專利名稱：Rna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA疫苗。
背景技術(shù)：
在過去幾十年中，I型過敏性疾病成為西方工業(yè)化國家的主要公共健康問題，至今 已有約25%的人口受到影響。除了家庭傾向之外，成長條件(包括早期兒童期的感染)和飲食習(xí)慣，還有環(huán)境因 素例如被動吸煙或暴露于空氣污染，均被證明與特異反應(yīng)性(atopic)疾病發(fā)展的重大相 關(guān)性。特異性免疫治療，即多年進(jìn)行劑量漸增的變應(yīng)原的注射，是現(xiàn)在唯一可獲得的治 療性干預(yù)。但是，由于高劑量給藥，所以存在明顯的導(dǎo)致過敏的副作用，并且使用粗制的、幾 乎沒有鑒定的變應(yīng)原提取物存在病人針對以前未識別的成分而致敏的可能性。此外，沒有針對I型過敏癥的預(yù)防性疫苗，雖然預(yù)防具有增加的遺傳風(fēng)險的年幼 兒童發(fā)展過敏性疾病可能是最可行的方法。訓(xùn)練原態(tài)免疫系統(tǒng)比平衡已經(jīng)出現(xiàn)的過敏性免 疫表型較容易實(shí)現(xiàn)。在Ying等人(Nature Med(1999) 5 :823_827)中公開了自我復(fù)制的RNA疫苗，其 RNA編碼β-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶經(jīng)常被用作研究免疫過程的模式分子。在Ying 等人中，研究了抗腫瘤反應(yīng)并且觀察到了 CD8陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)。但是，在Ying等人中未研 究的CD4陽性細(xì)胞，而不是CD8陽性細(xì)胞，調(diào)節(jié)針對過敏癥的免疫保護(hù)并且防止B細(xì)胞中朝 向IgE的種類轉(zhuǎn)換。最近，基于核酸的疫苗已經(jīng)成為有前景的方法，以偏向過敏性疾病的免疫機(jī)理。 已經(jīng)在很多動物研究中表明，DNA疫苗可以防止I型過敏性反應(yīng)的誘導(dǎo)，甚至可以逆轉(zhuǎn)已 經(jīng)建立的過敏性 ΤΗ2 免疫狀態(tài)(Weiss, R.等人(2006) Int Arch AllergyImmunol 139 332-345)。但是，引起了基于DNA的疫苗的安全性的一般考慮引入的DNA分子可以潛在地整 合入宿主基因組，或者，由于其分布在各種組織，可以引起變應(yīng)原的持續(xù)遞送，因此在具有 預(yù)先存在變應(yīng)原特異性IgE分子的病人中誘導(dǎo)不可控制的過敏性反應(yīng)。而且，對任何抗過 敏癥疫苗來說，健康兒童的疫苗接種需要最高的安全標(biāo)準(zhǔn)。因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供克服DNA疫苗缺點(diǎn)的變應(yīng)原疫苗，并且仍然允許過敏癥 的有效治療或成功預(yù)防針對變應(yīng)原的致敏。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明涉及RNA疫苗，其包含至少一個編碼至少一個變應(yīng)原或其衍生物的 RNA分子，其中所述的變應(yīng)原是下列的變應(yīng)原赤楊(Alnus glutinosa)、煙草赤星病菌 (Alternaria alternata)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)、序菜(Apiumgraveolens)、花 生(Arachis hypogaea)、撫枝樺(Betula verrucosa)、歐洲我鳥耳櫪(Carpinus betulus)、f}\ ^ (Castanea sativa)、· ± 豐支 包 β (Cladosporiumherbarum)、f}\ W (Corylus avellana)Λ 日 ^(Cryptomeria japonica)Λ Sl fe (Cyprinus carpio)Λ 古月胃卜
(Daucus carota)、歐洲室塵輸(Dermatophagoidespteronyssinus)、歐洲山毛櫸(Fagus sylvatica)、家貓(Felis domesticus)、巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)、美國雪松 (Juniperus ashei)、蘋果(Malus domestica)、白櫟(Quercus alba)禾口貓尾草(Phleum pratense)0結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼變應(yīng)原或其衍生物的RNA分子還可以有效用作RNA疫苗。RNA疫苗 表現(xiàn)出屬于DNA疫苗的治療過敏性疾病方面的性質(zhì)它們以最純的形式提供變應(yīng)原，即遺 傳信息，并且與DNA疫苗類似，它們誘導(dǎo)偏向THl的免疫反應(yīng)。而且，對于DNA疫苗開發(fā)的 用于產(chǎn)生低變應(yīng)原的基因產(chǎn)物的方法，也可應(yīng)用于RNA疫苗。此外，RNA疫苗具有相對于DNA疫苗的顯著的優(yōu)點(diǎn)(i)疫苗含有變應(yīng)原的純的 遺傳信息但沒有通常存在于用于DNA疫苗的質(zhì)粒骨架中的附加的外源序列，例如病毒啟動 子、抗生素抗性基因或病毒/細(xì)菌調(diào)節(jié)序列。(ii)RNA不能整合入宿主基因組，因此去除了 惡性風(fēng)險。(iii) RNA在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被翻譯，因此不需要細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，這使得RNA 疫苗不依賴于轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核和轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，以及不依賴于核的階段。(iv)由于RNA的迅 速降解，外源轉(zhuǎn)基因的表達(dá)壽命短，這避免了不可控制的長期抗原表達(dá)。本發(fā)明的RNA疫苗可以包含一個以上的編碼變應(yīng)原的RNA分子，優(yōu)選為兩個、三 個、五個、十個等。但是，一個RNA分子也可以編碼至少一個變應(yīng)原，意思是一個RNA分子包 含編碼至少一個、兩個、三個、五個、十個等不同或相同的變應(yīng)原的核苷酸序列。一個或多個 RNA分子所編碼的變應(yīng)原可以選自下面所列的任意組合。本文所用的術(shù)語“RNA疫苗”是指包含如本文所定義的RNA分子的疫苗。但是，所 述疫苗當(dāng)然可以包含其它的物質(zhì)和分子，當(dāng)給予個體所述疫苗時，所述物質(zhì)和分子是必需 的或有利的(例如藥學(xué)賦形劑)。術(shù)語“某某的變應(yīng)原”和術(shù)語“源自某某的變應(yīng)原”以及“從某某獲得的變應(yīng)原” 可以相互替換地使用。其意思是該變應(yīng)原天然表達(dá)于所述生物中，并且編碼所述變應(yīng)原的 DNA/RNA被分離從而產(chǎn)生本發(fā)明的RNA分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予哺乳動物或人類時，不是所有的編碼變應(yīng)原的RNA分子都能誘 導(dǎo)變應(yīng)原特異性抗體的形成。例如，編碼艾蒿(Artemisia vulgaris)變應(yīng)原Artvl和油橄 攬(Olea europea)變應(yīng)原Ole e 1的RNA分子不能誘導(dǎo)Thl記憶并抑制變應(yīng)原特異性IgE 反應(yīng)。但是，編碼上述來源的變應(yīng)原的RNA分子能夠做到。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，赤楊的變應(yīng)原是Aln g 1，煙草赤星病菌的變應(yīng) 原選自 Alt a l、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12 或 Alt a 13，豚草的變應(yīng)原選自 Amb a U Amb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9 或 Amb a 10，芹菜的變應(yīng)原選自 Api g 1、Api g 4 或 Api g 5，花 生的變應(yīng)原選自 Ara h l、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7 或 Ara h 8，疣枝樺的變應(yīng)原選自Bet ν U Bet ν 2、Bet ν 3、Bet v4、Betv 6或Betv 7，歐洲鵝 耳櫪的變應(yīng)原是Carb 1，歐洲栗的變應(yīng)原選自Cas s U Cas s 5或Cas s 8，多主枝孢霉 的變應(yīng)原選自 Cla h 2,Cla h 5,Cla h 6,Cla h 7,Cla h 8,Cla h 9,Cla h 10 或 Cla h 12，歐洲榛的變應(yīng)原選自 Cor a UCor a 2、Cora 8、Cor a 9、Cor a 10 或 Cor a 11，日本柳杉的變應(yīng)原選自Cryj 1或Cryj 2，鯉魚的變應(yīng)原是Cyp c 1，胡蘿卜的變應(yīng)原選自Dau c 1或 Dau c 4，歐洲室塵蟎的變應(yīng)原選自 Derp U Derp 2、Derp 3、Derp 4、Derp 5、Derp 6、Derp 7、Derp 8、Derp 9、Derp 10、Derp 11、Derp 14、Derp 20、Derp 21 或克隆 30 變應(yīng) 原，歐洲山毛櫸的變應(yīng)原是Fag s 1，家貓的變應(yīng)原選自Fel d UFel d 2,Fel d 3,Fel d 4, Fel d 5w、Fel d 6w 或 Fel d 7w，巴西橡膠樹的變應(yīng)原選自 Hev b UHev b 2, Hev b3、 Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6. 01、Hev b 6. 02、Hev b 6. 03、Hev b 7. 01、Hev b 7. 02、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12 或 Hev b 13，美國雪松的變應(yīng)原選自 Jun a 1、 Jun a 2或Jun a 3，蘋果的變應(yīng)原選自Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3或Mal d 4，白櫟的變 應(yīng)原是 Que a 1，貓尾草的變應(yīng)原選自 Phl ρ UPhl ρ 2, Phl ρ 4, Phl ρ 5, Phl ρ 6, Phl ρ 7, Phl ρ IUPhl ρ 12 或 Phl ρ 13。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，變應(yīng)原選自草花粉Phl ρ l,Phl ρ 2,Phl ρ 5,Phl ρ 6,Phl ρ 7,Phl ρ 12房屋塵螨Der ρ 1，Der ρ 2，Der ρ 7，Der ρ 21，克隆 30 變應(yīng)原 (PCT-申請 ΑΤ2007/000201，奧地利專利申請 AT 503530 MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPTTTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDPHKFYICSNWE AVHKDCPGNT RffNEDEETCT,SEQ ID No. 1)樺樹花粉Bet ν 1及其同源的樹木(Aln g 1，Cor a 1，F(xiàn)ag s 1) 或食物變應(yīng)原)Mal d l,Api g 1, Pru ρ 1)貓F(tuán)el d 1，F(xiàn)el d 2野草(豚草屬，艾屬)Amb a 1柏科/ 杜松屬 / 雪松 Cryj 1，Cryj 2，Jun a 1，Jun a 3，Cha ο 1，Cha ο 2, Cup a 1，Cup a 3, Jun a 1，Jun a 3, Pla a3花生 Ara h 1, Ara h 2，Ara h 4榛實(shí) Cora 8, Cor a 9魚 / 蝦 Gad c 1, Cyp c 1, Pen a 1用于本發(fā)明的RNA疫苗中的特別優(yōu)選的變應(yīng)原選自Aln g 1、Alt a 1、Amb a 1、 Api g UAra h 2,Bet ν 1、β-酪蛋白、Car b UCas s UCla h 8, Cor a UCryj UCyp c U Dau c U Der ρ 2、Fag s U Fel d 1、Hev b 6、Jun a U Mal d 1、卵清蛋白(OVA)、 Phl ρ UPhl ρ 2、Phl ρ 5、Phl ρ 6 或 Phl ρ 7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上面列舉的變應(yīng)原特別適合用于RNA疫苗。但是當(dāng)然也可能將本發(fā)明 用于其它的變應(yīng)原，例如 Amb a UAmb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、 Amb a 9、Amb a 10、Amb t 5、Hel a KHel a 2、Hel a 3、Mera l、Che a l、Che a 2、Che a 3、Sal k 1、Cat r l、Pla 1 l、Hum j l、Parj l、Parj 2、Parj 3、Par ο l、Cyn d l、Cyn d7 λ Cyn d 12、Cyn d 15、Cyn d 22w、Cyn d 23 Λ Cyn d 24、Dac g KDac g2、Dac g 3、Dac g 5、Fes ρ 4w、Hol 1 K Lol ρ K Lol p2、Lol ρ 3、Lol ρ 5、Lol ρ IK Pha a K Phl ρ 1、 Phl ρ 2、Phl ρ 4、Phl ρ 5、Phl ρ 6、Phl ρ 11、Phl ρ 12、Phl ρ 13、Poa ρ UPoa ρ 5、 Sor h UPho d 2、Aln g UBet ν UBet ν 2、Bet ν 3、Bet ν 4、Bet ν 6、Bet ν 7、Car b 1、Cas s K Cas s 5、Cas s 8、Cor a Cor a 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 10、Cor a 11、Que a K Fra e K Lig ν K Syr ν K Cry j K Cryj 2、Cup a K Cup s K Cup s 3w、 Jun a K Jun a 2、Jun a 3、Jun ο 4、Jun s K Jun ν K Pla a K Pla a 2、Pla a 3Λ Aca s 13、Blo t UBlo t 3、Blot 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t IUBlo t 12、Blo t 13、Blo t 19、Der f l、Derf2、Der f3、Der f 7、Der f 10、Der f IUDer f 14、Der f 15、 Der f 16、Der f 17、Der f 18w、Der m K Der ρ K Der ρ 2、Der ρ 3、Der ρ 4、Der ρ 5、 Der ρ 6λDer p7、Der ρ 8、Der ρ 9、Der ρ 10、Der ρ IKDer ρ 14、Der ρ 20、Der ρ 21、 Eur m 2、Eur m 14、Gly d 2，Lep d K Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10、Lep d 13、 Tyr ρ 2λ Tyr ρ 13、Bos d 2、Bos d 3、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8、Can f l、Can f2、Can f3、Can f4、Equ c KEqu c 2、Equ c 3、Equ c 4、Equ c 5、Fel d KFel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w、Fel d 7w、Cav ρ K Cav ρ 2、Mus ml、Rat η UAlt a UAlt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12、 Alt a 13、Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h 8、Cla h 9、Cla h 10、Cla h 12、 Asp fl 13、Asp f UAsp f2、Asp f3、Asp f4、Asp f5、Asp f6、Asp f7、Asp f8、Asp f9、Asp f IO^Asp f IUAsp f 12^Asp f 13^Asp f 15^Asp f 16、Aspf 1 了、Asp f 18^Asp f22w^ Asp f23、Asp f27、Asp f28、Asp f29、Asp η 14、Aspn 18、Asp η 25、Asp ο 13、Asp ο 21、 Pen b 13、Pen b 26、Pen ch 13、Pen ch 18、Pen ch 20、Pen c 3、Pen c 13、Pen c 19、Pen c 22w、Pen c 24、Pen ο 18、Fus c KFus c 2、Tri r 2、Tri r 4、Tri t K Tri t 4、Cand a 1 λ Cand a 3、Cand b 2、Psi c K Psi c 2、Cop c K Cop c 2、Cop c 3、Cop c 5、Cop c 7λRho m URho m 2、Mala f2、Mala f 3、Mala f 4、Mala s UMala s 5、Mala s 6、Mala s 7、Mala s 8、Mala s 9、Mala s 10、Mala s IUMala s 12、Mala s 13、Epi ρ UAed a 1、 Aed a 2、Api m K Api m 2、Api m 4、Api m 6、Api m 7、Bom ρ 1, Bom ρ 4、Bla g K Bla g 2、Bla g 4、Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Per a KPer a 3、Per a 6、Per a 、 Chi k 10、Chi t 1—9、Chi t 1.01、Chi t 1. 02、Chi t 2. 0101、Chi t 2. 0102、Chi t 3、 Chi t 4、Chi t5、Chit 6. 01、Chi t 6. 02、Chi t 7、Chi t 8、Chi t 9、Cte f UCte f2、 Cte f3、Tha pl、Lep s K Dol m K Dol m 2、Dol m 5、Dol a 5、Pol a K Pol a 2、Pol a 5、Pol dl、Pol d 4、Pol d 5、Pol e UPol e 5、Pol f5、Pol g 5、Pol m 5、Vesp c UVesp c 5λVesp m KVesp m 5、Ves f5、Ves g 5、Ves m KVes m 2、Ves m 5、Ves ρ 5、Ves s5、 Ves vi 5、Ves ν UVes ν 2、Ves ν 5、Myr ρ UMyr ρ 2、Sol g 2、Sol g 4、Soli2、Sol i 3、Sol i 4、Sol s 2、Tria ρ K Gad c K Sal s K Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、 Bos d 8、Gal d UGal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Gal d 5、Met e UPen a UPen i UPen m l、Pen m 2、Tod ρ K Hel as K Hal m K Ran e K Ran e 2、Bra j K Bra η K Bra ο 3λ Bra r KBra r 2、Hor ν 15、Hor ν 16、Hor ν 17、Hor ν 21、Sec c20、Tri a 18、Tri a 19、Tri a 25、Tri a 26、Zea m 14、Zea m 25Λ Ory s KApi g KApi g 4、Api g 5、Dau c UDau c 4λ Cor a L04、Cor a 2、Cor a 8、Fra a 3、Fra a 4、Mal d UMal d 2、Mal d 3、Mal d 4λ Pyr c KPyr c 4、Pyr c 5、Pers a KPru ar KPru ar 3、Pru av KPru av 2、 Pru av 3λ Pru av 4、Pru d 3、Pru du 4、Pru ρ 3、Pru ρ4Λ Aspa ο K Cro s K Cro s 2、 Lac s K Vit ν K Mus χρ K Ana c K Ana c 2、Citl 3、Cit s K Cit s 2、Cit s 3、Lit c l、Sin a K Gly m K Gly m 2、Gly m 3、Gly m4、Vig r K Ara h K Ara h 2、Ara h 3、 Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7、Ara h8、Len c KLen c 2、Pis s KPis s 2、Act c KAct c 2 λ Cap a Iw Λ Cap a 2、Lyc el Λ Lyc e 2、Lyc e 3、Sola t KSola t 2、Sola t 3、 Sola t 4、Ber e K Ber e 2、Jug nl、Jug η 2、Jug r K Jug r 2、Jug r 3、Ana ο K Ana ο 2λ Ana ο 3、Ric c K Ses i K Ses i 2、Ses i 3、Ses i 4、Ses i 5、Ses i 6、Cuc m 1、 Cue m 2、Cue m 3、Ziz m K Ani s K Ani s 2、Ani s 3、Ani s 4、Arg r、Asc s K Car ρ UDen η UHev b UHev b 2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6. OUHev b 6.02、Hev b 6.03、Hev b 7. OUHev b 7.02、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12、Hev b 13、Hom s K Horn s 2、Hom s 3、Hom s 4、Hom s 5 或 Trip s 1。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，變應(yīng)原衍生物是低變應(yīng)原的。為了在哺乳動物特別是在人中誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，而不激發(fā)變應(yīng)原性反應(yīng)或激發(fā)顯著減少的變應(yīng)原性反應(yīng)，優(yōu)選為變應(yīng)原或其衍生物表現(xiàn)出低變應(yīng)原性的性質(zhì)，即低變 應(yīng)原性分子不表現(xiàn)IgE反應(yīng)性或表現(xiàn)出顯著減少的IgE反應(yīng)性。本文所用的術(shù)語“低變應(yīng)原的，，是指當(dāng)給予個體時，源自具有變應(yīng)原性性質(zhì)的變 應(yīng)原的肽、多肽或蛋白的誘導(dǎo)對所述變應(yīng)原特異性的T細(xì)胞的誘導(dǎo)并且表現(xiàn)出減少的或不 表現(xiàn)出過敏性反應(yīng)的能力。變應(yīng)原的“低變應(yīng)原性”衍生物誘導(dǎo)個體中過敏性反應(yīng)的降低的 或缺失的能力是通過從所述變應(yīng)原除去或破壞IgE結(jié)合抗原決定簇，但是，保存所述變應(yīng) 原上存在的T細(xì)胞抗原決定簇而獲得的。這可以通過例如將變應(yīng)原剪接成具有降低的IgE 結(jié)合能力或無IgE結(jié)合能力的片段并且可選地將所述片段中的一些或全部所述片段以不 同于野生型變應(yīng)原中片段順序的順序進(jìn)行融合而達(dá)到(參見例如EP 1 440 979)。從變應(yīng) 原產(chǎn)生“低變應(yīng)原性”分子的另一個方法包括將野生型變應(yīng)原的C和/或N末端刪除(參 見例如EP 1 224215)。當(dāng)然，也可以通過引入影響野生型變應(yīng)原中的一個或多個氨基酸殘 基的特異性突變而產(chǎn)生低變應(yīng)原性分子，其中所述修飾產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的喪失。通過將產(chǎn)生的蛋白靶向細(xì)胞的泛素化途徑而賦予RNA疫苗低變應(yīng)原性，其中各個 蛋白被降解為低變應(yīng)原性的肽。這通過將編碼泛素的序列融合至編碼變應(yīng)原的RNA的5’ 末端而實(shí)現(xiàn)?？梢酝ㄟ^將76位的氨基酸殘基從甘氨酸突變?yōu)楸彼?G76->A76)而增強(qiáng) 泛素化的效率?？梢酝ㄟ^將變應(yīng)原的第一個氨基酸(蛋氨酸)突變?yōu)椴环€(wěn)定氨基酸(精氨 酸)(M77- > R77)而進(jìn)一步增強(qiáng)泛素化的效率?；蛘撸梢酝ㄟ^加入羧基末端不穩(wěn)定序列 (稱為PEST序列)而實(shí)現(xiàn)所得到的基因產(chǎn)物的泛素化。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，疫苗中RNA所編碼的低變應(yīng)原性變應(yīng)原衍生物 表現(xiàn)出比野生型變應(yīng)原的IgE反應(yīng)活性低至少10%，優(yōu)選低至少20%，更優(yōu)選低至少30%， 特別是低至少50%的IgE反應(yīng)活性。RNA疫苗的低變應(yīng)原性可通過在體外在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液系統(tǒng)中翻譯RNA而常 規(guī)地檢測。將使用合適的病人的血清庫(pool)通過IgE western印跡分析所得到的基因 產(chǎn)物。與所述網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液系統(tǒng)中翻譯的野生型分子的IgE結(jié)合能力相比較，從而評 價各個低變應(yīng)原的IgE結(jié)合能力的降低。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的RNA分子可以編碼一個以上， 優(yōu)選兩個以上，更優(yōu)選三個以上，再更優(yōu)選四個以上的變應(yīng)原或其衍生物。特別地，RNA分 子可以編碼 Phl ρ UPhl ρ 2,Phl ρ 5 禾口 Phl ρ6，或編碼 Aln g UCor a UQue a UCar b 1 禾口 Bet ν 1。將編碼變應(yīng)原或其衍生物的RNA分子融合至至少進(jìn)一個肽、多肽或蛋白。編碼變應(yīng)原的RNA序列可以融合至編碼肽、多肽或蛋白的RNA序列。這些肽可以 是將變應(yīng)原靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而增強(qiáng)蛋白從細(xì)胞的分泌的信號肽，例如人類組織血漿酶原激活 劑信號肽(hTPA)。所述肽或蛋白可以是與溶酶體結(jié)合的膜蛋白(LAMP)或溶酶體內(nèi)在膜蛋 白-II (LIMP-II)的20個氨基酸的C末端尾巴。LAMP/LIMP-II序列用于將抗原蛋白指引 到轉(zhuǎn)染的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)的主要組織相容性II類(MHC II)的小泡室，從而增強(qiáng) T輔助細(xì)胞的激活，T輔助細(xì)胞增加疫苗功效。所述蛋白或多肽還可以是增強(qiáng)疫苗的THl偏 向的蛋白，例如熱激蛋白70(HSP70)，或細(xì)菌毒素例如霍亂毒素(CT)或相關(guān)毒素例如大腸 桿菌(Escherichia coli)的不耐熱腸毒素。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，RNA分子包含至少進(jìn)一個元件，選自復(fù)制酶、 β-球蛋白引導(dǎo)序列、capO、Capl或polyA尾。RNA疫苗由編碼各個變應(yīng)原的RNA序列組成。該RNA序列可以是變應(yīng)原的野生型 序列或可以根據(jù)其密碼子使用而改編。密碼子使用的改編可以增加翻譯效率和RNA的半衰 期。由至少30個腺苷殘基組成的poly A尾附加至RNA的3’末端以增加RNA的半衰期。 給RNA的5’末端加上具有m7G(5’)ppp(5’)N結(jié)構(gòu)(cap O結(jié)構(gòu))的修飾的核糖核苷酸或 其衍生物的帽子，這可以在RNA合成過程中引入或者可以在RNA轉(zhuǎn)錄之后通過使用牛痘病 毒加帽酶(VCE，由mRNA三磷酸酶、鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶和鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶組成)而以酶學(xué) 方法進(jìn)行工程化，所述加帽酶催化N7-單甲基化cap O結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。cap O結(jié)構(gòu)在保持RNA 疫苗的穩(wěn)定性和翻譯效率中發(fā)揮重要作用。RNA疫苗的5’帽子可以進(jìn)一步被2’ -0-甲基 轉(zhuǎn)移酶修飾，這產(chǎn)生cap 1結(jié)構(gòu)(m7Gppp[m2' _0]N)，其進(jìn)一步增加翻譯效率。RNA疫苗可以通過將其轉(zhuǎn)化成自我復(fù)制的疫苗而進(jìn)一步優(yōu)化。這樣的載體包括源 自甲病毒的復(fù)制元件并以目標(biāo)基因取代病毒結(jié)構(gòu)蛋白。已經(jīng)證明由于源自病毒的危險信 號調(diào)控的免疫激活，基于復(fù)制酶的RNA疫苗在極低的劑量誘導(dǎo)抗體以及細(xì)胞毒反應(yīng)(Ying， H.等人(1999) Nat Med 5 :823_827)。RNA疫苗也可以是自我復(fù)制的RNA疫苗。自我復(fù)制的RNA疫苗由復(fù)制酶RNA分子 組成，所述RNA分子源自塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德畢斯病毒(SIN)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病 毒(VEE)、羅斯河病毒(RRV)或其它屬于甲病毒家族的病毒。復(fù)制酶的下游具有控制變應(yīng)原 RNA復(fù)制的亞基因組啟動子，接著是由至少30個腺苷殘基組成的人工poly A尾。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實(shí)施方式
，疫苗還包含CpG-DNA和細(xì)胞因子，優(yōu)選為白細(xì)胞介素(IL)-12和IL-15。本發(fā)明的疫苗或疫苗制劑還可以包含佐劑。根據(jù)本發(fā)明，“佐劑”是指增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的化合物或混合物。佐劑還可能作為組織庫來緩慢釋放抗原。佐劑包括完全弗 氏佐劑，不完全弗氏佐劑，皂角苷，礦物凝膠例如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂， 復(fù)合多元醇，聚陰離子，肽，左咪唑(Levamisol)，CpG_DNA，油或烴乳劑，和潛在有用的佐劑 例如BCG (卡介苗)和短棒菌苗。
或者，或另外，還可以提供免疫刺激蛋白作為佐劑或增強(qiáng)對疫苗的免疫反應(yīng)?？梢酝ㄟ^與疫苗特別是載體疫苗共同給予免疫刺激分子例如免疫刺激、免疫增強(qiáng)或促炎性細(xì) 胞因子，淋巴因子，或趨化因子而增強(qiáng)疫苗接種的有效性(Salgaller andLodge, J.Surg. Oncol. (1988)68 122)。例如，可以使用細(xì)胞因子或細(xì)胞因子基因例如IL_2、IL_3、IL-12、 IL-15、IL-18、IFN- y、IL-10、TGF- β、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF)和其 它的集落刺激因子、巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3配體(Lyman，Curr. Opin. Hemato 1.，1998，5 192)、⑶40配體以及一些主要的共刺激分子或其基因(例如B7. 1、B7. 2)。這些免疫刺激分 子可以作為蛋白全身或局部遞送，或可以由本發(fā)明的RNA疫苗中的RNA分子或另外的RNA 分子編碼。作為免疫刺激分子還可以應(yīng)用聚陽離子肽例如聚精氨酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，疫苗適合于肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、 局部或生物導(dǎo)彈(biolistic)給藥。本發(fā)明的RNA疫苗可以以各種途徑給藥。例如，一種途徑是在體內(nèi)直接將RNA疫苗 轉(zhuǎn)移至機(jī)體(例如，肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)等)?；蛘?，還可以將RNA放置入機(jī)體外的細(xì)胞 (例如表皮細(xì)胞)里，例如在體外以RNA疫苗轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞，然后給藥(移植)入機(jī)體。當(dāng) RNA被引入細(xì)胞內(nèi)時，可以通過外源或異源RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。可以通過脈沖將RNA引入細(xì)胞， 即以本發(fā)明的RNA分子孵育細(xì)胞?；蛘撸梢栽隗w內(nèi)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作為裸露RNA或與其 它轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑(肽、聚合物等)一起而將RNA引入?？梢允褂煤铣傻年栯x子脂類來制備 用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體。有用的用于轉(zhuǎn)移核酸的脂類化合物和組合物為，例如D0DC、D0PE、 CHOL, DMEDA, DDAB, DODAC, DOTAP和D0TMA。其它分子對于促進(jìn)體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)染也是有用的， 例如陽離子寡肽(例如WO 95/21931)、源自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如WO 96/25508)或陽離 子聚合物(例如WO 95/21931)。還可以使用聚乙烯亞胺及其衍生物，聚交酯-聚乙醇酸交 酯和殼聚糖?；蛘?，可以通過本領(lǐng)域已知的方法將RNA分子引入所需要的宿主細(xì)胞內(nèi)，例如 電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀，或使用基因槍(生物導(dǎo)彈轉(zhuǎn)染)，參見 例如 Tang 等人，Nature (1992) 356 152-154)。本發(fā)明的另一個方面涉及本文所述的至少一個RNA分子在制備用于治療或預(yù)防 過敏癥的疫苗中的用途。本發(fā)明的另外一個方面涉及本文所述的至少一個RNA分子在制備用于使個體對 變應(yīng)原弱敏化的疫苗中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，疫苗適合于肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、 局部或生物導(dǎo)彈給藥。本發(fā)明的另一個方面涉及分離的RNA分子，其包含編碼至少一個變應(yīng)原或其衍生 物的至少一個核苷酸序列。所述RNA分子優(yōu)選包含至少一個選自capO、capl、5’ -β球蛋 白引導(dǎo)序列、自我復(fù)制型RNA、重新編碼變應(yīng)原序列或人工poly-A尾的核苷酸序列，其中 CapO-變應(yīng)原序列-poly A尾是特別優(yōu)選的RNA分子。CapO對于體內(nèi)產(chǎn)生抗體和關(guān)于自我 復(fù)制型RNA疫苗的誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性T細(xì)胞和IFN- γ分泌是有用的。本發(fā)明由以下附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明，但不是限制于此。


圖1顯示了以編碼β _半乳糖苷酶的RNA( β Gal-RNA)或自我復(fù)制型RNA(^Gal-repRNA)轉(zhuǎn)錄本體外轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。測試了具有(帽子)或不具有(無帽 子)添加m7G(5' )ppp(5' )G帽子結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄本。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為背景對照(未 轉(zhuǎn)染)。數(shù)據(jù)顯示為平均數(shù)士三次獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的SEM。圖2顯示了以核酸疫苗接種(A)然后以明礬中的重組變應(yīng)原致敏后(B)的Phlp 5 特異性的IgGl和IgG2a水平。血清以1 1000(A)和1 100000(B)稀釋。柱頂端的數(shù) 字代表各個組的平均IgGl IgG2a比例。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士SEM(η = 4)表示。圖3顯示通過RBL釋放檢驗(yàn)測定的Phlp 5特異性IgE。以各個核酸疫苗接種后 (灰色條柱)和接下來以明礬中的重組變應(yīng)原致敏后(黑色條柱)測定的IgE水平。數(shù)值 以％特異性氨基己糖苷酶的釋放的平均數(shù)士SEM(η = 4)表示。_ =P < 0. 001。圖4顯示在體外以重組Phlp 5重刺激后通過ELISP0T測定的分泌IFN- y (A)、 IL-4(B)和IL-5(C)的脾細(xì)胞的數(shù)目。數(shù)據(jù)以每IO6個脾細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)目 的平均數(shù)士 SEM (η = 4)表示。圖5顯示i. η.給予變應(yīng)原之后致敏小鼠的BALF中總的白細(xì)胞㈧和嗜酸性粒細(xì) 胞⑶的總數(shù)目。數(shù)值以平均數(shù)士SEM(η = 4)表示。*:Ρ<0.05;**:Ρ<0.01。圖6顯示i. η.給予變應(yīng)原之后致敏小鼠的BALF中IL_5 (A)和IFN- y (B)的水平。 數(shù)值以平均數(shù) +SEM(η = 4)表示。* =P < 0. 05 ；** =P < 0. 01 ；*** =P < 0. 001。圖7顯示由RNApTNT-Bet ν 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖8顯示由RNApTNT-Car b 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖9顯示由RNApTNT-Cas s 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖10顯示由RNA ρΤΝΤ-Phl ρ 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖11顯示由RNApTNT-Phl ρ 6產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖12顯示由RNApTNT-Cor a 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖13顯示由RNApTNT-Aln g 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖14顯示由RNApTNT-Fag s 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖15顯示由RNApTNT-Phl ρ 2產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖16顯示由RNApTNT-Phl ρ 7產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖17顯示由RNApTNT-雜交體(Phi ρ 1-2-5-6)產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反 應(yīng)的抑制。圖18顯示由RNApTNT-Cryj 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖19顯示由RNApTNT-Jun a 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖20顯示由RNApTNT-Amb a 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖21顯示由RNApTNT-Api g 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖22顯示由RNApTNT-Dau c 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖23顯示由RNApTNT-Mal d 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖24顯示由RNApTNT-Ova產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖25顯示由RNApTNT-β -酪蛋白產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖26顯示由RNApTNT-Cyp c 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖27顯示由RNApTNT-Fel d 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。
圖28顯示由RNApTNT-Derp 2產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。
圖29顯示由RNApTNT-Alt a 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖30顯示由RNApTNT-Cla h 8產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖31顯示由RNApTNT-Hev b 6產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖32顯示由RNApTNT-雜交體(變應(yīng)原)產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖33顯示由RNApTNT-Ara h 2產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)和IgE反應(yīng)的抑制。圖34顯示由RNApTNT-Que a 1產(chǎn)生的Thl記憶的誘導(dǎo)。圖35顯示RNApTNT-Artv 1不產(chǎn)生Thl記憶的誘導(dǎo)。圖36顯示RNApTNT-Ole e 1不產(chǎn)生Thl記憶的誘導(dǎo)或IgE反應(yīng)的抑制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例實(shí)施例1 在本實(shí)施例中顯示，編碼臨床上相關(guān)的梯牧草花粉變應(yīng)原Phlp 5的RNA以及基于 復(fù)制酶的RNA疫苗可以有效地防止過敏性反應(yīng)。材料和方法用于RNA轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒質(zhì)粒pTNT購自Promega (Mannheim, Germany)并包括一些特殊的特征，提供了相對 于其它載體的優(yōu)點(diǎn)。存在兩個啟動子，一個是針對SP6，另一個是針對T7聚合酶，以允許基 于SP6和T7的體外轉(zhuǎn)錄。它們一前一后地位于多克隆位點(diǎn)(MCS)附近。5’-β球蛋白引 導(dǎo)序列幫助增加幾個基因的翻譯以更快地啟動翻譯。另一個增強(qiáng)基因表達(dá)的特征是其合成 的 poly (A) 30 尾。質(zhì)粒pSin-R印5(Invitrogen，Austria)源自辛德畢斯甲病毒，該病毒是有被膜 的，正鏈RNA病毒?；诩撞《镜膹?fù)制子載體缺少病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但是保持了細(xì)胞質(zhì)RNA自 我擴(kuò)增和通過甲病毒啟動子表達(dá)插入基因所必需的復(fù)制元件(復(fù)制酶)。Phl ρ 5 基因通過 Nhel/Xbal 從載體 pCMV_Phlp5 切割而來(Gabler 等人(2006)， JAllergy Clin Immunol 118:734-741)并連接至 pTNT 和 pSin-R印5 的 XbaI 限制性位點(diǎn)， 分別產(chǎn)生PTNT-P5和pSin-R印5-P5。RNA 轉(zhuǎn)錄使用相應(yīng)的限制性酶將質(zhì)粒pTNT-P5和pSin-R印5-P5線性化；通過苯酚-氯 仿-異戊醇提取然后進(jìn)行單次氯仿-異戊醇提取來純化模板。加入1/10體積的PH 5. 2的 3M醋酸鈉后，以2體積的100%乙醇沉淀質(zhì)粒，并以70%的乙醇洗滌3次。所有的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以T7 或 SP6 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (Promega)根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程進(jìn)行。簡單地說，對于100 μ 1的反應(yīng)，以不含核酸酶 的水將20 μ 1轉(zhuǎn)錄緩沖液、30 μ 1 rNTP、5-10 μ g模板和10 μ 1酶混合物加滿至100 μ 1并在 37°C孵育2-3小時。當(dāng)使用SP6 RiboMax試劑盒時，使用20 μ 1而不是30 μ 1的rNTP。為了模擬mRNA的加帽結(jié)構(gòu)，在RNA合成過程中引入5’7_甲基鳥苷核苷酸 (m7G (5 ‘ )ppp(5' ) G)或帽子的類似物(EPICENTRE，USA)。以 25 25 25 22. 5 2. 5mM 混合 rATP、rCTP、rUTP、rGTP 和 m7G (5' )ppp(5' ) G 來制備 rNTP 混合物。在轉(zhuǎn)錄以后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘來沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀 并重懸于不含核酸酶的水。結(jié)果以RNA和自我復(fù)制型RNA進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)染在體外以編碼β -半乳糖苷酶的兩種不同的RNA轉(zhuǎn)錄本，或者作 為從載體ρΤΝΤ-β Gal (β Gal-RNA)轉(zhuǎn)錄的常規(guī)RNA疫苗，或者作為從載體 pRep5- β Gal ( β Gal-repRNA)轉(zhuǎn)錄的自我復(fù)制型RNA而轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。以含有不含有添加的m7G(5' )ppp(5' ) G帽子結(jié)構(gòu)測試RNA轉(zhuǎn)錄本。圖1顯示， 以等量的自我復(fù)制型RNA的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了比常規(guī)RNA高7. 5倍的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。另外，以帽 子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定RNA對于RNA的體外轉(zhuǎn)染/翻譯是至關(guān)重要的。編碼變應(yīng)原Phl ρ 5的基于RNA的疫苗是免疫原性的并且防止IgE的誘導(dǎo)為了研究基于RNA的疫苗防止誘導(dǎo)過敏癥的潛力，以編碼Phl ρ 5的常規(guī)RNA或 者編碼Phl P 5的自我復(fù)制型RNA免疫雌性BALB/c小鼠。為了評價RNA疫苗的效力也使 用相同劑量的編碼Phl ρ 5的常規(guī)DNA疫苗(pCMV-P5)和自我復(fù)制型DNA疫苗(pSin-P5) 免疫對應(yīng)的小組。免疫小鼠三次，間隔為一周；兩周后通過兩次注射重組Phl ρ 5與明礬的 混合物將小鼠致敏(這是已知的誘導(dǎo)過敏表型的規(guī)程)，其特征為高水平的IgE以及T細(xì)胞 的偏向TH2的細(xì)胞因子圖譜。圖2A顯示，與自我復(fù)制型DNA疫苗pSin_P5相比，兩個RNA疫苗均誘導(dǎo)相似的體 液免疫反應(yīng)。相反，與其它疫苗相比，常規(guī)DNA疫苗pCMV-P5誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)高出將近 一個數(shù)量級。所有類型的疫苗均顯示出清晰的偏向THl的血清型圖譜，特征是IgGl/IgG2a 比例低，沒有誘導(dǎo)功能性IgE (如RBL釋放檢驗(yàn)所測定，圖3，灰色條柱)。致敏后，沒有預(yù)先免疫的對照組顯示出嚴(yán)格的偏向TH2的血清學(xué)，具有高IgGl水 平和高IgGl/IgG2a比例，這表明過敏性致敏。相反，所有疫苗接種的小組保持了 THl平衡 的免疫表型(圖2B)。與其DNA對應(yīng)物作為對照動物相比較，以兩種類型的RNA疫苗預(yù)先疫 苗接種均誘導(dǎo)了相似的或更好的IgE誘導(dǎo)的抑制(圖3，黑色條柱)?？傮w來說，以兩種類 型的RNA疫苗預(yù)先疫苗接種產(chǎn)生了對過敏性致敏誘導(dǎo)的IgE的93%的抑制?；赗NA的疫苗誘導(dǎo)偏向THl的T細(xì)胞記憶在最后一次致敏后兩周，在體外以重組Phl ρ 5蛋白重新刺激脾細(xì)胞以檢測其 TH1/TH2圖譜。因此，通過ELISP0T確定了分泌IFN-γ、IL-4和IL-5的細(xì)胞的數(shù)目。與對照組相比，所有的以核酸疫苗預(yù)先疫苗接種的小組顯示出顯著的對分泌 IFN-Y細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖4Α)。同時，分泌ΤΗ2類細(xì)胞因子IL_4(圖4B)和IL_5(圖4C)的 細(xì)胞數(shù)量被抑制，這表明與DNA疫苗類似，RNA疫苗能夠建立偏向THl的抗原特異性記憶， 這可以在后續(xù)暴露于變應(yīng)原之后被重新激活?；赗NA的疫苗減少變應(yīng)原誘導(dǎo)的肺炎為了研究RNA疫苗接種對于誘導(dǎo)肺病的效應(yīng)，在最后一次致敏后兩周，以兩次每 日i.n.給予Iyg重組Phl P 5誘導(dǎo)肺炎。這個規(guī)程誘導(dǎo)強(qiáng)烈的白細(xì)胞滲透入致敏小鼠的 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中(圖5A，對照)。約80%的滲透性白細(xì)胞是嗜酸性粒細(xì)胞(圖 5B)。相反，預(yù)先進(jìn)行疫苗接種的小鼠顯示出顯著減少量的總白細(xì)胞滲透，嗜酸性粒細(xì)胞的 減少甚至更多。
炎性滲透的減少還通過BALF中IL-5的強(qiáng)烈抑制反映出來(圖6A)。IL-5的抑制 與IFN- γ的誘導(dǎo)負(fù)相關(guān)(圖6B)。結(jié)論DNA疫苗具有預(yù)防和治療過敏性疾病的巨大前景。但是，與DNA疫苗相關(guān)的假定的風(fēng)險提出了在健康成人甚至兒童中臨床使用這類新型疫苗的問題。在這個實(shí)施例中，第一次證明了具有臨床相關(guān)變應(yīng)原的裸露的RNA疫苗接種可以 在所使用的相同劑量上與可比較的DNA疫苗在相同的程度上防止過敏癥的誘導(dǎo)。為了解決生產(chǎn)大量RNA的問題，將常規(guī)RNA與源自辛德畢斯病毒復(fù)制子的自我復(fù) 制型RNA進(jìn)行了比較。以兩種類型的RNA進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)染均證明抗原表達(dá)除其它因素外依 賴于m7G(5' )ppp(5' )G帽子類似物的添加。已知大部分真核mRNA在5’末端具有這樣 的m7G(5' )ppp(5' )G帽子結(jié)構(gòu)，這對于結(jié)合翻譯起始因子是重要的，并且對mRNA穩(wěn)定性 起作用。另外，還顯示出相似數(shù)量的自我復(fù)制型RNA翻譯出高7倍水平的蛋白(圖1)，這可 容易地歸結(jié)于編碼各個抗原的亞基因組RNA的自我復(fù)制。這與自我復(fù)制型DNA疫苗相反， 自我復(fù)制型DNA疫苗的蛋白表達(dá)比常規(guī)DNA疫苗要低，這個效果歸結(jié)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中細(xì)胞凋 亡的誘導(dǎo)。但是，RNA疫苗的表達(dá)只是瞬時的，因此與那些經(jīng)過自我復(fù)制疫苗轉(zhuǎn)染后不久進(jìn) 行細(xì)胞凋亡的細(xì)胞是相當(dāng)?shù)?。的確自我復(fù)制型RNA疫苗誘導(dǎo)與自我復(fù)制型DNA疫苗相似的 體液免疫反應(yīng)(圖2A)，而常規(guī)DNA疫苗(以其連續(xù)的抗原表達(dá))顯示出最高的體液免疫反 應(yīng)。雖然在這個實(shí)施例中自我復(fù)制型核酸疫苗以比常規(guī)RNA/DNA疫苗低5倍的劑量給 予，但是觀察到相似的THl記憶的誘導(dǎo)(顯示為在后續(xù)的以明礬中的重組變應(yīng)原致敏后的 IgG2a的增多(圖2B)和重新刺激的脾細(xì)胞的THl細(xì)胞因子圖譜)和高保護(hù)能力(圖3)。 在這里，兩種RNA疫苗和自我復(fù)制型DNA疫苗顯示出比常規(guī)DNA疫苗更高的保護(hù)能力，雖然 后者誘導(dǎo)更高水平的完整抗原和更高的體液免疫反應(yīng)。這表明以RNA和自我復(fù)制型疫苗看 來，與短期疫苗表達(dá)相比，疫苗誘導(dǎo)的長期持續(xù)的變應(yīng)原分泌可能是其反作用的。在以變應(yīng)原i. η.刺激后，RNA疫苗接種還產(chǎn)生與DNA疫苗類似的對肺滲透的減少 (圖5Α)，這主要?dú)w結(jié)于BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的強(qiáng)烈減少(圖5Β)。這與肺中IL-5的 減少(圖6Α)和IFN-Y的中度水平的誘導(dǎo)(圖2Β)相關(guān)，表明疫苗誘導(dǎo)的THl細(xì)胞的產(chǎn)生 也影響肺中ΤΗ1/ΤΗ2細(xì)胞因子的平衡。雖然在病毒模型中肺中的IFN-Y可以對哮喘和肺 病具有有害的效應(yīng)，但這似乎是間接效應(yīng)，因?yàn)镮FN-Y可以激活肺上皮細(xì)胞以募集更多的 ΤΗ2細(xì)胞到組織中。確實(shí)，在過敏癥模型中，可以顯示將ΤΗ2免疫重新指向更平衡的THl環(huán) 境對肺炎和氣道高反應(yīng)性具有有益的效應(yīng)，主要是通過反調(diào)節(jié)IL-5和IL-13 (Ford, J. G.等 人(2001)J Immunol167 :1769_1777)。綜上，可以證明，基于RNA的疫苗可以誘導(dǎo)顯著的對于過敏性致敏的保護(hù)，并且通 過使用自我復(fù)制型RNA疫苗，可以在低劑量實(shí)現(xiàn)這個效應(yīng)。鑒于RNA疫苗的完美的安全性 能，這為臨床上應(yīng)用RNA疫苗打開了一扇門，不光是用于治療性安排，還用于具有發(fā)展過敏 性病癥的高風(fēng)險的健康個體。實(shí)施例2 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄
如實(shí)施例1所述，將編碼Bet ν 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程加帽子。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Bet ν 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Bet ν 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Bet V 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Betv 1預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖7A)和 IFN-Y的分泌(圖7B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo) (圖 7C)。實(shí)施例3 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Car b 1的cDNA克隆入載體pTNT。按上述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Car b 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Car b 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Car b 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Car bl預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖8A)和IFN- γ的分泌(圖8B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo) (圖 8C)。實(shí)施例4 材料和方法
質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Cas s 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Cas s 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Cas s 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgEjn 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Cas S 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Cas si預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖9A)和 IFN-Y的分泌(圖9B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo) (圖 9C)。實(shí)施例5 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Phl ρ 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Phl ρ 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Phl P 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Phl P 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Phl pi預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖10A) 和IFN-Y的分泌(圖10B)所指征。實(shí)施例6 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Phl ρ 6的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Phl ρ 6免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Phl P 6與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Phl P 6重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Phl p6預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖11A) 和IFN- γ的分泌(圖11B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的 誘導(dǎo)(圖11C)。實(shí)施例7 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Cor a 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Cor a 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一次)Iyg重組Cor a 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)相反，以RNApTNT-Cor a 1預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生 變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖12)所指征。實(shí)施例8 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Aln g 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Aln g 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Aln g 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏10天后，在體外以重組Aln g 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞 培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Aln gl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN-Y的分泌(圖13) 所指征。實(shí)施例9 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Fag s 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Fag s 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Fag s 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Fag S 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Fag si預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖14A) 和IFN- γ的分泌(圖14B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的 誘導(dǎo)(圖14C)。實(shí)施例10 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Phl ρ 2的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Phl ρ 2免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Phl P 2與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgE，如實(shí)驗(yàn)1所述。最后 一次致敏后10天，在體外以重組Phl P 2重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上清液 中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Phl p2預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN-Y的誘導(dǎo)(圖15A) 所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖15B)。實(shí)施例11 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Phl ρ 7的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNA pTNT-Phl ρ 7免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一次)Iyg重組Phl P 7與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgE，如實(shí)驗(yàn)1所述。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Phl p7預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN-Y的誘導(dǎo)(圖16A) 所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖16B)。實(shí)施例12 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Phl P U Phl P 2、Phl ρ 5和Phl ρ 6的雜交體 cDNA(Linhart B.和 Valenta R.，Int Arch Allergy Immunol (2004) 134 324-331)克隆入 載體PTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明 書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNA pTNT-雜交體(Phi ρ 1-2-5-6)免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩 次注射(每周一次)Iyg重組Phl P UPhl P 2,Phl ρ 5和Phl ρ 6與明礬的混合物將小 鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組變應(yīng)原重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNA pTNT-雜交體(Phl P 1-2-5-6)預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的 誘導(dǎo)(圖17A)和IFN-Y的分泌(圖17B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異 性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖17C)。實(shí)施例13 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Cryj 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Cryj 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Cry j 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。 最后一次致敏后10天，在體外以重組Cry j 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Cry jl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖18A) 和IFN-Y的分泌(圖18B)所指征。實(shí)施例14 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Jun a 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Juna 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Jun a 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏10天后，在體外以重組Jim a 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞 培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Jim al預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN-Y的誘導(dǎo)(圖19) 所指征。實(shí)施例15 材料和方法
質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Amb a 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Amb a 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg純化的Amb a 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏10天后，在體外以純化的Amb a 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Amba 1預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN- γ的分泌(圖20) 所指征。實(shí)施例16 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Api g 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Api g 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Api g ι與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Api g 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Api gl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖21A) 和IFN- γ的分泌(圖21B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖21C)。實(shí)施例17 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Dau c 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Dau c 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Dau c 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。 最后一次致敏后10天，在體外以重組Dau C 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Dau cl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖22A) 和IFN-Y的分泌(圖22B)所指征。實(shí)施例18 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Mal d 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Mal d 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Mal d 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Mal d 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。
結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Mal dl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖23A) 和IFN- γ的分泌(圖23B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的 誘導(dǎo)(圖23C)。實(shí)施例19 材料和方法
質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Ova的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并 使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Ova免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)1 μ g重組Ova與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接 受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Ova重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞 培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Thl細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNA pTNT-Ova預(yù)先接 種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖24A)和 IFN-Y的分泌(圖24B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo) (圖 24C)。實(shí)施例20 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼β -酪蛋白的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn) 錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-β-酪蛋白免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周 一次)Iyg重組β-酪蛋白與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgE，如實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組β-酪蛋白重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上清 液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-β -酪蛋白 預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IFN- γ的分泌(圖 25Α)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖25Β)。實(shí)施例21 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Cyp c 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Cyp c 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Cyp c 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。結(jié)果以RNApTNT-Cyp c 1預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集， 如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖26)所指征。實(shí)施例22 材料和方法質(zhì)料和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Fel d 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Fel d 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Fel d 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。 最后一次致敏后10天，在體外以重組Fel d 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Fel dl預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖27A) 和IFN-Y的分泌(圖27B)所指征。實(shí)施例23 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Der ρ 2的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Der ρ 2免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Der ρ 2與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。結(jié)果以RNApTNT-Der ρ 2預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集， 如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖28A)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反 應(yīng)的誘導(dǎo)(圖28B)。實(shí)施例24 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Alt a 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏
以RNApTNT-Alt a 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Alt a 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Alt a 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。
結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Alt a 1預(yù) 先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖29A) 和IFN- γ的分泌(圖29B)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的 誘導(dǎo)(圖29C)。實(shí)施例25 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Cla h 8的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Cla h 8免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Cla h 8與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgE，如實(shí)驗(yàn)1所述。最后 一次致敏后10天，在體外以重組Cla h 8重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上清液 中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-ClahS預(yù)先接 種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如IFN- γ的分泌(圖30A)所指征。 這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的誘導(dǎo)(圖30B)。實(shí)施例26 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Hev b 6的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Hev b 6免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Hev b 6與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。 最后一次致敏后10天，在體外以重組Hev b 6重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Hevb6預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖31A) 和IFN-Y的分泌(圖31B)所指征。實(shí)施例27 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼5個不同變應(yīng)原的部分的雜交體的cDNA克隆入載體 PTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNA pTNT-雜交體(Aln-Cor-Que-Car-Bet)免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后 通過兩次注射(每周一次)1 μ g重組全部變應(yīng)原與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性 表型。對照動物只致敏，不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。結(jié)果以RNApTNT-雜交體(變應(yīng)原)預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Thl細(xì) 胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖32)所指征。實(shí)施例28 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Ara h 2的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。
在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT_Arah2免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Ara h 2與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgE，如實(shí)驗(yàn)1所 述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Arah 2重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng) 物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果以RNApTNT-Ara h 2預(yù)先接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集， 如IFN- γ的分泌(圖33A)所指征。這個Th 1的引發(fā)能夠抑制變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)的 誘導(dǎo)(圖33B)。實(shí)施例29 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄 如實(shí)施例1所述，將編碼Que a 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Que a 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Que a 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1所述。 最后一次致敏后10天，在體外以重組Que a 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上 清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果與致敏對照(黑色條柱)或原態(tài)小鼠(白色條柱)相反，以RNApTNT-Que al預(yù)先 接種(陰影條柱)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募集，如增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖34A) 和IFN-Y的分泌(圖34B)所指征。實(shí)施例30 材料和方法
質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Art ν 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Art ν 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Art ν 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a，如實(shí)驗(yàn)1 所述。最后一次致敏后10天，在體外以重組Art V 1重新刺激脾細(xì)胞72小時，分析細(xì)胞培 養(yǎng)物上清液中的IFN-Y作為變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞激活的指征。結(jié)果以RNApTNT-Art ν 1預(yù)先接種(陰影條柱)不產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募 集，如沒有增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖35A)或IFN-γ的分泌(圖35Β)所指征。實(shí)施例31 材料和方法質(zhì)粒和RNA轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1所述，將編碼Ole e 1的cDNA克隆入載體pTNT。按所述制備RNA轉(zhuǎn)錄 本并使用ScriptCap試劑盒(Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書加帽。在37°C以不含RNAse的DNAse (Promega)孵育加帽的轉(zhuǎn)錄本15分鐘以除去模板 DNA。然后，通過向反應(yīng)管中加入1體積的5M的醋酸銨并在冰上孵育混合物10-15分鐘而 沉淀RNA。在4°C或室溫離心15分鐘(13000rpm)的時間后，以70%的乙醇洗滌沉淀并重懸 于不含核酸酶的水。免疫和致敏以RNApTNT-Ole e 1免疫小鼠三次，間隔為一周；一周后通過兩次注射(每周一 次)Iyg重組Ole e 1與明礬的混合物將小鼠致敏以誘導(dǎo)過敏性表型。對照動物只致敏， 不接受RNA疫苗預(yù)先接種。Th 1記憶的誘導(dǎo)和保護(hù)的測定最后一次致敏一周后，通過ELISA和RBL測定變應(yīng)原特異性血清IgG2a和IgE，如 實(shí)驗(yàn)1所述。結(jié)果以RNA pTNT-Ole e 1預(yù)先接種(陰影條柱)不產(chǎn)生變應(yīng)原特異性Th 1細(xì)胞的募 集，如沒有增加的IgG2a的誘導(dǎo)(圖36A)所指征。此外，沒有檢測到變應(yīng)原特異性IgE反 應(yīng)的誘導(dǎo)的抑制(圖36B)。
權(quán)利要求
RNA疫苗，其包含至少一個編碼至少一個變應(yīng)原或其衍生物的RNA分子，其中所述的變應(yīng)原是赤楊、煙草赤星病菌、豚草、芹菜、花生、疣枝樺、歐洲鵝耳櫪、歐洲栗、多主枝孢霉、歐洲榛、日本柳杉、鯉魚、胡蘿卜、歐洲室塵蟎、歐洲山毛櫸、家貓、巴西橡膠樹、美國雪松、蘋果、白櫟和貓尾草的變應(yīng)原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于赤楊的變應(yīng)原是Alng 1，煙草赤星病菌的 變應(yīng)原選自 Alt a UAlt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、 Alt a 12 或 Alt a 13，豚草的變應(yīng)原選自 Amb a UAmb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、 Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9 或 Amb a 10,芹菜的變應(yīng)原選自 Api g UApi g 4 或 Api g 5， 花生的變應(yīng)原選自 Ara h UAra h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7 或 Ara h 8，疣枝樺的變應(yīng)原選自Bet ν UBet ν 2,Bet v3、Betv4、Betv 6或Betv 7，歐洲鵝耳櫪 的變應(yīng)原是Carb 1，歐洲栗的變應(yīng)原選自Cas s UCas s 5或Cas s 8，多主枝孢霉的變應(yīng) 原選自 Cla h 2,Cla h 5,Cla h 6,Cla h 7,Cla h 8,Cla h 9,Cla h 10 或 Cla h 12，歐 洲榛的變應(yīng)原選自Cor a UCora 2,Cor a 8,Cor a 9,Cor a 10或Cor a 11，日本柳杉的 變應(yīng)原選自Cryj 1或Cryj 2，鯉魚的變應(yīng)原是Cyp c 1，胡蘿卜的變應(yīng)原選自Dau c 1或 Dau c 4，歐洲室塵蟎的變應(yīng)原選自 Der ρ U Der ρ 2、Der ρ 3、Der ρ 4、Der ρ 5、Der ρ 6、Der ρ 7、Der ρ 8、Der ρ 9、Der ρ 10、Der ρ IUDer ρ 14、Der ρ 20>Der ρ 21 或克隆 30變應(yīng)原，歐洲山毛櫸的變應(yīng)原是Fag s 1，家貓的變應(yīng)原選自Fel d UFel d 2,Fel d 3、 Fel d 4,Fel d 5w、Fel d 6w 或 Fel d 7w，巴西橡膠樹的變應(yīng)原選自 Hev b UHev b2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6. 01、Hev b 6. 02、Hev b 6. 03、Hev b 7. 01、Hev b 7.02、 Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10,Hev b IUHev b 12 或 Hev b 13，美國雪松的變應(yīng)原選自 Jun a UJun a 2或Jun a 3，蘋果的變應(yīng)原選自Mal d UMal d 2、Mal d 3或Mal d 4，白櫟 的變應(yīng)原是Que a 1，貓尾草的變應(yīng)原選自Phl ρ UPhl ρ 2、Phl ρ 4、Phl ρ 5、Phl ρ 6、 Phl ρ 7、Phl ρ 11、Phl ρ 12 或 Phl ρ 13。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于變應(yīng)原選自Alng UAlt a UAmb a 1、Api g 1、Ara h 2、Bet ν 1、β -酪蛋白、Car b 1、Cas s 1、Cla h 8、Cor a 1、Cry j U Cyp c U Dau c U Der ρ 2、Fag s 1、Fel d 1、Hev b 6、Jun a U Mal d 1、卵清蛋白 (OVA)、Phl ρ UPhl ρ 2、Phl ρ 5、Phl ρ 6 或Phl ρ 7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于RNA分子編碼Phlρ UPhlp 2,Phl ρ 5 和 Phl ρ6 或編碼 Aln g UCor a UQue a UCar b 1 和 Bet ν 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于變應(yīng)原衍生物是低變應(yīng)原性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于低變應(yīng)原性變應(yīng)原衍生物表現(xiàn)出比野生型 變應(yīng)原的IgE反應(yīng)活性低至少10 %，優(yōu)選至少20 %，更優(yōu)選至少30 %，特別是至少50 %的 IgE反應(yīng)活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于編碼變應(yīng)原或其衍生物的RNA 分子與至少進(jìn)一個編碼肽、多肽或蛋白的分子融合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于RNA分子包含至少進(jìn)一個選自 復(fù)制酶、β -球蛋白引導(dǎo)序列、capO、capl或polyA尾的元件。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于疫苗還包含佐劑，優(yōu)選選自 CpG-DNA或細(xì)胞因子，細(xì)胞因子優(yōu)選為IL-12和IL-15。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于疫苗適合于肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈 內(nèi)、經(jīng)皮、局部或生物導(dǎo)彈給藥。
11.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的至少一個RNA分子在制備用于治療或預(yù)防過敏癥 的疫苗中的用途。
12.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的至少一個RNA分子在制備用于使個體對變應(yīng)原弱 敏化的預(yù)防性和治療性疫苗中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的用途，其特征在于疫苗還包含佐劑，優(yōu)選選自 CpG-DNA或細(xì)胞因子，細(xì)胞因子優(yōu)選為IL-12和IL-15。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于疫苗適合于肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈 內(nèi)、經(jīng)皮、局部或生物導(dǎo)彈給藥。
15.分離的RNA分子，其包含編碼如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的至少一個變應(yīng)原或其 衍生物的至少一個核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼變應(yīng)原或其衍生物的RNA分子的RNA疫苗及其用途。
文檔編號A61K39/36GK101827606SQ200880109057
公開日2010年9月8日 申請日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者A·弗呂維特, E·勒斯勒, J·塔爾哈默, R·韋斯, S·沙伊希爾霍弗 申請人:碧歐美公司