專利名稱：：一種預(yù)知子提取物及其制劑與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中草藥提取物，具體涉及一種預(yù)知子提取物，本發(fā)明還涉及該提取物的制劑與用途。
背景技術(shù)：
：預(yù)知子，為木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.)Decne.、三葉木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.或白木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.Var.australis(Diels)Rehd.的干燥近成熟果實(shí)。分布于我國的江蘇、湖南、湖北、四川、浙江、安徽等省份。功效為舒肝理氣，活血止痛，利尿，殺蟲。用于脘脅脹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、小便不利、蛇蟲咬傷。其中主要含木通皂苷(Akebin)A、B、C、D、E、F及G，其皂甙元均為常春藤皂苷元。據(jù)《本草綱目.草部(下)》記載山預(yù)知子組方主治"心氣不足，精神恍惚，語言錯(cuò)妄，忪悸煩郁，憂悉慘戚，喜怒多風(fēng)扇，健忘少睡，夜多異夢(mèng)，狂不知人"；元代《御藥院方'預(yù)知子丸》也記載預(yù)知子丸主治"心氣不足，志意不定，神情恍惚,語言錯(cuò)忘，驚悸，郁愁，慘戚，喜驚多恐，健忘少睡，寐則驚魔，發(fā)狂旺暴不知人。"提示預(yù)知子可能具有治療抑郁癥的作用。常春藤皂苷元(hederagenin)及其糖苷在自然界分布相對(duì)較廣，但是其在植物中含量一般較低，含量相對(duì)高的植物較少。揚(yáng)中林等報(bào)道續(xù)斷(DipsacusasperWall.)根中常春藤皂苷元糖苷含量較高，僅木通皂苷D含量可高達(dá)8。/。；馬雙成等報(bào)道白木通(Akebia.Trifoliata(Thunb.)Koidz,Var.Australis(Diels)Rehd.)禾中子中皂苷含量高達(dá)38.5。/。，且主要是常春藤皂苷元糖苷。前期研究發(fā)現(xiàn)預(yù)知子乙醇浸膏具有抗抑郁作用，通過對(duì)其進(jìn)行活性指導(dǎo)的分離，發(fā)現(xiàn)活性部位是以常春藤皂苷元為苷元的一系列皂苷的混合物，進(jìn)一歩分離得到木通皂苷A、B、C、D、E、F、G各單體，目甜研究顯示上述皂苷的苷元一常春藤皂苷元具有顯著的抗抑郁活性。目前還尚未發(fā)現(xiàn)常春藤皂苷元及其衍生物用于制備治療抑郁癥藥物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種預(yù)知子提取物，該提取物活性成分含量高，雜質(zhì)少。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述提取物的制備方法，該制備方法步驟簡潔、科學(xué)合理。本發(fā)明的目的還在于提供上述提取物的制劑及該提取物及其制劑的用途，該制劑安全有效，質(zhì)量可控。為達(dá)到本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的預(yù)知子提取物通過以下方法制備獲得.*以預(yù)知子藥材為原料，先進(jìn)行脫脂處理，再依次進(jìn)行乙醇提取、乙酸乙酯處理和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷，所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物，所述預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。為達(dá)到本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明提供的預(yù)知子提取物的制備方法，包括以下歩驟(1)脫脂取預(yù)知子藥材，加入2~3倍重量的石油醚超聲脫脂2030min后揮發(fā)除去石油醚；(2)乙醇提取在脫脂處理后預(yù)知子藥材中加入34倍重量的體積濃度為75~85%的乙醇溶液超聲提取23次，每次提取3040min，將提取液減壓濃縮至原體積的1/51/4，靜置過夜后過濾；(3)乙酸乙酯處理在歩驟(2)所得濾液中加水稀釋至原體積的1.5~1.8倍，加入等體積的乙酸乙酯萃取35次，棄去乙酸乙酯萃取液以除去非預(yù)知子皂苷成份；(4)水飽和正丁醇提取在歩驟(3)乙酸乙酯處理后的水液中加入等體積的水飽和正丁醇溶液提取35次，減壓回收水飽和正丁醇后，得預(yù)知子總皂苷；(5)降解取歩驟(4)所得預(yù)知子總皂苷，加入1015倍重量的含酸乙醇溶液中，加熱至90110'C，降解24h，過濾，得不溶物，將不溶物水洗后除去多余酸并抽干，得預(yù)知子提取物粗晶；(6)純化在預(yù)知子提取物粗晶中加入4055倍重量的體積濃度為45%的藥用乙醇，加熱溶解后加入活性炭回流3040min,過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后，得預(yù)知子提取物結(jié)晶體，用無水乙醇在0-4。C反復(fù)重結(jié)晶，蒸餾水洗除去氯離子后，真空干燥得預(yù)知子提取物，所得預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。本發(fā)明的目的還可通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供的上述預(yù)知子提取物的制劑，它是以預(yù)知子提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的藥物載體混和制成的藥劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的藥物劑型為片劑，所述的藥物載體包括填充劑、崩解劑和潤滑劑。其中，在預(yù)知子提取物和藥物載體混合制成的片劑中，所述預(yù)知子提取物的重量百分含量為5090%,所述崩解劑的重量百分含量為03%,所述潤滑劑的重量百分含量為0.21.0%，其余為填充劑。優(yōu)選的，在預(yù)知子提取物和藥物載體混合制成的片劑中，預(yù)知子提取物的重量百分含量為6080%，所述崩解劑的重量百分含量為1.02.2%,所述潤滑劑的重量百分含量為0.30.8%，其余為填充劑。本發(fā)明所述片劑通過如下的方法制備獲得取計(jì)量比的預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑，過60100目篩，混合均勻，采用粘合劑制軟材，2050目篩制粒，409(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，整粒后加入潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。本發(fā)明所述填充劑為乳糖、微晶纖維素、淀粉和預(yù)膠化淀粉中的一種或幾種；所述崩解劑為交聯(lián)聚維酮、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉或交聯(lián)甲基纖維素鈉；所述潤滑劑為硬脂酸鹽、硬脂酸、淀粉、微粉硅膠、氫化植物油或滑石粉。本發(fā)明所述粘合劑為聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為3555%，聚維酮的體積濃度為1.54.5%。本發(fā)明所述的預(yù)知子提取物及其制劑在制備具有抗抑郁藥物中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提取物的提取歩驟科學(xué)合理，所得提取物中雜質(zhì)含量少，其中活性成份預(yù)知子提取物的含量高，提取物的含量最高可達(dá)90%;經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提取物制劑安全有效，質(zhì)量可控；(2)建立了其抗抑郁的藥效學(xué)測試方法，觀察了提取物的急性毒性，并以此方法提取的產(chǎn)物制備了適于臨床應(yīng)用的片劑藥物，由此提供了一種能夠用于制備抑郁癥預(yù)防和治療等產(chǎn)品的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用。圖l是常春藤皂苷元對(duì)照品色譜圖；圖2是預(yù)知子提取物的色譜圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所述
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。第一部分預(yù)知子提取物與預(yù)知子提取物的片劑及其制備方法實(shí)施例1本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物通過如下歩驟制備獲得以預(yù)知子藥材為原料，先進(jìn)行脫脂處理，再依次進(jìn)行乙醇提取、乙酸乙酯處理和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷，所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物，所述預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。本實(shí)施例提供的上述預(yù)知子提取物的制備方法如下(1)脫脂取預(yù)知子藥材粗粉500g，用石油醚1000ml超聲脫脂2030min;(2)乙醇提取藥材粗粉揮發(fā)除去石油醚后，用體積濃度為85%的乙醇溶液2000ml超聲提取2次，每次3(K40min，提取液減壓濃縮至500ml，放置過夜后過濾；(3)乙酸乙酯處理濾液部份加水至800ml，分別用乙酸乙酯EtOAc800ml提取3次，棄去乙酸乙酯萃取液以除去非預(yù)知子皂苷成份；(4)水飽和T「J—'醇提取在歩驟(3)所得水液中分別加入水飽和正丁醇n-BuOH800ml提取3次，減壓回收n-BuOH近干，得預(yù)知子總皂苷；(5)降解取歩驟(4)所得預(yù)知子總皂苷5g，力卩60~70毫升含濃度為2mol/L的鹽酸乙醇溶液，乙醇的體積濃度為45%，在IO(TC條件下降解3h，過濾，得不溶物，將不溶物水洗后洗去多余酸并抽干，得預(yù)知子提取物粗晶；(6)純化在預(yù)知子提取物粗品中加入50倍重量的體積濃度為45%的藥用乙7醇加熱溶解粗晶，另加入約占粗晶量10%的活性炭，加熱回流30min，趁熱過濾，棄去炭層，醇溶液減壓濃縮后，析出大量針簇狀結(jié)晶，用無水乙醇在04'C反復(fù)重結(jié)晶，濾出結(jié)晶，用蒸餾水沖洗至無氯離子，85'C真空干燥，得白色成品為預(yù)知子提取物，所得預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微晶纖維素和乳糖為填充劑，以交聯(lián)聚維酮為崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為35%，聚維酮的體積濃度為3.0%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物400mg，微晶纖維素22mg，乳糖64mg，交聯(lián)聚維酮10mg，硬脂酸鎂4mg，總量500mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過6080目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，30目篩制粒，6(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，30目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢查法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限46s，溶出度為98.5%。實(shí)施例2本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物通過如下歩驟制備獲得以預(yù)知子藥材為原料，先進(jìn)行脫脂處理，再依次進(jìn)行乙醇提取、乙酸乙酯處理和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷，所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物，所述預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。本實(shí)施例提供的上述預(yù)知子提取物的制備方法如下(1)脫脂取預(yù)知子藥材粗粉500g，用石油醚1500ml超聲脫脂2030min;(2)乙醇提取藥材粗粉揮發(fā)除去石油醚后，用體積濃度為85%的乙醇溶液2500ml超聲提取3次，每次3040min，提取液減壓濃縮至500ml，放置過夜后過濾；(3)乙酸乙酯處理濾液部份加水至1000ml，分別用乙酸乙酯EtOAclOOOml提取4次，棄去乙酸乙酯萃取液以除去非預(yù)知子皂苷成份；(4)水飽和正丁醇提取在步驟(3)所得水液中分別加入水飽和正丁醇n-BuOH1000ml提取4次，減壓回收n-BuOH近干，得預(yù)知子總皂苷；(5)降解取步驟(4)所得預(yù)知子總皂苷5g，力n60~70毫升含濃度為2mol/L的鹽酸乙醇溶液，乙醇的體積濃度為45%,在IO(TC條件下降解3h,過濾，得不溶物，將不溶物水洗后洗去多余酸并抽干，得預(yù)知子提取物粗晶；(6)純化在預(yù)知子提取物粗晶中加入50倍重量的體積濃度為45%的藥用乙醇加熱溶解粗晶，另加入約占粗晶量10%的活性炭，加熱回流3040min，趁熱過濾，棄去炭層，醇溶液減壓濃縮后，析出大量針簇狀結(jié)晶，用無水乙醇在04'C反復(fù)重結(jié)晶，濾出結(jié)晶，用蒸餾水沖洗至無氯離子，85'C真空干燥，得白色成品為預(yù)知子提取物，所得預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微晶纖維素和乳糖為填充劑，以交聯(lián)聚維酮為崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為45%，聚維酮的體積濃度為2.0%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物200mg，微晶纖維素22mg，乳糖68mg，交聯(lián)聚維酮8mg，硬脂酸鎂2mg，總量300mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，40目篩制粒，8(TC干燥，顆粒水分控制在3。/。以內(nèi)，40目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢査法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限38s，溶出度為95.4%。實(shí)施例3本實(shí)施例提供的預(yù)知子及其制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以乳糖為填充劑，以低取代羥丙基纖維素為崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為55%，聚維酮的體積濃度為3.0%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物200mg，乳糖94mg，低取代羥丙基纖維素4mg，硬脂酸鎂2mg，總量300mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60-100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，50目篩制粒，90'C干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，50目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢査法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限40s，溶出度為94.9%。實(shí)施例4本實(shí)施例提供的預(yù)知子及其制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微晶纖維素和乳糖為填充劑，以羧甲基淀粉鈉為崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為45%，聚維酮的體積濃度為3.5%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物200mg，微晶纖維素23mg，乳糖69mg，羧甲基淀粉鈉6mg，硬脂酸鎂2mg，總量300mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，50目篩制粒，9(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，50目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢查法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限35s，溶出度為93.6%。實(shí)施例5本實(shí)施例提供的預(yù)知子及其制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微品纖維素和乳糖為填充劑，以交聯(lián)聚維酮崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為45%，聚維酮的體積濃度為3.5%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物300mg，微晶纖維素22mg，乳糖66mg，交聯(lián)聚維酮8mg，硬脂酸鎂3mg，總量400mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，50目篩制粒，9(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，50目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢查法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限34s，溶出度為92.3%。實(shí)施例6本實(shí)施例提供的預(yù)知子及其制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微晶纖維素和乳糖為填充劑，以交聯(lián)聚維酮崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為45%，聚維酮的體積濃度為3.5%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物400mg，微晶纖維素22mg，乳糖64mg，交聯(lián)聚維酮10mg，硬脂酸鎂4mg，總量500mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，2050目篩制粒，409(TC千燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，50目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢查法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限31s，溶出度為91.6%。實(shí)施例7本實(shí)施例提供的預(yù)知子及其制備方法參照實(shí)施例1或?qū)嵤├?。本實(shí)施例提供的預(yù)知子提取物的片劑以預(yù)知子提取物為活性物質(zhì)，以微晶纖維素和乳糖為填充劑，以交聯(lián)聚維酮崩解劑，以硬脂酸鎂為潤滑劑，粘合劑選11用聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為45%，聚維酮的體積濃度為3.5%。各組分的重量如下預(yù)知子提取物600mg，微晶纖維素25mg，乳糖60mg交聯(lián)聚維酮10mg，硬脂酸鎂5mg，總量700mg。上述預(yù)知子提取物的片劑的制備方法如下按50倍處方量稱取預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑一次過60100目篩，混合均勻，使用上述粘合劑制軟材，20~50目篩制粒，409(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，50目篩整粒后加入適量的潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。檢測指標(biāo)及方法崩解時(shí)限取樣品6片，照中國藥典2005年版二部附錄XA崩解時(shí)限檢查法檢測結(jié)果為崩解時(shí)限32s，溶出度為90.2%。第二部分預(yù)知子提取物及其片劑在制備具有抗抑郁藥物中的用途2.1提取物的鑒定分析2丄1對(duì)照品溶液制備精密稱取常春藤皂苷元對(duì)照品2mg，以甲醇定容至10m，過濾后待用。2丄2供試品溶液制備精密稱取預(yù)知子提取物8mg，以甲醇定容至10ml，過濾后待用。2.1.3色譜條件色譜柱AgelaC18柱(4.6mmx250mm，5pm);流動(dòng)相甲醇水冰醋酸三乙胺(87:13:0.04:0.02)，流速0.8mL.min-1;檢測波長210nm;柱溫25°C。2.1.4鑒定結(jié)果分析結(jié)果顯示預(yù)知子提取物得率約為0.5%，其中常春藤皂苷元含量占提取物總量的69.48%。2.2預(yù)知子抗抑郁活性成分的藥效學(xué)研究2.2.1小鼠行為絕望模型實(shí)驗(yàn)2.2丄1分組及給藥將昆明系小鼠(雌雄各半)100只隨機(jī)分為5組，每組9-19只，即空白組(給予等體積0.5。/。CMC-Na溶液)，低劑量組(25mg/kg預(yù)知子提取物)，中劑量組(50mg/kg預(yù)知子提取物)，高劑量組(100mg/kg預(yù)知子提取物)，陽性對(duì)照組(2mg/kg西酞普蘭)，每組均灌胃給藥，每閂一次，連續(xù)給藥7天。采用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠不動(dòng)時(shí)間。122.2.1.2小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)小鼠置于12cm高的盛水透明圓筒形容器內(nèi)，水深10cm，水溫24士2。C，觀察6min內(nèi)小鼠游泳情況，記錄后4min內(nèi)游泳累計(jì)不動(dòng)時(shí)間("不動(dòng)"即小鼠停止掙扎或小鼠呈漂浮狀態(tài),小鼠四肢有輕微動(dòng)作保持頭部在水面)。2.2.1.3小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥lh后，距小鼠尾尖部約lcm處用膠布貼于距離地面50cm支架上，使小鼠成倒掛狀態(tài)，一次懸掛2只小鼠，中間用擋板隔開使兩者視線隔離。懸掛時(shí)間為6min，記錄小鼠后4min內(nèi)懸尾累積不動(dòng)時(shí)間(不動(dòng)狀態(tài)即小鼠停止掙扎不動(dòng)或無任何活動(dòng))。2.2.1.4小鼠自主活動(dòng)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)后，通過測定小鼠自主活動(dòng)以排除藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮作用。將小鼠置于小鼠自主活動(dòng)儀內(nèi)，適應(yīng)2min后，測定后4min內(nèi)累計(jì)自主活動(dòng)次數(shù)(以小鼠直立次數(shù)計(jì))。2.2丄5統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表1小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中預(yù)知子提取物對(duì)各組小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響(i士s)組別樣本楚n齊U量(mg/kg)不動(dòng)時(shí)間(s)Control18180.1U27.989925130.33土55.756"AkebiaeEx1950150.42±37.015*19100135.32土41.980"ESC182151.56士32.688'/，4.111尸0細(xì)P<0.05,尸<0.01,Lj空白組相比表1結(jié)果顯示，給予25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg預(yù)知子提取物均能顯著縮短小鼠不動(dòng)時(shí)間，其中25mg/kg劑量組效果最好。表2小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中預(yù)知子提取物對(duì)各組小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響(f±s)甜別齊!j呈(mg/kg)不動(dòng)時(shí)間(s)Control15141.47±27.409102590.80±20.585"AkebiaeEx175088.47±35.932*"700〗16.8±41.075ESC19107.95士44.599*5.065尸0.001尸<0.05,》<0.01，><0.001勾空甶組相比表2結(jié)果顯示，給予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg預(yù)知子提取物均能顯著縮短小鼠不動(dòng)時(shí)間，其中50mg/kg劑量組效果最好。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3結(jié)果顯示各給藥劑量組小鼠活動(dòng)能力與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。2.2.2慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激加孤養(yǎng)(CUMS)模型實(shí)驗(yàn)2.2.2.1造模及給藥除空白對(duì)照組大鼠外，CUMS模型組、不同劑量預(yù)知子提取物給藥組及西酞普蘭陽性對(duì)照組大鼠均單籠飼養(yǎng)。造模方法要點(diǎn)如下將禁水(24h)、夾尾(lmin)、45。C環(huán)境(5min)、4。C冰水游泳(5min)、晝夜顛倒(24h)、禁食(24h)、電擊足底(電壓50mv，每隔50s刺激1次，每次持續(xù)10s，30次)、居住環(huán)境改變(潮濕墊料、鼠籠傾斜)、限制行為(2h)等9種刺激隨機(jī)安排到18天內(nèi)，每H給予1種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免發(fā)生適應(yīng)性。從造模第一天起，每天8:0012:00各組大鼠灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組及CUMS模型組大鼠給予0.5MCMC-Na溶液；不同劑量預(yù)知子提取物給藥組分別給予劑量為含6.25mg/kg，12.5mg/kg，25mg/kg預(yù)知子提取物的0.5%CMC-Na混懸液，陽性對(duì)照組大鼠給予劑量為6.25mg/kg西酞普蘭的0.5%CMC-Na混懸液。連續(xù)灌胃21天，每F1—次。2.2.2.2體質(zhì)量變化及糖水偏愛度實(shí)驗(yàn)分別稱取各組大鼠在造模給藥第0天(造模前，基礎(chǔ)體質(zhì)量)、第5天、第10天、第15天、第20天體質(zhì)量，按照公式體質(zhì)量變化百分比(％)=(當(dāng)前體質(zhì)量_基礎(chǔ)體質(zhì)量)/基礎(chǔ)體質(zhì)量x100%，計(jì)算各組大鼠體質(zhì)量變化程度。糖水消耗實(shí)驗(yàn)前在安靜的房間內(nèi)，訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24h，兩瓶均為1%蔗糖水，隨后的24h，一個(gè)瓶裝1%蔗糖水，一個(gè)瓶裝純水。造模后第1天，經(jīng)24h的禁食禁水，行動(dòng)物的基礎(chǔ)/純水消耗實(shí)驗(yàn)，給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，60min后，兩瓶取水定量。計(jì)算動(dòng)物的總液體消耗糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(糖水偏愛度=糖水消耗/液體消耗x100%)。2.2.2.3敞箱實(shí)驗(yàn)糖水實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天上午7:00-11:OO在安靜的房間內(nèi)進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)觀察，將大鼠放入敞箱中心方格內(nèi)，觀察大鼠在5min內(nèi)穿越格數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格才記數(shù)，為水平運(yùn)動(dòng)得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動(dòng)得分)及理毛次數(shù)，每次徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下一次觀察。2.2.2.4血漿皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素濃度測定各組大鼠在所有行為學(xué)測試結(jié)束后第2天上午8:00-10:00斷頭取血5ml，其中2ml放入加入10%EDTA二鈉30^1和抑肽酶20^1的試管中，混勻，4°C3000rpm離心10min，分離血漿放置-20。C冰箱保存，待測ACTH;另2ml，4°C，3000rpm離心10min，分離血漿放置-20'C冰箱保存，待測CORT。2.2.2.5統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表4預(yù)知子提取物對(duì)各組大鼠體質(zhì)量變化的影響(i±s，n二6-7)組別劑M(mg/kg)第5大第10大第15大第20天Control-12.62±2.72722.62±5.245*40.19±8.102"37.38土7.726Model-8.81±3.07116.53±4.15421.9肚5.89326.85士5.1506.2510.41±1.70915.47±3.80721.43±6.16929.48±6.957FAE12.59.19±1.85816.48±2.72920.5歸.30027.67±6.5842510細(xì).17017.23±2鄰520.88±5.32628.68±6.679ESC6.259.73±3.38117.17±6.07928.75±1.30729.49±5.3972.0022.2579.5602.045尸0.1060.072.0.0000.]03'尸<0.05,"尸<0.01,與其余各組相比表5預(yù)知子提取物對(duì)各組大鼠糖水偏愛度的影響(3f士s)組別樣本呈n劑tt(mg/kg)糖水偏愛度(％)Control666.670Model620.672±12.213###76.2551.041±15.029"*AkebiaeEx712.557.163士14.48172571.677±9.237,ESC76.2554.656±8.92715.555尸O細(xì)0.001，丄j空A對(duì)照組相比；*><0.001，與模荊組相比15表4結(jié)果顯示，在造模給藥進(jìn)行第5天、第10天、第15天、第20天，正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量有顯著增加，而其余各組應(yīng)激大鼠僅表現(xiàn)為體質(zhì)量較為微弱的增加，且增加幅度均相似。表5結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠比較，CUMS模型組大鼠對(duì)糖水偏愛程度顯著降低，而其余各給藥組大鼠糖水偏愛度與CUMS模型組比較均有顯著增加，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。表6預(yù)知子提取物對(duì)各組大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響(3f±s，n=6-7)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7預(yù)知子提取物對(duì)各組大鼠尸<0.001勾空^對(duì)照組相比血漿CORT和ACTH的影響(x±s，n=6-7)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>腳尸<0.001，與空對(duì)照組相比；><0.05,**尸<0.01，<0.001與模艱組相比表6結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠比較，CUMS模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂運(yùn)動(dòng)、理毛次數(shù)得分均顯著減少，而不同劑量給藥組大鼠以及陽性對(duì)照組大鼠三者得分情況與CUMS模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均表現(xiàn)出增加趨勢(shì)。表7結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠比較，CUMS模型組大鼠血漿CORT和ACTH水平均顯著升高，預(yù)知子提取物在12.5mg/kg及25mg/kg劑量下能顯著降低CUMS引起的血漿內(nèi)CORT和ACTH水平升高，但在6.25mg/kg劑量的預(yù)知子提取物對(duì)CUMS引起的血漿內(nèi)CORT和ACTH水平升高不能表現(xiàn)出明顯的改善作用。2.2.3中藥預(yù)知子提取物抗抑郁作用機(jī)制的研究2.2.3.1預(yù)知子提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用2.2.3.1.1皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷及給藥檢測PC12細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl()5/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔腳l，放置于C02孵箱中，在37°C，5%(202條件下用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，每孔換成含1%小牛血清的DMEM100iil培養(yǎng)12h使其同歩化。吸去細(xì)胞液，分別給予預(yù)知子高、中、低劑量組預(yù)知子提取物(50nmol七—1，25pmol'L—'和12.5pmol丄—"及陽性對(duì)照藥物西酞普蘭(12.5pmol'L")預(yù)保護(hù)4-6h后，每孔再加入含有相應(yīng)濃度為20C^mol'L"Cor的無血清DMEM(對(duì)照組不含任何藥物)，培養(yǎng)48h。輕輕吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.5g七—1MTT20^1，培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入100^1二甲基亞砂L輕輕震蕩，待藍(lán)色顆粒完全溶解，使用酶標(biāo)儀檢測，使用波長為570nm。2.2.3.1.2統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表8預(yù)知子提取物對(duì)Cor損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用(i±s，n=6-7)組別樣本呈n劑量(imol七-lA570nmA變化率o/。空白對(duì)照組(control)71.138士0.081###100Cor(model)102000.745±0.05165.57Cor+預(yù)知于50(預(yù)知子50)7500.958士0.063"'84.18Cor+預(yù)知十25(預(yù)知子25)9251.013±0.08289.02Cor+預(yù)知于12.5(預(yù)知子12.5)1012.51.083±0.107"*95.17Cor+ESC12.5(卩l(xiāng)l性對(duì)照組)1012.51.022±0.082"*89.81F26.71P0.00###P<0.01,與空白對(duì)照組相比，'"P<0.001,與模型組相比。表8結(jié)果顯示，50nmol七"、25nmol丄-'、U.S^imol'L-1三個(gè)不同濃度的預(yù)知子提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC2細(xì)胞損傷均有明顯的保護(hù)作用，數(shù)據(jù)分析顯示與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中12.5pmol，L—i預(yù)知子提取物的保護(hù)作用最強(qiáng)。2.3提取物的片劑在制備具有抗抑郁作用的藥物中的用途經(jīng)初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取物的片劑在制備具有抗抑郁作用的藥物中的用途與提取物在制備具有抗抑郁作用的藥物中的用途相當(dāng)。權(quán)利要求1、一種預(yù)知子提取物，其特征在于，通過以下方法制備獲得以預(yù)知子藥材為原料，先進(jìn)行脫脂處理，再依次進(jìn)行乙醇提取、乙酸乙酯處理和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷，所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物，所述預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60％。2、一種制備權(quán)利要求1所述的預(yù)知子提取物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)脫脂取預(yù)知子藥材，加入2~3倍重量的石油醚超聲脫脂20~30min后揮發(fā)除去石油醚；(2)乙醇提取在脫脂處理后預(yù)知子藥材中加入34倍重量的體積濃度為7585%的乙醇溶液超聲提取23次，每次提取3040min，將提取液減壓濃縮至原體積的1/5~1/4，靜置過夜后過濾；(3)乙酸乙酯處理在歩驟(2)所得濾液中加水稀釋至原體積的1.5~1.8倍，加入等體積的乙酸乙酯萃取35次，棄去乙酸乙酯萃取液以除去非預(yù)知子皂苷成份；(4)水飽和正丁醇提取在歩驟(3)乙酸乙酯處理后的水液中加入等體積的水飽和lH丁醇溶液提取35次，減壓回收水飽和正丁醇后，得預(yù)知子總皂苷；(5)降解取歩驟(4)所得預(yù)知子總皂苷，加入10~15倍重量的含酸乙醇溶液屮，加熱至9011(TC，降解24h，過濾，得不溶物，將不溶物水洗后除去多余酸并抽干，得預(yù)知子提取物粗晶；(6)純化在預(yù)知子提取物粗晶中加入4055倍重量的體積濃度為45%的藥用乙醇，加熱溶解后加入活性炭回流3040min，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后，得預(yù)知子提取物結(jié)晶體，用無水乙醇在04t;反復(fù)重結(jié)晶，蒸餾水洗除去氯離子后，真空干燥得預(yù)知子提取物，所得預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60%。3、一種權(quán)利要求]所述預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，它是以預(yù)知子提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的藥物載體混和制成的藥劑。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，所述的藥物劑型為片劑，所述的藥物載體包括填充劑、崩解劑和潤滑劑。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，在預(yù)知子提取物和藥物載體混合制成的片劑中，所述預(yù)知子提取物的重量百分含量為5090%，所述崩解劑的重量百分含量為03%，所述潤滑劑的重量百分含量為0.2~1.0%，其余為填充劑。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，在預(yù)知子提取物和藥物載體混合制成的片劑中，預(yù)知子提取物的重量百分含量為6080%，所述崩解劑的重量百分含量為1.0~2.2%，所述潤滑劑的重量百分含量為0.3~0.8%，其余為填充劑。7、根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，所述片劑通過如下的方法制備獲得取計(jì)量比的預(yù)知子提取物、填充劑和崩解劑，過60100目篩，混合均勻，采用粘合劑制軟材，2050目篩制粒，409(TC干燥，顆粒水分控制在3%以內(nèi)，整粒后加入潤滑劑，混合均勻，壓片，即得預(yù)知子提取物的片劑。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，所述填充劑為乳糖、微晶纖維素、淀粉和預(yù)膠化淀粉中的一種或幾種；所述崩解劑為交聯(lián)聚維酮、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉或交聯(lián)甲基纖維素鈉；所述潤滑劑為硬脂酸鹽、硬脂酸、淀粉、微粉硅膠、氫化植物油或滑石粉。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)知子提取物的制劑，其特征在于，所述粘合劑為聚維酮的乙醇水溶液，其中乙醇的體積濃度為3555%，聚維酮的體積濃度為1.54.5%。10、權(quán)利要求1屮所述的預(yù)知子提取物或權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的預(yù)知子提取物的制劑在制備具有抗抑郁藥物中的用途。全文摘要一種預(yù)知子提取物，通過以下方法制備獲得以預(yù)知子藥材為原料，先進(jìn)行脫脂處理，再依次進(jìn)行乙醇提取、乙酸乙酯處理和水飽和正丁醇提取后得預(yù)知子總皂苷，所得總皂苷經(jīng)含酸乙醇降解及純化處理后得預(yù)知子提取物，所述預(yù)知子提取物中常春藤皂苷元的重量百分含量不低于60％；本發(fā)明還公開了上述預(yù)知子提取物的制備方法及其制劑與用途；該預(yù)知子提取物雜質(zhì)少、活性成分含量高，步驟科學(xué)合理，其制劑安全有效、質(zhì)量可靠，該預(yù)知子提取物及其制劑具有良好的抗抑郁作用。文檔編號(hào)A61P25/00GK101590086SQ20091004049公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月23日優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日發(fā)明者徐江平申請(qǐng)人:徐江平