專利名稱：：四角蛤蜊提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種四角蛤蜊提取物，及其制備方法和在制藥上的應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：四角蛤樹(JW"ac/m)，又叫方形馬珂蛤、白蛤或四角蛤，俗稱白蜆子、泥蜆子、布鴒頭，是一種常見的海生軟體動物，廣泛分布于我國南北沿海海域。屬于軟體動物門，瓣鰓綱，真瓣鰓目，蛤蜊科。貝殼略呈四角形，兩殼相等，側(cè)膨脹，殼面光滑呈白色。斧足發(fā)達，無足絲，生活于淺海泥沙中。江蘇沿海多灘涂，四角蛤蜊為優(yōu)勢貝類，已實現(xiàn)了大規(guī)模人工養(yǎng)殖，產(chǎn)量高達每年80000噸。四角蛤蜊是一種重要的食用經(jīng)濟貝類，其軟體肉嫩鮮美，營養(yǎng)豐富，內(nèi)含蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，鈣、鐵、磷及多種維生素。四角蛤蜊不僅可以食用，還具有藥用、保健價值。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為蛤蜊味咸、性寒、無毒，歸胃、肝、膀胱經(jīng)，有多種的主治功能。關(guān)于四角蛤蜊的研究主要集中于食品加工、增養(yǎng)殖、種屬界定等方面。國內(nèi)外針對四角蛤蜊的開發(fā)應(yīng)用多見以軟體為原料加工罐頭、調(diào)味品、飼料添加劑等，而以藥效功能為目標的四角蛤蜊的醫(yī)藥、保健品研究開發(fā)較少。四角蛤竭活性物質(zhì)研究多集中在小分子化學成分(如?；撬岷虴PA),對其生物活性大分子提取物，諸如蛋白質(zhì)和多糖的研究報道較少。目前市場上未見關(guān)于四角蛤樹提取物的藥物和保健品。三、
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明公開了一種四角蛤蜊提取物，同時公開了該提取物的制備方法、以及該提取物在制備降血糖、調(diào)節(jié)免疫和保護肝臟藥物或保健食品中的應(yīng)用。技術(shù)方案一種四角蛤蜊提取物，由以下方法制得取四角蛤樹軟體部位為原材料，洗凈、絞碎，加水煎煮，濾過，得水煎煮提取液，將水煎煮提取液離心，收集上清液，濃縮，濃縮液冷卻后加乙醇沉淀，濾過，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。上述的四角蛤蜊提取物的制備方法，可進一步包括純化步驟取所述乙醇沉淀物溶于水中，脫蛋白，收集脫蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脫蛋白的四角蛤測提取物。上述的四角蛤蜊提取物的制備方法，加水煎煮步驟循環(huán)進行1-3次，每次加水與四角蛤姊J軟體原材料的質(zhì)量比為2:1-5:1，每次提取時間為30-120分鐘。上述四角蛤樹提取物的制備方法，加乙醇沉淀步驟為在攪拌情況下加入乙醇，至乙醇在沉淀體系中的質(zhì)量百分含量為60-90°/。。上述的四角蛤樹提取物的制備方法，脫蛋白步驟使用蛋白酶法，或離子交換柱層析法。如上所述的四角蛤蜊提取物在制備降血糖藥物或保健品中的應(yīng)用。如上所述的四角蛤蜊提取物在制備調(diào)節(jié)免疫藥物或保健品中的應(yīng)用。如上所述的四角蛤樹提取物在制備護肝藥物或保健品中的應(yīng)用。上述的四角蛤蜊提取物的應(yīng)用，所述藥物和保健品中添加制劑學和食品學中上允許添加的其他輔料和添加劑，制成常規(guī)的制劑形式。有益效果本發(fā)明公開了一種四角蛤姊J提取物，該提取物由以下方法制備取四角蛤蜊軟體部位為原材料，洗凈、絞碎，加水煎煮，濾過，得水煎煮提取液，將水煎煮提取液離心，收集上清液，濃縮，濃縮液冷卻，加乙醇沉淀，濾過，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。該方法以中藥理論指導的提取分離為技術(shù)手段，得到了具有功能活性的四角蛤州提取物，該提取物主要是四角蛤蜊多糖。上述制備方法還進一步包括純化步驟取所述乙醇沉淀物溶于水中，脫蛋白，收集脫蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脫蛋白的四角蛤蜊提取物。通過純化步驟，能夠明顯的提高提取物中有效物質(zhì)__四角蛤竭多糖的含量。作為本發(fā)明的一個優(yōu)選上述加水煎煮步驟循環(huán)進行1-3次，每次加水與四角蛤姊J軟體原材料的質(zhì)量比2:1-5:1,每次提取時間為30-120分鐘。該優(yōu)選操作步驟的實施，在保證四角蛤蜊多糖提取得率較高的同時，既簡化了操作，又降低了能耗，節(jié)約了成本。作為本發(fā)明的另一個優(yōu)選，上述加乙醇沉淀步驟的方法為在攪拌情況下加入乙醇，至乙醇在沉淀體系中的質(zhì)量百分含量為60-90%。該優(yōu)選操作能明顯的提高四角蛤蜊提取物的得率。作為本發(fā)明的還一個優(yōu)選，上述脫蛋白步驟使用蛋白酶法、離子交換柱層析法。該優(yōu)選操作方法不對四角蛤蜊提取物引入其它對人體有毒的成分，生產(chǎn)操作簡單，環(huán)保衛(wèi)生。上述方法制得的該四角蛤姊J提取物主要由多糖和蛋白質(zhì)組成，其中多糖總含量為70-100%,蛋白質(zhì)和其他成分低于30°/。。本發(fā)明還涉及上述四角蛤蜊提取物在制備藥物或保健品中的應(yīng)用，具體來說公開了該種四角蛤蜊提取物具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫力和保護肝臟的活性。本發(fā)明通過藥效學實驗對上述四角蛤蜊提取物的降血糖、調(diào)節(jié)免疫和保護肝臟活性進行了驗證，結(jié)果證實該種四角蛤蜊提取物能夠改善正常小鼠和糖尿病小鼠的口服糖耐量(0GTT),降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平而對正常小鼠的空腹血糖水平無影響，明顯改善化學性糖尿病小鼠的肝腎腫脹而對正常小鼠臟器指數(shù)無影響，明顯抑制正常小鼠糖異生引起的血糖升高；四角蛤蜊粗提取物能夠顯著增強正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，能夠提高免疫力低下小鼠的血清溶血素水平，顯著降低二硝基氯苯51起的低疫力小鼠的耳腫脹率；四角蛤蜊提取物明顯降低四氯化碳所致肝損傷引起的ALT和ALT水平升高，表現(xiàn)出較強的護肝活性。具體實施例方式以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)視為是對本發(fā)明的限定。一、四角蛤測提取物的制備2007年7月至2008年6月期間，每月在江蘇啟東呂四港鎮(zhèn)水產(chǎn)養(yǎng)殖場采收三貝齡的四角蛤測，通過測量所采收的四角蛤樹的選出肉率、蛋白質(zhì)和多糖含量，得出6和7月份采收的四角蛤蜊品質(zhì)最優(yōu)。據(jù)此確定以6-7月份江蘇沿海采收的三貝齡四角蛤樹為產(chǎn)品原料，制備降血糖四角蛤姊]提取物。以下為具體的實施方式。實施例1:取新采收的活體四角蛤蜊，除去外殼，得軟體部位原材料5kg,洗凈泥砂，瀝干后絞碎。沸水煎煮重復提取3次，每次加水IOkg,每次煎煮提取30分鐘，用200目濾布濾過，收集濾液。煎煮液于離心機在4000rmp轉(zhuǎn)速下離心，得上清液，濃縮至約5L,冷卻后中加入質(zhì)量濃度95%的乙醇，使體系乙醇含量達到50%,攪勻，-l(TC下靜置12小時進行沉淀，抽濾，得白色絮狀沉淀物。沉淀物用于60°C真空箱中干燥64小時，得淺棕色四角蛤蜊提取物。實施例2:取新采收的活體四角蛤測，除去外殼，得軟體部位原材料5kg,洗凈泥砂，瀝干后絞碎。沸水煎煮重復提取2次，每次加水15kg,每次煎煮提取60分鐘，用200目濾布濾過，收集濾液。煎煮液于離心機在4000rmp轉(zhuǎn)速下離心，得上清液，濃縮至約5L，濃縮液冷卻加入質(zhì)量濃度95°/。的乙醇，使體系乙醇含量達到90%,攪勻，-l(TC下靜置12小時進行沉淀，抽濾，得白色絮狀沉淀物。沉淀物用于80°C烘箱中干燥48小時，得棕黃色四角蛤蜊提取物。實施例3:取新采收的活體四角蛤網(wǎng)，除去外殼，得軟體部位原材料5kg,洗凈泥砂，瀝干后絞碎。沸水煎煮循環(huán)提取2次，第一次加水15kg,第二次加水10kg，每次煎煮60分鐘，用200目濾布濾過，收集濾液。濾液于離心才幾在4000r即轉(zhuǎn)速下離心，得上清液，濃縮至約5L,濃縮液冷去后加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使體系乙醇含量達到80%,攪勻，-10。C下靜置6小時進行沉淀，抽濾，得白色絮狀沉淀物。沉淀物轉(zhuǎn)入冷凍干燥才幾中，-25°C凍干48h,得乳白色塊狀四角蛤竭提耳又物。實施例4:取新采收的活體四角蛤蜊，除去外殼，得軟體部位原材料5kg，洗凈泥砂，瀝干后絞碎。沸水煎煮提取l次，加水25kg，煎煮120分鐘，用200目濾布濾過，收集濾液，于離心機在4000r即轉(zhuǎn)速下離心，得上清液。提取液濃縮至約5L,冷卻后加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使體系乙醇含量達到90%，攪勻，-IO'C下靜置24小時進行沉淀，抽濾，得白色絮狀沉淀物。將該沉淀物于少量純凈水中，配成濃度適當?shù)奶崛∥锶芤海M行噴霧干燥，得淺白色粉末狀四角蛤蜊提取物。實施例5:取新采收的活體四角蛤姊j若干，除去外殼，得軟體部位原材料50kg，洗凈泥砂，瀝干后絞碎，加水150kg,沸水煎煮60分鐘，120目濾布過濾，收集濾液，濾渣再加100kg水煎煮60分鐘，120目濾布過濾得濾液，合并2次提取濾液。將濾液濃縮至50L，于管式離心機在14000rmp轉(zhuǎn)速下離心，得上清液。離心液中加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，使醇含量達到80%,攪勻，常溫下靜置24h,抽濾，得白色沉淀物。將該沉淀用少許質(zhì)量濃度為95°/。的乙醇再次洗滌，于60。C真空箱中干燥60小時，得淺棕色四角蛤蜊提取物。實施例6酶法脫蛋白取實施例5所制備的四角蛤測提取物，溶于水，配成一定濃度的溶液。量取所配制的溶液IOOOml,調(diào)pH值至6.5，60。C下放置1h后，用1°/。(V/V)的木瓜蛋白酶55。C恒溫5h后，離心(4000rmp,5min)，得到脫蛋白液。脫蛋白溶液加入95%乙醇，至乙醇含量達80%，-1(TC下靜置24小時進行沉淀，醇沉液抽濾，得白色絮狀沉淀物，冷凍干燥得白色塊狀四角蛤樹提:取物。實施例7:陽離子交換柱層析法脫蛋白稱取陽離子交換樹脂(732型，中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司)，浸泡于水中，漂去異物，反復沖洗數(shù)次，待浸泡充分后裝柱，以4-5倍體積1M的HC1水溶液流洗，蒸餾水沖洗至中性，然后以4-5倍體積1M的NaOH水溶液流洗，蒸餾水沖洗至中性，后再以4-5倍體積的1M的HC1水溶液流洗，蒸餾水沖洗至中性。稱取一定量實施例5所制得的四角蛤樹提取物，用蒸餾水溶解，緩緩沿樹脂柱壁均勻上樣。用蒸餾水洗脫樣品，收集洗脫液，直至洗脫液未4全出多糖時為止。洗脫液在70。C下減壓濃縮，用0.5M的NaOH調(diào)洗脫液的pH至7.0。濃縮液中加入95%乙醇至醇的質(zhì)量百分含量達80%,-10。C條件下醇沉12h。過濾醇沉液，收集沉淀，冷凍干燥后即得除蛋白的四角蛤樹提取物。實施例8:四角蛤蜊提取物的表征取上述各實施例制備的四角蛤蜊提取物進行樣品表征分析四角蛤蜊提取物易溶于水，室溫溶解度可高達20y。，a-萘酚反應(yīng)檢驗呈陽性，費林試劑反應(yīng)呈陽性，水溶液加熱沉淀反應(yīng)呈陽性，茚三酮反應(yīng)呈陽性，說明提取物中主要由多糖和蛋白質(zhì)組成。蒽酮硫酸法測量提取物中總糖含量為70-100%,蛋白質(zhì)和其他成分含量低于30%，其中經(jīng)陽離子交換柱層析得到的脫蛋白四角蛤蜊提取物中多糖含量高于99.7°/。。元素分析結(jié)果顯示提取物中含C元素35-42%，H元素5.5-7.2%，N元素2.0-4.0%;另外，等離子體原子發(fā)射光譜分析顯示樣品中還含有S、P、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Zn、Cu等元素微量。紅外光鐠(KBr)顯示四角蛤竭提取物在3400cm-1、2930cm—1、1650cm—'、1420cm—!、1153cm—'、1080cnf1、847cm—1、760cm—'、583cnf左右處有明顯的吸收。>琉酸呻唑法、硫酸鋇比濁法和乙酰丙酮比色法顯示四角蛤姊j提取物中含有一定量的糖醛酸、磺酸基團和氨基糖。二、四角蛤蜊提取物的降血糖藥效學實驗降血糖藥效學實驗選用正常和化學性糖尿病小鼠模型，口服灌胃，從定時檢測小鼠血糖入手，在整體水平上評價了四角蛤賴提取物的降血糖藥效活性。同時，為了說明四角蛤蜊提取物的降血糖物質(zhì)基礎(chǔ)是其中的多糖成分，對經(jīng)陽離子柱層析得到的脫蛋白四角蛤樹提取物進行了降血糖活性的驗證。實施例9:1.四角蛤竭提取物的降血糖活性實驗實驗材料取實施例5所制得的四角蛤樹提取物；美國癌研所選育種(ICR)小鼠，體重20-22g,全雄，由南京中醫(yī)藥大學動物房提供；四氧嘧咬(Sigma公司產(chǎn)品，上海貝基生物科技有限公司進口分裝，批號A7413);鹽酸二曱雙胍片(深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號0708212);鹽酸腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號080106);L-a-丙氨酸(上海惠興生化試劑有限公司，批號20080418);格列齊特片(北京京豐制藥有限公司，批號080101);GT1810型血糖儀附加血糖試紙條，日本ARKRAY公司。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標準差(X±S)表示，統(tǒng)計學處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件做單因素方差分析。1.1.四角蛤樹提取物對正常小鼠口服糖耐量(OGTT)的影響實驗方法取正常小鼠30只，禁食12h(可自由飲水)后，取尾靜脈血測定空腹血糖值(FBG),按血糖水平分為5組，每組6只。分別為空白對照組，二曱雙胍組(175mg/kg);四角蛤蜊提取物低劑量組(200mg/kg),四角蛤姊j提取物中劑量組(400mg/kg),四角蛤姊j提取物高劑量組(600mg/kg)。再按上述劑量灌胃給藥，空白組給予等體積的蒸餾水。1h后，各組以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分別于O、30、60、120min后尾靜脈取血，用血糖儀測定血糖值，繪制血糖曲線并計算曲線下面積(AUC)。實驗結(jié)果見下表表l四角蛤蜊提取物對正常小鼠口服葡萄糖耐量的影響血糖值(mmol/L)實驗分組-AUC/AUC,FBGOmin30min60min120min空白組2.23±0.232.33±0.3411.05±1.086,35±0.592.87±0.44—陽性藥2.43±0.471,43±0.48*5.43±0.60**■3.95±0.87**1.98±0.83*57.1%低劑量2.12±0,252.85±0.6310.82±2.226.43±1,292.42±0.5198.8%中劑量2.05±0.712.73±0.509.00±1.63*6.03±0.602.33±0.2788,4%高劑量2,15±0,432.65±0.878.20±2.22**5.47±0.872.03±0.63*80.3%注實-驗組同空白組比較，木表示p〈0.05,"表示p〈0.01。實驗結(jié)果顯示四角蛤測提取物的中、高劑量組在給予葡萄糖后30min時，能明顯地抑制葡萄糖引起的血糖升高，低劑量組也呈現(xiàn)一定抑制趨勢。在給予葡萄糖后120min時，高劑量組仍對血糖的升高有顯著抑制作用，與空白組比較有顯著性差異。從各組0GTT試驗曲線下面積(AUC)可以看出，四角蛤賴提取物高劑量能明顯減少血糖升高的曲線下面積，與空白組比較有顯著性差異。1.2.四角蛤網(wǎng)提取物對糖尿病小鼠口服糖耐量(0GTT)的影響實驗方法正常小鼠禁食12h(不禁水)后，由尾靜脈快速注射新鮮配制的四氧嘧啶生理鹽水溶液(劑量為60mg/kg),72h后(禁食4h)尾靜脈取血測定小鼠空腹血糖值，血糖值>11.lmmol/L并出現(xiàn)多飲、多尿癥狀的小鼠被選為糖尿病模型小鼠。取成功糖尿病模型小鼠30只，禁食12h(不禁水)后，取尾靜脈血測定空腹血糖值(FBG),按血糖和體重水平分為5組，每組6只，分別為空白對照組；二甲雙胍組(175mg/kg);四角蛤蜊提取物低劑量組(200mg/kg);提取物中劑量組(400mg/kg);提取物高劑量組(600mg/kg)。再按上述劑量灌胃給藥，空白組給予等體積的蒸餾水。lh后，各組以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分別于0、30、60、120、180min后取尾靜脈血測定血糖值，繪制血糖曲線并計算曲線下面積(AUC)。實驗結(jié)果見下表_表2四角蛤糊提取物對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響_血糖值(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注實-瞼組同空白組比爭支，承表示p〈0.05，"表示p〈0.01。實驗結(jié)果在給予葡萄糖后60min時，四角蛤樹提取物的低、中、高劑量組對血糖的升高顯示出一定的抑制作用，在給予葡萄糖后120min時，四角蛤姊j提取物的中、高劑量組能明顯地抑制葡萄糖引起的血糖升高(與空白組比較，p<0.05),低劑量組也呈現(xiàn)一定抑制趨勢，在給予葡萄糖后180min時，四角蛤蜊提取物各實驗組動物的血糖仍低于模型組。從各組OGTT試驗曲線下面積(AUC)可以看出，四角蛤蜊提取物能減小葡萄糖引起的血糖升高的曲線下面積，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性關(guān)系。1.3.四角蛤姊J提取物對正常小鼠的空腹血糖及臟器指數(shù)的影響實驗方法取正常小鼠50只，禁食12h后取尾靜脈血測定空腹血糖值(FBG),按空腹血糖和體重水平隨機分為5組。每組10只，分別為空白對照組；格列齊特組(100mg/kg);四角蛤州提取物低劑量組(200mg/kg);提取物中劑量組(400mg/kg);提取物高劑量組(600mg/kg),各組藥物臨用前用蒸餾水配至所需濃度，按0.2mL/10g灌胃，空白組給予等體積的蒸餾水。每天給藥1次，連續(xù)10天。末次給藥后禁食12h尾靜脈取血測定空腹血糖值。最后處死動物，取胸腺、肝、脾、腎稱重，計算臟器指數(shù)。實驗結(jié)果見下表表3四角蛤樹提取物對正常小鼠空腹血糖的影響實驗分組給藥劑量空腹血糖值(mmol'L-1)(mg'kg")初始10d空白組—3.84±0.803.40±0.56陽性藥1003.72±0.892,34±0,73**低劑量2003.87±0.803.29±0.63中劑量4003.87±0.793.46±0.76高劑量6003.83±0.723.60±0.64注**表示同初始空腹血糖值相比p<0.01。表4四角蛤蜊提取物對正常小鼠臟器指數(shù)的影響給藥劑量臟器指數(shù)實驗分組(mg/kg)肝(mg/g)腎(mg/g)脾(mg/g)胸腺(mg/g)空白組_62.39±5.1718.67±2.744.01±0.681.61±0.33陽性藥10061.54±4.9218.36±0.963.38±0.42*1.68±0.37低劑量20062.98±4.6218.11±1.653.62±0.821.78±0.46中劑量40064.96±8.9318.99士1.933,76±0.681.66±0.55高劑量60062.59±7.4819.20±1.843.85±0.532條0.77注實驗組同空白組比較，承表示p〈0.05。實驗結(jié)果給藥10d后，格列齊特(100mg/kg)能顯著降低正常小鼠的空腹血糖水平(與空白對照組比較，P<0.01)，使正常小鼠的脾指數(shù)降低(與空白對照組比較，P<0.05);四角蛤蜊粗提取物三個劑量組對正常小鼠的空腹血糖水平和臟器系數(shù)均無明顯影響。說明四角蛤蜊提取物藥效活性比較緩和，對人更加安全，這與化學降血糖藥品有很大的區(qū)別，說明四角蛤蜊提取物適合作為保健藥品，符合藥食同源的觀念。1.4.四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠的空腹血糖及臟器指數(shù)的影響實驗方法取正常小鼠80只，隨機取10只作為空白對照組，其余禁食12h(不禁水)，由尾靜脈快速注射新鮮配制的四氧嗜啶生理鹽水溶液(劑量為60mg/kg)，造成糖尿病動物模型。正常對照組注射等量的生理鹽水。72h后(禁食4h)尾靜脈取血測定小鼠空腹血糖值，血糖值^11.lmmol/L并出現(xiàn)多飲、多尿癥狀的小鼠被選為糖尿病模型小鼠。造模成功的小鼠取50只按血糖水平隨機分為5組(各組小鼠血糖均值相差不大于0.55mmol/L)，分別為模型對照組，二甲雙胍組(250mg/kg),四角蛤姊j提取物低劑量組(200mg/kg)，提取物中劑量組(400mg/kg),提取物高劑量組(600mg/kg)。各組藥物臨用前用蒸餾水配制成所需濃度，每天1次，共30天。給藥10天、20天和30天后測定小鼠空腹血糖值(禁食4h);給藥30天后處死各組小鼠，取肝、腎、脾、胸腺稱重，計算臟器指數(shù)。實驗結(jié)果見下表表5四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響實驗分組給藥劑量(mg'kg-1)空腹血糖值(mmol'L")初始10d20d30d空白對照—3.14±0.773.56±0,823.87±0,933.81±0.78模型對照—21.68±4.0623.06±4.5723.21±4.0423.22±6.15陽性藥25021.72±3.7718.42±4.36*14.12士6.57**10.97±5,71**低劑量20021.39±4.2620.43±3.3820.20±6.0020.37±5.34中劑量40021.42±4.2819.02±5.6618.44±5.55*16.84±4.79**高劑量60021.73±3.6418.48±5.15*17.76±7.13*16.01±6.87**注*表示同初始空腹血糖值相比p<0.05,**表示？<0.01。表6四角蛤竭提取物對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響實驗分組給藥劑量臟器指數(shù)(mg'kg-1)肝(mg/g)腎(mg/g)脾(mg/g)胸腺(mg/g)空白對照—49.94±3.6916.03±1.033.21±0.461.40±0,43模型對照—61.93±4.87AA24.97±2.29AA2.93±0,550.50±0.24AA陽性藥25059,01±3.72AA24.49±2.68AA3.22±0.540.46±0.19AA低劑量20054.30±4.10A*24.33±1.86AA2.75±0.310.48±0.33AA中劑量40053.89±4.03A*23.18±2.66AA2.80±0.640.61±0.26AA高劑量60053.59±3.15*23.31±1.85AA3.08±0.790.66±0.23AA注&表示同空白對照組相比p<0.05,"表示p〈0.01;*表示同模型對照組相比p<0.01。實驗結(jié)果給藥10d后，四角蛤姊j提取物的高劑量組，能顯著降低四氧嗜咬糖尿病小鼠的空腹血糖值，給藥20d后，四角蛤姊j提取物的中、高劑量組均顯示出明顯的降血糖作用，給藥30d后，四角蛤樹提取物的中、高劑量組仍顯示出明顯降血糖作用，這說明四角蛤蜊提取物的降血糖活性比較緩和，需長期的堅持服用?；瘜W物質(zhì)四氧嘧啶能引起小鼠肝、腎臟和胸腺顯著性腫大，通常情況下，重型糖尿病患者也伴有肝、腎腫大等并發(fā)癥，患者免疫力低下。四角蛤賴提取物的低、中、高劑量組能顯著抑制四氧嘧。定糖尿病小鼠的肝腫大，同時，四角蛤蜊摘_取物的低、中、高劑量組均能適度減輕四氧嘧。定糖尿病小鼠的腎水腫，使腎指數(shù)略低于模型組，但是對脾臟和胸腺幾乎沒有影響。說明四角蛤蜊提取物在作為調(diào)節(jié)血糖藥物或^f呆健品的長期服用的過程中，具有標本兼治的功效。1.5.四角蛤蜊提取物對正常小鼠糖異生的影響實驗方法取正常小鼠30只禁食12h(不禁水)后，取尾靜脈血測定空腹血糖值(記為0min),按血糖水平分為5組，每組6只，分別為空白對照組，二甲雙胍組(175mg/kg)，四角蛤蜊提取物低劑量組(200mg/kg),提取物中劑量組(400mg/kg),提取物高劑量組(600mg/kg)。再按上述劑量灌胃給藥，空白組給予等體積的蒸餾水。30rain后各組腹腔注射L-a-丙氨酸2g/kg,給藥60min后用血糖儀取尾靜脈血測定血糖水平，計算糖異生效率。實驗結(jié)果見下表12表7四角蛤蜊提取物對正常小鼠糖異生的影響組別給藥劑量.(mg'kg-1)血糖值(mmol'L-1)0min60min糖異生效率(％)空白組—2.33±0.783.47±0.5448,93陽性藥1752.33±0.722.38±0.43**2.15低劑量2002.35±0.663.28±0.4839,57中劑量4002.27±0.562.75±0.37*21.15高劑量6002.23±0.542.35±0.53**5,38注實-瞼組同空白組比較，*表示卩<0.05,"表示p〈0.01。實驗結(jié)果表7顯示蛤蜊粗多糖中、高劑量組在腹腔注射L-a-丙氨酸后60min時均能明顯地抑制正常小鼠糖異生引起的血糖升高，低劑量組也顯示抑制趨勢。實施例10:2.脫蛋白四角蛤測提取物的降血糖藥效學實驗實驗材料取實施7制得的脫蛋白四角蛤蜊提取物；美國癌研所選育種(ICR)小鼠，體重20-22g,全雄，由本校動物房提供；其他實驗材料與上述降血糖藥效學實驗相同。實驗統(tǒng)計方法與上述實驗相同2.1.脫蛋白四角蛤蜊提取物對正常小鼠口服糖耐量的影響實驗方法取正常小鼠30只，全雄，體重24-26g，禁食12h(自由飲7jc)后，耳又尾靜脈血測定空腹血糖值(FBG),按血糖水平分為5組，每組6只，分別為空白對照組；二甲雙胍組(175mg/kg);脫蛋白四角蛤樹提取物低劑量組(150mg/kg);脫蛋白四角蛤蜊提取物中劑量組(300mg/kg);脫蛋白四角蛤賴提取物高劑量組(450mg/kg)。再按上述劑量灌胃給藥，空白組給予溶劑。lh后，各組以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分別于O、30、60、90、120rain后取尾靜脈血用血糖儀測定血糖值，繪制血糖曲線并計算曲線下面積(AUC)。實驗結(jié)果見下表表8.脫蛋白四角蛤蜊提取物對正常小鼠口服糖耐量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注實驗組同空白組比較、，承表示P〈0.05,**表示？<0.01。實驗結(jié)果表8顯示四角蛤蜊提取物的低、中劑量組在給予葡萄糖后30min時，能明顯地抑制葡萄糖引起的血糖升高，而高劑量組對降血糖無明顯活性。從各組OGTT試驗曲線下面積(AUC)可以看出，脫蛋白四角蛤梯j提取物中劑量能明顯減少血糖升高的曲線下面積。2.2.脫蛋白四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響實驗方法取成功糖尿病模型小鼠30只，禁食12h(不禁水)后，取尾靜脈血測定空腹血糖值(FBG)，按血糖和體重水平分為5組，每組6只，分別為模型組；二曱雙胍組(175mg/kg);脫蛋白四角蛤蜊提取物低劑量組(150mg/kg);脫蛋白四角蛤蜊提取物中劑量組(300mg/kg);脫蛋白四角蛤蜊提取物高劑量組(450mg/kg)。再按上述劑量灌胃給藥，模型組給予溶劑。lh后，各組以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分別于0、30、60、90、120、180min后取尾靜脈血用血糖^f義測定血糖值，繪制血糖曲線并計算曲線下面積(AUC)。實驗結(jié)果見下表表9.脫蛋白四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠口月糖耐量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注實驗組同空白組比4交，氺表示P〈0.05,"表示P〈0.01。實驗結(jié)果表9顯示在給予葡萄糖后60min時，脫蛋白四角蛤測提取物低、中、高劑量組對血糖的升高顯示出一定的抑制作用；在給予葡萄糖后120min時，提取物的中、高劑量組能明顯地抑制葡萄糖引起的血糖升高，中劑量組抑制效果略優(yōu)于高劑量組，低劑量組也呈現(xiàn)一定抑制作用；在給予葡萄糖后180min時，脫蛋白提取物低、中、高劑量組的血糖值仍低于模型組。從各組OGTT試驗曲線下面積(AUC)可以看出，脫蛋白四角蛤蜊提取物低、中、高劑量組能減小葡萄糖引起的血糖升高的曲線下面積，中劑量效果略優(yōu)于低、高劑量。2.3.脫蛋白四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠空腹血糖及臟器指數(shù)的影響實驗方法取正常小鼠80只，隨機取10只作為空白對照組，其余禁食12h(不禁水)，由尾靜脈快速注射新鮮配制的四氧嘧啶生理鹽水溶液(劑量為60mg/kg),造成糖尿病動物模型。正常對照組注射等量的生理鹽水。72h后(禁食4h)尾靜脈取血測定小鼠空腹血糖值，血糖值^11.lmmol/L并出現(xiàn)多飲、多尿癥狀的小鼠被選為糖尿病模型小鼠。造模成功的小鼠取50只按血糖水平隨機分為5組(各組小鼠血糖均值相差不大于0.55mmol/L)，分別為模型對照組，二曱雙胍組(250mg/kg),脫蛋白四角蛤測提取物低劑量組(150mg/kg)、中劑量組(300mg/kg)、高劑量組(450mg/kg)。各組藥物臨用前用蒸餾水配制成所需濃度，每天l次，共30天。給藥10天、20天和30天后測定小鼠空腹血糖值(禁食4h);給藥30天后處死各組小鼠，取肝、腎、脾、胸腺稱重，計算臟器指數(shù)。實驗結(jié)果見下表表IO脫蛋白四角蛤擲提取物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響實驗分組給藥劑量空腹血糖4iLOnmol'L-l)(mg'kg-1)10d20d30d空白對照_3.14±0.773,56±0.823.87±0.933.81土0.78模型對照_21,68±4.0623.06±4.5723.21±4.0423.22±6.15陽性藥25021.72±3.7718.42±4.36*14.12±6.57**10.97±5.71**低劑量15021.68±4.4621.30±5.0522.24±4.1521.28±5,78中劑量30021.56±4.3019.49±4.9519.16±5,9517.52±5.29*高劑量45021.58±3.9418.92+6.25*18.07±5.24*16.51±5.10**注*表示同初始空腹血糖值相比p<0.05,"表示p〈0.01。15表ll脫蛋白四角蛤蜊提取物對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響實驗分組給藥劑量臟器指it(mg'kg-1)肝(mg/g)腎(mg/g)脾(mg/g)胸腺(mg/g)空白對照—49.94±3.6916.03±1.033,21±0.461.40±0.43模型對照_61.93±4.87AA24.97±2.29AA2.93±0.550.50±0.24AA陽性藥25059.01±3.72AA24.49±2.68AA3.22±0.540,46士0,19厶厶低劑量20060.09±6.28AA24.12±2.46AA2.99±0,340.59±0.16AA中劑量40056.26±4.35AA*23.83±2.37AA2.88±0.460.60±0.16AA高劑量60055.64±3.72AA**24.36±2.15AA2.98±0.600.64±0.14AA注。a表示同空白對照組相比p<0.01;*表示同模型對照組相比p<0.05,**表示p<0.01。實驗結(jié)果表IO顯示在給藥10d時，脫蛋白四角蛤姊j提取物的高劑量組，能顯著降低四氧嘧。定糖尿病小鼠的空腹血糖值；在給藥20d時，高劑量顯示出明顯的降血糖作用；在給藥30d時，脫蛋白四角蛤測提取物中、高劑量組均顯示出明顯降血糖。這和四角蛤賴提取物的降血糖效果相似，說明多糖成分就是提取物的降血糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。表11說明了脫蛋白提取物同樣能減輕四氧嘧咬糖尿病小鼠的肝腫大，適度減輕腎水腫。三、四角蛤樹提取物的免疫調(diào)節(jié)活性藥效實驗免疫調(diào)節(jié)藥效學實驗選用碳粒廓清實驗、雞紅細胞吞噬實驗、和遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)實驗，對正常和免疫缺陷的模型小鼠口服灌胃，評價四角蛤蜊提取物的免疫調(diào)節(jié)藥效活性。實施例11:3.四角蛤樹提取物的免疫調(diào)節(jié)活性藥效實驗實驗材料取實施例5所制得的四角蛤賴提取物；美國癌研所選育種(ICR)小鼠，體重20-22g,全雄，由本校動物房提供；市售公雞，適應(yīng)性祠養(yǎng)，取血保藏備用；環(huán)磷酰胺(Sigma公司，批號A7413);印度墨汁(青島海博生物技術(shù)有P艮公司，批號921044);香菇多糖(深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號0708212);左旋咪唑(西南制藥一廠，批號000806019);二硝基氟苯(DNCP,中國醫(yī)藥集團，批號070412)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計同實驗例1。3.l.碳粒廓清實驗16實驗方法取正常小鼠40只，隨機分為4組，每組10只；設(shè)空白對照組(生理鹽水)，陽性對照組(香菇多糖)，提取物高劑量組和低劑量組(四角蛤蜊提取物)；連續(xù)給藥15天，每只小鼠沿尾靜脈按0.05ml每10g體重注射印度墨汁，分別于3和10min眼眶取血20ial，加入到2ml的^20)3溶液(0.1%w/v)中，680nm下分光光度計測光密度，計算廓清指數(shù)。實驗結(jié)果如下表表12四角蛤樹提取物對正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響實驗分組給藥劑量廓清指數(shù)空白對照一5.870±0.602陽性對照2006.920+0.905*提取物高劑量4007.682±0.677**提取物低劑量2006.571±0.457*注*表示同空白組相比p<0.05，"表示p〈0.01。實驗結(jié)果見表12，結(jié)果表明，四角蛤梯j提取物高低劑量組均能夠顯著增強正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，其中高劑量與空白組比較具有極顯著統(tǒng)計學差異。3.2.雞紅細胞吞謹實驗實驗方法取正常小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，設(shè)為空白組對照組(生理鹽水)，免疫力低下模型對照組(環(huán)磷酰胺)，陽性藥組(香菇多糖)，四角蛤樹提取物低、中、高劑量組。除空白對照外，其余各組于第1、2、3天腹腔注射環(huán)磷酰胺(按200mg每公斤體重注射)，造成免疫力低下小鼠模型。同時，上述各實驗組按設(shè)定劑量口服灌胃給藥，連續(xù)給藥10次，每次間隔24h。于第l次口服給藥后的30min，按0.2mL/只劑量腹腔注射5°/。的雞紅細胞生理鹽水混懸液進行小鼠免疫；于第10次給藥后的30min,對小鼠進行眼眶取血。所取血樣離心，分離血清，生理鹽水稀釋至100倍，取稀釋樣品lml,加入0.5ml的5°/。雞紅細胞混懸液和O.5ml的10%補體，混勻，37。C下孵育30min，放入冰浴中終止反應(yīng)，分光光度法測量540nm處的吸光度值。實驗結(jié)果見下表17表13四角蛤竭提取物對免疫力低下小鼠的血清溶血素生成的影響實驗分組給藥劑量血清溶血素水平(OD)空白對照—0.462±0.054模型對照2000.210±0.010AA陽性藥組2000.285±0.027AA*提取物低劑量1000.253±0.018AA提取物中劑量2000.240±0.013AA提取物高劑量4000.266士0細aa"注aa表示同空白對照組相比pO.01;承表示同模型對照組相比p0.05,^表示p0.01。實驗結(jié)果雞紅細胞呑噬實驗結(jié)果見表13,腹腔注射環(huán)磷酰胺導致小鼠免疫力低下，血清溶血素水平明顯降低，表明免疫力低下小鼠造模成功；口服灌胃蛤姊J粗提取物能夠提高免疫力低下小鼠的血清溶血素水平，高劑量組與模型對照組比較有極顯著的差異。3.3.遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)實驗實驗方法取ICR小鼠60只，隨機分為6組,每組10只，設(shè)為空白對照組(生理鹽水)，模型對照組(環(huán)磷酰胺)，陽性藥組(左旋咪唑)，四角蛤蜊提取物低、中、高劑量組。除空白對照外，其余各組于第1、2、3天腹腔注射環(huán)磷酰胺(按200mg每公斤體重注射)，造成免疫力低下小鼠模型。同時，上述各實驗組按設(shè)定劑量口服灌胃給藥，連續(xù)給藥7次，每次間隔24h。在口服灌胃給藥第7天，除空白對照組外，其余各組小鼠腹部剔除毛發(fā)，范圍約3x3cn^，并將20^1的2%DNCB丙酮-麻油(丙酮麻油=1:l)溶液均勻涂抹于棵露皮膚上進行致敏反應(yīng)。致敏后第5d,再將3(^1的DNCP溶液均勻涂抹于小鼠右耳(背側(cè)耳廓)進行致敏攻擊。攻擊后24h,頸推脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重，以(右耳重-左耳重)/左耳重為腫脹率。實驗結(jié)果如下表所示18表14四角蛤梯j提取物對免疫力低下小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響實驗分組給藥劑量腫脹率空白對照—3.06±0.12模型對照2002.26±0,18AA陽性藥組403.00±0.12*提取物低劑量1002.98±0.12*提取物中劑量2002.88士0.11*提取物高劑量4003.07±0.12**注"表示同空白對照組相比p<0.01;*表示同才莫型對照組相比p<0.05,**表示p<0.01。實驗結(jié)果遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果見表14。結(jié)果表明，四角蛤姊J提取物各劑量組與模型對照組比較均能顯著降低二硝基氯苯引起的低疫力小鼠的耳腫脹率，其中，高劑量組效果極顯著。四、四角蛤蜎提取物的護肝活性藥效學實驗護肝活性實驗選用四氯化碳肝損傷小鼠模型，評價口服四角蛤樹提取物的護肝效果。實施例12:4.四角蛤蜊提取物的護肝活性藥效學實驗實驗材料實施例5所制的四角蛤蜊提取物；美國癌研所選育種(ICR)小鼠，體重20-22g，全雄，由本校動物房提供；四氯化碳(廣東光華化工廠，批號200804015);聯(lián)苯雙脂滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號200807012);谷草轉(zhuǎn)氨酶(ASL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒(南京大光明公司)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計同實驗例1。實驗方法ICR小鼠正常飼養(yǎng)2天，隨即分成8組，為空白對照組(生理鹽水)，模型對照組(四氯化碳)，陽性藥組(聯(lián)苯雙酯)，四角蛤蜊提取物低、中、高劑量組。每組動物取10只，按指定劑量口服灌胃連續(xù)給藥6次，每次間隔24h(模型對照組給予生理鹽水)。末次給藥lh后，空白對照組按10mL每公斤體重的劑量腹腔注射花生油，其余7組均按10mL.kg—1腹腔注射0.1%CCL花生油溶液，制成四氯化碳肝損傷模型。禁食，不禁水，24h后，再次按劑量給藥，lh后小鼠眼眶19耳又血，3000rpm離心10min,耳又血清，測ALT,AST。結(jié)果如下表表15四角蛤樹提取物對CCL肝損傷模型小鼠血清中ALT、AST的影響組別劑量(mg/kg)ALT(U)AST(U)空白對照組-55,4±13.975.7±8.6模型對照組-158.7±28.5A165.8±37.3A陽性藥組15065,4±19.780.1±13.4A*提取物低劑量125127,8±28,8133.9±18.7提取物中劑量250117.7士45.6125.7±31.3提取物高劑量500122.6±22.3124.2±28.6A*注a表示同空白對照組相比p<0.05;*表示同;^莫型對照組相比p<0.05。實驗結(jié)果四角蛤蜩提取物對由四氯化碳造成的化學肝損傷小鼠的護肝活性效果見表15。結(jié)果顯示，對正常小鼠腹腔注射四氯化碳后，小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯提升，這是肝功能異常的表現(xiàn)，說明四氯化碳肝損傷模型成功。給予小鼠口腔灌服四角蛤樹各提取部位后，小鼠ALT,AST水平變化出現(xiàn)差異，四角蛤姊j提取物三個給藥水平的ALT和ALT水平均下降明顯，說明提取物具有護肝活性，且活性比較強烈。六、四角蛤蜊提取物的保健品或藥品配方實施例13:保健品片劑四角蛤蜊提取物180g,硬脂酸鎂lg，滑石粉O.5g，干淀粉18g,上述組分在混合機中混勻后壓制成片。實施例14:保健品膠嚢劑20四角蛤蜊^是取物100g，微晶纖維素0.5g,上述組分混合勻后灌制成膠嚢。實施例15:藥品片劑二甲雙胍10g,四角蛤蜊提取物150g，干淀粉40g,硬脂酸鎂lg,滑石粉0.5g，上述組分在混合機中混勻后壓制成片。實施例16:藥品膠嚢劑二甲雙胍10g，四角蛤姊J提取物100g，微晶纖維素lg,上述組分混合勾后灌制成膠囊。2權(quán)利要求1.一種四角蛤蜊提取物，由以下方法制得取四角蛤蜊軟體部位為原材料，洗凈、絞碎，加水煎煮，濾過，得水煎煮提取液，將水煎煮提取液離心，收集上清液，濃縮，濃縮液冷卻后加乙醇沉淀，濾過，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。2.權(quán)利要求1所述的四角蛤娜提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟取四角蛤樹軟體部位為原材料，洗凈、絞碎，加水煎煮，濾過，得水煎煮提取液，將水煎煮提取液離心，收集上清液，濃縮，濃縮液冷卻，加乙醇沉淀，濾過，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的四角蛤蜊提取物的制備方法，其特征在于進一步包括純化步驟取所述乙醇沉淀物溶于水中，脫蛋白，收集脫蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脫蛋白的四角蛤姊J提取物。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的四角蛤蜊提取物的制備方法，其特征在于所述加水煎煮步驟循環(huán)進行1-3次，每次加水與四角蛤蜊軟體原材料的質(zhì)量比為2:1-5:1,每次提取時間為30-120分鐘。5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的四角蛤網(wǎng)提取物的制備方法，其特征在于所述加乙醇沉淀步驟為在攪拌情況下加入乙醇，至乙醇在沉淀體系中的質(zhì)量百分含量為60-90%。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的四角蛤蜊提取物的制備方法，其特征在于所述脫蛋白步驟使用蛋白酶法，或離子交換柱層析法。7.權(quán)利要求1所述的四角蛤蜊提取物在制備降血糖藥物或保健品中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求1所述的四角蛤蜊提取物在制備調(diào)節(jié)免疫藥物或保健品中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求1所述的四角蛤姊]提取物在制備護肝藥物或保健品中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9之一所述的四角蛤姊j提取物的應(yīng)用，其特征在于相應(yīng)藥物和保健品中添加制劑學和食品學中上允許添加的其他輔料和添加劑，制成常規(guī)的制劑形式。全文摘要本發(fā)明涉及一種四角蛤蜊提取物，由以下方法制得取四角蛤蜊軟體部位為原材料，洗凈、絞碎，加水煎煮，濾過，得水煎煮提取液，將水煎煮提取液離心，收集上清液，濃縮，冷卻后加乙醇沉淀，濾過，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物；對該提取物進行脫蛋白，可得純化后的四角蛤蜊提取物，該四角蛤蜊提取物具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)和保護肝臟的功能，本發(fā)明同時公開該四角蛤蜊提取物在制備藥物或保健品中的應(yīng)用。文檔編號A61P37/02GK101548989SQ20091002780公開日2009年10月7日申請日期2009年5月15日優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日發(fā)明者皓吳,念常,文紅梅,狄留慶,王令充,程建明申請人:南京中醫(yī)藥大學