專利名稱：一種含雷洛昔芬的藥物配伍組合及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含雷洛昔芬的藥物配伍組合及其在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣 硬化性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在全球范圍內(nèi)，每年約有1750萬(wàn)人死于心血管疾病，大約一半左右為女性，世界 上平均每1分鐘就有16個(gè)女性死于心腦血管疾病，心血管疾病是女性死亡最多的單病 種死亡原因，包括美國(guó)在內(nèi)的許多發(fā)達(dá)國(guó)家中，每年死于心血管疾病的女性數(shù)量超過(guò)男 性。既往的流行病學(xué)觀察性研究顯示女性冠心病及腦卒中的發(fā)病年齡較男性推遲10年。 絕經(jīng)后婦女冠心病患病率較絕經(jīng)前增加2-3倍，早絕經(jīng)者發(fā)病早，提示內(nèi)源性雌激素對(duì) 育齡婦女可能有心血管保護(hù)作用，這就促使了絕經(jīng)后婦女性激素替代療法(Hormone R印lacement Therapy, HRT)的出現(xiàn)。在過(guò)去的半個(gè)多世紀(jì)里，西方國(guó)家絕經(jīng)后婦女HRT 的使用率不斷增加，1988-1994年期間，在美國(guó)絕經(jīng)后婦女中HRT的使用率是15.3W， 至90年代后期全世界約有2億婦女在進(jìn)行服T， 1999-2002年期間，美國(guó)絕經(jīng)后婦女中 HRT的使用率達(dá)到了頂峰為28.8X。但是，前瞻性隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)婦女健 康初始項(xiàng)目(woman's Health initiative, WHI)的結(jié)果2002年7月在《JAMA》上發(fā)布， 與安慰劑組相比，治療組(雌激素+孕激素)浸潤(rùn)性乳腺癌、冠心病和卒中的相對(duì)危險(xiǎn) 性增加，HRT作為絕經(jīng)后婦女預(yù)防性治療的價(jià)值受到前所未有的挑戰(zhàn)，在2003年初，北 美絕經(jīng)學(xué)會(huì)對(duì)服T的應(yīng)用指南進(jìn)行了修正:短期內(nèi)應(yīng)用服T來(lái)緩解絕經(jīng)期癥狀是合適的， 建議不要應(yīng)用HRT來(lái)預(yù)防疾病。2005年7月，Michael E Mendelsohn等人在《science》 上發(fā)表的文章中提到了使用HRT的時(shí)間假說(shuō)，2007年6月，JoArm E. Manson等人在《新 英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上公布了大規(guī)模隨機(jī)臨床試驗(yàn)婦女健康初始項(xiàng)目-冠狀動(dòng)脈鈣化^f究 WHI-CACS (WHI Coronary-Artery Calcium Study)的結(jié)果，支持HRT存在時(shí)間效應(yīng)的 假說(shuō)，即在年齡為50-59歲的絕經(jīng)早期的婦女中應(yīng)用HRT預(yù)防心血管病是有益的，傳統(tǒng) 的雌激素替代療法要比雌激素+孕激素替代療法對(duì)心血管的益處大，但單用雌激素療法 又帶來(lái)一些可怕的副作用，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、靜脈血栓的形成。
選擇性雌激素受體拮抗齊U (selective estrogen receptor modulator, SERM)是 指能和雌激素受體結(jié)合，對(duì)不同組織具有組織特殊作用的一類化合物。他莫西芬是第一 代SERM，能競(jìng)爭(zhēng)性和內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，阻止雌激素的作用，為乳腺癌的輔助治療 藥物。雷諾昔芬是新近研制成功的第二代SERM，不能像雌激素一樣改善更年期癥狀，但 具有獨(dú)特的選擇性作用特點(diǎn)，對(duì)乳腺和子宮組織顯示為雌激素受體拮抗劑，對(duì)骨骼和血 脂為雌激素受體激動(dòng)劑，己被美國(guó)食品衛(wèi)生管理局批準(zhǔn)用于絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的預(yù)防 和治療。此外，大量的研究證實(shí)口服小劑量阿司匹林能夠預(yù)防血栓的形成，現(xiàn)已成為臨 床的基礎(chǔ)用藥。
縱觀已發(fā)表的大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)雷洛昔芬、雌激素、阿司匹林三藥聯(lián)用在藥理作用方 面有相輔相成的治療效果。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索査新，有關(guān)雷洛昔芬、雌激素、阿司匹林聯(lián) 用配伍及其在防治絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有雌激素替代療法及傳統(tǒng)的雌、孕激素聯(lián)用的性激素替代療法的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種含雷洛昔芬的藥物配伍組合及其在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化性疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的含雷洛昔芬的藥物配伍組合，其特征是所述藥物組合物由鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇和阿司匹林組成，其中鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇與阿司匹林的質(zhì)量比例為105 : 1 : 43. 75。
本發(fā)明所述的含雷洛昔芬的藥物配伍組合在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用針對(duì)絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所述的含雷洛昔芬的藥物配伍組合在抑制動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用以及對(duì)乳腺、子宮、血栓因素等的影響。
絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的制備
80只3月齡純種雌性平均體重2. 25公斤的新西蘭大白兔用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用3%的戊巴比妥鈉靜脈麻醉，行去雙側(cè)卵巢手術(shù)，偽手術(shù)組只打開(kāi)腹腔，不去卵巢，飼以含1.5%膽固醇的高脂飼料，在去卵巢手術(shù)后喂養(yǎng)12周。
絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的藥物處理
80只新西蘭大白兔被隨機(jī)分成8組(n=10)，分別為A組(對(duì)照組)、B組(雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林)、C組(雷洛昔芬+雌激素)、D組(雌激素)、E組(雷洛昔芬組)、F組(雌激素+孕激素組)、G組(阿司匹林組)和H組(偽手術(shù)組)。對(duì)照組給安慰劑，B、 C、 D、F組中各兔每周一、三、五、日給予0.5mg戊酸雌二醇，總量為2mg/周，B、 C、 E組給予雷羅昔芬30 mg/d， B、 G組給予阿司匹林12.5 mg/d。
動(dòng)脈標(biāo)本的制備
于高脂喂養(yǎng)第12周末應(yīng)用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行病理學(xué)研究。以3%的戊巴比妥鈉過(guò)量處死實(shí)驗(yàn)兔，用生理鹽水及4%的多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動(dòng)脈后，自主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈分叉處離斷整個(gè)主動(dòng)脈，首先切取主動(dòng)脈根部5mm標(biāo)本，制備石蠟切片，其余主動(dòng)脈剝?nèi)⊥饽そY(jié)締組織后，縱形剖開(kāi)。
采用HE染色、油紅0染色、天狼星紅染色、巨噬細(xì)胞的免疫組化等方法，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究以雷洛昔芬為主的藥物組合在防治絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化中的作用
1. 動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜/中膜(IM)比值測(cè)定
采用HE染色法，將組織脫蠟、脫水，Harris蘇木素液染5分鐘左右，水洗1分鐘，75%的鹽酸酒精分化15秒，水洗，氨水處理30秒，水洗1分鐘，酸化伊紅乙醇液染12分鐘，自來(lái)水快速?zèng)_洗，脫水、透明和固定。結(jié)果表明偽手術(shù)組血管壁可見(jiàn)少量脂質(zhì)沉積，對(duì)照組內(nèi)膜明顯增厚，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組可見(jiàn)內(nèi)膜稍增厚，但與對(duì)照組比較顯著降低(代O.Ol)，相互之間差異無(wú)顯著性(/M).05);雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和偽手術(shù)組I/M比值均顯著低于對(duì)照組(代O. 01)(圖1-圖8)。
2. 斑塊面積占內(nèi)膜總面積的比值測(cè)定
釆用油紅0染色法，取主動(dòng)脈弓降部起始處到腹主動(dòng)脈分叉處，用4%的多聚甲醛固定24小時(shí)，流水洗15分鐘，剝?nèi)ネ饽?，縱形剖開(kāi)，再用蒸餾水浸洗；取油紅0原液60 ml加入蒸溜水至100 ml,混勻放置10分鐘后染色，染色時(shí)間為2-4小時(shí)；70%乙醇浸泡標(biāo)本至斑塊呈紅色，底色呈白色為止，最后用蒸餾水浸泡標(biāo)本，浸入甲醛溶液中保存。偽手術(shù)組可見(jiàn)脂質(zhì)沉積斑塊，對(duì)照組則為大面積脂質(zhì)沉積斑塊，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組明顯低于對(duì)照組(代O.Ol)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組之間無(wú)顯著差異性(^0.05),雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組顯著低于雌激素+孕激素組(代0.05)(圖9-圖16)。
3. 斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(Ram-ll陽(yáng)性染色面積比)測(cè)定釆用SABC法，鼠抗巨噬細(xì)胞(Ram-11)抗體1:1000稀釋，Ram-11表達(dá)陽(yáng)性為胞漿
內(nèi)的棕黃色顆粒，x20倍鏡下任意交互分割，分別選取切片中的多個(gè)粥樣斑塊部位，計(jì)算斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性面積，取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。陽(yáng)性面積比越高，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的水平越高。結(jié)果表明偽手術(shù)組巨噬細(xì)胞含量顯著低于與其他各組(代O.Ol)，對(duì)照組巨噬細(xì)胞的含量明顯高于雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和雌激素+孕激素組(代O.Ol)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組顯著低于雌激素組及雌激素+孕激素組(代O.Ol)(圖17-圖24)。
4. 斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (ramp-9)的含量測(cè)定
采用石蠟切片免疫組化方法，標(biāo)本以4%的多聚甲醛浸泡固定、石蠟包埋，切片厚度為5um,將組織切片梯度脫蠟至水。脫水后蒸餾水洗滌，3%&0210分鐘阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗3次，每次5分鐘，加入微波修復(fù)液，微波爐加熱92'C-96'C15分鐘。室溫冷卻30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，甩干。5%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，37'C20分鐘后甩去，滴加不同稀釋濃度的一抗4'C冰箱過(guò)夜，次日從冰箱中取出，用PBS洗3次，每次5分鐘，滴辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37'C30分鐘，PBS洗3次，滴加DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素輕度復(fù)染，沖洗，1%鹽酸酒精分化，流動(dòng)水沖洗5-IO分鐘，鏡下觀察。然后脫水、透明、封片。對(duì)照組MMP-9的含量明顯高于雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組及雌激素+孕激素組(代O.Ol),雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和雌激素+孕激素組三組之間無(wú)顯著差異性(/M). 05)(圖25-圖32)。
5. 斑塊內(nèi)膠原纖維的含量測(cè)定
石蠟切片5um厚度，常規(guī)脫蠟至水，浸入1%苦味酸天狼猩紅染液lh;隨后浸入Harris蘇木素染液中3min, 1%鹽酸酒精分化10秒。然后脫水透明，最后用中性樹(shù)膠封片。在日本Olympus公司生產(chǎn)的偏振光顯微鏡下觀察并采集圖像，在同一部位明、暗視野都采集，以形成對(duì)比?？辔端崽炖切羌t染色鏡下I型膠原纖維呈紅色或黃色，m型膠原纖維呈綠色。用專業(yè)圖像分析軟件IPP6.0，測(cè)量參數(shù)為斑塊內(nèi)膠原纖維的含量(膠原纖維陽(yáng)性面積占斑塊面積的百分比)。結(jié)果表明血管外膜主要由纖維結(jié)締組織構(gòu)成，其含有豐富的膠原纖維，天狼星紅染色后，利用偏振光顯微鏡在血管的同一部位分別在明視野和暗視野下各取照片一張，利于觀察和比較。各組血管壁外膜主要由I膠原纖維
組成(紅色或黃色)，含少量的m型膠原纖維(綠色)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組及
雌激素組斑塊內(nèi)膠原纖維的含量明顯高于對(duì)照組(代0.05)，且雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組高于雌激素組斑塊內(nèi)膠原纖維含量，差異有顯著性(代0.05)。含雷洛昔芬的藥物組合對(duì)血清學(xué)指標(biāo)的影響1. 血清雌激素水平
雷洛昔芬LISA法測(cè)定血清雌激素水平。喂養(yǎng)12周后各組兔血清雌激素的水平假手組為76.36土10.80p阿司匹林/ml、雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組為229. 07 ±39.41pg/ml、雷洛昔芬+雌激素組為245. 7 ± 41. 19pg/ml 、雌激素組為225. 39 ±51.91pg/ml和雌激素+孕激素組為218.04±57. 19pg/ml、明顯高于對(duì)照組(14. 82 ±2.34pg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。
2. 血清脂質(zhì)水平
氧化酶法測(cè)定血清脂質(zhì)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，雌激素+雷羅昔芬+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組的血清總膽固醇(TC)值分別為18.23±3.58mmol/L、 19.33±2. 13mmol/L和23. 54 ± 3. 90mmol/L，低密度脂蛋白(LDL)值分別為12. 65 ±2.75,1/L、 13.40土3.76咖ol/L和16. 68±6.23mmol/L，對(duì)照組的總膽固醇(TC)值為32.09±3.30mmol/L，低密度脂蛋白(LDL)值為26. 41 ±5, 03mmol/L，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組的血清總膽固醇(TC)值和低密度脂蛋白(LDL)值明顯低于對(duì)照組(p〈0.05)。而高密度脂蛋白(HDL)和甘油三酯(TG)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(》0.05)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雌激素組及雌激素+孕激素組的血脂水平之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(/M). 05)。
3. 血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)水平
雷洛昔芬LISA法測(cè)定血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)水平為571.95±120,32^/1111，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組MCP-l水平為249. 99±63. 12pg/ml，雷洛昔芬+雌激素組MCP-l水平為256. 28±68.47pg/ml，雌激素組MCP-1水平為324. 95±56. 70pg/ml，雌+孕組MCP-1水平為213.34±52.44pg/ml，對(duì)照組顯著高于雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組、雌+孕組(P〈0.01)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組及雌+孕組之間無(wú)顯著差異性(/M).05)。
含雷洛昔芬的藥物組合對(duì)血小板聚集功能的影響
雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組血小板聚集率為67%±9.56%，雷洛昔芬+雌激素組血小板聚集率為83. 6%±7.03%，雌激素組血小板聚集率為83.8%±6. 94%,雌+孕組為84. 9%±5.42%，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組血小板聚集率顯著低于雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和雌+孕組(P〈O.OD。
含雷洛昔芬的藥物組合對(duì)乳腺的影響
偽手術(shù)組乳房正常發(fā)育，是乳腺腺腔面積比值最大的一組，對(duì)照組各兔的乳房萎縮，乳腺腺腔面積最小。偽手術(shù)組乳腺腺腔面積比為29.53%±4.12%,雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組為5. 07%±0. 83%，雌激素組為15, 43%±2.17%，、雌+孕組為12. 99%±2. 05%,雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組明顯低于雌激素組和雌+孕組(代O. 01)。
含雷洛昔芬的藥物組合對(duì)子宮的影響
偽手術(shù)組子宮正常發(fā)育，為最重的一組，重量為7.97土0.65g，與其它各組之間存在顯著差異性。對(duì)照組各兔的子宮萎縮，子宮重量最小，重量為2.07±0.348,雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組為2.10 ±0. 34g,雌激素組為4. 91 ±0. 7g，雌+孕組為3. 02 ±0. 54g，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組明顯低于雌激素組(代O.Ol)和雌+孕組(代O.Ol)。
含雷洛昔芬的藥物組合對(duì)骨密度的影響各組實(shí)驗(yàn)兔處死前測(cè)骨密度，對(duì)照組為0.301土0.012mg/cm3，雷洛昔芬+雌激素+阿 司匹林組為0.298±0.011mg/cm3，雷洛昔芬+雌激素組為0. 290±0。 015mg/cm3，雌激素 組為0.293±0.015mg/cm3，雷洛昔芬組為0.293±0.014mg/cm3，雌+孕組為0.293± 0. 011mg/cm3，阿司匹林組為0.298±0. 009mg/cm3，偽手術(shù)組為0. 290±0. 015mg/cm3，各 組兔之間骨密度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(》0. 05)。
上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
計(jì)量資料用「土s表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件， 多組間比較采用On雷洛昔芬-WayANOVA方差分析。兩組間比較采用q檢驗(yàn)。代O. 05為 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由以上實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論
以雷洛昔芬為主的藥物組合能夠通過(guò)降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，降低血 液中炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)的水平，從而降低斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、基質(zhì) 金屬蛋白酶-9的含量，增加斑塊內(nèi)膠原纖維的含量，從而抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。 與傳統(tǒng)的性激素替代療法(雌激素與雌激素+孕激素)相比，能夠減少子宮的重量，抑 制乳腺腺腔的增大，降低血小板的聚集，從而能夠減少傳統(tǒng)性激素療法帶來(lái)的弊端。因 此，本發(fā)明為研究新的絕經(jīng)后性激素替代療法提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本發(fā)明涉及的含 雷洛昔芬的藥物配伍組合及其在動(dòng)脈粥樣硬化防治中的應(yīng)用，為研制防治絕經(jīng)后女性動(dòng) 脈粥樣硬化性疾病的新藥奠定了基礎(chǔ)。


圖1-圖8: HE染色檢測(cè)以雷洛昔芬為主藥物組合對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜/中膜比值 的影響
其中偽手術(shù)組血管壁可見(jiàn)少量脂質(zhì)沉積，對(duì)照組內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜厚度為432. 30 土40.55um，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組可見(jiàn)內(nèi)膜 稍增厚，分別為153.65士24.99"m、 164. 36±20.10 u m、 174. 31±18. 27 u m與對(duì)照組 比較有顯著差異性(代O. 01)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組和雌激素+孕激素組之間有 顯著差異性(代O.Ol)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組 之間無(wú)顯著差異性(AO. 05)，對(duì)照組的I/M比值為3. OO土O. 41、雷洛昔芬+雌激素+阿司 匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和偽手術(shù)組的I/M比值分別為0. 64±0.11、 0. 74 ±0.12、 0.79±0.10、 0.17±0.08，對(duì)照組與雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬 +雌激素組、雌激素組和偽手術(shù)組之間有顯著差異性(代O. 01)。
圖l.對(duì)照組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(HE, X100)可見(jiàn)斑塊中有較多的脂 質(zhì)沉積
圖2.雌激素+雷羅昔芬+阿司匹林組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(HE， XIOO)， 與對(duì)照組內(nèi)膜厚度相比明顯減小
圖3.雌激素+雷羅昔芬組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(服，X100),與對(duì)照組 內(nèi)膜厚度相比明顯減小
圖4.雌激素組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(冊(cè)，X100) 圖5.雷洛昔芬組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(HE， X100) 圖6.雌激素+孕激素組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(HE, X100) 圖7.阿司匹林組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度(冊(cè)，X100)圖8.偽手術(shù)組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)膜厚度最小(HE， X100) 圖9-圖16:油紅0染色檢測(cè)斑塊面積占內(nèi)膜總面積的比值
其中偽手術(shù)組可見(jiàn)脂質(zhì)沉積斑塊，對(duì)照組則為大面積脂質(zhì)沉積斑塊，對(duì)照組斑塊 面積占內(nèi)膜總面積的比值為91. 09%±5. 09%，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組為45. 63%± 8.63%、雷洛昔芬+雌激素組為45.57%±8. 58%、雌激素組為52. 69%±8. 93%，與對(duì)照組 有明顯差異(代0.01),雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組 之間無(wú)顯著差異性(》0. 05)，雌激素+孕激素組斑塊面積占內(nèi)膜總面積的比值為61. 61% ±9.87%，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組和雌激素+孕激素組之間有顯著差異性 (代O. 05)。
圖9.對(duì)照組去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅O染色，可見(jiàn)有較多的脂質(zhì)沉 積
圖10.雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅o染色，
與對(duì)照組相比，可見(jiàn)有較少的脂質(zhì)沉積
圖11.雷洛昔芬+雌激素去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅o染色
圖12.雌激素去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅O染色 圖13.雷洛昔芬組去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅0染色 圖14.雌激素+孕激素組去卵巢家兔大休主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅0染色 圖15.阿司匹林組去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅O染色 圖16.偽手術(shù)組去卵巢家兔大體主動(dòng)脈脂質(zhì)粥樣斑塊的油紅O染色 圖17-圖24:免疫組化檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量 其中偽手術(shù)組巨噬細(xì)胞含量為11.32%±4.98%，與其他各組有顯著差異性 (代O.Ol)，對(duì)照組巨噬細(xì)胞的含量為83.81%±6. 14%,明顯高于雷洛昔芬+雌激素+阿司 匹林組為39. 80%±10. 04%、雷洛昔芬+雌激素組為46. 86%±11. 11%、雌激素組為55. 90% ±10.77%，和雌激素+孕激素組為58.22%±11.57% (代O.Ol)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹 林組分別和雌激素組及雌激素+孕激素組都存在顯著差異性(代O. 01)。 圖17.對(duì)照組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200)可見(jiàn)斑塊內(nèi) 有較多的巨噬細(xì)胞
圖18.雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200)可見(jiàn)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量明顯少于對(duì)照組
圖19.雷洛昔芬+雌激素去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖20.雌激素去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖21.雷洛昔芬組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖22.雌激素+孕激素組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖23.阿司匹林組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖24.偽手術(shù)組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量(SABC， X200) 圖25-圖32:免疫組化法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9含量 其中對(duì)照組MMP-9的含量為28. 56%±8. 98%，明顯高于雷洛昔芬+雌激素+阿司匹 林組為9. 79%±5. 10%、雷洛昔芬+雌激素組為10. 73%±4. 08%、雌激素組為15. 33%± 3,66%,雌+孕組為10.55%±4.09% (代O.Ol)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬
+雌激素組、雌激素組和雌激素+孕激素組三組之間無(wú)顯著差異性(AO. 05)。圖25.對(duì)照組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9含量(SABC， X200)可見(jiàn)斑塊內(nèi)有 較大的陽(yáng)性面積，標(biāo)尺100um
圖26.雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)醒P-9含量(SABC， X 200)
圖27.雷洛昔芬+雌激素去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)腿P-9含量(SABC， X200) 圖28.雌激素去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9含量(SABC， X200) 圖29.雷洛昔芬組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9含量(SABC， X200) 圖30.雌激素+孕激素組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)醒P-9含量(SABC， X200) 圖31.阿司匹林組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9含量(SABC， X200) 圖32.偽手術(shù)組去卵巢家兔的動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)畫(huà)P-9含量(SABC， X200)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1含雷洛昔芬的藥物配伍組合物的制備
取藥品鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇和阿司匹林，按鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇與阿
司匹林的質(zhì)量比例為105 : 1 : 43.75分別稱取(單位克)，然后充分混勻，分裝或以 常規(guī)方式壓片，備用。
實(shí)施例2本發(fā)明所述的含雷洛昔芬的藥物配伍組合作為防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥
樣硬化藥物的應(yīng)用。
(一) 絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的制備與治療
80只3月齡純種雌性平均體重2. 25公斤的新西蘭大白兔用普通詞料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用3%的戊巴比妥鈉靜脈麻醉，行去雙側(cè)卵巢手術(shù)，偽手術(shù)組只打開(kāi)腹腔，不去 卵巢,飼以含1. 5%膽固醇的高脂飼料，在去卵巢手術(shù)后喂養(yǎng)12周。隨機(jī)分成8組"=10)， 分別為A組(對(duì)照組)、B組(雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林)、C組(雷洛昔芬+雌激素)、D 組(雌激素)、E組(雷洛昔芬組)、F組(雌激素+孕激素組)、G組(阿司匹林組)和H組(偽 手術(shù)組)。對(duì)照組給安慰劑，B、 C、 D、 F組中各兔每周一、三、五、日給予0.5mg戊酸 雌二醇，總量為2mg/周，B、C、E組給予雷羅昔芬30mg/d，B、G組給予阿司匹林12.5 mg/d。
(二)采用HE染色、油紅O染色、天狼星紅染色、巨噬細(xì)胞的免疫組化等方法測(cè) 定藥物處理后粥樣硬化斑塊變化
于高脂喂養(yǎng)第12周末應(yīng)用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行病理學(xué)研究。以3%的 戊巴比妥鈉過(guò)量處死實(shí)驗(yàn)兔，用生理鹽水及4%的多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動(dòng)脈 后，自主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈分叉處離斷整個(gè)主動(dòng)脈，取主動(dòng)脈根部5nun標(biāo)本進(jìn)行切片 (橫切面)冊(cè)染色,觀察橫切面動(dòng)脈硬化病變的內(nèi)膜/中膜厚度比值；苦味酸天狼星紅染 色，觀察斑塊內(nèi)膠原纖維的含量，免疫組化法半定量觀察橫切面斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和基質(zhì) 金屬蛋白酶-9(薩P-9)的陽(yáng)性率。其余部分從胸主動(dòng)脈起始部到腹主動(dòng)脈分叉處縱行剖 開(kāi)，油紅O染色，分析縱剖面斑塊面積及占主動(dòng)脈的面積比。
結(jié)果表明1.偽手術(shù)組、雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素、雌激 素組和雌激素+孕激素組的雌激素水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0. 01)。 2.雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素和雌激素組的血清總膽固醇(TC) 水平和低密度脂蛋白(LDL)明顯低于對(duì)照組(尸〈0.05)，而高密度脂蛋白(HDL)和甘 油三酯(TG)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸〉0.05)。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雌激素組及雌激素+孕激素組之間各項(xiàng)血脂指標(biāo)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸〉0.05)。 3.對(duì)照組內(nèi)膜明 顯增厚，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組可見(jiàn)內(nèi)膜稍增 厚，與對(duì)照組比較有顯著差異性(戶〈0.01)，對(duì)照組的I/M比值明顯大于雷洛昔芬+雌激 素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素、雌激素組和偽手術(shù)組的I/M比值，它們間有顯著差 異性(尸<0.01)。油紅O染色顯示偽手術(shù)組可見(jiàn)脂質(zhì)沉積斑塊，，對(duì)照組則為大面積脂 質(zhì)沉積斑塊，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組與對(duì)照組 有明顯差異(P〈0.01)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組和雌激素組 之間差異不顯著(尸〉0, 05),雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組和雌激素+孕激素組之間存在 顯著差異性(尸〈0.05)。
4.對(duì)照組與雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素 組、雌激素組雌激素+孕激素組血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1的水平之間有顯著差異'性(尸 〈0.01)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素、雌激素組、雌激素+孕激素 組之間無(wú)顯著差異性(,〉0.05)。 5.對(duì)照組巨噬細(xì)胞的含量明顯高于雷洛昔芬+雌、激素+ 阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、雌激素組和雌激素+孕激素組(戶〈0.01)，雷洛昔芬 +雌激素+阿司匹林組分別和雌激素組及雌激素+孕激素組都存在顯著差異性(Z5〈0. 01)。 .6.對(duì)照組MMP-9的含量明顯高于雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、 雌激素組和雌+孕組(尸<0.01)，雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組、雷洛昔芬+雌激素組、 雌激素組和雌+孕組四組之間無(wú)顯著差異(尸>0.05) 。 7.雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林 組和雌激素組斑塊內(nèi)膠原纖維含量明顯高于對(duì)照組(尸〈0.05)，且雷洛昔芬+雌激素+阿 司匹林組和雌激素組斑塊內(nèi)膠原纖維含量有顯著差異性(尸<0.05)。 (三)乳腺、子宮、血小板聚集率、骨密度變化檢測(cè)
給藥12周后檢測(cè)血小板聚集功能，取子宮并稱重，取乳腺組織，HE染色，觀察乳 腺腺腔面積比，用骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)定骨密度。結(jié)果表明偽手術(shù)組乳房正常發(fā)育，是乳 腺腺腔面積比值最大的一組，對(duì)照組各兔的乳房萎縮，乳腺腺腔面積最小。雷洛昔芬+ 雌激素+阿司匹林組與雌激素組、和雌激素+孕激素組存在顯著差異性(尸〈O.OD。對(duì)照 組各兔的子宮重量最小。雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組與雌激素組存在顯著差異性(尸 〈0.01),雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組與雌激素+孕激素組存在顯著差異性(P<0.01)。 雷洛昔芬+雌激素+阿司匹林組的血小板聚集功能明顯低于雷洛昔芬+雌激素組、雌激素 組和雌激素+孕激素組(尸〈O.OD。各組中兔的骨密度無(wú)顯著差異性(F>0.05)。
權(quán)利要求
1.一種含雷洛昔芬的藥物配伍組合，其特征是所述藥物組合物由鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇和阿司匹林組成，其中鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇與阿司匹林的質(zhì)量比例為105∶1∶43.75。
2. 權(quán)利要求1所述的含雷洛昔芬的藥物配伍組合在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含雷洛昔芬的藥物配伍組合及其在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化性疾病藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物組合由鹽酸雷洛昔芬、戊酸雌二醇、阿司匹林組成，其質(zhì)量比例為105∶1∶43.75。通過(guò)絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型證實(shí)本發(fā)明組合物比單一藥物及傳統(tǒng)的性激素替代療法能更好地抑制絕經(jīng)后動(dòng)脈粥樣硬化并減輕副作用，預(yù)示其在制備防治絕經(jīng)后女性動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的新藥開(kāi)發(fā)和應(yīng)用中有較為誘人的發(fā)展前景。
文檔編號(hào)A61K31/616GK101637473SQ200910016409
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者戶可慶, 李繼福, 楊發(fā)林, 欣 王, 紅 賀 申請(qǐng)人:山東大學(xué)