專利名稱：制造負載生長因子的顆粒的方法以及由此制得的顆粒的制作方法
制造負載生長因子的顆粒的方法以及由此制得的顆粒本發(fā)明涉及制造負載生長因子的顆粒材料(顆粒)的方法、由此制得的顆粒及其 用于提高植入材料(尤其是金屬或陶瓷材料)生長入骨質(zhì)中的應用，這些植入材料用于諸 如人造骨骼、關節(jié)、牙齒植入物以及微植入物的植入物中。最近幾年，植入人造關節(jié)或骨骼對于例如治療關節(jié)發(fā)育異?；蛘呙摪滓约耙蜿P節(jié) 錯位導致的關節(jié)磨損所產(chǎn)生的疾病越來越重要。植入物的功能以及用于制造它們的材料 (包括金屬，如鈦或者金屬合金；以及陶瓷或塑料，如特氟隆(Teflon)或者聚交酯)得到不 斷改進，使得植入物在90-95%的病例中能在成功的康復過程之后具有高達10年的使用壽 命。盡管有這些進步以及改進的手術方法，植入仍舊是一種艱難和有壓力的介入措 施，尤其是當這種植入關系到針對植入物的長期康復過程，包括長時間呆在具有康復檢測 的診所和康復中心。除了疼痛之外，長時間的治療以及與熟悉環(huán)境的分離也會給所涉及的 患者帶來沉重的壓力。而且，由于需要精心的護理，長期康復過程要付出高昂的人力成本和 治療成本。近年來，為滿足植入物成功長入所需，對該方法在分子水平的理解越來越迫切。結 構相容性和表面相容性對植入物的組織相容性來說是致關重要的。狹義上說，生物相容性 僅取決于表面。蛋白質(zhì)對所有水平的融合來說很重要。如下文所述，在植入手術過程中，由 于起始吸附蛋白質(zhì)層的形成(如首批生長在這一層的細胞)，它們已決定了植入物生長的
進一步方法。就植入物(也稱為生物材料)與組織之間的分子相互作用而言，它們之間發(fā)生許 多顯示為極具分級結構的反應。作為第一生物反應，在生物材料表面上發(fā)生了蛋白質(zhì)的吸 附。在由此形成的蛋白質(zhì)層中，單一蛋白質(zhì)分子隨后通過例如構象改變而轉化為位于表面 上的信號傳導物質(zhì)，或者蛋白質(zhì)片段通過催化(蛋白質(zhì)水解)反應作為信號傳導物質(zhì)(分 子信號(cue))傳遞。在分子信號的激發(fā)下，在下一階段發(fā)生細胞沉積，該沉積包括許多類細胞，例如白 細胞、巨噬細胞、免疫細胞和最終的組織細胞(成纖維細胞、纖維囊腫(fibrocyst)、成骨細 胞和骨細胞)。在這一階段，其它信號傳導物質(zhì)(也稱為介質(zhì)，如細胞因子、趨化因子、形態(tài) 發(fā)生因子(morphogene)、組織激素和真激素(realhormone))發(fā)揮重要的作用。在生物相容 的情況下，發(fā)生植入物與整個器官的整合，理想的是形成永久的植入物。從近年來對骨生成分子水平的研究來看，化學信號傳導物質(zhì)(對骨骼生長有影響 的所謂的“骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)”(BMP-1-BMP-15))變得越來越重要。BMP (尤其是BMP-2和 BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7)是骨誘導性蛋白，通過影響前體細胞到成骨細胞的增殖和分化 來刺激骨骼形成和骨骼康復。而且，它們有助于形成堿性磷酸酶、激素受體、骨骼特異性物 質(zhì)(如I型膠原質(zhì))、成骨素、骨橋蛋白(osteopontine)和最終的礦化作用。BMP分子調(diào)節(jié)各前體細胞的三種關鍵的反應趨化性、有絲分裂和分化。而且，BMP 在胚胎形成、骨骼和其它組織的器官形成中起到重要作用，這樣，已知成骨細胞、成軟骨細 胞、成肌細胞和血管平滑肌細胞為靶細胞(通過BMP-2阻斷增殖)。
同時，已知包含15BMP的許多同種型。除了 BMP-I外，所有BMP都是“轉化生長因 子β (TGF-β)超家族”的一部分，在各細胞的表面上已經(jīng)找到它們的特異性受體。由于在 鼠、狗、兔和猴子的缺損康復實驗中已成功使用重組ΒΜΡ-2和/或ΒΜΡ-7，似乎沒有任何物種 出現(xiàn)特異性。在現(xiàn)有技術中，已知許多關于用來促進骨質(zhì)生長的負載材料和顆粒領域的實驗。 有關將ΒΜΡ-2結合到羥基磷灰石(hydroxyl apatite, HAP)的報道又回到BMP研究的起始 階段，即Urist在1984年發(fā)現(xiàn)BMP可以通過在羥基磷灰石柱上色譜分離純化。在那一年， Urist提到引起軟骨在小鼠中形成的BMP和TCP聚集(US4，596，574)。在之后的20年中，發(fā) 表了大量有關磷酸鈣(羥基磷灰石、磷酸三鈣)和BMP-2組合的應用的報道。此外，也提到 將BMP-2與指定量的膠原或羥基磷灰石混合，然后立刻將混合物凍干，并在凍干之后使用。 在另一報道中還研究了在變性劑(如脲)存在下，將變性的rh-BMP-2吸附到羥基磷灰石。 即便在這種激烈的條件下，僅有少量的BMP-2結合到羥基磷灰石上。目前，BMP-2作為“可吸收膠原海綿”上的Induct Os (Wyeth,惠氏)或者 Ossigraft (Stryker，斯特瑞克)用于治療用途上。對那些材料來說相同的是每體積單 位使用的BMP的濃度相對較低，即 2ml顆?；蚝＞d的所需體積對應于lmgBMP-2。僅僅在 非生理條件(如在堿性或酸性的極端PH值下或者在中性范圍時在去污劑存在下)，較大量 的BMP-2才是可溶的。在許多情況下，這些量對于根據(jù)傷口大小施用BMP-2以及最佳地刺 激骨骼生長(尤其是存在其它骨替換物質(zhì)時)是不夠的。通過這些施用形式(由于BMP-2 與膠原的不充分結合)以及在單獨的早期遞送階段(“突釋期”，burst phase)將BMP-2提 供給器官會存在干擾。下文中，本發(fā)明基于對于BMP-2在顆粒材料，尤其是無機骨替換材料如羥基磷灰 石、磷酸三鈣、碳酸鈣、氧化鋁或者它們混合物(尤其是它們兩相或三相混合物)上吸附的 觀察，如果吸附步驟在受控PH值下進行足夠長的時間，與上文所述材料相比，在固相上每 體積份可以獲得更多量的BMP，尤其是BMP-2。在吸附步驟之后，第二步較好用至少10倍液 體體積(相比所用的固相體積)進行大量的洗滌。這樣，可確保除去可溶于液相中的BMP-2。 由此，將所謂的突釋期顯著降低到1-2%的吸附的BMP-2量。因此，可實現(xiàn)在小隔室中施加 高劑量的BMP-2的選擇?？梢栽趐H 4-5(尤其是pH 4.5)的酸性范圍或者在pH 9_11(尤 其是PH 10)的弱堿性范圍內(nèi)在緩沖水溶液中涂覆所述表面。而且，當顆粒材料是可生物再 吸收的(bioresorbable)材料時很有利。通過本發(fā)明的方法，不能從顆粒上洗去的大量骨生長因子通過化學鍵合的形式被 吸附到表面上，這不同于 與HAP或TCP的混合/組合(即混合物)·例如包含/捕獲在孔隙中·通過例如液體的凍干和材料中的沉積進行結合·涂覆金屬或陶瓷，其中，例如，將顆粒或模塑體浸沒在BMP溶液中，并立即進行干 燥步驟以除去溶液[BMP-2干燥成表面上的一層](即不是吸附(adsorption)，而是附著 (adhesion))在BMP-2 (表1)對各種羥基磷灰石的結合研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)BMP，尤其是BMP-2 大量地在大范圍內(nèi)線性結合到磷酸鈣上。
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在表1中，顯示了在pH 4. 5下進行的吸附實驗的結果(20mM乙酸鈉pH 4. 5)，其 中，吸附/孵育已經(jīng)進行了至少30分鐘(t1/2 = 16d)，較好至少1-2小時(t1/2 = 19d)，尤
其優(yōu)選至少4-6小時(t1/2 = 20d)。最長的半壽期值為孵育15-17小時(t1/2 = 23d)。較 好在去污劑如SDS存在下，在堿性范圍內(nèi)進行涂覆(緩沖液125mM硼酸鹽/0.066% SDS, PH 10.0)。在吸附步驟之后，通過用10倍于材料體積的PBS緩沖液(pH 7. 4，137mM NaCl, 8. ImM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 1. 5mM KH2PO4)洗滌 5 次來除去去污劑。在顆粒材料上吸附BMP-2之后，測量脫附。為此，將樣品各自轉移到2ml緩沖液 (50mM Tris/HCl,150mMNaCl,pH 7.4)中。在預定間隔之后，將樣品取出，進行洗滌(3X2ml 緩沖液(50mM Tris/HCl,150mM NaCl, pH 7. 4))，并在Y-計數(shù)器中計數(shù)。然后，將它們轉 移到2ml新鮮緩沖液中，進行下一次釋放間隔。被固定的BMP-2的量使用125碘輻射標記蛋 白質(zhì)并在Y計數(shù)器中計數(shù)來確定。使所有骨替換材料在室溫下，在溶有指定濃度的BMP-2的20mM乙酸鈉-緩沖液 (pH 4. 5)中孵育15小時。在50mM Tris/HCl, 150mM NaCl (pH 7.4)中測定脫附。在所謂的 突釋期中釋放的半壽期時間(僅僅涉及1-2%吸附量的BMP-2)為0. 4-1. 1天(未顯示)。 APS 氨丙基三乙氧基硅烷；Algipore (密度 0. 63g/cm3 ； 1. 3X IO4個顆粒/克)， Algisorb (Dichte 0. 63g/cm3 ； 1. 3X IO4 個顆粒 / 克)，Co. Algoss GmbH,(阿高 斯公司，維也納)；Bon it , Company DOT GmbH (DOT股份有限公司，羅斯托克)；NuOss , Collagen Matrix ACE Surgical Supply Co.(膠原基質(zhì)ACE外科用品公司，布魯克敦 (Brockton)，MA, USA) ·本發(fā)明通過附圖進一步舉例說明

圖1顯示了從石灰石藻類獲得的Algipore -顆粒的超微結構(單位對應 10 μ m) 。Algisorb 具有相同的結果(摘自“Bone Augmentation in Oral Implantology" 《口腔移植學中的骨質(zhì)增大》，Khoury，F(xiàn).等人，第349頁，2007，QuintessenzVerlags-GmbH， 國際精萃出版集團，柏林)。圖2顯示了在含有MC3T3-E1細胞的細胞培養(yǎng)中，吸附在Algisorb(C^PD)上的 rhBMP-2的生物活性的證據(jù)，其中A =Algisorb,陰性對照-在培養(yǎng)基中沒有可溶rhBMP-2)；B. Algisorb,陽性對照-將50nM可溶rhBMP-2加入到培養(yǎng)基中)；C. rhBMP-2 吸附到 Algisorb ( 0. 5mg rhBMP-2 每克 Algisorb)(保持潮濕)；D. rhBMP-2 吸附至Ij Algisorb ( 0. 5mg rhBMP—2 每克 Algisorb)(干燥的)；圖3A顯示rhBMP-2的親水和疏水吸附；和圖3B顯示rhBMP-2的釋放(第一順序的反應)。圖1顯示了從石灰石藻類獲得的微結構Algipore (阿高斯公司，維也納)的電 子顯微鏡圖，相比其它多孔羥基磷灰石，其具有顯著提高的康復和再吸收性能。紅色石灰石 辣根菜(Cochlearia officinalis)的原始 CaCO3 被羥基磷灰石(HAP) ( Algipore )或者 磷酸三鈣(TCP) ( Algisorb )替換，保持原微結構[1]。如圖2所示，吸附在Algisorb上的rhBMP-2的生物活性證據(jù)在含有MC3T3-E1細胞 的細胞培養(yǎng)基中是成功的。因此，5X105個新鮮用胰蛋白酶消化的MC3T3-E1細胞在無菌條 件下被接種在Algisorb-顆粒上(這些顆粒用纖維蛋白粘合劑固定在48孔微滴定板的孔 底部)，并在含有10% FCS的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，吉必可)中孵育。在6_12小時之后， 用新鮮的含有FCS的α -MEM培養(yǎng)基替換融合生長在板中的細胞的培養(yǎng)基，所述細胞進一步在對照-Algisorb或者吸附有BMP-2的Algisorb (沒有用APS功能化)上生長6天。 6天之后，用杜爾貝科(Dulbecco)磷酸緩沖液洗滌長有細胞的Algisorb-顆粒，并用2%的 多聚甲醛固定。用磷酸酶檢測試劑盒ELF-97 (Molecular Probes, Inc.，分子探針公司，奧 勒岡，USA)，使用熒光顯微鏡(Nikon Eclipse E400，10兆像素照相機，尼康公司，杜塞爾多 夫，德國，激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長530nm)，對堿性磷酸酶(綠色熒光染料)進行成像和測 定。如圖3所示，以下可以看到本發(fā)明高密度固相BMP-2的性能。從 1. 3X IO4個顆 粒/克Algisorb (6. 7mg/g的rhBMP-2負載量)的顆粒數(shù)來計算，每個顆粒結合0. 5微克 rhBMP-2。這意味著2個顆粒(1微克)足夠在綿羊?qū)嶒炛刑峁╋@著的骨誘導[2]。按照發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，Algipore的改進性能一方面基于互連孔隙系統(tǒng)以及各向同 性(無定形)羥基磷灰石顆粒的存在，這與Bio-0SS(GeiStliCh，蓋思特利公司)的高結 晶羥基磷灰石相反。在本研究中，與Algipore相比，包含磷酸三鈣形式的石灰石藻類， Algisorb 因此具有進一步提高的再吸收性能。結合行為不僅在Algipore和Algisorb中顯示，類似行為也在其它羥基磷灰石中 出現(xiàn)。Algipore和Algisorb的特別之處在于結合的量在l-2mg/g或以上。這種量迄今在 本領域中也是未知的。使用本發(fā)明的方法，可以獲得超過7mgBMP-2/克顆粒(2. 8_4. 4mg/ cm3)(高密度固相BMP-2)。用在本發(fā)明中的材料Algipore和Algisorb的信息可以在文獻[1]中找到。因此， Algipore : 98%羥基磷灰石 HA-單相，和Algisorb : 80%磷酸三鈣 β -TCP, 19. 3% HA, 0.7%方解石CaCO3-在本發(fā)明中可以使用兩相/三相。對于后者，β-TCP和HA的所有兩相 /三相形式均可以使用，它們具有相同的電子顯微鏡結構。方解石為0. 3-0. %。發(fā)明人有關高密度固相ΒΜΡ-2性質(zhì)的研究進一步揭示了從 1. 3X IO4個顆粒/ 克Algisorb (6. 7mg/g的rhBMP-2負載量，圖1)的顆粒數(shù)來計算，每個顆粒結合0. 5微克 rhBMP-2。這意味著2個顆粒(1微克)足夠在綿羊?qū)嶒炛刑峁╋@著的骨誘導[2]。因此，在 本發(fā)明的方法中，可以在體內(nèi)和臨床中合理且無擴散損失地使用rhBMP-2。對于制造本發(fā)明的高密度固相BMP-2的方法，該方法在BMP-2含量/每體積單位 高于在水溶液中獲得的濃度的范圍內(nèi)有效。較好的是，在本發(fā)明中，使用BMP(優(yōu)選BMP-2) 的緩沖溶液，其濃度為0. 1-1. 5mg/ml緩沖溶液，較好是0. 5-1. 5mg/ml緩沖溶液。將這樣濃 度的包含BMP的緩沖溶液以一定量加入到顆粒中，加入量為能獲得以毫克BMP/克顆粒為單 位的所需的負載量。例如，如果想要2. 5毫克BMP/克顆粒的負載量，則將包含lmg/ml BMP 的5ml緩沖溶液加入到2g顆粒中。如果試驗體積相比凈重增大4倍，則得到7mg/g顆粒， 而不是結合10mg/g顆粒。而且，發(fā)明人未完成的研究表明可以獲得更高量(4-5毫克BMP 8_10毫克BMP/ 克顆粒)。因此，可以使用一定量(單位為ml)的根據(jù)濃度來預定的包含BMP的緩沖溶液。 由此，如果在使用過程中僅僅使用一些BMP-HAP組合物顆粒(例如，和植入物一起或者在上 頌竇的骨質(zhì)增大過程中)來再產(chǎn)生骨誘導，則使用本發(fā)明負載有骨生長因子的顆粒是足夠 的。發(fā)明人的體外研究顯示，結合到HAP的BMP-2是具有生物活性的。發(fā)明人在綿羊上的 進一步研究目前正在進行。而且，發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)和羥基磷灰石組合用作骨替換材料的磷酸三鈣(在上述Algisorb 中占約80%)可以和活化劑(如氨丙基三乙氧基硅烷)發(fā)生活化反應，從而使 BMP-2對顆粒表面的吸附提高至少2倍。因此，發(fā)明人揭示了每克由 80 %的TCP和 20 %的HAP組成的顆粒材料 (Algisorb)，可以結合與98%的HAP(Algipore)相同的結合量。更令人驚奇的是，本領域 技術人員所預期的是，如果僅是HAP在反應，則相比具有98 % HAP的Algipore而言，僅可 以結合額外的20% BMP(即Algisorb中的HAP份額)。發(fā)明人假設額外的60-70%的結合 的BMP-2被改性的TCP結合。因此，本發(fā)明也公開了在骨生長因子吸附之前，通過用活化方 式處理來活化顆粒材料。所述活化劑可選自硅烷，其中優(yōu)選使用氨基烷基烷氧基硅烷，如 氨丙基三乙氧基硅烷。這種活化處理通常如下所述進行在3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS， Sigma-Aldrich，西格馬-奧覺齊公司，Taufkirchen，塔吉城)在無水甲苯的5體積％溶液 混合物(50ml)中，于惰性氣體氣氛(氮氣5.0)中，在加熱的玻璃設備中加熱骨替換材料 (參見表1)至沸騰，回流3.5小時。在反應結束后，冷卻樣品，并各自在IOml的氯仿中洗滌 3次，在丙酮中洗滌3次，并在甲醇中洗滌3次。之后，將如此活化的顆粒材料(特別是由TCP、HAP或它們混合物組成(見表1)) 在PH 4-5的酸性范圍，在pH 4. 5(20mM乙酸鈉-緩沖液，pH 4. 5)或者在pH9_ll，優(yōu)選在pH 10(125mM硼酸鹽，0.066% SDS pH 10. 0)的弱堿性范圍內(nèi)，在骨生長因子(優(yōu)選BMP-2或 BMP-7)的緩沖溶液中處理至少30分鐘(t1/2 = 26d)，優(yōu)選至少4小時(t1/2 = 36d)，尤其優(yōu) 選至少15小時(t1/2 = 43d)。為此，在用氨丙基三乙氧基硅烷(APS)化學改性之后，用水洗 滌顆粒材料，隨后轉移到小的反應容器(2ml)中，其中各自裝有在20mM乙酸鈉-緩沖液(pH 4. 5)中或者在125mM硼酸鹽/0. 066% SDS-緩沖液(pH 10. 0)中的1. Oml BMP-2溶液。對 于將rhBMP-2吸附到材料，使用了三種不同的蛋白質(zhì)濃度0. 1、0.2和0. 3mg/ml。使用用125 碘輻射標記的蛋白質(zhì)確定被固定的BMP-2的量。為了防止突釋期(例如，過量釋放沒有吸附到顆粒表面上而僅僅是保留在顆粒上 的骨生長因子)，在吸附步驟之后優(yōu)選洗滌該顆粒，較好用10倍于顆粒材料體積的不含骨 生長因子的緩沖溶液(20mM乙酸鈉-緩沖液，pH 4. 5或者125mM硼酸鹽，0. 066% SDS pH 10. 0)分別洗滌三次。之后，在 pH 7. 4 的 PBS-緩沖液(137mM NaCl, 8. ImM Na2HPO4, 2. 7mM KCl，1. 5mM KH2PO4，pH 7. 4)中再洗滌 5 次。通過提供本發(fā)明的高密度固相BMP，可以用新的方式在體內(nèi)和臨床上合理且無任 何擴散損失地使用rhBMP-2。已經(jīng)顯示所述高密度固相BMP在凍干之后可以存儲數(shù)星期，而 活性不發(fā)生任何損失任何(見圖2)。本發(fā)明最早的研究顯示本發(fā)明的高密度固相BMP的儲 存期可延長至超過1-2年。由此，發(fā)明人認為BMP生物活性的保持可歸功于優(yōu)選在無菌條 件下使用的所述材料。文獻[1]Spassova, E. , Gintenreiter, S. , Halwax, Ε. , Moser, D. , Schopper, C. , & Ewers, R. (2007)Chemistry, Ultrastructure and Porosity of Monophasicand Biphasic Bone Forming Materials Derived from Marine Algae.(“源自海藻的單相禾口雙相骨形成 材料的化學、超微結構和多孔性，，)Materialwiss. fferkstofftech.，38，1BMP-27-1034.[2] Lichtinger, T. K. ， Muller, R. T. ， Schurmann, N. ， ffiemann, M.， Chatzinikoleidou, M. , Rumpf, H. M. , & Jennissen, H. P. (2001)Osseointegrationof Titanium Implants by Addition of Recombinant BoneMorphogenetic Protein 2 (rhBMP-2).( “通過添加重組骨形態(tài)形成蛋白2 (rhBMP-2)進行的鈦移植物的骨整合”) Materialwiss. Werkstofftech. ,32，937—941.
權利要求
一種制造負載有生長因子的無機顆粒材料的方法，其中，選自陶瓷材料的所述顆粒材料在pH 4-5的酸性范圍或者在pH 9-11的弱堿性范圍的緩沖水溶液中用生長因子處理至少30分鐘。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖水溶液的PH值為4.3-4. 7，尤其是4. 5。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖水溶液的PH值為9.5-10. 5，尤其 是10。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述顆粒材料的粒度為10-500 微米，并且具有互連孔隙結構。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述顆粒材料由羥基磷灰石、磷 酸三鈣、碳酸鈣、氧化鋁或者它們的混合物組成。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，使用具有化學活化的表面的顆 粒材料。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，具有化學活化的表面的所述顆粒材料通過 用活化劑處理顆粒材料來獲得，優(yōu)選所述活化劑選擇硅烷類。
8.如以上任一項權利要求所述的方法，其特征在于，在負載步驟之后，將所述無機顆粒 材料與緩沖水溶液分離，然后用不含生長因子的至少相同體積的緩沖溶液洗滌至少一次， 并優(yōu)選進行干燥。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述干燥步驟包括凍干。
10.如上述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，使用BMP-2或BMP-7作為生長因子。
11.按照上述任一項權利要求所述方法制得的顆粒材料。
12.權利要求11所述顆粒材料在制造促進骨生長的藥物組合物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及制造負載有生長因子的顆粒材料(顆粒)的方法、由此制得的顆粒以及用于改善植入材料向骨質(zhì)中生長的應用。
文檔編號A61L27/54GK101883593SQ200880114486
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權日2007年10月29日
發(fā)明者K·澤林登, 赫伯特·詹尼森 申請人:赫伯特·詹尼森