單獨(dú)的包含上述任一種寡核苷酸序列或其混合物及藥用載體的組合物，或者是還包括化療藥物的聯(lián)用組合物。
文檔編號A61K31/7068GK101590243SQ20091004047
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者何冬梅, 琴 諶 申請人:暨南大學(xué)