專利名稱：彌漫性大b細胞淋巴瘤治療指導和預后判斷的分子標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液腫瘤學和醫(yī)學領域。更具體地，涉及彌漫大B細胞淋巴瘤 治療方案選擇和/或預后評價的分子靶點及包含用來檢測靶點的試劑盒。
背景技術：
彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常見的非 霍奇金淋巴瘤，約占成人非霍奇金淋巴瘤的30-40%。我國目前非霍奇金淋巴瘤 的發(fā)病率約為3-4/10萬，并以每年2-3%的速度增長，其中彌漫性大B細胞淋 巴瘤(DLBCL)最為常見，約占每年所有淋巴瘤的50%，因此，每年全國新發(fā)病 例約為2-3萬。
DLBCL具有顯著的生物學異質(zhì)性，對治療的反應可完全不同。病人對治 療的反應差異顯著，常規(guī)的CHOP聯(lián)合化療方案(環(huán)磷酰氨、阿霉素、長春新堿 和潑泥松)只能使約40%的患者獲得長期緩解。
近年來，人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體利妥昔(IDEC-C2B8， Rituximab， Rituxan)的應用又進一步提高DLBCL的臨床療效。但是利妥昔單抗每個療程治 療費用為10-15萬人民幣，對于大部分患者而言是沉重經(jīng)濟負擔。
因此選擇合理的治療方案，有助于需使用利妥昔單抗的患者獲得及時而對 癥的治療，也有利于節(jié)約只需CHOP治療即可獲得良好治療和預后效果的患者 的醫(yī)療支出。
國際預后指數(shù)(International Prognostic Index, IPI)以臨床指標為基礎，根據(jù) 以下因素對患者的預后進行分析年齡、體力狀態(tài)、臨床Ann Arbor分期、節(jié) 外病灶數(shù)目、乳酸脫氫酶水平。IPI雖然為患者進行預后分析及制定治療方案 提供了方便，但這種評價只是臨床參數(shù)的組合，其與DLBCL的生物學特征相 脫節(jié)，并不能非常準確地評估患者的預后。 一些被分在低危、低中危組的病人 5年生存率仍僅有32%。
淋巴瘤的發(fā)生源于獲得性基因異常，但除了腫瘤遺傳學事件的發(fā)生，B淋 巴細胞淋巴瘤的形成、增殖和存活需要來自微環(huán)境的各種生物信號。信號傳導
4通路的活化主要由各種蛋白激酶的磷酸化介導。各種信號傳導通路的異?；罨?對細胞的生長、增殖、代謝、凋亡活動起著重要作用，并導致淋巴瘤的形成。 最近大量研究顯示PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活在各種淋巴瘤， 包括彌漫大B細胞淋巴瘤的形成及發(fā)展中起著重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol-3-kinase , PI3K)通過磷脂酰肌醇依賴性激酶 (phosphoinositide-dependent kinase, PDK)使Akt(蛋白激酶B， PKB)第308位上 的蘇氨酸位點(Thr308)和第473位上的絲氨酸位點(Ser473)磷酸化，從而激活 Akt。
活化的Akt是該信號通路上一個重要介導分子，可調(diào)控多個與細胞增殖和 凋亡有關的基因家族。哺乳動物雷帕霉素受體(Mammalian target of rapamycin， mTOR)是Akt最主要的下游分子，被激活后磷酸化其下游兩個影響蛋白質(zhì)合成 的重要分子核糖體蛋白S6激酶(ribosomal S6 kinase, p70S6K)和真核細胞翻 譯抑制分子結(jié)合蛋白l(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 ， 4E-BP1)。
另有研究發(fā)現(xiàn)Y-Box結(jié)合蛋白-l(YB-l)是一個新的Akt下游分子。YB-1 是一種多功能蛋白，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯調(diào)控、細胞增殖、DNA修復等作用。 YB-1蛋白在PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路中起重要作用，通過結(jié)合在其RNA 結(jié)合域和C末端結(jié)合域來特異性的抑制翻譯。YB-1的抑制活性在被Akt磷酸 化后下降，從而增加了致癌基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄。
淋巴細胞增殖的調(diào)控失常和正常凋亡過程的阻斷共同導致了淋巴瘤的形 成。有研究顯示由Akt調(diào)節(jié)的磷酸化會影響B(tài)cl-2家族、NF-kB以及其它控制 細胞凋亡途徑的轉(zhuǎn)錄因子的活性。粒細胞白血病-1蛋白(Mcl-l)是Bcl-2家族成 員。PI3K/Akt/mTOR抑制劑誘導的凋亡與抗凋亡蛋白Mcl-l、 Bcl-2的下調(diào)密切 相關。PI3K/Akt可在轉(zhuǎn)錄水f上調(diào)Mcl-l，其過度表達能夠抑制多種淋巴瘤細 胞株的外源性和藥物誘導性凋亡作用。
然而，現(xiàn)有技術中并未提供可有力地揭示與DLBCL組織學異質(zhì)性和預后 有關的分子標志物。因此，DLBCL臨床治療仍然迫切需要可簡便而有效地用 作DLBCL治療方案選擇和/或預后指標的分子標志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在臨床研究和診斷時，能夠?qū)浡驜細胞淋 巴瘤AKT信號傳導通路耙分子p-Akt和/或YB-1進行檢測的診斷試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種彌漫大B細胞淋巴瘤AKT信號傳導通路 靶分子p-Akt和/或YB-1的檢測方法，并將其作為檢測指標。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種彌漫大B細胞淋巴瘤的預后評價模式。 本發(fā)明的另一目的在于為彌漫大B細胞淋巴瘤臨床治療方案的選擇提供 指導。
在本發(fā)明的第一方面提供了一種試劑盒，其用于彌漫大B細胞淋巴瘤的治 療方案選擇和/或預后評估，所述試劑盒包含
i) 檢測生物樣品中p-Akt表達的一種或多種試劑；和/或
ii) 檢測生物樣品中YB-1表達的一種或多種試劑。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述試劑盒中的試劑i)、 ii)是分別用于對生 物樣品中p-Akt和/或YB-1的表達進行免疫組織化學檢測的試劑。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述生物樣品獲自經(jīng)或未經(jīng)臨床治療的彌 漫大B細胞淋巴瘤患者的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。
在一個優(yōu)選例中，所述患者未經(jīng)臨床治療。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述臨床治療選自聯(lián)合化療、或聯(lián)合化 療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療。
在一個優(yōu)選例中，所述聯(lián)合化療為CHOP聯(lián)合化療，即環(huán)磷酰胺-阿霉素-長春新堿-潑尼松聯(lián)合化療。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多種使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、或免疫助劑。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述使用說明書中寫明當檢測結(jié)果為
p-Akt和/或YB-l表達呈陽性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后將不佳，但聯(lián)
用利妥昔單抗將改善預后，對其治療宜選用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治
療；當檢測結(jié)果為p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者只需采用聯(lián) 合化療即可獲得良好的治療效果和預后。
在一個優(yōu)選例中，所述聯(lián)合化療為CHOP聯(lián)合化療。
本發(fā)明的第二方面提供了 p-Akt表達和/或YB-1表達檢測試劑或試劑組在 制備用于彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預后評估的試劑盒中的用 途。
本發(fā)明的第三方面提供了 p-Akt和/或YB-1作為彌漫大B細胞淋巴瘤的治 療方案選擇和/或預后評估的標志物的用途。本發(fā)明的第四方面提供了一種評估彌漫大B細胞淋巴瘤預后效果的方法， 所述方法包括
a) 檢測獲自彌漫大B細胞淋巴瘤患者的生物樣品中p-Akt和/或YB-l的表 達情況；
b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；
其中，當p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后 效果將良好；當p-Akt和/或YB-l表達呈陽性時，提示單用聯(lián)合化療的預后效 果不佳，但聯(lián)用利妥昔單抗將改善預后。
在一個優(yōu)選例中，所述方法還包括對國際預后指數(shù)進行評估。
在另一優(yōu)選例中，所述聯(lián)合化療為CHOP聯(lián)合化療。
在另一個優(yōu)選例中，所述患者未經(jīng)臨床治療。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種選擇彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案的 方法，所述方法包括:'，'
a) 檢測獲自彌漫大B細胞淋巴瘤患者的生物樣品中p-Akt和/或YB-1的表 達情況；
b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；
其中，當p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者宜采用聯(lián)合化療； 當p-Akt和/或YB-1表達呈陽性時，提示宜對該患者采用聯(lián)合化療與利妥昔單 抗的聯(lián)合治療。
在另一優(yōu)選例中，提供了一種篩選改善彌漫大B細胞淋巴瘤預后效果的藥 物或治療方案的方法，所述方法包括
(a) 對彌漫大B細胞淋巴瘤患者、模型動物或細胞施用待篩選的藥物或治療 方案；和
(b) 檢測所述患者、模型動物或動物中p-Akt和YB-1的表達情況，
其中，p-Akt和YB-1均呈陰性提示該待篩選的藥物或治療方案的預后效果好。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物是化療藥物、對彌漫大B細胞淋巴瘤具有特異 性的單克隆抗體、或它們的組合。


圖l: DLBCL樣品石蠟切片(HE染色)照片。圖2: AKT信號傳導通路靶點p-Akt表達陽性樣品的石蠟切片(HE染色) 照片。
圖3: AKT信號傳導通路耙點YB-1表達陽性樣品的石蠟切片(HE染色)照片。
圖4: 60例隨訪患者的p-Akt表達與OS的關系，圖中分別顯示了 p-Akf 患者和p-Akt+患者的生存曲線。
圖5:采用CHOP方案治療的患者中p-Akt表達與OS的關系，圖中分別 顯示了 p-Akf患者和p-Akt+患者的生存曲線。
圖6:采用R-CHOP方案治療的患者中p-Akt表達與OS的關系，圖中分 別顯示了 p-Akf患者和p-Akt+患者的生存曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明人對彌漫大B細胞淋巴瘤組織PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路所涉 及多種分子(例如p-Akt、 YB-1、 Bcl-2、 p-p70S6K、 p-4E-BPl等)的表達情況與 該疾病的治療和預后進行了長期而深入的研究，從分子生物學角度更好地理解 彌漫大B細胞淋巴瘤的組織學異質(zhì)性，同時將考察患者的分子病理學表達特征 與臨床治療反應和預后情況間的聯(lián)系尋找該信號通路上能夠作為生物學治療 靶點和臨床預后指標的分子標志物。
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路中的分子p-Akt 和YB-1對彌漫大B細胞淋巴瘤的預后有指示意義且具有良好的敏感性，可作 為良好的臨床治療方案選擇和預后效果的分子標志物。在此基礎上，本發(fā)明人 完成了本發(fā)明。
治療方案選擇及預后評估
目前國內(nèi)外常用于DLBCL治療的方案聯(lián)合化療(主要為CHOP聯(lián)合化療方 案，即環(huán)磷酰氨、阿霉素、長春新堿和潑泥松)、或結(jié)合人-鼠嵌合性抗CD20 單克隆抗體利妥昔和CHOP聯(lián)合化療(R-CHOP)。
CHOP聯(lián)合化療方案只能使約40%的患者獲得長期緩解，但其治療費用相 對低廉。而利妥昔單抗與CHOP的聯(lián)合治療方案可進一步提高DLBCL的臨床 療效，改善患者的預后，然兩該方案每個療程治療費用為10-15萬人民幣，對 于大部分患者而言是沉重經(jīng)濟負擔。因此區(qū)分適用不同治療方案的患者，尤其是僅采用CHOP聯(lián)合化療方案就 可獲得良好預后的患者和必須采用聯(lián)合利妥昔單抗治療方案的患者，對于提高 DLBCL的臨床治療的效果、改善預后、減輕醫(yī)患負擔均有重要的意義。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)p-Akt和/或YB-1可作為彌漫大B細胞淋巴瘤良好的 臨床治療方案選擇和預后效果的分子標志物。
在本發(fā)明中可采用p-Akt和/或YB-1，僅對治療方案進行選擇或僅對預后 進行評估，也可同時將兩者結(jié)合在一起綜合考慮對患者的總體治療。
本發(fā)明的治療方案選擇及預后評估還可結(jié)合國際預后指數(shù)(IPI)等其它生 理病理指標進行，以進一步提高其準確性。
分子標志物
在本發(fā)明中，"分子標志物"、"DLBCL治療方案選擇和/或預后指標的 分子標志物"可互換使用，均表示本發(fā)明中可用于指示DLBCL預后效果并對 其臨床治療方案選擇具有指導意義的分子。本發(fā)明的分子標志物具體為 PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路中的p-Akt和YB-1分子。
本發(fā)明中，術語"p-Akt"是指PI3K/Akt/mTOR信號通路中的一個重要介 導分子，磷酸化為其活性形式，可調(diào)控多個與細胞增殖和凋亡有關的基因家族。 術語"YB-1"是指Y-Box結(jié)合蛋白-1，它是PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路中 新發(fā)現(xiàn)的一種Akt下游分子。
p-Akt位于該信號轉(zhuǎn)導通路的上游，而YB-1則位于該通路的下游。p-Akt 可對其下游多條通路中的眾多信號分子進行調(diào)控，從而進一步調(diào)節(jié)腫瘤細胞的
增殖和存活，并影響細胞遷移、黏附和胞外基質(zhì)降解等。
p-Akt的下游信號分子涉及DNA損傷修復與細胞周期調(diào)控(例如MDM2)、 蛋白質(zhì)合成與細胞生長(例如mTOR)、葡萄糖代謝(例如GSK3(3)、細胞凋亡(例 如BAD、 FKHR)等眾多重要生理和生化過程。
本發(fā)明人的實踐證明并不是所有的p-Akt下游信號分子都對DLBCL預后 及治療方案的選擇具有指導意義，例如通過研究發(fā)現(xiàn)同樣是P-Akt下游信號分 子的p-p70S6K、 p-4E-BPl就未見指導意義。而本發(fā)明人正是從紛繁蕪雜的信 號途徑中，從眾多的信號分子中篩選出了對DLBCL預后效果及其臨床治療方 案選擇具有指導意義的敏感性分子P-Akt和YB-1分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，當檢測到獲自DLBCL患者的樣品中p-Akt和/或YB-1表達呈陽性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后將不佳，但聯(lián)
用利妥昔單抗將改善預后，.対其治療宜選用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治
療；當檢測結(jié)果為p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者只需采用聯(lián) 合化療即可獲得良好的治療效果和預后。
在本發(fā)明中，術語"陰性"是指檢測結(jié)果顯示標志物分子在樣品中不表達 或與陰性對照相比無統(tǒng)計學或組織學上的差異。反之，術語"陽性"是指檢測 結(jié)果顯示標志物分子在樣品中表達或與陰性對照相比表達增加或存在統(tǒng)計學 或組織學上的明顯差異。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，采用了免疫組織化學檢測方法，p-Akt、 YB-1陽性定義為>10%的腫瘤細胞出現(xiàn)定位清晰的顆粒狀棕褐色或棕黃著色， 而陰性則定義為視野里面<10%的細胞著色。
可單獨檢測p-Akt或YB-1的表達，并將結(jié)果用于預后評估和治療方案選 擇。也可結(jié)合這兩種信號分子表達的檢測結(jié)果，以更為準確地進行預后評估和 治療方案選擇。
試劑盒
本發(fā)明中還提供了用于彌漫大B細胞淋巴瘤治療方案選擇和/或預后評估的 試劑盒，該試劑盒中含有i)檢測生物樣品中p-Akt表達的一種或多種試劑；禾口/ 或ii)檢測生物樣品中YB-1表達的一種或多種試劑。
生物樣品可以是獲自彌漫大B細胞淋巴瘤患者的新鮮組織、福爾馬林固定
或石蠟包埋組織、體液、血液、或細胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或 石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液等適于檢測的各種形式 存在，例如在結(jié)合免疫組織化學的檢測中，優(yōu)選釆用石蠟切片標本。優(yōu)選在釆 集樣品前，所述患者未經(jīng)臨床治療。
用于本發(fā)明中的檢測方法優(yōu)選免疫組織化學檢測法，該方法可極為簡便而
有效地檢測并確定樣品中p-Akt和域YB-1表達的狀況，非常適用于臨床應用。 當然，本發(fā)明也不排除本領域技術人員可采用的其它檢測方法，諸如蛋白質(zhì)印 跡法、ELISA法、流式細胞法、生物芯片法等，但其操作過程可能較本發(fā)明中 優(yōu)選的免疫組化方法繁瑣，本領域技術人員可根據(jù)需要進行選擇。
可根據(jù)多種檢測原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測p-Akt禾n/或 YB-1表達的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，"試劑組"是指包含了檢測所需的多種試劑的試劑組合。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，所釆用的檢測方法是免疫組織化學檢測 法，因此在試劑盒中所包含的檢測p-Akt的試劑包括抗p-Akt的一抗、二抗、 免疫組化所需的其它試劑(諸如稀釋劑)等。
此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對照物(包括陽性或陰性對 照)、使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領域技術人員可根據(jù)具體情況對其進 行選擇。
本發(fā)明的優(yōu)點
1. 本研究分析了 AKT信號傳導通路靶點p-Akt， YB-1在彌漫大B細胞淋 巴瘤組織中表達情況。
2. 本研究證實了 AKT信號傳導通路靶點p-Akt， YB-1的表達陽性患者對 治療反應效果差，無進展生存期和總體生存期短，臨床預后不佳，提示該通路 的持續(xù)活化是DLBCL的不良分子生物學預后因素。
3. 利妥昔單抗聯(lián)合化療(p-CHOP)消除了該通路表達對預后的負面影響， Akt、 YB-1分子可作為新的DLBCL生物學治療靶點和臨床預后指標。
實施例
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另 外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1.標本收集
入選本研究的病例為73例初治DLBCL患者，其中男42例，女31例，年 齡22-80歲，中位年齡53歲。收集患者如下臨床資料性別、年齡，行為狀態(tài)、 Ann Arbor臨床分期、LDH水平和節(jié)外病變數(shù)、腫瘤大小，并根據(jù)國際預后指 數(shù)(International Prognostic Index, IPI)進行評分?；颊甙凑赵核蠛灦ㄖ橥?。患者接受6個療程標準劑量的CHOP或R-CHOP方案治療，根據(jù)病情加或 不加用放療。
CHOP方案具體組成如下環(huán)磷酰胺750 mg/m2，靜推，第1天；阿霉素 50mg/m2，靜推，第l天；長春新堿1.4mg/m2(最大劑量，2.0 mg)，靜推，第 l天；和潑尼松60mg， 口服，第l-5天。
R-CHOP方案具體組成如下利妥昔單抗375 mg/m2，緩慢靜滴，第1天； 環(huán)磷酰胺750 mg/m2，靜推，第2天；阿霉素50 mg/m2，靜推，第2天；長春 新堿1.4mg/m2(最大劑量，2.0 mg)，靜推，第2天；和潑尼松60 mg， 口服， 第2-6天。
療效評估在6個療程治療后1個月進行。所有患者必須進行頸、胸、腹部 CT掃描的檢査，不論發(fā)病時這些部位是否受累。根據(jù)國際工作組標準 (International Workshop criteria),將治療反應分為完全緩解(CR)、臨床完全緩解 (Cru)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)?？傆行识x為CR， Cm和PR之和。
73例病例中可隨訪病例為60例，隨訪截止時間為2007年8月30日。本 研究的主要研究終點是無進展生存期(Progression-free survival, PFS)和總體生 存期(Overall survival, OS)。 PFS定義為治療有效開始至淋巴瘤進展、復發(fā)、 死亡或末次隨訪時間。OS則定義為初次確診至死亡或末次隨訪時間。
實施例2.免疫組化檢測與結(jié)果判定 1.組織樣品處理
73例DLBCL樣本均為甲醛固定，經(jīng)組織學和免疫組織化學分析，由兩位 高年資病理醫(yī)師按照2001年版WHO淋巴瘤分類標準確定組織類型。
切取3微米切片，常規(guī)脫臘，脫水，微波抗原修復后自然冷卻30分鐘， 1.5%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶，1。/。牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉20分 鐘，加入以下一抗抗p-Akt(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)，抗 YB-1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)， 4。C孵育過夜，Dako Envision HRP(Dako Cytomation)標記^抗，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透亮后蘇 木素復染細胞核。 ，
高倍鏡下選取IO個具有代表性視野，計算IOOO個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù) 換算成百分比。p-Akt， YB-1陽性定義為>10%的腫瘤細胞出現(xiàn)定位清晰的顆粒狀棕褐色或棕黃著色。陽性對照為乳腺癌或結(jié)腸癌組織，TBS代替一抗作為陰 性對照。所有染色切片由兩位血液病理學家在同一天判定結(jié)果，若出現(xiàn)爭議， 重新評價直到達成共識。
2.結(jié)果判定與分析
石蠟切片和細胞的免疫組化結(jié)果運用Leica CTR MIC顯微鏡觀測系統(tǒng) (LeicaMicrosystem, Wetzlar,德國)進行觀察，3CCD照相系統(tǒng)(HV-C20AMP， Hitachi Kokusai Electric Inc.， Tokyo，日本)進行拍照，圖像捕捉軟件為Matrox Intellicam Version 2.06(Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval， Quebec,力口拿 大)，圖像后期處理軟件為Adobe Photoshop CS2 9.0(Adobe Systems, San Jose， CA)。
所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析應用SPSS 13.0軟件進行。頻數(shù)比較資料使用義2檢驗 和Fisher確切P檢驗。PFS、 OS的計算均采用Kaplan-Meier方法，并描繪生存 曲線。單因素對生存的影響分析(生存資料的比較)均采用Log rank t檢驗。
實施例3.p-Akt、 YB-1檢測結(jié)果與療效分析
1. 免疫組織化學檢測結(jié)果
DLBCL石蠟組織p-Akt， YB-1的陽性率分別為54.8% (40/73)、 65.8% (48/73)。 p-Akt， YB-1陽性均定位于胞漿，呈棕黃色均勻片狀染色。YB-1強陽 性可表現(xiàn)為胞膜、核周以及胞核棕褐色顆粒狀染色。如圖1 圖3所示。
2. p-Akt和YB-1的表達與不同治療方案下預后效果的關系
在入選的73例患者中，單因素5C2檢驗顯示p-Akt'患者的治療總體有效率 為91.0%， p-Akt+患者的治療總體有效率為60.0%，兩者之間存在統(tǒng)計學差異 (P^.003)。同樣YB-1表達陽性者對化療的總反應率低，P值為0.002。p-p70S6K-總體反應率為82.1%, p-p70S6K+總體反應率為64.7%,兩者無統(tǒng)計學差異(P-0.113); p-4E-BPl-總體反應率為77.5%， p-4E-BPl+總體反應率為69,7，兩者無 統(tǒng)計學差異(P^.593)。
根據(jù)治療反應分組，單因素分析顯示，CHOP組中p-Akf患者的總體有效 率為85.7%， p-Akt+患者的總體有效率為37.5%，兩者之間存在統(tǒng)計學差異 (P=0.011)。 R-CHOP組中p-Akt-患者的總體有效率為94.7%, p-Akt+患者的總體有效率為75.0%，兩者之間無統(tǒng)計學差異(P=0.112)。與p-Akt類似，CHOP組 中YB-1表達者的總體有效率低，P值為0.018，在R-CHOP組中則無統(tǒng)計學差異。
對本研究中的60例彌漫大B患者進行隨訪，中位隨訪時間14個月(3-61 月)，2年估計無進展生存期(PFS)和總體生存期(OS)分別為75±7%和80±5%。 單因素分析各分子標記與PFS和OS的關系。p-Akt—者PFS、 08均優(yōu)于？-八1 + 者(PFS， 89°/。vs62%， P =0.008;而OS, 97% vs 65%， P =0.034)(生存曲線如 圖4示)。同樣YB-1表達陽性與不良預后有關(PFS， P-0.011; OS， P=0.030)。 相反，p-p70S6K-者PFS、 OS與p-p70S6K+者無統(tǒng)計學差異(P二0.158; 0.306); p-4E-BPl-者PFS、 OS與p-4E-BPl+者無統(tǒng)計學差異(P^0.903; 0.972)。
按照治療方案分組，CHOP組中p-Akf者PFS、 OS均優(yōu)于p-Akt+者((PFS， 100%vs56%， P=0.017 ; OS, 100% vs 58°/。， P =0.018)(生存曲線如圖5所示)。 在R-CHOP組中，p-Akt-患者與p-Akt+患者在PFS(PK).156)和OS(P-0.270)上的 差異無統(tǒng)計學意義(生存曲線如圖6所示)。同樣在CHOP組中，YB-l禾HBcl-2 陽性表達者預后差，在R-CHOP組中差異無統(tǒng)計學意義。IPI指數(shù)在CHOP組 和R-CHOP組都存在預后意義。
上述結(jié)果均表明可采用P-Akt與YB-1作為分子標志物來選擇適于不同 DLBCL患者的優(yōu)選治療方案.，并可對預后效果作出評估。p-Akt和/或YB-1表 達呈陽性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后將不佳，但聯(lián)用利妥昔單抗將改善 預后，對其治療宜選用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療。當檢測結(jié)果為p-Akt 和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者只需釆用聯(lián)合化療即可獲得良好的治 療效果和預后，宜選用聯(lián)合化療。
實施例4.檢測試劑盒的制備
按如下組成制備本實施例中的試劑盒(以下溫度為適宜的儲藏溫度)
試劑A:修復液粉劑(Unmasking Buffer) 5.lg， 2-8°C; 試劑B:封閉液即用型(Blocking Buffer) 5ml， 2-8°C ; 試劑C1:抗p-Akt單克隆抗體50ul， -20°C;
C2:抗YB-1單克隆抗體50 yl， -20°C ; 試劑D: —抗稀釋緩沖液，18ml， 2-8。C; 試劑E: 二抗(HRP標記)即用型5ml， 2-8。C;試劑F: DAB工作液F1—濃縮緩沖液100ul(20X)， 2-8。C(避光)；
F2 — DAB溶液lOOu 1(20X)2-8。C(避光)；
F3 —濃縮H202 100iM(20X)， 2-8。C(避光)； 試劑G: 3%&02-甲醇溶液即用型1.5ml， 2-8'C(避光)； 試劑H:蘇木精(Hematoxylin)即用型1.5ml， 2-8°C。
采用該試劑盒對分離自DLBCL患者的組織樣品進行檢測，p-Akt陽性定位于 胞漿，呈棕黃色均勻片狀染色。YB-1強陽性可表現(xiàn)為胞膜、核周以及胞核棕褐 色顆粒狀染色。陽性定義為>10%的腫瘤細胞出現(xiàn)定位清晰的顆粒狀棕褐色或棕 黃著色。采用本發(fā)明的方法根據(jù)所得結(jié)果對患者的預后做出評估，評估結(jié)果與 臨床實踐相吻合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1. 一種試劑盒，其用于彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預后評估，所述試劑盒包含i)檢測生物樣品中p-Akt表達的一種或多種試劑；和/或ii)檢測生物樣品中YB-1表達的一種或多種試劑。
2. 如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的試劑i)、 ii)是分別用于對生物樣品中p-Akt和/或YB-1的表達進行免疫組織化學檢測的試 劑。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物樣品獲自經(jīng)或未經(jīng) 臨床治療的彌漫大B細胞淋巴瘤患者的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織。
4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述臨床治療選自聯(lián)合化 療、或聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療。
5. 如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多種使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、或免疫助劑。
6. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述使用說明書中寫明當檢測結(jié)果為p-Akt和/或YB-1表達呈陽性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后將 不佳，但聯(lián)用利妥昔單抗將改善預后，對其治療宜選用聯(lián)合化療與利妥昔單抗 的聯(lián)合治療；當檢測結(jié)果為p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者只 需采用聯(lián)合化療即可獲得良好的治療效果和預后。
7. p-Akt表達和/或YB-1表達檢測試劑或試劑組在制備用于彌漫大B細胞 淋巴瘤的治療方案選擇和/或預后評估的試劑盒中的用途。
8. p-Akt和/或YB-1作為彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預后評 估的標志物的用途。
9. 一種評估彌漫大B細胞淋巴瘤預后效果的方法，所述方法包括a) 檢測獲自彌漫大B細胞淋巴瘤患者的生物樣品中p-Akt和/或YB-l的表 達情況；b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；其中，當p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示該患者對聯(lián)合化療的預后 效果將良好；當p-Akt和/或YB-l表達呈陽性時，提示單用聯(lián)合化療的預后效果不佳，但聯(lián)用利妥昔單抗將改善預后。
10. —種選擇彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案的方法，所述方法包括a) 檢測獲自彌漫大B細胞淋巴瘤患者的生物樣品中p-Akt和/或YB-l的表達情況；b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；其中，當p-Akt和YB-1表達均呈陰性時，提示對該患者宜采用聯(lián)合化療； 當p-Akt和/或YB-1表達呈陽性時，提示宜對該患者采用聯(lián)合化療與利妥昔單 抗的聯(lián)合治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預后評估的分子標志物(具體為p-Akt和/或YB-1)及其應用，還涉及彌漫大B細胞淋巴瘤治療方案選擇和/或預后評估的方法。采用本發(fā)明的分子標志物p-Akt和/或YB-1，可對彌漫大B細胞淋巴瘤的預后簡便而正確地作出判斷，以有助于對患者采取有針對性的治療方案，從而提高治療方案的預后效果并節(jié)省醫(yī)療費用。
文檔編號G01N33/53GK101470112SQ20071017360
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權日2007年12月28日
發(fā)明者張慶華, 徐子真, 李軍民, 沈志祥, 趙維蒞 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院;上海生物芯片有限公司