專利名稱：：化橘紅總黃酮在制備治療酒精性肝損傷的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及種中藥提取物的新用途，特別涉及種化橘紅提取物的新用途。
背景技術(shù)：
：酗酒是一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的行為。大量飲酒可引起急性酒精中毒。長期過量飲酒會(huì)引發(fā)精神障礙、胃腸道損傷、酒精性肝損傷，嚴(yán)重者甚至可以導(dǎo)致死亡。酒精性肝損傷是常見的慢性肝病，迄今臨床缺乏理想的藥物防治手段。在歐美國家，酒精性肝損傷是中青年死亡的主要原因之一，是主要肝臟疾病和研究重點(diǎn)。在我國，隨著生活方式的改變，近年來灑精性肝損傷也有增加的趨勢。因此，積極減輕酒精對人體的危害，防治酒精性肝損傷具有重要的意義。研究已經(jīng)證實(shí)，酒精作為一種肝臟毒性劑，可削弱正常肝細(xì)胞的代謝及肝細(xì)胞末的穩(wěn)定性，損傷線粒體功能等。乙醇進(jìn)入體內(nèi)后通過胃腸道吸收，僅有2%10%由呼吸道、尿道和汗腺以原形排出，其余90%在肝臟代謝。經(jīng)肝臟代謝的乙醇經(jīng)過肝乙醇脫氫酶(ADH)、過氧化氫分解酶(CAT)和肝微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(ME0S)三條途徑氧化為乙醛，乙醛再經(jīng)過乙醛脫氫酶(ALDH)轉(zhuǎn)化為乙酸，后者以乙?；男问竭M(jìn)入三羧酸循環(huán)，氧化成二氧化碳和水。乙醇在代謝過程可使肝內(nèi)耗氧增加，肝細(xì)胞氧化還原反應(yīng)增高，自由基產(chǎn)生增多，使肝細(xì)胞的新陳代謝受到影響。此外，乙醛對于肝臟有直接毒性作用，可使肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受損，造成肝細(xì)胞損傷及壞死?；偌t是蕓香科植物化州柚C,Ymygra"tfo7bwewtoragra"^fo".J>Qy&ck的未成熟或近成熟干燥外層果皮。前者習(xí)稱"毛橘紅"，后者習(xí)稱"光橘紅"，化橘紅富含黃酮類成分，其中柚皮苷、野漆樹苷均為活性成分?；偌t主產(chǎn)于廣東化州，是特產(chǎn)道地藥材，具有散寒、燥濕、利氣、消痰的功能，用于風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔吐痞悶。《本草綱目拾遺》中就有化橘紅"……醒酒寬中……"的記載，在清代早期著名醫(yī)家葉天士等就已普遍應(yīng)用，林群蓮等報(bào)道葉天士在治胃脘痛中對"胃痛引脅，肝郁化火犯胃者，……以半夏、化橘紅苦辛散結(jié)，疏肝理氣……"。然而對于化橘紅或化橘紅的有效成分用于酒精性肝損傷的防治或其防治酒精性肝病的機(jī)理，目前為止，尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能夠防治酒精性肝損傷的天然中藥，具體而言，本發(fā)明提供了天然中藥化橘紅新的藥用用途，特別涉及化橘紅在防治酒精性肝損傷藥物中的用途。3本申請的發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的化橘紅總黃酮，能夠防治酒精性肝損傷降低酒精性肝損傷患者的死亡率；抑制肝臟腫脹的作用；恢復(fù)酒精造成的肝功能損害，降低酒精性肝損傷患者ALT和AST含量；促進(jìn)肝臟蛋白的生成；促進(jìn)肝內(nèi)脂肪代謝作用；化橘紅總黃酮還具有抗氧化作用，能降低肝組織SOD活力，升高M(jìn)DA含量；化橘紅總黃酮還可以抗肝脂肪變性的作用、減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和降低細(xì)胞水腫；降低肝細(xì)胞凋亡率；降低酒精性肝損傷細(xì)胞炎癥因子，例如可以降低TNF-a、TGF-pi和IL-6的含量。根據(jù)本發(fā)明，所用的的化橘紅優(yōu)選毛橘紅，更優(yōu)選毛橘紅的提取物，最優(yōu)選毛橘紅總黃酮?；偌t總黃酮，是指從中藥化橘紅中提取分離得到的一種有效化學(xué)部位，其中總黃酮的含量不低于80%，化學(xué)成分主要是黃酮和二氫黃酮，外觀為黃色固體粉末，易溶于水，可溶于甲醇。總黃酮可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的或常用的提取黃酮的方法制備而成，例如水提醇沉法，也可以按照其他現(xiàn)有技術(shù)的方法制備而成，例如中國專利申請(毛橘紅總黃酮及其提取方法和用途)200410051224.1所述的方法，優(yōu)選地，本發(fā)明的總黃酮可以按照包括如下步驟的方法得到(1)化橘紅藥材經(jīng)水提取、濃縮；(2)加乙醇至重量濃度為80%;(3)濾過，濾液濃縮；(4)加水，調(diào)PH值至1.5，冷藏72小時(shí)，分取沉淀，蒸餾水洗滌沉淀，6(TC烘干。本發(fā)明化橘紅總黃酮，可以作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物，其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏齊IJ、霜齊U、噴霧劑、滴齊IJ、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時(shí)可對片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二垸基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e—環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。5本發(fā)明的組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20齊IJ，如l-20袋或?；蚱?。本發(fā)明提供的化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷保護(hù)作用，以下為藥理實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以下實(shí)驗(yàn)以五子衍宗丸作為對照藥。有研究表明，五子衍宗丸能明顯防止乙醇性肝損傷大鼠模型的血清總膽固醇的降低及血清和肝內(nèi)甘油三醋的升高，肝脂變及肝組織壞死明顯減輕等藥理作用，能較好防治酒精性肝損傷。([l]李育浩，鄧響潮，吳清和，等.五子衍宗丸對乙醇性肝損傷大鼠脂質(zhì)代謝的影響.中國中藥雜志，1994;19(5):300-303.[2]黃順玲，謝晃君，文體端，等.抗脂肪肝沖劑對大鼠乙醇性肝損傷防治的實(shí)驗(yàn)研究.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2001;11(6):343-344.)試驗(yàn)例1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究1.實(shí)驗(yàn)藥物五子衍宗丸(安陽路德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)050901);化橘紅總黃酮(按照實(shí)施例l的方法自制，批號(hào)061129);紅星二鍋頭(55度，北京紅星酒業(yè)技術(shù)發(fā)展公司)。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境2.1動(dòng)物來源SPF級雄性SD大鼠，體重280-320g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK(粵)2006A015)。2.2詞養(yǎng)條件飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境設(shè)施合格證(NO:SYXK粵2003-002)，室溫25士2'C，濕度60±10%,自由飲水、進(jìn)食。顆粒飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3.方法SD大鼠93只，雄性，隨機(jī)分為6個(gè)組，空白對照組10只，模型組15只，陽性組(五子衍宗丸)15只，每天給藥劑量為0.182g/kg,相當(dāng)于60kg人臨床劑量；化橘紅提取物總黃酮低劑量組19只，每天給藥劑量為O.108g/kg，相當(dāng)于60kg人臨床劑量；中劑量組17只，每天給藥劑量為0.217g/kg，相當(dāng)于60kg人臨床劑量的2倍；高劑量組17只，每天給藥劑量為O.433g/kg，相當(dāng)于60kg人臨床劑量的4倍；每6只大鼠共飼于一個(gè)詞養(yǎng)籠內(nèi)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，每天灌胃給藥一次，除了空白對照組外，各組動(dòng)物每日藥后5小時(shí)加灌55度紅星二鍋頭2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂飼料喂飼，試驗(yàn)起、始即試驗(yàn)過程中按常規(guī)每周稱體重一次。64.結(jié)果4.1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型一般情況及肝功能指標(biāo)的影響4.1.1儀器與試劑4.1.1.1儀器全自動(dòng)生化檢測儀(意大利L0G0TECH公司產(chǎn)品，S/N:2003E1007113);UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼卡儀器有限公司，SQ0403010);組織勻漿儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司，產(chǎn)品批號(hào)XHF-1);數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司，型號(hào)冊-4)。4.1.1.2試劑ALT測定試劑盒(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)060901);AST測定試劑盒(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)060701);TC測定試劑盒(上海復(fù)旦江生物醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)060801);TG測定試劑盒(上海復(fù)旦江生物醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)0601101);HDL-C測定試劑盒(浙江東甌生物工程有限公司，批號(hào)2006040145)。4.1.1.3方法在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程觀察各組動(dòng)物的死亡率。給二鍋頭后第28天，動(dòng)物末次給藥2小時(shí)后(即禁食不禁水16小時(shí)后)，各組大鼠稱重，腹腔注射2X戊巴比妥鈉45mg/kg，腹主動(dòng)脈釆血后處死。剪取各組動(dòng)物肝組織，稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。采血30min后3000r/min離心，分離血清，供測定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。4.1.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠一般狀態(tài)的影響空白對照組大鼠毛發(fā)亮澤，動(dòng)作靈活，食欲和大便正常，無溏便，無死亡；模型組及給藥組大鼠在初期灌服酒精后均有流涎，體態(tài)呆板，嗜睡，精神萎靡，食欲減退，行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象，一般需要經(jīng)過6小時(shí)后才開始蘇醒，16小時(shí)后完全清醒，并表現(xiàn)為毛發(fā)光澤度差，體重增長緩慢，多數(shù)大鼠的大便較為稀爛。而藥物組大鼠在灌食酒精后醒酒時(shí)間較前者早，食欲較前者佳，實(shí)驗(yàn)后期上述表現(xiàn)減輕。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表l、表2、表3。表l化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠體重增長的影響(x±s)組別N基礎(chǔ)值N第一周N第二周對照組12264.9±20.012276.9±34.012295.3±17.5模型組14269.1±18.912281.6±17.211302.8±20.5陽性組14267.8±17.514278.2±21.514290.6±20.8低劑量組18259.4±20.516266.6±23.216280.2±21.1*中劑量組17265.6±14.315276.0±22.415281.7±26.5*高劑量組17270.4±24.216272.0±40.915286.9±25.37表l續(xù)化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠體重增長的影響(x±"組別N第三周N第四周對照組12324.1±16.8AA12353.2±18.8AA模型組8298.8±22.57319.7±13.5陽性組14308.1±25.814329.4±29.5低劑量組16294.6±22.015307.0±26.1中劑量組13299.3±34.913313.3±36.7高劑量組14304.3±23.614323.3±23.7注與對照組比較，"△"P〈0.05和P〈0.01;與模型組比較，"*"P〈0.05和"**P<0.01。表2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠飼料消耗量的影響(S±s)組別N第一周第二周第三周第四周對照組236.4±1.535.5±1.633.9±2.734.4±5.3模型組221.5±4.620.7±3.619.9±3.922.9±2.0陽性組221.3±4.419.1±5.121.3±3.520.0±4.2低劑量組322.6±2.620.5±3.220.5±1.421.8±2.5中劑量組321.5±2.923.1±1.922.0±2.620.1±3.1高劑量組323.4±2.821.0±1.622.4土3.921.0土3.8表3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠飲水量的影響(;c士s)組別N第一周第二周第三周第四周對照組235.4±2.936.7±1.237.5±3.541.7±2.4模型組225.1±1.224.5±4.325.3±1.926.5±0.3陽性組224.3±4.025.8±1.224.2±1.225.8±1.2低劑量組324.4±1.425.5±2.824.7±0.626.8±1.6中劑量組324.7±2.326.3±3.226.6±1.927.2±3.0高劑量組325.6±3.227.4±0.725.3±2.126.1±2.4注其中表l中N指每組大鼠的例數(shù)；表2和表3中N是指盒數(shù)。實(shí)驗(yàn)過程中總共有22只大鼠死亡，其中模型組有2只大鼠、陽性組有l(wèi)只大鼠、高劑量組有1只大鼠因誤入氣管或胃穿孔，即時(shí)死亡；剩余死亡大鼠是灌酒后第二天發(fā)現(xiàn)死亡的，8解剖未發(fā)現(xiàn)胸腔有瘀血或胃穿孔，死因不明，死前均表現(xiàn)為步履蹣跚、煩躁不安及陣發(fā)性抽搐等現(xiàn)象，各組大鼠死亡率統(tǒng)計(jì)見表4。表4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠的死亡率的影響組別劑量(g/kg)N剩余只數(shù)死亡率對照組—12120模型組15753%五子衍宗丸組i82151220%低劑量組0.108191521%中劑量組0.217171324%高劑量組0.4331714腦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物死亡率約為53%,而化橘紅總黃酮高、中、低劑量藥物死亡率分別為18%、24%和21%，可有效地降低酒精性肝損傷大鼠的死亡率。4.1.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響各組大鼠處死后剪取各組動(dòng)物肝組織，并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。表5化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響(;c土s)組別劑量(g/kg)N肝臟指數(shù)對照組—123.43±0.38**模型組—74.63±0.47五子衍宗丸組1.82123.69±0.45**低劑量組0.108154.13±0.33*中劑量組0.217133.76±0.59**高劑量組0.433143.99±0.69*注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(A0.05);林表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(;XO.Ol)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠的肝臟指數(shù)為(4.63±0.47)與對照組(3.43±0.38)比較，肝臟指數(shù)明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明具有顯著性差異(p<0.01)，說明模型組動(dòng)物的肝臟具有腫大的現(xiàn)象。化橘紅總黃酮低、中、高劑量組動(dòng)物的肝臟指數(shù)分別為(4.13±0.33)、(3.76土0.59)和(3.99土0.69)，與模型組比較，肝臟指數(shù)明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明具有顯著性差異(P〈0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有抑制肝臟腫脹的作用。94.1.4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清中ALT和AST的影響腹動(dòng)脈取血后分離血清，按試劑盒說明測定血清中的ALT、AST的含量(表6)。表6化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清中ALT和AST的影響(5±^)組別劑量NALTAST對照組—1296.8±19.7**42.4±8.2**模型組一7159.8±46.673.9±16.5五子衍宗丸組1.821285.8±23.l林50.6±19.5**低劑量組0.10815108.1±15.4**60.6±20.2**中劑量組0.2171399.5±17.3**53.3±22.1*高劑量組0.43314110.9±13.l林42.1±14.1**注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(/X0.05);**表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(/X0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血清中的ALT明顯升高，與對照組相比，具有顯著性差異(P〈0.01)，說明模型組動(dòng)物肝功能已經(jīng)受到損害，提示造模成功?；偌t總黃酮低、中、高劑量組動(dòng)物血清中ALT與模型組比較，都有不同程度的恢復(fù)，且均接近正常組水平，尤其以中劑量為明顯。結(jié)果提示化橘紅總黃酮對酒精造成的ALT異常具有一定的保護(hù)作用。各組動(dòng)物血清AST的變化與ALT基本相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物AST明顯升高，與空白組相比，差異具有顯著性(P〈0.01)。而各用藥組的AST與模型組相比都有不同程度的恢復(fù)，其中化橘紅總黃酮組以高劑量效果為佳，基本接近至正常對照組水平。以上結(jié)果提示，化橘紅總黃酮可恢復(fù)酒精造成的動(dòng)物肝功能，使受損的肝功能有所恢復(fù)，并逐漸接近正常水平。本研究中主要采用給予大鼠灌胃55度紅星二鍋頭2nil/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂飼料喂飼，共灌酒精4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該模型組動(dòng)物死亡率高達(dá)53%，另外動(dòng)物肝臟指數(shù)明顯增加，血清ALT與AST含量明顯增加，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該模型制作成功，由于該方法簡便，易于操作，可重復(fù)性強(qiáng)，因此可認(rèn)為該模型為制作慢性酒精性肝損傷的理想方法之一。本研究結(jié)果表明，化橘紅總黃酮可改善酒精性肝損傷動(dòng)物的死亡率，與模型組53%的死亡率相比較，化橘紅三個(gè)劑量組分別為21%、24%和18%。另外化橘紅總黃酮使腫大的肝臟指數(shù)明顯減少，具有抑制肝臟腫脹的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，化橘紅總黃酮可降低酒精性肝損傷動(dòng)物ALT和AST含量，與模型組相比，差異具有顯著性。104.1.6小結(jié)4.1.5.1采用給予大鼠灌胃55度紅星二鍋頭2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂飼料喂詞，共灌酒精4周。模型組大鼠與該正常組相比ALT、AST、TC升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異或顯著性差異，說明本方法是較為理想的制作慢性酒精性肝損傷模型的方法，具有操作簡便，時(shí)程短的優(yōu)點(diǎn)。4.1.5.2化橘紅總黃酮對慢性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用?？筛纳凭凭愿螕p傷模型大鼠一般情況，降低死亡率，抑制肝腫脹，降低血清降低酒精性肝損傷動(dòng)物ALT和AST含量，與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(;X0.05)或顯著性差異(/X0.01)。4.2對酒精性肝損傷大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂質(zhì)過氧化氧化指標(biāo)的影響4.2.1儀器、試藥與方法4.2.1.1儀器UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼卡儀器有限公司，SQ0403010);組織勻漿儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司，產(chǎn)品批號(hào)XHF-1);數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司，型號(hào)朋-4)。4.2.1.2試劑SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070108);MDA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070108);糖原測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070108);蛋白質(zhì)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070105)。4.2.1.3方法給二鍋頭后第28天，動(dòng)物末次給藥2小時(shí)后(即禁食不禁水16小時(shí)后)，各組大鼠稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉45mg/kg，腹主動(dòng)脈采血后處死。剪取各組動(dòng)物肝組織，制備肝組織勻漿，檢測肝組織中肝蛋白含量，肝糖原含量，MDA含量及S0D含量。4.2.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠的影響實(shí)驗(yàn)中各大鼠肝蛋白的測定4.2.2.l考馬斯亮蘭貯備液60mLXl瓶。臨用時(shí)按所需量用蒸餾水1:4稀釋，配成應(yīng)用液，4。C保存。4.2.2.2蛋白標(biāo)準(zhǔn):0.615g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液lmLXl支。-20。C冷凍保存20天。4.2.2.3測定方法取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱取0.2g左右的肝臟組織，按照重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，2000轉(zhuǎn)離心lOmin，然后取組織勻漿上清再用生理鹽水按l:9稀釋成10%組織勻漿。測定管取0.05raL樣品，加3.OmL考馬斯亮蘭顯色劑；標(biāo)準(zhǔn)管取0.05mL0.615g/L標(biāo)準(zhǔn)液，加3.OmL考馬斯亮蘭顯色劑?；靹?，靜置10min，于595nm處測定各管的OD值。11蛋白含量(g/L)=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度乂標(biāo)準(zhǔn)管濃度(g/L)4.2.2.4將測定后肝蛋白含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表8。表8化橘紅對酒精性肝損傷大鼠肝中蛋白含量的影響(S±x)組別N劑量(g/kg)蛋白含量(mg/g肝組織)對照組12—0.68±0.04模型組7一0.65±0.03五子衍宗丸組121.820.91±0.07**低劑量組150.1080.72±0.03**中劑量組130.2170.71±0.04**高劑量組140.4330.72±0.07*注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(/X0.05);襯表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(;KO.Ol)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化橘紅總黃酮各劑量組動(dòng)物肝臟中蛋白含量與模型組相比，具有顯著性差異(P〈0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有促進(jìn)大鼠肝臟蛋白的生成。4.2.3化橘紅總黃酮對酒精性大鼠肝臟中糖原的影響4.2.3.1測定方法堿溶液4(kLXl瓶，室溫保存。lmg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液5mLXl支，室溫保存。配制方法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水=1:99，配成0.01mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配，保存一天。顯色劑粉劑X6支，用時(shí)每支加25M198X濃硫酸，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存。取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱取75mg左右的肝臟組織，放進(jìn)玻璃試管中，按照重量體積比l:3加入試劑盒里的堿溶液，用保鮮膜將管口扎起，以防水分蒸發(fā)，同時(shí)在膜上用針頭扎一小孔，以便氣體熱脹冷縮。在沸水中煎煮20min進(jìn)行水解，然后用流水冷卻。冷卻后往試管里加入7.2mL(75mgX96=7200uL=7.2mL)的蒸餾水稀釋成1%肝糖元檢測液。測定管取0.lmLl^肝糖元檢測液，加入0.9mL的蒸餾水和2mL的顯色液；標(biāo)準(zhǔn)管取1.0mL0.01rag/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和2mL顯色劑?；靹蚝笾梅兴兄?min中，冷卻后于620nm波長，測定OD值。4.2.3.2計(jì)算公式糖元量(mg/g組織)二(測定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值)X標(biāo)準(zhǔn)管含量(O.Olmg)X樣本測試前稀釋倍數(shù)(100)X10(測試過程中的稀釋倍數(shù))/1.11(葡萄糖換算成糖原含量的系數(shù))124.2.3.3測定后統(tǒng)計(jì)分析肝臟中肝糖原的含量，結(jié)果見表9。表9化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟中肝糖原的影響(x±s)組別N劑量(g/kg)肝糖原(mg/g肝組織)對照組12一11.12±5.81**模型組7—27.10±16.24五子衍宗丸組121.8214.58±11.40*低劑量組150.10816.62±10.51*中劑量組130.21717.44±13.16高劑量組140.43315.85±4.56*注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(/X0.05);**表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(/X0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物中的肝糖原與對照組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)。化橘紅總黃酮低劑量組和高劑量組動(dòng)物的肝糖原與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有一定的促進(jìn)肝內(nèi)脂肪代謝的作用。4.2.4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝組織中MDA含量的影響4.2.4.1測定方法試劑一液體20mLXl瓶，室溫保存。試劑二液體12mLXl瓶，用時(shí)每瓶加340raL雙蒸水混勻，4'C冷藏。試劑三粉劑X1支，用時(shí)將粉劑加入到9010(TC的熱雙蒸水60mL中，充分溶解后用雙蒸水補(bǔ)足至60mL再加冷醋酸60mL，混勻，配好的試劑避光冷藏。標(biāo)準(zhǔn)品10nmol/mL四乙氧基丙烷5mLXl瓶，4。C冷藏。取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱取0.2g左右的肝臟組織，按照重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，2000轉(zhuǎn)離心10min，然后取組織勻漿上清再用生理鹽水稀釋成5%組織勻漿，按照試劑盒操作要求依次加入試劑，旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95。C水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500轉(zhuǎn)/min，離心10min，取上清液，532nm處，測定各管的吸光度。4.2.4.2計(jì)算公式肝組織中MDA含量計(jì)算公式組織中MDA含量(nmol/mgprot)=[(定管吸光度一測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)]X標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/mL)十蛋白含量(mgprot/ml)。134.2.4.3測定后統(tǒng)計(jì)分析肝組織中MDA的含量，結(jié)果見表10。表10化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝組織中MDA含量的影響(x±s)組別N劑量(g/kg)MDA(nmol/mgprot)對照組12—2.97±0.59**模型組7—5.41±1.59五子衍宗丸組121.823.01±0.82林低劑量組150.1083.80±1.44*中劑量組130.2173.32±0.98**高劑量組140.4333.05±1.07**注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(p〈0.05);**表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(p〈0.0D。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型動(dòng)物肝臟中MDA的含量與對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)?；偌t總黃酮各劑量組動(dòng)物肝臟中MDA的含量與模型組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有抗氧化的作用。4.2.5化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟中SOD的影響4.2.5.1測定方法-試劑一貯備液10mLXl瓶(天冷時(shí)或放冰箱會(huì)有部分結(jié)晶析出，需熱水浴溶解后再用)；試劑一應(yīng)甩液的配制用時(shí)每瓶加蒸餾水稀釋至IOOmL，4'C保存。試劑二液體IOmLXl瓶，4-IO'C保存。試劑三液體IOmLXl瓶，4-l(TC保存。試劑四液體350uLX2支，4'C保存，不可冷凍；4號(hào)稀釋液10mLXl瓶，4"C保存。用時(shí)二者按1:14稀釋，可以一次稀釋，也可以分次稀釋。配好的試劑四4'C保存，不可冷凍。配好后可保存2-3個(gè)月。注所用吸嘴最好為專用且消毒處理過。試劑五粉劑X1支，用時(shí)加70-8(TC熱雙蒸水75raL溶解后備用，若加熱過程中水分蒸發(fā)了，此時(shí)必須用雙蒸水補(bǔ)充至75mL，配好后的試劑避光4'C冷藏。試劑六粉劑X1支，用時(shí)加蒸餾水75mL溶解后備用，配好后的試劑避光4'C冷藏。顯色劑的配制按照試劑五試劑六冰醋酸=3:3:2的體積比配成顯色劑，4'C避光冷藏。取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱取0.2g左右的肝臟組織，按照重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻槳，2000轉(zhuǎn)離心10min，然后取組織勻漿上清再用生理14鹽水稀釋成1%組織勻漿，作為測試樣品。按照試劑盒要求加入試劑及顯色劑后混勻，室溫放置10分鐘，于550nm處比色，測定OD值。4.2.5.2計(jì)算公式:組織勻漿中SOD活力(U/mgprot)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度+50%X(反應(yīng)液總體積/取樣量(mL)}+組織中蛋白含量(mgprot/ml)。4.2.5.3測定后統(tǒng)計(jì)分析肝組織中S0D含的含量，結(jié)果見表l丄。表ll化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟中SOD的影響(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(;X0.05);林表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(;X0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝臟中SOD含量與對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)。化橘紅總黃酮各劑量組動(dòng)物肝臟中SOD的含量與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，并存在一定的劑量依賴關(guān)系，說明化橘紅總黃酮可能具有一定的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，化橘紅總黃酮可明顯升高酒精性肝損傷大鼠肝臟蛋白含量、降低肝糖元含量，改善受損的肝功能，推測其作用機(jī)理可能與以上提到的因素有關(guān)。本研究中模型大鼠肝組織S0D活力明顯降低，MDA含量明顯升高，說明氧化應(yīng)激已參與到慢性酒精肝的發(fā)病過程中。而化橘紅總黃酮可有效增加酒精性肝損傷動(dòng)物模型的SOD活力，并抑制肝組織MDA含量，結(jié)果提示化橘紅總黃酮的藥物作用機(jī)理可能與發(fā)揮抗氧化應(yīng)激有關(guān)。4.2.6小結(jié)4.2.6.1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝內(nèi)蛋白質(zhì)含量和肝糖原的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組動(dòng)物中的肝蛋白質(zhì)含量和肝糖原含量與對照組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)?；偌t總黃酮低劑量組和高劑量組動(dòng)物的肝糖原與模型組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有一定的促進(jìn)肝內(nèi)脂肪代謝的作用。4.2.5.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝臟中S0D和MDA含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型動(dòng)物肝臟中MDA的含量、S0D的含量與對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)。化橘紅總黃酮各劑量組動(dòng)物肝臟中MDA的含量、SOD的含量與模型組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有抗氧化的作用。4.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝組織病理的影響4.3.1儀器與試藥4.3.1.1儀器LeicaTB1020切片機(jī)；LeicaRM2135脫水機(jī)；OLYMPUSCX21顯微鏡。4.3.1.2試劑IO福爾馬林；2%伊紅染液；蘇木素染液；酒精。4.3.1.3.實(shí)驗(yàn)方法給二鍋頭后第28天，動(dòng)物末次給藥2小時(shí)后(即禁食不禁水16小時(shí)后)，各組大鼠稱重，腹腔注射2X戊巴比妥鈉45mg/kg，腹主動(dòng)脈采血后處死。于肝右葉切取0.2cmX0.2cmX0.5cm肝組織l塊，固定于4X的多聚甲醛中(固定時(shí)間大于48h)，用于制作石蠟切片。經(jīng)HE染色、脫水、透明、封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。4.3.1.4肝臟病理檢測標(biāo)準(zhǔn)，見表12。表12肝臟病理檢測標(biāo)準(zhǔn)肝細(xì)胞脂肪變性肝細(xì)胞炎癥肝細(xì)胞水腫程度脂肪變性肝細(xì)胞和泡沫細(xì)局部灶性水樣變，少細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)胞占肝細(xì)胞總數(shù)比<30%量小壞死灶細(xì)小紅染的顆粒脂肪變性肝細(xì)胞和泡沫細(xì)氣球樣變，多數(shù)小壞細(xì)胞體積增大，胞漿比較稀中度胞占肝細(xì)胞總數(shù)30%50%死灶，Mallory小體，疏局部PMN浸潤脂肪變性肝細(xì)胞和泡沫細(xì)變性壞死嚴(yán)重，橋接細(xì)胞高度腫脹似氣球，胞漿胞占肝細(xì)胞總數(shù)比>50%壞死，損傷廣泛成分基本都已溶解消失4.3.2結(jié)果4.3.2.l空白對照組肝臟病理檢測結(jié)果(圖l)。圖1是空白對照組肝臟病理切片圖。由圖1可見12例肝組織標(biāo)本鏡下均可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，界板平滑，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，竇內(nèi)皮細(xì)胞、儲(chǔ)脂細(xì)胞及枯否氏細(xì)胞未見增生。肝細(xì)胞胞漿紅染，核居中。匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，膽管未見明顯增生，纖維結(jié)締組織未見增生。4.3.2.2模型組肝臟病理檢測結(jié)果(圖2)。16由圖2可見7例肝組織中均可見中至重度脂肪變性，以中央靜脈中央?yún)^(qū)和中間區(qū)為主。其中6例為重度脂肪變性，伴局部肝細(xì)胞胞漿疏松化。另1例為彌漫性肝細(xì)胞水腫(胞漿疏松化為主，部分可見氣球樣變)，伴局部肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)小脂滴。7例肝組織中均見肝血竇及匯管區(qū)輕度炎細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞為主)，均見小膽管有不同程度的增生，其中2例見肝血竇明顯擴(kuò)張充血，2例見肝血竇局部擴(kuò)張，3例肝組織內(nèi)可見散在分布的多處小壞死灶。4.3.2.3陽性組肝臟病理檢測結(jié)果(圖3)。由圖3可見6例肝組織中可見輕至中度脂肪變性，以小葉周邊區(qū)多見，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪滴細(xì)小，以彌漫泡沫細(xì)胞為主要表現(xiàn)，其中2例中度脂肪變性，并可見散在點(diǎn)狀、小灶性肝細(xì)胞壞死。4例輕度脂肪變性。2例肝組織未見明顯脂肪變性。偶見部分肝細(xì)胞胞漿疏松化。8例肝組織小膽管均有不同程度的增生，肝血竇及匯管區(qū)輕度炎細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主)。4.3.2.4化橘紅總黃酮低劑量組肝臟病理檢測結(jié)果(圖4)。由圖4可見8例肝組織中可見輕至重度脂肪變性，以小葉周邊區(qū)多見。其中2例重度脂肪變性，見大范圍肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡；3例中度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪滴細(xì)小，以彌漫泡沫細(xì)胞為主要表現(xiàn)；3例輕度脂肪變性，見部分肝細(xì)胞內(nèi)散在小脂肪空泡。7例肝組織中可見不同程度的部分肝細(xì)胞胞漿疏松化，其中2例僅見少數(shù)中央靜脈周圍肝細(xì)胞胞漿疏松化，2例見肝血竇明顯擴(kuò)張充血，4例見部分肝血竇擴(kuò)張。其中9例肝組織均見血竇及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主)，伴散在分布的點(diǎn)狀、小灶性壞死和小膽管增生。l例除局部血竇擴(kuò)張外，未見明顯異常改變。4.3.2.5化橘紅總黃酮中劑量組肝臟病理檢測結(jié)果(圖5)。由圖5可見6例肝組織中可見輕至中度脂肪變性。其中2例中度脂肪變性，見大范圍肝細(xì)胞內(nèi)大小不等的脂肪空泡；4例輕度脂肪變性，見部分肝細(xì)胞內(nèi)散在細(xì)小脂肪空泡，以彌漫泡沫細(xì)胞為主要表現(xiàn)。6例肝組織中可見不同程度的部分肝細(xì)胞胞漿疏松化，其中3例見部分肝血竇擴(kuò)張。其中7例均見血竇及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主)，伴小膽管增生，17有1例還可見增生的纖維組織圍繞小膽管。5例肝組織可見少量散在分布的點(diǎn)狀、小灶性肝細(xì)胞壞死。4.3.2.6化橘紅總黃酮高劑量組肝臟病理檢測結(jié)果(圖6)。由圖6可見IO例肝組織中可見輕至中度脂肪變性。其中2例中度脂肪變性，見部分肝細(xì)胞內(nèi)較多小脂肪空泡，以彌漫泡沫細(xì)胞為主要表現(xiàn)；7例輕度脂肪變性，見肝細(xì)胞內(nèi)散在細(xì)小脂肪空泡。8例肝組織中可見不同程度的部分肝細(xì)胞胞漿疏松化，其中l(wèi)例比較嚴(yán)重，余累積范圍較小。9例均見血竇及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主)，伴小膽管增生。7例肝組織可見點(diǎn)狀、灶性肝細(xì)胞壞死。其中2例可見多處較大的壞死灶，5例僅見散在分布的點(diǎn)狀、小灶性壞死。4.3.2.7實(shí)驗(yàn)各組病理檢査結(jié)果匯總對以上各組病理檢查結(jié)果進(jìn)行匯總分析化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠的病理影響(表13)。表13化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠的影響實(shí)驗(yàn)肝臟病理檢查結(jié)果細(xì)胞脂肪變性(炎細(xì)胞浸潤與水腫小膽散在壞死)組別正常管增脂肪輕中重生空泡度度度輕度重度輕中重度<3030-5>50度度%0%%對照組73133模型組070162232陽性組1624212131低劑量組16222412中劑量組071423高劑量組0735114142本研究中采用55度北京紅星二鍋頭灌胃4周，合喂以高脂飼料制作慢性酒精性肝損傷模18型。光鏡下顯示正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰；實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞則出現(xiàn)廣泛性的空泡性變性，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞漿疏松、淺染，乃至清亮、透明，部分肝細(xì)胞呈典型的氣球樣變，證明所造大鼠ALD模型比較成功。研究結(jié)果提示化橘紅總黃酮對慢性酒精性肝損傷的病理改變有明顯的影響，使動(dòng)物脂肪變性病變減輕，表明藥物有明顯的抗肝脂肪變性的作用。4.3.3小結(jié)4.3.3.1模型組各例肝組織均可見中至重度脂肪變性等病變，提示酒精性肝損傷模型組復(fù)制成功。4.3.3.2陽性組、化橘紅總黃酮各劑量組動(dòng)物在降低肝細(xì)胞脂肪變性、減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和降低細(xì)胞水腫，且存在一定的劑量依賴關(guān)系，提示化橘紅總黃酮具有一定的護(hù)肝作用。4.4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響4.4.1儀器與試藥4.4.1.1儀器電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號(hào)PB203-N);離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)TDL-5-A);無菌超凈臺(tái)(蘇州凈化有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD);流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號(hào)FACSCalibur)。4.4.1.2i式劑AnnexinV-FITC(美國Biovision)。4.4.L3方法給二鍋頭后第28天，動(dòng)物末次給藥2小時(shí)后(即禁食不禁水16小時(shí)后)，各組大鼠稱重，腹腔注射2X戊巴比妥鈉45mg/kg，腹主動(dòng)脈采血后處死。于肝小葉切取200mg肝組織l塊，磨碎，200目篩網(wǎng)過濾，制成肝細(xì)胞懸液。1500rpm/min離心5分鐘，棄上清，Hank，s液洗兩次，每次1500rpm/min離心5分鐘。加入預(yù)冷的lmlPBS重懸細(xì)胞，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮。計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為lXl(r個(gè)/ml。取O.5ml細(xì)胞懸液，離心，棄上清。力卩50(^1BindingBuffer,混勻后加5jilAnnexinV-FITC和5plPI，室溫避光保存5min?？瞻讓φ战M多制備一管，力卩500plBindingBuffer,以不加AnnexinV—FITC及PI，作為陰性對照。Ex=488nm，Em=530nm，F(xiàn)ITC使用FL1通道，PI使用FL3通道，上流式細(xì)胞儀(FCM)測定肝細(xì)胞凋亡率。4.4.2結(jié)果各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝細(xì)胞凋亡圖見圖13-18。對各組肝細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響(表14)。由圖中可見，每個(gè)圖由一個(gè)大方框構(gòu)成。每個(gè)大方框中又由兩條相垂直的線，將大方框分為4個(gè)象限，都可看到l、2、3、4，這4個(gè)數(shù)字分別表示4個(gè)區(qū)域。PI標(biāo)記的是死細(xì)胞，F(xiàn)ITC標(biāo)記的是凋亡的細(xì)胞。FITC使用FL1通道，PI使用FL3通道。圖中，1區(qū)域表示PI表達(dá)陽性的，就是表示死的細(xì)胞，2區(qū)域應(yīng)表示PI和FITC表達(dá)雙陽性的，3區(qū)域表示，PI和FITC都是陰性的，都不表達(dá)的，4區(qū)域表示FITC表達(dá)陽性的，就是凋亡的細(xì)胞。所以，本實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞即是指4區(qū)域，數(shù)字越大，表示凋亡的越多。表14化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注"*"與模型組比較，/X0.01。表14顯示模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡率達(dá)到16.34±11.58，與對照組(5.0±0.77)相比較，具有顯著性差異(;XO.Ol)，說明酒精性肝損傷模型制作較為成功。五子衍宗丸組、高劑量組大鼠肝組織的凋亡率分別為(4.84±0.29)和(5.22±0.90)，與模型組比較，肝細(xì)胞的凋亡率有明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明各組間具有顯著性差異(;XO.Ol)，說明五子衍宗丸、化橘紅總黃酮高劑量可減少酒精性肝損傷的肝細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)肝組織的作用?；偌t總黃酮低劑量組和中劑量組凋亡率分別為(10.16±3.91)和(7.96士1.74)，盡管和模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，但也提示藥物組具有使酒精性肝損傷肝細(xì)胞凋亡率下降的趨勢。4.4.3.小結(jié)4.4.3.1在慢性酒精性肝損傷大鼠中可觀察到肝細(xì)胞凋亡明顯增加，說明細(xì)胞凋亡在酒精性肝病的致病過程中具有重要的意義。4.4.3.2化橘紅總黃酮高劑量組可明顯降低酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡率，提示藥物可能通過抑制模型動(dòng)物肝細(xì)胞凋亡而起到對抗肝損傷的治療作用。4.5化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型血清細(xì)胞因子含量的影響4.5.1.儀器與試藥4.5.1.1儀器BIO-RAD550微板酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；EPPE腦RF5415D離心機(jī)(德國EPPENDORF公司)；IKR-1型微型振蕩器(德國IKR公司)。4.5.1.2試劑大鼠TNFaELISA試劑盒(購自深圳晶美生物工程有限公司，批號(hào)FR訓(xùn)03);RATTGF-(31ELISA試劑盒(購自奧地利Bendermedsystems公司，批號(hào)BMS623);RATIL-6ELISA試劑盒(購自奧地利Bendermedsystems公司，批號(hào)BMS625)。4.5.1.3方法給二鍋頭后第28天，動(dòng)物末次給藥2小時(shí)后(即禁食不禁水16小時(shí)后)，各組大鼠稱重，腹腔注射2X戊巴比妥鈉45mg/kg，腹主動(dòng)脈采血后處死。采血30min后3000r/min離心，分離血清，供測定血清中的TNF-a、TGF-(31、IL-6含量。4.5.2結(jié)果4.5.2.1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-ct含量的影響按試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行大鼠血清TNF-ct的含量測定，得如下結(jié)果。4.5.2丄1大鼠血清TNF-ot含量ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定(圖7)由圖7可以看出，大鼠血清TNF-a含量與450nm吸光度值成正相關(guān)。線性方程式為y=0.0016x+0.242;線性相關(guān)指數(shù)R2=0.9779。各組樣品根據(jù)該線性方程換算含量。4.5.2丄2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-a含量的影響(圖8)化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-a含量的影響見圖8。由結(jié)果可知，模型組血清TNF-a含量明顯增高，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(;KO.Ol)。化橘紅總黃酮三個(gè)劑量組TNF-a含量與模型組相比，均有不同程度的降低，與模型組相比，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異&<0.01)。陽性藥組也可降低酒精性肝損傷大鼠的血清TNF-a含量，與模型組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(/K0.01)。4.5.2.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TGF-(31含量的影響按試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行大鼠血清TGF-卩1的含量測定，得如下結(jié)果。4.5.2.2.1大鼠血清TGF-pl含量ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定(圖9)由圖9可以看出，大鼠血清TGF-pl含量與450nm吸光度值成正相關(guān)。線性方程式為y=0.0184x-0.005;線性相關(guān)指數(shù)R2=0.9792。各組樣品根據(jù)該線性方程換算含量。4.5.2.2.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TGF-(31含量的影響(圖10)化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清TGF-pi含量的影響見圖lO。由結(jié)果可知，模型組血清TGF-pl含量明顯增加，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(;KO.Ol)?；偌t總黃酮三個(gè)劑量組TGF-P1含量與模型組相比，均有不同程度的減弱，其中以中劑量組為明顯，與模型組相21比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.Ol)，陽性藥五子衍宗丸組也呈明顯的減少酒精性肝損傷模型大鼠TGF-pi含量的趨勢，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.Ol)。4.5.2.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清IL-6含量的影響按試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行大鼠血清IL-6的含量測定，得如下結(jié)果。4.5.2.3.1大鼠血清含量IL-6ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定見圖11。由圖11可以看出，大鼠血清IL-6含量與450nm吸光度值成正相關(guān)。線性方程式為y=0.0003x+0.0409;線性相關(guān)指數(shù)R2=0.9996。各組樣品根據(jù)該線性方程換算含量。4.5.2.3.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清IL-6含量的影響(圖12)化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清IL-6含量的影響見圖12。由結(jié)果可知，模型組血清IL-6含量與空白組相比，有明顯增加的趨勢，但并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(p>0.05)?；偌t總黃酮三個(gè)劑量組IL-6含量與模型組相比，均有不同程度的減弱，其中以低劑量組為明顯，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。陽性藥五子衍宗丸組也呈明顯的減少酒精性肝損傷模型大鼠IL-6含量的作用，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本課題研究結(jié)果表明，酒精性肝損傷模型動(dòng)物的血清TNF-ouTGF-(31、IL-6含量明顯升高，提示在造模4周后，有可能肝損傷己經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維化。而采用化橘紅總黃酮治療后，血清TNF-cuTGF-pi、IL-6含量降低，與模型組比較大部分有顯著性差異(PO.01)或有差異(P<0.05)，說明化橘紅總黃酮有可能通過減少腫瘤壞死因子含量、抑制TGF-pi含量、降低IL-6含量，從而減輕肝臟炎癥、扭轉(zhuǎn)肝纖維化趨勢、改善肝臟病理等，控制肝損傷的進(jìn)一步發(fā)展，從而達(dá)到治療酒精性肝損傷的治療目的。4.5.3小結(jié)4.5.3.1采用55度紅星二鍋頭灌胃4周，配以高脂飼料，制作的慢性酒精性肝損傷模型，動(dòng)物血清進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)血清中TNF-a、TGF-(31和IL-6含量明顯增加。說明在慢性酒精性肝損傷過程中細(xì)胞炎癥因子含量增加，導(dǎo)致多種細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放，使肝組織損傷加重，同時(shí)有可能使肝損傷進(jìn)一步加重為肝纖維化。4.5.3.2采用化橘紅總黃酮治療后，可減低模型動(dòng)物的細(xì)胞因子含量，使肝臟炎癥減輕，肝功能恢復(fù)，同時(shí)有可能逆轉(zhuǎn)肝臟病理改變。5討論由酗酒所導(dǎo)致的肝臟疾病，目前己經(jīng)成為歐美青年的主要死因[1]'隨著我國居民生活方式、膳食結(jié)構(gòu)的改變和酒類產(chǎn)量的增加，人群中嗜酒者比例呈上升趨勢。1996年流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國12億人口巾酒民約3億，東北地區(qū)酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)的發(fā)病率高達(dá)20%。ALD已成為我國僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾患^。目前西醫(yī)治療該疾病以戒酒、對癥支持治療為主，而中醫(yī)在防治該病方面有獨(dú)到之處。積極開展屮醫(yī)藥防治ALD的研究，已成為肝病領(lǐng)域的新課題。化橘紅為廣東化州特產(chǎn)藥材，除用于化痰止咳外，清.趙學(xué)敏還提出該藥材具有"解酒寬同"作用，本研究主要考察了化橘紅主要有效部位總黃酮對酒精性肝損傷的防治作用，并對其機(jī)理進(jìn)行探討。5.1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型一般情況及肝功能指標(biāo)的影響5.1.1酒精性肝損傷模型的選擇目前對酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的了解很大程度上取決于動(dòng)物模型的可靠性和可重復(fù)性，以及模型與人類酒精性肝病的相似性。酒精性肝損傷的造模根據(jù)發(fā)病的病理過程分為急性肝損傷和慢性肝損傷兩種類型。急性酒精性肝損傷多為小鼠或大鼠以50至60度白酒或體積分?jǐn)?shù)為50-60的乙醇一次或多次經(jīng)口灌胃4.06.Og/kg，給予乙醇的時(shí)間通常為l周以內(nèi)，末次給予乙醇424h內(nèi)處死動(dòng)物，檢查肝功、肝組織的病理變化及脂質(zhì)過氧化等有關(guān)指標(biāo)。—4]。慢性酒精性肝損傷動(dòng)物模型也是以給予酒精為主進(jìn)行。Liber等用狒狒為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過液體食料飼喂酒精的方法造模，6個(gè)月可出現(xiàn)肝小葉中央靜脈周圍纖維化，23年后，1/3的動(dòng)物發(fā)生肝硬化。該模型與人類酒精性肝硬化極其相似，但由于動(dòng)物來源有限，價(jià)格昂貴，造模周期長，難以推廣應(yīng)用[112]。李舒丹等[5]、范建高等[6]、李東良等[7]、馮志強(qiáng)等[8]采用不同方式給動(dòng)物灌服酒精，均成功地建立了酒精性肝損傷模型。本研究中主要采用給予大鼠灌胃55度紅星二鍋頭2ml/100g的方法。除灌二鍋頭外，每日仍以充足的水分和高脂飼料喂飼，共灌二鍋頭4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該模型組動(dòng)物肝臟指數(shù)明顯增加，血清ALT與AST含量明顯增加，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該模型制作成功，由于該方法簡便，易于操作，可重復(fù)性強(qiáng)，因此可認(rèn)為該模型為制作慢性酒精性肝損傷的理想方法之一。5.1.2酒精性肝損傷的中醫(yī)病機(jī)認(rèn)識(shí)酒精性肝病在中醫(yī)古文獻(xiàn)中無確切病名記載，在各文獻(xiàn)中以"酒疸"、"脅痛"、"傷酒"、"酒癖"、"酒脹"、"酒鼓"等病名稱之。長期大量飲酒造成酒毒濕熱之邪內(nèi)蘊(yùn)不解。酒毒之邪傷人，壅塞中焦，釀痰生濕，痰阻氣機(jī)，而成肝郁之證。濕熱之邪，灼傷陰液，導(dǎo)致肝腎陰虛?？傊?，本病由于脾胃、肝、腎功能相互失調(diào)，終至氣、濕、痰、水、血內(nèi)停腹中，形成本虛表實(shí)，虛實(shí)夾雜之證[9-11]。5.1.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷的保護(hù)作用23化橘紅具有化痰活血的作用，可能使停積在腹中的積痰和瘀血得以消除，使酒精肝的病因得消，病位得去，因此，從中藥的主要功能來看，化橘紅應(yīng)當(dāng)具有治療酒精肝的作用，這也與《本草綱目拾遺》所載相吻合。本研究結(jié)果表明，化橘紅總黃酮可改善酒精性肝損傷動(dòng)物的死亡率，與模型組53%的死亡率相比較，化橘紅三個(gè)劑量組分別為21%、24%和18%。另外化橘紅總黃酮使腫大的肝臟指數(shù)明顯減少，具有抑制肝臟腫脹的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，化橘紅總黃酮可降低酒精性肝損傷動(dòng)物ALT和AST含量，與模型組相比，差異具有顯著性。5.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響5.2.1酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制研究ALD的致病因素單一，即長期大量的酒精攝入，但其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚不完全清楚?？赡芘c酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒性作用、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)和細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、內(nèi)毒素、遺傳多態(tài)性、與病毒的疊加作用等多種因素有關(guān)。機(jī)體攝入的酒精90%以上在肝臟代謝。經(jīng)過肝細(xì)胞內(nèi)(ADH)、微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(ME0S)和過氧化酶(CaUlase)氧化成乙醛，進(jìn)而氧化為乙酸。在對乙醇氧化的過程中引起氧化型的輔酶I(NAD)向還原型輔酶I(NADH)轉(zhuǎn)變.導(dǎo)致NADH/NAD比例增加，進(jìn)而影響NAD依賴的代謝過程，如枸椽酸循環(huán)、氨基酸氧化和脂肪酸的氧化代謝。NADH也抑制草酰乙酸、丙酮酸、磷酸二羥丙酮和糖原合成酶的活性，進(jìn)而干擾糖原異生過程，導(dǎo)致患者低血糖癥。氧化還原狀態(tài)的改變和代謝紊亂是酒精代謝過程中的急性改變，戒酒后可以逆轉(zhuǎn)[12]。大量研究已經(jīng)顯示乙醛在活體生理狀態(tài)下能與多種蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的和不穩(wěn)定的乙醛蛋白加合物(APA)""，其形成不但改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而且造成了蛋白質(zhì)功能異常，如蛋白酶失活、DNA修復(fù)蛋白功能障礙、GSH耗竭、線粒體損傷、氧利用障礙和膠原蛋白合成增加，乙醛誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷是ALD肝細(xì)胞氣球樣變的根本機(jī)制。而且可作為抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，引起肝細(xì)胞炎癥、壞死及纖維組織增生[14]。生理情況下，細(xì)胞內(nèi)存在著自由基的清除劑即抗氧化劑，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、維生素E等，可以隨時(shí)清除不斷生成的有害自由基，使自由基的生成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，病理情況下，由于活性氧生成過多或機(jī)體抗氧化能力不足，可引發(fā)氧化應(yīng)激(oxidativestresss)反應(yīng)。自由基可與生物膜內(nèi)多價(jià)不飽和脂肪酸作用，形成脂質(zhì)自由基和過氧化物，從而破壞生物膜的正常結(jié)構(gòu)和間接抑制膜蛋白功能、促進(jìn)自由基及其他代謝反應(yīng)、影響線粒體功能和促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性等，最終促進(jìn)炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致線粒體功能異常、干擾脂肪酸氧化、ATP生成減少，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。Sampey等""認(rèn)為酒精誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化發(fā)生在肝損傷的早期，脂質(zhì)過氧化可使機(jī)體對醛類毒性作用敏感性增強(qiáng)以及導(dǎo)致促炎和促纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，化橘紅總黃酮可明顯升高酒精性肝損傷大鼠肝臟蛋白含量及肝糖元含量，改善受損的肝功能，推測其作用機(jī)理可能與以上提到的因素有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)，在慢性酒精性肝損傷中，大鼠肝組織SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高，說明氧化應(yīng)激己參與到慢性酒精肝的發(fā)病過程中。而化橘紅總黃酮可有效增加酒精性肝損傷動(dòng)物模型的SOD活力，并抑制肝組織MDA含量，結(jié)果提示化橘紅總黃酮的藥物作用機(jī)理可能與發(fā)揮抗氧化應(yīng)激有關(guān)。5.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝組織病理的影響5.3.1酒精性肝損傷所致的肝組織病理改變乙醇進(jìn)人肝臟后，先氧化為乙醛，再氧化為乙酸，最后轉(zhuǎn)變?yōu)槎趸己退懦鲶w外。過量飲酒，大量乙醛對肝細(xì)胞有明顯的毒害作用，可直接或間接導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死及纖維化，同時(shí)還有肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的改變。肝細(xì)胞脂肪變性是酒精性肝損傷最早和最常出現(xiàn)的損傷形式。酗酒者約90%肝穿可見脂肪變性，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞胞漿內(nèi)見明顯脂滴。酒精性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松，淡染，呈水樣變性，若細(xì)胞進(jìn)一步腫大則呈氣球樣變性。常規(guī)病理切片可見胞漿內(nèi)有圓形空泡，閑為脂滴的主要成分為三酰甘油，在石蠟切片制片過程中被脂溶劑二甲苯溶掉，故在切片中僅留下圓形空泡，主要分布在小葉中央靜脈周圍。此外，酒精性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松，淡染，呈水樣變性；若細(xì)胞進(jìn)一步腫大則呈氣球樣變性，上述改變多位于小葉中心帶，呈灶狀分布[16]。5.3.2慢性酒精性肝損傷模型的復(fù)制本實(shí)驗(yàn)采用55度北京紅星二鍋頭灌胃4周，合喂以高脂飼料制作慢性酒精性肝損傷模型。光鏡下顯示正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰；實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞則出現(xiàn)廣泛性的空泡性變性，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，胞漿疏松、淺染，乃至清亮、透明，部分肝細(xì)胞呈典型的氣球樣變。以上結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[17—18]。以上結(jié)果證明，我們所造大鼠ALD模型比較成功，同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所造酒精性肝病動(dòng)物模型與以往模型相比，更接近于人類該疾病的發(fā)生過程，故該模型能夠應(yīng)用于人類對酒精性肝病的研究。5.3.3化橘紅總黃酮對大鼠慢性酒精性肝損傷病理形態(tài)的影響化橘紅總黃酮用藥后，動(dòng)物肝臟病理學(xué)檢查可見，小膽管明顯增生，散在脂肪空泡明顯增加，脂肪變性明顯減弱，細(xì)胞重度水腫的例數(shù)明顯減少，細(xì)胞炎癥狀態(tài)有所改善。研究結(jié)果提示化橘紅總黃酮對慢性酒精性肝損傷的病理改變有明顯的影響，使動(dòng)物脂肪變性病變減輕，提示藥物有明顯的抗肝脂肪變性的作用。5.4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞死亡過程。凋亡是正常細(xì)胞現(xiàn)象，但也可被許多外部因素激發(fā)，提示激活調(diào)亡控制基因的機(jī)制可以不同。肝細(xì)胞凋亡發(fā)生在肝發(fā)育和成人肝的肝細(xì)胞更新時(shí)，也發(fā)生在各種病毒性、免疫、腫瘤和藥物引起的肝臟疾病。5.4.l細(xì)胞凋亡與酒精性肝損傷在ALD患者肝活檢中發(fā)現(xiàn)Mallory小體和調(diào)亡標(biāo)志物同時(shí)出現(xiàn)在同一肝細(xì)胞內(nèi)，提示含Mallory小體的肝細(xì)胞可能以凋亡的方式被清除。Zhao「^等用末端核什酸轉(zhuǎn)移酶(Tdr)脫氧三磷酸卡復(fù)苷酸(dNTP)缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測，43例ALD患者肝活檢標(biāo)本中的肝細(xì)胞凋亡率為4%5.3%。長期給小鼠酒精飲食后可見鼠肝細(xì)胞中凋亡小體明顯增多，并伴有不同程度的肝損傷，如脂肪肝、炎癥等，表明在人類、動(dòng)物酒精誘發(fā)肝損傷的過程中確有肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在大鼠ALD的逐漸發(fā)展過程中，不僅凋亡的肝細(xì)胞不斷增加，而且肝細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性率也隨之上升。提示在ALD中肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及其再生修復(fù)同時(shí)存在。Z。il[淵等認(rèn)為，肝細(xì)胞凋亡在ALD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，ALD肝細(xì)胞凋亡代表在肝細(xì)胞增殖的刺激下肝臟的重塑，以維持肝臟的正常形態(tài)。在這種情況下肝細(xì)胞凋亡與肝損傷再生密切相關(guān)，以保持細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖平衡。為證實(shí)肝細(xì)胞凋亡在ALD中的作用，在Ziol『，等的臨床研究中，ALD患者肝活檢中均可見肝細(xì)胞調(diào)亡，凋亡率在0.3%-28%，平均凋亡率為6.2%，并且肝細(xì)胞氣球樣變性與凋亡、中性粒細(xì)胞浸潤無關(guān)，表明凋亡是ALD肝細(xì)胞死亡的主要形式。Natori等P"認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是ALD的重要病理特征，在他們的研究屮AH組肝細(xì)胞凋亡率是正常對照組的6倍[(0.33±0.04)-(2.0±0.31)]，ALD組caspase表達(dá)強(qiáng)陽性，對照組則為陰性，并且肝細(xì)胞凋亡率與肝損傷的生化指標(biāo)(如AST、TBIL)及組織病損程度相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)凋亡在ALD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。5.4.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝損傷大鼠模型組肝細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明細(xì)胞凋亡是該模型中肝細(xì)胞損傷的主要形式，與Ziol等人的研究結(jié)果相一致?；偌t總黃酮高劑量組可明顯降低模型動(dòng)物肝細(xì)胞凋亡率，提示藥物治療可能通過抑制細(xì)胞凋亡率而達(dá)到減少肝細(xì)胞死亡的效果?；偌t總黃酮中低劑量組雖然未表現(xiàn)出明顯的降低模型動(dòng)物肝細(xì)胞凋亡率的作用，但也表現(xiàn)出明顯的降低趨勢，推測與藥物使用的劑量有關(guān)。化橘紅總黃酮抑制酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。5.5化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型血清細(xì)胞因子含量的影響5.5.1TNF-a與酒精性肝損傷腫瘤壞死因子(TNF)還稱為惡液素，這是因?yàn)樗芤鸺毙曰蚵愿腥緞?dòng)物的惡液質(zhì)狀態(tài)。TNFct的生物學(xué)活性非常復(fù)雜，包括對造血、免疫和炎癥的調(diào)節(jié)；對血管和凝血的影響和對多種器官的作用等。TNF-ot對不同的細(xì)胞有不同的作用殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)敏感細(xì)胞凋亡，快速、強(qiáng)烈、不可逆的抑制紅細(xì)胞系前體和紅系、粒系腫瘤細(xì)胞的生長等。ALD病人循環(huán)中TNF-ot水平增高，且TNF-a與酒精性肝損傷的生化指數(shù)相關(guān)。TNF-ct在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中也占有重要地位，它在肝臟主要由激活的Kuffer細(xì)胞產(chǎn)生，并作為一個(gè)關(guān)鍵因子參與各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。TNF-a被普遍認(rèn)為是酒精相關(guān)性肝壞死性炎癥發(fā)病機(jī)制中的最后共同通路。研究認(rèn)為，酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞因子在肝臟的炎癥中發(fā)揮作用，ALD患者血漿和肝臟促炎細(xì)胞因子增多24倍。75。/q的患者IL-ip、IL-8(中性粒細(xì)胞趨化因子)、TNF-a、TGF-(3水平增高，而IL-4水平下降，肝細(xì)胞通過與TNF-a結(jié)合后通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起肝細(xì)胞壞死和凋亡[22]。ALD病人循環(huán)中TNF-a水平增高，且TNF-(x與酒精性肝損傷的生化指數(shù)相關(guān)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)在大鼠ALD模型的研究中發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)TNF-amRNA增高的水平與肝臟病理損傷的程度相關(guān)。趙世義[23]的研究發(fā)現(xiàn)，不論是哪一種類型的酒精性肝病，所測血清中TNF-a的水平均高于對照組，這與KamimumP"發(fā)現(xiàn)在大鼠慢性飲酒模型中大鼠血清TNF-a僅的水平升高相一致。目前，認(rèn)為TNF-(x在ALD發(fā)病機(jī)制中的作用有P5、(l)介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡；(2)觸發(fā)炎癥反應(yīng)；(3)促進(jìn)肝纖維化；(4)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂；(5)與ald發(fā)病的性別差異有關(guān)；(6)與氧化應(yīng)激有關(guān)。本課題研究結(jié)果表明，酒精性肝損傷模型動(dòng)物的血清TNF-a含量明顯升高，與張維麗[26]、洪鐘淑[27]、陳克河[28]等人的研究結(jié)果一致。而采用化橘紅總黃酮治療后，血清TNF-a含量明顯降低。說明藥物有可能通過減少腫瘤壞死因子含量，從而減輕肝臟炎癥，控制肝損傷的進(jìn)一步發(fā)展，從而達(dá)到治療酒精性肝損傷的治療目的。5.5.2TGF-p與酒精性肝損傷TGF-p(轉(zhuǎn)化生長因子)是近年公認(rèn)的促膠原合成因子，具多功能的調(diào)節(jié)作用，在全身各臟器尤其是肝臟纖維化疾病中起著關(guān)鍵性的作用。TGF-(J在肝損傷中的作用機(jī)制為促進(jìn)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與沉積P9、抑制ECM的降解PW。研究表明，慢性乙型肝炎及肝硬變患者血清TGF-(i水平明顯升高[w，并按慢性乙型肝炎輕、中、重度、肝硬變依次升高；TGF-p與血清PCNA、LN、M水平呈正相關(guān)并隨肝組織纖維化程度的加重而增加。秋水仙堿、活血軟肝丹處理后的動(dòng)物血清及肝組織TGF-(3水平均較模型組明顯下降，而活血軟肝丹作用更明顯，這可能是活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)方藥的作用機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明，酒精性肝損傷大鼠血清TGF-pi含量較空白對照組明顯增加，提示在造模4周后，有可能肝損傷已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維化，而TGF-pi是其中的主要標(biāo)志。采用化橘紅總黃酮治療后，中劑量組可明顯降低血清TGF-I31含量，說明藥物可能通過抑制TGF-(31含量，扭轉(zhuǎn)肝纖維化趨勢，改善肝臟病理。5.5.3IL-6和酒精性肝損傷在酒精性肝病中，IL-6(白介素-6)活性改變越明顯，纖維化的程度越重，其病情越重，預(yù)后越差。IL-6的活性改變與酒精性肝病的肝纖維化呈正相關(guān)。IL-6作為肝細(xì)胞剌激因子，可直接刺激肝細(xì)胞增生分泌膠原；刺激儲(chǔ)脂細(xì)胞增生并合成膠原、層粘蛋白和蛋白多糖；刺激肝細(xì)胞、儲(chǔ)脂細(xì)胞和枯否細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，弓l起這些細(xì)胞因子的致纖維作用；也可促進(jìn)a2-巨球蛋白表達(dá)，抑制膠原酶活性，減少膠原蛋白降解使膠原沉積，促使肝纖維化形成[32]。在酒精性肝病中，IL-6活性改變越明顯，HA、LN、PC-III、IVC的水平越高，纖維化的程度越重，其病情越重，預(yù)后越差。IL-6的活性改變與酒精性肝病的肝纖維化呈正相關(guān)。王瑞科M等的研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝病患者血清IL-6含量較正常組明顯增加。本研究結(jié)果表明，酒精性肝損傷大鼠血清IL-6含量增高，采用化橘紅總黃酮治療后，低劑量組可明顯降低血清IL-6含量，說明藥物治療組有可能通過減少炎癥細(xì)胞因子的含量，從而減輕肝臟炎癥，改善肝功能。6結(jié)論本文從動(dòng)物整體、組織、細(xì)胞、分子等不同水平進(jìn)行了化橘紅總黃酮抗酒清性肝損傷研究，化橘紅總黃酮表現(xiàn)出較好的肝臟保護(hù)作用，對酒精性肝損傷有較好的預(yù)防作用。這與《本草綱目拾遺》中"化橘紅……醒酒寬中……"的記載相一致，亦驗(yàn)證了《中華人民共和國藥典》2005版中"化橘紅用于……食積傷酒……"的功能。6.1化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型一般情況及肝功能指標(biāo)的影響采用給予大鼠灌胃55度紅星二鍋頭2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂飼料喂詞，共灌酒精4周。該方法是較為理想的制作慢性酒精性肝損傷模型的方法，具有操作簡便，時(shí)程短的優(yōu)點(diǎn)。化橘紅總黃酮對慢性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用?？筛纳凭凭愿螕p傷模型大鼠一般情況，降低死亡率，抑制肝腫脹。6.2化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂質(zhì)過氧化氧化指標(biāo)的影響模型組動(dòng)物中的肝蛋白質(zhì)含量和肝糖元含量與對照組比較，具有顯著性差異(P〈0.05)?；偌t總黃酮低劑量組和高劑量組動(dòng)物的肝糖原與模型組比較，具有顯著性差異(P〈0.05),說明化橘紅總黃酮可能具有一定的促進(jìn)肝內(nèi)脂肪代謝的作用。模型動(dòng)物肝臟中MDA的含量、SOD的含量與對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)?；偌t總黃酮各劑量組動(dòng)物肝臟中MDA的含量、SOD的含量與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，說明化橘紅總黃酮可能具有抗氧化的作用。6.3化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝組織病理的影響模型組各例肝組織均可見中至重度脂肪變性等病變，提示酒精性肝損傷模型組復(fù)制成功；中藥提取物的各治療組脂肪變性病變有明顯減輕，提示中藥提取物有明顯的抗肝脂肪變作用。6.4化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型肝細(xì)胞凋亡的影響在慢性酒精性肝損傷大鼠中可觀察到肝細(xì)胞凋亡明顯增加，說明細(xì)胞凋亡在酒精性肝病的致病過程中具有重要的意義；化橘紅總黃酮高劑量組nj明顯降低酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡率，提示藥物可能通過抑制模型動(dòng)物肝細(xì)胞凋亡而起到對抗肝損傷的治療作用。6.5化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠模型血清細(xì)胞因子含量的影響采用56度紅星二鍋頭灌胃4周，配以高脂飼料，制作的慢性酒精性肝損傷模型，動(dòng)物血清進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)血清中TNF-a、TGF-(31和IL-6含量明顯增加。說明在慢性酒精性肝損傷過程中細(xì)胞炎癥因子含量增加，導(dǎo)致多種細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放，使肝組織損傷加重，同時(shí)有可能使肝損傷進(jìn)一歩加重為肝纖維化。采用化橘紅總黃酮治療后，可減低模型動(dòng)物的細(xì)胞因子含量，使肝臟炎癥減輕，肝功能恢復(fù)，同時(shí)有可能逆轉(zhuǎn)肝臟病理改變。圖1是空白對照組肝臟病理切片圖圖2模型組肝臟病理切片圖圖3五子衍宗丸組肝臟病理切片圖圖4化橘紅總黃酮低劑量組肝臟病理切片圖圖5化橘紅總黃酮中劑量組肝臟病理切片圖圖6化橘紅總黃酮高劑量組肝臟病理切片圖圖7大鼠血清TNF-a含量ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠TNF-a含量的影響注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(;X0.05);林表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(;XO.Ol)圖9大鼠血清TGF-e1含量ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖10化橘紅總黃酮對灑精性肝損傷大鼠血清TGF-e1含量的影響注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P<0.05);**表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(p〈0.01)圖11大鼠血清IL-6含量ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖12化橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠血清IL-6含量的影響注*表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(p〈0.05);林表示與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(p<0.01)圖13是空白對照組細(xì)胞凋亡圖圖14是模型組細(xì)胞凋亡圖圖15是五子衍宗丸組細(xì)胞凋亡圖圖16是化橘紅總黃酮低劑量組細(xì)胞凋亡圖圖17是化橘紅總黃酮中劑量組細(xì)胞凋亡圖圖18是化橘紅總黃酮高劑量組細(xì)胞凋亡圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，下述各實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。實(shí)施例l化橘紅總黃酮的制備毛橘紅藥材加水提取，濃縮至藥材lg/ml，加乙醇至重量濃度為80%，濾過，濾液濃縮至藥材2g/ml，加水至生藥濃度為0.4g/ml，調(diào)PH值至1.5，冷藏72小時(shí)，分取沉淀，蒸鎦水洗滌沉淀，6(TC烘干即可?？傸S酮的測定方法和結(jié)果采用高效液相色譜(HPLC)法制備總黃酮的指紋圖譜，化學(xué)成分主要是黃酮和二氫黃酮，其中柚皮苷與野漆樹苷含量較高，以其中柚皮苷與野漆樹苷為指標(biāo)成分進(jìn)行測定，合計(jì)占總黃酮的85%以上。實(shí)施例2化橘紅總黃酮的制備取毛橘紅粉末(過四號(hào)篩)2g，加石油醚500ml，超聲波提取45min，棄去石油醚液，待樣品中殘存的石油醚全部揮去后，加甲醇500ml超聲波提取30min，過濾，即得?？傸S酮的測定方法和結(jié)果采用高效液相色譜(HPLC)法制備總黃酮的指紋圖譜，化學(xué)成分主要是黃酮和二氫黃酮，其中柚皮苷與野漆樹苷含量較高，以其中柚皮苷與野漆樹苷為指標(biāo)成分進(jìn)行測定，合計(jì)占總黃酮的83%以上。實(shí)施例3化橘紅總黃酮的制備取毛橘紅粉末(過四號(hào)篩)，用70%乙醇提取3次，每次加6倍溶劑、提取1.5h,提取物經(jīng)大孔樹脂吸附處理后噴霧干燥,所得總黃酮?？傸S酮的測定方法和結(jié)果采用高效液相色譜(HPLC)法制備總黃酮的指紋圖譜，化學(xué)成分主要是黃酮和二氫黃酮，其中柚皮苷與野漆樹苷含量較高，以其中柚皮苷與野漆樹苷為指標(biāo)成分進(jìn)行測定，合計(jì)占總黃酮的86%以上。實(shí)施例4化橘紅總黃酮分散片的制備化橘紅總黃酮34.25%,MCC34.25%，CMS-NA20.55%，PVPP8.22%，硬脂酸鎂0.68%，十一烷基磺酸鈉0.68%，微粉硅膠1.37%，各原輔料分別過100目篩后，將毛橘紅總黃酮粉末與MCC、CMS-N混勻，加入0.5。/。PVP水溶液制成軟才，30目制粒后，加入其他輔料，壓制成片劑，控制片劑硬度在4.5kg力左右，即得淡黃色分散片。實(shí)施例5化橘紅總黃酮滴丸的制備取化橘紅總黃酮30g及聚乙二醇-600060g,水浴溶化，化勻后，移至滴丸機(jī)中，制成1000粒滴丸。實(shí)施例6化橘紅總黃酮片劑的制備取化橘紅總黃酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常規(guī)方法制成片劑200片。實(shí)施例7化橘紅總黃酮顆粒劑的制備取化橘紅總黃酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常規(guī)方法制成顆粒劑125袋。實(shí)施例8化橘紅總黃酮膠囊的制備取化橘紅總黃酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常規(guī)方法灌制膠囊。英文縮寫的中文全稱ADH:乙醇脫氫酶；CAT:過氧化氫分解酶；MEOS:肝微粒體乙醇氧化酶系；ALDH:乙醛脫氫酶。參考文獻(xiàn)[I]MccullughAj|OconnorJF.Alcoholicliverdisease:proposedrecommendationgsfortheAmericancollegeofGastroenterology.AMJGastrOenterOlOgy，1998:93(11):2002-2036.葉永安，田德祿.中西藥治療酒精性肝病研究思路探討、中國中醫(yī)藥信息雜志，1996;3(11):12.童英,姚小蔓,吳少平.乙醇誘發(fā)急性肝損傷生物標(biāo)記的探討.中國食品衛(wèi)生雜志，1999:11:12-14.朱平生，龐亞麗,王宇亮,等.大鼠急性酒精性肝損傷模型的脂質(zhì)過氧化損傷觀察.中華中醫(yī)藥雜志，2006;21(6):376-377.LieberCS,MendelsonJJ,DecaxliLM.Fattyliver,hyperlipemiaandhyperuricemiaproducedbyprolongedalcoholconsumption.despiteadequatedietaryintake.TransASS0SAmPhysician，1963:76(1):289-293.李舒丹，厲有名，虞朝輝.大鼠慢性酒精性肝損傷模型的建立.哲汀.醫(yī)學(xué),2002;(9):524—525.范建高，曾民德，李繼強(qiáng),等，脂肪肝與肝纖維化關(guān)系的實(shí)驗(yàn)觀察.中華醫(yī)學(xué)雜志，1998;78(10):758-759.李東良，王玉玫,大鼠酒精性肝損傷模型的建立及病理學(xué)觀察.實(shí)用肝臟病雜志，1998;3(4):207-208.馮忐強(qiáng)，沈志祥，譚詩云,等.大鼠急性酒精性脂肪肝造模方法的改進(jìn).世界華人消化雜志，2003;11(8):1189-1192.任延明.酒精性肝病的中醫(yī)病機(jī)淺探.青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004;25(2):140-141.丁霞，田得祿，姚雪彪.中醫(yī)對酒精性肝纖維化的認(rèn)識(shí).中華中醫(yī)藥雜志，2006;26(1):50-53.武正權(quán),林平.酒精性肝病的中醫(yī)藥研究概述.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2006;6(1):85-87.[13]趙可，李繼民.酒精性肝病的研究進(jìn)展.實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2006;7(12):197-200.[14]TUMADJ，CASEYCA.DangerousByproductsofAlcoholBreakdownFocusonAdducts.AlcoholResHealth,2003;27(4):285-290.LIMSP，BATTAKB.CalciphylaxisinaPatientwithAI_coholiLiverDiseaseintheAbsenceofRena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