專利名稱：一種次級淋巴趨化因子slc的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是人次級淋巴趨化因子SLC的一種新的制備方法。
背景技術(shù)：
趨化因子是由一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)、功能上不同的小分子細(xì)胞因子(8-12KDa)組成的家族。它們在多種組織細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。趨化因子在機(jī)體生理和病理狀況下，都起著重要的作用。在炎癥、腫瘤、自身免疫病、血管生成、變態(tài)反應(yīng)、干細(xì)胞的分化、次級淋巴器官的發(fā)育、AIDS等病毒感染中均有趨化因子及受體的參與。至今已發(fā)現(xiàn)近50種趨化因子。絕大多數(shù)趨化因子的一級結(jié)構(gòu)中有4個(gè)保守的半胱氨酸，根據(jù)半胱氨酸的數(shù)目和相對位置，按系統(tǒng)命名法將趨化因子分為四大亞家族CXC趨化因子，其前兩個(gè)半胱氨酸之間有一個(gè)其它的氨基酸相隔；CC趨化因子，前兩個(gè)半胱氨酸相鄰；C趨化因子，只有第二和第四位的兩個(gè)半胱氨酸；CX3C趨化因子，前兩個(gè)半胱氨酸被其它3個(gè)氨基酸隔開。有的亞家族若有多種趨化因子，則再根據(jù)被發(fā)現(xiàn)的先后進(jìn)行編排。
最近發(fā)現(xiàn)一種次級淋巴趨化因子SLC(Secondary Lymphiod tissure Chemokine)也稱CCL21，其由111個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列從N端至C端為SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSTPATLFLPRKRSQAELCADRKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPA QGCRKDRGASKTGKKGKCSK GCKRTERSQTPKGP。它是一種特殊的趨化因子，除了具有4個(gè)保守的半胱氨酸外，C末端還有2個(gè)半胱氨酸，研究證明，該趨化因子對新分離的和培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞以及成熟的樹突狀細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用，還能指導(dǎo)髓祖先細(xì)胞的動(dòng)員(Murphy P等人Pharmacological Reviews.2000，52(1)145-176)。制備方法國外有報(bào)道利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)SLC(NagiraM等人The Journal Of BiologicalChemistry 1997.272，19518-19524)，他們將重組SLC注射到小鼠肺腫瘤實(shí)體內(nèi)，有40％的腫瘤消失，顯示出SLC潛在的治療腫瘤效果，但是用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的成本高，細(xì)胞培養(yǎng)繁鎖；國內(nèi)已有單位用大腸桿菌表達(dá)SLC(王東寧等人生物工程學(xué)報(bào)2001 17(4)392-395)。而用大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物，不易純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種成本低廉、操作方便的次級淋巴趨化因子SLC的制備方法。所選用的表達(dá)系統(tǒng)為畢赤酵母，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)容易操作，成本低，安全性高，能高密度發(fā)酵，產(chǎn)物易純化。
制備方法包括如下步驟一、構(gòu)建SLC重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/SLC1、合成引物正向引物為5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′反向引物為5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′上述引物的5′端分別引入XnoI和ECoRI酶切位點(diǎn)(橫線所示)；2、將上述引物以人肺cDNA庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得DNA片段，其中有含XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)的SLC DNA片段；3、將所得DNA片段和酵母載體PPIC9分別用XhoI和ECoRI酶切后，用T4DNA連接酶連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化和酶切及測序其重組質(zhì)粒，獲得正確序列的SLC重組質(zhì)粒PPIC9/SLC，再用BamHI/EcoRI酶切下0.6Kb片段，插入到載體PPIC9K的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/SLC。
二、構(gòu)建表達(dá)SLC的畢赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC將上述重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/SLC用BgI II限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，并用電穿孔轉(zhuǎn)化畢赤酵母受體細(xì)胞GS115，經(jīng)G418(新霉素相關(guān)氨基糖苷類抗生素)抗藥篩選，獲得工程菌GS115/PPIC9K/SLC。
三、制備SLC將酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，再用BMM誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心后分別取上清液以及由上清液上柱純化得到的SLC洗脫液兩種樣品液進(jìn)行除鹽，再分別測定活性，結(jié)果表明，發(fā)酵上清液及純化的SLC對從外周血分離到的T淋巴細(xì)胞均顯示出明顯趨化活性。


圖1重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/SLC的構(gòu)建流程圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的載體PPIC9和PPIC9K購自Invitrogen公司，所用大腸桿菌宿主菌株TOP10和畢赤酵母宿主菌GS115也購自Invitrogen公司。具體操作步驟如下一、構(gòu)建SLC重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/SLC(見圖1)1、合成引物
為了從人肺cDNA庫中分離到次級淋巴趨化因子SLC基因片段，根據(jù)表達(dá)載體PPIC9K的克隆位點(diǎn)和SLC基因的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)一對引物，其正向引物和反向引物的5′端分別引進(jìn)XhoI和ECoRI酶切位點(diǎn)(CTCGAG和GAATTC)，正向引物為5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′，反向引物為5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′。
2、PCR擴(kuò)增以人肺cDNA庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其循環(huán)擴(kuò)增的條件為94℃4分鐘；94℃45秒，58℃45秒，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。擴(kuò)增后的產(chǎn)物，經(jīng)1％Agarose凝膠電泳分離純化。
3、構(gòu)建重組質(zhì)粒PPIC9K/SLC(詳見分子克隆分冊第二版)按常規(guī)將純化的PCR產(chǎn)物和載體PPIC9分別用XhoI/ECoRI進(jìn)行雙酶切和純化，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，其連接反應(yīng)后的混合液以CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。其轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA經(jīng)XhoI/ECoRI酶切初步鑒定后，用AOXI的序列分析引物5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′進(jìn)行核苷酸序列分析，獲得SLC基因序列正確的重組載體轉(zhuǎn)化子TOP10/PPIC9/SLC。由于表達(dá)載體PPIC9K含2個(gè)XhoI酶切位點(diǎn)，所以用BamHI/ECoRI分別對載體PPIC9K和PPIC9/SLC進(jìn)行雙酶切，分別用1％Agaose凝膠電泳分離及純化。再將純化的PPIC9K大片段與PPIC9/SLC的小片段用T4DNA連接酶連接，以CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)酶切鑒定，獲得的陽性重組子為含重組質(zhì)粒PPIC9K/SLC的大腸桿菌。
二、構(gòu)建表達(dá)SLC的畢赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC(詳見Invitrogtn的畢赤酵母表達(dá)操作手冊)取少量重組大腸桿菌(含PPIC9K/SLC質(zhì)粒)種于3mlLB(含100μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，以1％的接種量種于50mlLB(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)14小時(shí)，按堿法提取質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒DNA用BglII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，用兩倍體積的乙醇沉淀DNA，離心后將線性化重組表達(dá)載體PPIC9K/SLC的DNA溶于無菌水中，最終濃度為0.4mg/μl，以電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備如下取GS115單菌落種于5mlYEPD(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)培養(yǎng)基中，28-30℃振蕩培養(yǎng)過夜，取15μl過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于40mlYEPD中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約1.3-1.6，離心(5000轉(zhuǎn)/分)收集菌體，分別用預(yù)冷的無菌水和1mol/L山梨醇各洗一次，用預(yù)冷的1mol/L山梨醇將菌體懸浮成200μl，取80μl菌體懸浮液與4μg/10μl線性化載體PPIC9K/SLC的DNA混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電擊杯(BioRad公司)中，在電擊儀上，設(shè)定電壓為1300V，電容為25μF，電阻為200Ω，進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化后，立即于電擊杯中加入0.9ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，取出全部的細(xì)胞液，涂于4塊MD平板上[1.34％YNB，(4×10-5)％生物素，2％葡萄糖，1mol/L山梨醇，2％瓊脂]，置于28-30℃培養(yǎng)至長出菌落。
由于PPIC9K/SLC重組載體含有細(xì)菌卡那霉素基因，線性化的SLC表達(dá)單元中仍含有卡那霉素基因，當(dāng)它轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后，能使酵母細(xì)胞對G418產(chǎn)生抗性，而對G418抗性程度大致取決于卡那霉素基因的整合數(shù)，因此可以通過不同濃度的G418來篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽點(diǎn)于含G418的YEPD平板，最終在G418濃度為1.5mg/ml平板上獲得10個(gè)GS115/PPIC9K/SLC克隆。三、SLC在畢赤酵母中的表達(dá)和純化及活性的測定1、SLC在畢赤酵母中的分泌表達(dá)分別取少量上述10個(gè)重組酵母轉(zhuǎn)化子和含空載體PPIC9K的GS115對照菌株種于50mlBMGY[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/L，PH6.0磷酸鉀緩沖液，(4×10-5％)生物素]培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600約2-6，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入20ml BMM[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％TNB，0.5％甲醇，100mmol/LPH6.0磷酸鉀緩沖液，(4×10-5％)生物素]誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28-30℃振蕩培養(yǎng)3天，離心取上清經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色，10個(gè)SLC重組酵母轉(zhuǎn)化子都顯示一條深色的約12KD的蛋白帶，而對照菌株沒有這條帶，該蛋白帶就是重組SLC，說明這種畢赤酵母工程菌能高水平分泌表達(dá)SLC。
2、分離純化選上述10個(gè)克隆中表達(dá)SLC最好(電泳條帶顯色最深)的GS115/PPIC9K/SLC工程菌用同樣的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液離心后取上清液，先對5mM Tris-Hcl PH8.0緩沖液進(jìn)行透析，透析后的樣品以20mM Tris-Hcl PH8.0平衡的CM柱進(jìn)行層析，用20mMTris-Hcl PH8.0+150mMNacl洗脫液進(jìn)行洗脫，收集其洗脫峰，再經(jīng)分子篩Superdex75柱分離，以20mM PBS PH8.0+150mMNacl洗脫，收集洗脫峰的蛋白樣品液。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色，只見一條SLC的蛋白帶，表明SLC被純化。
3、SLC趨化活性的測定取枸櫞酸鈉抗凝的人外周血3ml，用Hanks液稀釋至5ml，然后將它緩慢加到有3ml淋巴分離液的離心管中，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞，以Hanks液洗滌一次，用RPM1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，往孔內(nèi)加500μl趨化樣品液，該樣品液為上述工程菌發(fā)酵后，離心所得上清液經(jīng)G25膠除鹽，0.22μm膜過濾除菌處理所得，將Bodyman小室(美國BD公司)架于孔內(nèi)，然后往小室內(nèi)加入分離的單個(gè)核細(xì)胞30000個(gè)/200μl，將細(xì)胞置于37℃保溫4小時(shí)，收集培養(yǎng)板孔內(nèi)的細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。同時(shí)將含空載體PPIC9K的GS115酵母菌發(fā)酵液的上清液，用同樣的方法處理，作為陰性對照。結(jié)果顯示該畢赤酵母工程菌發(fā)酵上清液中含有SLC，其對新分離外周血的淋巴細(xì)胞有明顯的趨化作用，趨化細(xì)胞數(shù)是陰性對照的5倍。發(fā)酵上清液經(jīng)透析和柱層析純化后所得的SLC蛋白峰洗脫液采用同樣的方法測定SLC趨化活性，以PBS緩沖液為陰性對照。結(jié)果表明，純化的SLC蛋白樣品液對外周血分離的淋巴細(xì)胞有明顯的趨化活性，趨化細(xì)胞數(shù)量為陰性對照的5倍，說明本純化方法是切實(shí)可行的。本發(fā)明制備方法簡便，表達(dá)水平高，容易純化，成本低廉。
權(quán)利要求
1.一種次級淋巴趨化因子SLC的制備方法，包括構(gòu)建SLC重組表達(dá)質(zhì)粒、構(gòu)建表達(dá)SLC的工程菌及工程菌表達(dá)SLC產(chǎn)物的純化，其特征在于SLC的表達(dá)系統(tǒng)為畢赤酵母工程菌。
2.按權(quán)利要求1所述的次級淋巴趨化因子SLC的制備方法，其特征在于構(gòu)建的SLC重組表達(dá)質(zhì)粒為PPIC9K/SLC。
3.按權(quán)利要求2所述的次級淋巴趨化因子SLC的制備方法，其特征在于工程菌表達(dá)SLC產(chǎn)物純化采用CM陽離子交換柱及Superdex-75分子篩。
4.按權(quán)利要求1、2、3所述的次級淋巴趨化因子SLC的制備方法，其特征在于所用的畢赤酵母菌為GS115細(xì)胞株，構(gòu)建的表達(dá)SLC的畢赤酵母工程菌為GS115/PPIC9K/SLC。
5.權(quán)利要求1、2、3所述次級淋巴趨化因子SLC制備方法所制備的SLC用于制備抗腫瘤藥物的用途。
6.權(quán)利要求4所述次級淋巴趨化因子SLC制備方法所制備的SLC用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域,是人次級淋巴趨化因子SLC的一種新的制備方法。本發(fā)明選用的表達(dá)系統(tǒng)為畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),包括如下步驟:(1)合成正、反向引物,以人肺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建SLC重組表達(dá)質(zhì)粒
文檔編號C12P21/02GK1422959SQ0215123
公開日2003年6月11日 申請日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者武圣明, 高卜渝, 袁漢英 申請人:武圣明, 高卜渝, 袁漢英