專利名稱：：透明質(zhì)酸在制備用于改善皮膚、眼和粘膜的保護(hù)功能的組合物中的用途的制作方法透明質(zhì)酸在制備用于改善皮膚、眼和粘膜的保護(hù)功能的組合物中的用途本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸在制備用于改善皮膚、眼和粘膜，特別是上和下呼吸道以及腸粘膜的保護(hù)功能的組合物中的用途。呼吸道粘膜和腸粘膜、皮膚和眼覆蓋有表面上皮，所述表面上皮形成連續(xù)的覆蓋物，并且構(gòu)成物理保護(hù)屏障，其效能依賴于攻擊因子和該上皮所擁有的眾多防御機(jī)制之間的平衡。在這些機(jī)制中，表面上皮在諸如下列的防御機(jī)制中起著關(guān)鍵作用炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、電解質(zhì)的跨上皮運(yùn)輸和具有抗感染活性的分子的分泌。這些功能中的大多數(shù)要求維持細(xì)胞的相互作用和極性。上皮的任何改變可以導(dǎo)致這些防御機(jī)制的機(jī)能障礙。因此，在急性或慢性支氣管炎癥現(xiàn)象的過程中，與眾多傳染物(細(xì)菌、病毒等)或非傳染物(顆粒、大氣或職業(yè)污染)的吸入相關(guān)的粘膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)效能的改變，可以引起上皮屏障的完整性的改變，并且導(dǎo)致呼吸上皮的在程度上或多或少的損傷。這些損傷可以從上皮屏障的連接性的喪失到完全的上皮脫屑之間變化。在損傷后呼吸上皮的表面的上皮再形成起初依賴于受損區(qū)域周圍細(xì)胞的擴(kuò)展和遷移(Zahm等人，AmJRespirCellMolBiol1991,5242~248；H6rard等人，AmJRespirCellMolBiol1996，15:624_632)。這種上皮再形成應(yīng)當(dāng)伴隨上皮屏障的防御功能的恢Μ.ο上皮細(xì)胞的連接復(fù)合物也在維持上皮的完整性中起著主要作用。上皮的屏障功能通過三種主要類型的連接復(fù)合物來確保1)緊密連接和中間連接，其形成細(xì)胞間錨定帶，2)橋粒，其位于基細(xì)胞和表面圓柱狀細(xì)胞之間的界面處，和3)通訊連接，其為細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。緊密連接形成了調(diào)節(jié)離子和分子經(jīng)細(xì)胞旁間隙進(jìn)行通過的選擇性屏障。在電子顯微鏡術(shù)下，注意到緊密連接在兩個相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜的外層之間形成一系列融合點(diǎn)。通過冷凍斷裂，這些膜接觸區(qū)看起來為圍繞每個細(xì)胞的頂端的連續(xù)網(wǎng)狀物的形式。這個網(wǎng)狀物由膜蛋白質(zhì)(密蛋白和閉合蛋白)的聚合物構(gòu)成，這些蛋白質(zhì)本身與細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)相連接，在所述細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)中尤其發(fā)現(xiàn)有緊密連接蛋白質(zhì)(Z0-1至3)。閉合蛋白、密蛋白以及ZO-I通常是細(xì)菌毒素的靶標(biāo)，這導(dǎo)致緊密連接的組構(gòu)和功能的改變(Coraux等人，AmJRespirCellMolBiol2004，5:605_612)。在連接復(fù)合物中，通訊連接牽涉分子從一個細(xì)胞傳遞至另一個細(xì)胞。它們由連接蛋白的等級化裝配構(gòu)成，所述連接蛋白聚集成六聚體單元即連接子。每個連接子與鄰近細(xì)胞的連接子相聯(lián)合，從而形成2至4nm的通道，其允許小尺寸的分子通過。除了確保上皮的保護(hù)作用的這些連接復(fù)合物外，為了防止通過吸入的微生物而發(fā)生的建群和感染，呼吸上皮由于具有殺菌活性的肽和分子的產(chǎn)生而保持無菌環(huán)境。在由呼吸上皮細(xì)胞所分泌的這些抗菌劑中，已顯示，白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)能夠引起革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的死亡。盡管緊密連接的防御功能的改變最初是感染過程的后果，但還承認(rèn)伴隨感染的顯著炎癥可以是上皮屏障的滲透性發(fā)生變化的起因。細(xì)胞因子代表了在免疫和炎癥過程期間由非常大量的經(jīng)激活的細(xì)胞所釋放的低分子量的可溶性多肽分子家族。在這些細(xì)胞因子中，白介素8(IL-8)在炎性疾病和傳染病中是增加的。IL-8對于嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)吸引能力構(gòu)成了適合于大多數(shù)病理學(xué)情況的防御機(jī)制，但是由嗜中性粒細(xì)胞所放大的應(yīng)答可以加劇呼吸上皮的防御功能的改變(Tirouvanziam等人，AmJRespirCellMolBiol,2000，2:121_127)。因此，在上皮受到攻擊之后這些防御功能的恢復(fù)是在維持上皮的屏障功能中的重要步驟，并且因此闡明出能夠促進(jìn)這種恢復(fù)的分子代表了重大的利害關(guān)系。目前，對于上皮受到的攻擊所進(jìn)行的治療尤其在于癥狀治療支氣管擴(kuò)張藥、抗炎藥、抗生素、粘膜調(diào)節(jié)劑。法國專利FR2847818描述了透明質(zhì)酸、其制備方法以及其在尤其關(guān)于上呼吸道的呼吸疾患具有治療活性的組合物中的應(yīng)用。該專利中所描述的透明質(zhì)酸具有至多IO5Da的分子量。該透明質(zhì)酸尤其在治療上呼吸道的呼吸疾患(修復(fù)呼吸上皮)的情況下使用。專利US6，806，259描述了分子量為50，000至200，000道爾頓的的透明質(zhì)酸的制齊U。這種制劑作為用于使人類皮膚柔滑的營養(yǎng)補(bǔ)充劑通過口服途徑進(jìn)行施用。申請US2006/166930涉及包含乙?；该髻|(zhì)酸的藥物組合物，其用于治療眼干燥。乙?；该髻|(zhì)酸的分子量優(yōu)選地是10，000至1，000,000道爾頓。專利US5，166,331描述了兩種透明質(zhì)酸級分，一種具有50，000至100,000的分子量(hyalastine)并且用于瘢痕形成，和另一種具有500，000至730，000的分子量(hyalectin)并且用于眼內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射。申請DE10360425涉及分子量為50，000至10，000,000道爾頓的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸的鹽和/或其衍生物在制備用于治療眼和/或鼻并發(fā)癥的藥物組合物中的用途。使用透明質(zhì)酸的這些文獻(xiàn)無一描述了在上皮受到攻擊后連接復(fù)合物的防御功能的恢復(fù)，并且迄今為止，僅細(xì)胞因子例如TGF-β或糖皮質(zhì)激素被描述為能夠增加細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)。本發(fā)明的目的之一是具有30，000至45，000道爾頓的低分子量的透明質(zhì)酸用于刺激這樣的機(jī)制的用途，所述機(jī)制牽涉防御功能的恢復(fù)，并且具有在源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子的攻擊的情況下保護(hù)呼吸粘膜、腸粘膜、皮膚或眼和/或改善呼吸粘膜、腸粘膜、皮膚或眼的保護(hù)功能的活性。本發(fā)明的另一個目的是提供包含透明質(zhì)酸的藥物組合物，其用于制備用于預(yù)防病理學(xué)狀態(tài)例如哮喘、呼吸性變態(tài)反應(yīng)、呼吸窘迫綜合征的藥物。本發(fā)明的另一個目的是提供包含透明質(zhì)酸的美容組合物，其用于在皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂的情況下改善皮膚的保護(hù)功能，或者在眼病癥的情況下改善眼的保護(hù)功能。本發(fā)明的另一個目的是提供包含透明質(zhì)酸的食品組合物，其用于在消化性病癥的情況下改善腸粘膜的保護(hù)功能。因此，本發(fā)明涉及至少一種分子量為30，000至45，000道爾頓，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽在制備組合物中的用途，所述組合物用于在發(fā)生攻擊的情況下保護(hù)和/或恢復(fù)上和下呼吸道粘膜、腸粘膜、皮膚或眼的完整性，所述攻擊源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子，并且在所述攻擊中牽涉上皮細(xì)胞，特別是上皮細(xì)胞的連接復(fù)合物。當(dāng)?shù)陀?0，000道爾頓時，透明質(zhì)酸變得是炎癥性的(US5，166，331)，而當(dāng)超過45，000道爾頓時，透明質(zhì)酸喪失其活性。表述“相應(yīng)的鹽”是指鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鋇鹽、鍶鹽、鎂鹽、鋁鹽、銨鹽或取代的銨鹽。表述“呼吸粘膜”是指上和下呼吸道的上皮，其是假復(fù)層的，并且由纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞、刷細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞以及絨毛膜構(gòu)成，所述絨毛膜是非常血管化的并且包含眾多彈性纖維。表述“上呼吸道”包括鼻腔、咽和喉，和表述“下呼吸道”包括氣管、支氣管和細(xì)支氣管。表述“腸粘膜”是指消化道的內(nèi)部部分，并且包括-從胃開始由在其頂表面邊緣水平上經(jīng)由緊密連接而彼此相連的細(xì)胞單層形成的上皮；在該上皮層中包括有將粘液分泌到腔內(nèi)的外分泌細(xì)胞以及將激素釋放到血液中的內(nèi)分泌細(xì)胞，_固有層，這是松弛的結(jié)締組織層，其非常富含毛細(xì)血管和淋巴毛細(xì)管、針對能夠穿過上皮的微生物的防御系統(tǒng)的白細(xì)胞和其他細(xì)胞，-粘膜肌層，這是可以通過收縮來修飾上皮的褶皺的平滑肌細(xì)胞的薄層。表述“物理因子”一般是指能夠引起損傷或疾病的能量來源。這些尤其是噪聲、振動、輻射(電離性的，例如X和Y射線，或者光學(xué)的，例如紫外輻射、激光輻射和紅外線燈)、波(例如，微波或射頻波)以及極端溫度和壓力。表述“化學(xué)因子”是指化學(xué)產(chǎn)品(非危險性的、危險性的、非CMR(致癌性、誘變性、生殖毒性(canc6rog6nemutagenesreprotoxiques))危險性的、CMR危險性的)以及在大氣污染中所包含的化合物(灰塵，SO2,NOx,CO,重金屬，揮發(fā)性有機(jī)化合物，氟，鹽酸等，溫室效應(yīng)氣體例如C02、CH4,N2O,CFC、HFC、PFC和SF6,以及其他物質(zhì)例如臭氧、有機(jī)氯化合物(二噁英類和呋喃類)、HAP(多環(huán)芳香烴)，等等)。表述“微生物學(xué)因子”是指空氣、食物和飲用水中存在的因子，尤其是細(xì)菌、原生動物、病毒和真菌，并且可以是各種疾病的起因。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，上文所定義的透明質(zhì)酸另外還包含化合物B，所述化合物B選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，上文所使用的透明質(zhì)酸的濃度為0.lg/Ι至4g/l，和優(yōu)選地0.2至lg/1。低于和高于這個濃度，透明質(zhì)酸就會變得無活性。根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及上文所定義的至少一種透明質(zhì)酸在制備用于治療和/或預(yù)防由源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子的攻擊而引起的病理學(xué)狀態(tài)的藥物中的用途。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及上文所定義的透明質(zhì)酸在制備美容和食品組合物中的用途。根據(jù)另一個實(shí)施方案，上文所定義的透明質(zhì)酸用于制備用于預(yù)防病理學(xué)狀態(tài)例如哮喘、呼吸性變態(tài)反應(yīng)、呼吸窘迫綜合征的藥物，其中所牽涉的上皮細(xì)胞是上和下呼吸道粘膜的細(xì)胞。哮喘是支氣管的疾病，其在發(fā)作時導(dǎo)致在吸入空氣，尤其是在將空氣從肺中呼出方面的困難。所述發(fā)作可以通過各種不同的因素例如體力、濕度或灰塵或者其他變應(yīng)原例如大氣污染物來觸發(fā)。呼吸性變態(tài)反應(yīng)是由變應(yīng)原例如螨蟲觸發(fā)的疾病，所述螨蟲是造成兒童中的70-80%的變應(yīng)性哮喘的原因。在室內(nèi)環(huán)境的其他肺變應(yīng)原(pneumallergSnes)(通過呼吸途徑侵入生物體中的變應(yīng)原)中，家養(yǎng)動物(貓、犬、嚙齒動物)、蟑螂、霉菌是呼吸性變態(tài)反應(yīng)的常見來源。在室外環(huán)境中，還可以牽涉大氣污染物、大氣霉菌。職業(yè)變應(yīng)原也可以是造成致敏和呼吸性變態(tài)反應(yīng)的原因(最常見的來源面粉、實(shí)驗(yàn)室動物、膠乳等)。呼吸窘迫綜合征是由于急性肺損害而引起的危及生命的呼吸窘迫。它由各種不同因素引起，例如誤吸了烴類，吸入了刺激性化合物(氯、NO2、煙、臭氧、高濃度的氧、金屬煙、芥子氣)，除草劑例如百草枯或阿片樣物質(zhì)(例如海洛因、嗎啡、右丙氧芬或美沙酮)。下面的實(shí)施例1顯示了，本發(fā)明的透明質(zhì)酸引起通訊連接的功能性增加，并因此使得能夠預(yù)防尤其由大氣污染物引起的疾病。根據(jù)另一個實(shí)施方案，上文所定義的透明質(zhì)酸用于制備用于在皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂的情況下改善皮膚的保護(hù)功能的組合物，所述皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂尤其是皺紋、細(xì)小皺紋(ridule)、皮膚的張力和彈性的減少、皮膚脫水、其中所涉及的上皮細(xì)胞是皮膚細(xì)胞的病癥。皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂是緩慢的、進(jìn)行性的、在遺傳上經(jīng)編程的過程和皮膚每天所遭受的襲擊(其導(dǎo)致皮膚的衰老)的結(jié)果。皺紋是由于表皮和真皮的褶皺而出現(xiàn)在皮膚表面上的線狀條紋。細(xì)小皺紋是比皺紋更不明顯的條紋，并且更特別地是指在眼角處形成的(魚尾紋)并且比其他在面部上出現(xiàn)的皺紋更淺的皺紋。表述“皮膚的張力”是指松弛、下垂的皮膚。表述“皮膚的彈性”是指松開的皮膚。表述“皮膚脫水”是指不再保留足夠水的皮膚，這使得皮膚喪失其結(jié)構(gòu)。根據(jù)另一個實(shí)施方案，上文所定義的透明質(zhì)酸用于制備用于在消化性病癥的情況下改善腸粘膜的保護(hù)功能的組合物，所述消化性病癥特別是胃腸炎、缺血性壞死和腸粘膜潰瘍，其中所牽涉的上皮細(xì)胞是腸粘膜的細(xì)胞。所述消化性病癥包括可以涉及消化道的所有器官的多重癥狀。所觀察到的消化性障礙源于這些器官的機(jī)能障礙。胃腸炎是特征在于大量液狀糞便劇烈且頻繁地排出的炎癥性感染。缺血性壞死是由血管化不足而引起的凝固性壞死，其導(dǎo)致所存在的細(xì)胞元件的木乃伊化。腸粘膜潰瘍導(dǎo)致腸粘膜由于腸上皮的侵襲而受到破壞。根據(jù)另一個實(shí)施方案，上文所定義的透明質(zhì)酸用于制備用于在眼病癥的情況下改善眼的保護(hù)功能的組合物，所述眼病癥特別是水應(yīng)激(stresshydrique)、眼干燥、角膜損傷和角膜病變，其中所牽涉的上皮細(xì)胞是眼的細(xì)胞，尤其是角膜的細(xì)胞。表述“水應(yīng)激”是指眼球缺乏水。如果眼淚在某些重要組分例如皮脂中缺乏或者它們的產(chǎn)生不足，那么淚液膜可能降解。那么就會在角膜上形成干點(diǎn)，這引起眼干燥的癥狀癢、燒灼感、異物感和一般不適。表述“角膜損傷”是指由磨損或摩擦(其通常是由于眼中的創(chuàng)傷或異物)而引起的角膜上皮的表面缺陷。術(shù)語“角膜病變”是指具有創(chuàng)傷、化學(xué)、感染或遺傳起源的涉及角膜的所有疾病。角膜的疾病是非常眾多的，并且表現(xiàn)為透明度的喪失，這根據(jù)損傷的原因和部位可以導(dǎo)致或多或少完全的和長久的視力喪失。在另一個方面，本發(fā)明涉及具有下述通式(I)的化合物組合在制備藥物中的用途(Α,B)(I)其中A是如上所定義的透明質(zhì)酸，B選自維生素，特別是抗壞血酸和維生素E或生育酚，所述藥物用于治療和/或預(yù)防由攻擊而引起的病理學(xué)狀態(tài)，所述攻擊源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子，并且在所述攻擊中牽涉上皮細(xì)胞，特別是上皮細(xì)胞的連接復(fù)合物。所述維生素包括水溶性維生素例如維生素Bl(硫胺素)、B2(核黃素)、B3(煙酰胺)、B5(泛酸)、B6(吡哆醇)、B8(生物素)、B9(葉酸)、B12(鈷胺素)、C(抗壞血酸)、PP(煙酸)，以及脂溶性維生素例如維生素A(視黃醇)、D(麥角鈣化醇)、E(生育酚)、K1(葉綠醌)和K2(甲基萘醌)。維生素C以及維生素E在尤其用于皮膚治療的配方的情況下發(fā)揮抗氧化劑的作用。在另外一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含至少一種分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽，以及與之相聯(lián)合的藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，上文所定義的藥物組合物另外還包含化合物B以及與之相聯(lián)合的藥學(xué)上可接受的載體，所述化合物B選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含上文所定義的通式(A，B)的化合物以及與之相聯(lián)合的藥學(xué)上可接受的載體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所定義的藥物組合物被配制成用于以50mg/天至300mg/天，優(yōu)選地IOOmg/天至200mg/天的劑量通過局部途徑進(jìn)行施用，或者以0.66mg/kg/天至4mg/kg/天，優(yōu)選地1.33mg/kg/天至2.66mg/kg/天的劑量通過口服途徑進(jìn)行施用。根據(jù)另一個實(shí)施方案，上文所定義的藥物組合物以腸溶包衣型形式存在。表述“腸溶包衣型形式”是指以腸溶包衣型載體的形式存在的組合物，即保護(hù)透明質(zhì)酸不受胃的酸性的影響。生理學(xué)上穩(wěn)定的腸溶包衣型媒介物選自腸溶包衣型微顆粒劑、包有薄膜的腸溶包衣型微顆粒劑、腸溶包衣型納米顆粒或納米球、腸溶包衣型微球、腸溶包衣型微膠囊、腸溶包衣型顆粒劑、包有薄膜的腸溶包衣型顆粒劑、腸溶包衣型脂質(zhì)體、包有薄膜的腸溶包衣型脂質(zhì)體、腸溶包衣型凍干片(Iyoc)、包有薄膜的腸溶包衣型凍干片、在腸溶包衣中的滲透泵、樹膠劑、腸溶包衣型類球體、腸溶包衣型小球體、包有薄膜的腸溶包衣型類球體、包有薄膜的腸溶包衣型小球體、包有薄膜的腸溶包衣型片劑、包有薄膜的腸溶包衣型明膠膠囊。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及美容組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽，以及與之相聯(lián)合的美容學(xué)上可接受的載體。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，上文所定義的美容組合物另外還包含通式B的化合物以及與之相聯(lián)合的美容學(xué)上可接受的載體，所述通式B的化合物選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。根據(jù)另外一個方面，本發(fā)明涉及美容組合物，其包含通式(A，B)的化合物以及與之相聯(lián)合的美容學(xué)上可接受的載體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所定義的美容組合物被配制為以Img/天至300mg/天，優(yōu)選地4mg/天至150mg/天的劑量通過局部途徑可施用的。美容組合物的實(shí)例在下面的實(shí)施例3中呈現(xiàn)。在另一個方面，本發(fā)明涉及食品組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，上文所定義的食品組合物另外還包含通式B的化合物，所述通式B的化合物選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含上文所定義的通式(A，B)的化合物的食品組合物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文定義的食品組合物被配制為以50mg/天至300mg/天，優(yōu)選地IOOmg/天至200mg/天的劑量通過口服途徑可施用的。食品組合物的實(shí)例在實(shí)施例5中呈現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，上文所定義的食品組合物以腸溶包衣型形式存在。腸溶包衣型食品組合物可以以腸溶包衣型片劑、明膠膠囊、囊劑或顆粒劑的形式存在。附圖描述圖1描繪了連接蛋白質(zhì)ZO-I的免疫定位。在匯合的細(xì)胞區(qū)域中，根據(jù)細(xì)胞與或不與透明質(zhì)酸一起溫育，ZO-I的定位并無差別；但當(dāng)將細(xì)胞與透明質(zhì)酸(A，B)—起溫育時，由ZO-I所形成的網(wǎng)狀物更密集。相反地，在位于培養(yǎng)物外周且去分化的細(xì)胞水平上，觀察到與未與透明質(zhì)酸一起溫育的細(xì)胞(C)相比較，當(dāng)將細(xì)胞與透明質(zhì)酸一起溫育⑶時，ZO-I的表達(dá)更明顯且更連續(xù)。對于閉合蛋白這種連接蛋白質(zhì)觀察到相同的表達(dá)譜。圖2描繪了透明質(zhì)酸的濃度(橫坐標(biāo)軸)對于蛋白質(zhì)ZO-I和閉合蛋白的膜表達(dá)(縱坐標(biāo)軸)的影響。白色的柱相應(yīng)于閉合蛋白，而灰色的柱相應(yīng)于Z0-1。星形符號標(biāo)明了相對于沒有透明質(zhì)酸的對照而言統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(P<0.05)。圖3描繪了透明質(zhì)酸(橫坐標(biāo)軸)對于通訊連接的功能性(縱坐標(biāo)軸)的影響。白色的柱相應(yīng)于沒有透明質(zhì)酸的對照，而灰色的柱相應(yīng)于5mg/ml的透明質(zhì)酸。星形符號標(biāo)明了相對于對照而言統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(P<0.05)。圖4描繪了透明質(zhì)酸的濃度和呼吸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)時間(橫坐標(biāo)軸)對于跨上皮電阻(縱坐標(biāo)軸)的影響。依照時間和透明質(zhì)酸的濃度，觀察到跨上皮電阻的顯著增加(P<0.02)。圖5描繪了透明質(zhì)酸的濃度(橫坐標(biāo)軸)對于皮膚細(xì)胞的蛋白質(zhì)閉合蛋白的表達(dá)(縱坐標(biāo)軸)的影響。所述圖相應(yīng)于過氧化物酶活性的表達(dá)強(qiáng)度的測量。所述值是3個點(diǎn)的平均值。圖6描繪了透明質(zhì)酸的濃度(橫坐標(biāo)軸)對于皮膚細(xì)胞的蛋白質(zhì)ZO-I的表達(dá)(縱坐標(biāo)軸)的影響。所述圖相應(yīng)于過氧化物酶活性的表達(dá)強(qiáng)度的測量。所述值是3個點(diǎn)的平均值。圖7描繪了透明質(zhì)酸的濃度(橫坐標(biāo)軸)對于腸細(xì)胞的蛋白質(zhì)閉合蛋白的表達(dá)(縱坐標(biāo)軸)的影響。所述圖相應(yīng)于過氧化物酶活性的表達(dá)強(qiáng)度的測量。所述值是3個點(diǎn)的平均值。圖8描繪了透明質(zhì)酸的濃度(橫坐標(biāo)軸)對于腸細(xì)胞的蛋白質(zhì)ZO-I的表達(dá)的影響。下面的圖相應(yīng)于過氧化物酶活性的表達(dá)強(qiáng)度的測量。所述值是3個點(diǎn)的平均值。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1對于呼吸上皮細(xì)胞通過使用本發(fā)明中所描述的透明質(zhì)酸而增加了在維持上皮完整性中所牽涉的蛋白質(zhì)的表達(dá)的實(shí)例在包含DMEM/F12培養(yǎng)基的限制環(huán)(anneauxderestriction)中培養(yǎng)呼吸上皮細(xì)胞，所述DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)充有抗生素、生長因子，并且具有不同濃度的透明質(zhì)酸(0.1、1、5或10mg/ml)或者在不存在透明質(zhì)酸的情況下。當(dāng)匯合時，撤去限制環(huán)，以便允許在培養(yǎng)區(qū)域外周處的細(xì)胞進(jìn)行遷移。然后，固定細(xì)胞，隨后相繼地與抗ZO-I或抗閉合蛋白抗體，隨之與生物素化的抗體，和最后與偶聯(lián)至AlexaFluor488的鏈霉抗生物素蛋白(Invitrogen)一起進(jìn)行溫育。在使得能夠防止光漂白的溶液中，將所述制備物放置在載玻片上，并且借助于放大倍數(shù)為x40的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以便顯現(xiàn)蛋白質(zhì)ZO-I和閉合蛋白的細(xì)胞定位。在另一系列實(shí)驗(yàn)中，對于細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行兩次不同的提取總蛋白質(zhì)的提取和膜蛋白質(zhì)的提取，以便通過Western印跡技術(shù)來評估ZO-I和閉合蛋白的表達(dá)。通過測量跨上皮電阻來評估緊密連接的功能性將呼吸上皮細(xì)胞在具有雙區(qū)室(這使得能夠測量上皮電阻)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。借助于雙電極每24小時進(jìn)行這種測量，所述雙電極使得能夠在培養(yǎng)室的頂部培養(yǎng)基和底部培養(yǎng)基之間建立恒定的電壓。感應(yīng)電流的測量使得能夠計算出細(xì)胞層的電阻?？缟掀る娮璧脑黾颖砻鞴δ苄跃o密連接的存在。使用電視顯微鏡術(shù)和FRAP(熒光漂白恢復(fù))技術(shù)來評估通訊連接的功能性測量熒光探針經(jīng)由通訊連接的擴(kuò)散。(AbaciM等人，BiotechnolJ,2007,250-61；TedelindS,EurJEndocrinol2003,149:215-221)結(jié)果透明質(zhì)酸對于防御蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響通過免疫細(xì)胞化學(xué)來評估的Z0-1和閉合蛋白的表達(dá)在匯合的細(xì)胞區(qū)域中，根據(jù)細(xì)胞與或不與透明質(zhì)酸一起溫育，Z0-1的定位并無差另Ij。相反地，在位于培養(yǎng)物外周且去分化的細(xì)胞水平上，觀察到與未與透明質(zhì)酸一起溫育的細(xì)胞相比較，當(dāng)將細(xì)胞與透明質(zhì)酸一起溫育時，ZO-I的表達(dá)更明顯且更連續(xù)(圖1)。對于閉合蛋白這種連接蛋白質(zhì)觀察到相同的表達(dá)譜。通過Western印跡來評估的Z0-1和閉合蛋白的表汰在濃度漸增的透明質(zhì)酸存在下連接蛋白質(zhì)ZOl和閉合蛋白在膜水平上的表達(dá)率顯示在圖2中。依照在透明質(zhì)酸不存在下測量的蛋白質(zhì)的量，來表示在透明質(zhì)酸存在下測量的蛋白質(zhì)的量。所呈現(xiàn)的值相應(yīng)于4次實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。當(dāng)將細(xì)胞在濃度為1和5mg/ml的透明質(zhì)酸存在下進(jìn)行溫育時，觀察到蛋白質(zhì)ZOl的表達(dá)的顯著增加(P<0.05)。當(dāng)將細(xì)胞在濃度為lmg/ml的透明質(zhì)酸存在下進(jìn)行溫育時，也注意到閉合蛋白的表達(dá)的顯著增加(P<0.05)。通訊連接的功能件的分析通過測量熒光分子的細(xì)胞間擴(kuò)散，評估了通訊連接的功能性。圖3顯示了，在透明質(zhì)酸(5mg/ml)存在下呼吸上皮細(xì)胞的溫育引起擴(kuò)散指數(shù)的顯著增加(ρ<0.05)，這表明通訊連接的功能性的增加。實(shí)施例2對于皮膚細(xì)胞通過使用本發(fā)明中所描述的透明質(zhì)酸而增加了在維持細(xì)胞接近中所牽涉的蛋白質(zhì)的表達(dá)的實(shí)例將來自整形外科的外植體的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NormalHumanEpidermalKeratinocyte;NHEK))在補(bǔ)充有生長因子例如EGF(表皮生長因子)(0.25ng/ml)、25yg/ml垂體提取物(Invitrogen37000015)、25μg/ml慶大霉素(SigmaG1397)的SFM培養(yǎng)基(Invitrogen17005075)中于37°C在5%CO2下溫育24小時，然后去除培養(yǎng)基并且在本發(fā)明的透明質(zhì)酸分子存在或不存在(對照)下放置所述細(xì)胞。所測試的透明質(zhì)酸濃度為0.lmg/ml、lmg/ml和5mg/ml。在37°C和5%CO2下溫育72小時后，去除培養(yǎng)基，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞，隨后立即在-80°C下冷凍。提取由所述細(xì)胞表達(dá)的總蛋白質(zhì)，然后與偶聯(lián)至檢測系統(tǒng)的抗ZOl抗體(Cliniscience33-9100)和抗閉合蛋白抗體(Cliniscience33_1500)相接觸，所述檢測系統(tǒng)涉及與過氧化物酶相綴合的二抗。在過氧化物酶的底物存在下著色的表現(xiàn)提供了關(guān)于根據(jù)培養(yǎng)基中存在的HA的量標(biāo)志物ZOl和閉合蛋白表達(dá)的信息。在圖4和5中，當(dāng)細(xì)胞與本發(fā)明的透明質(zhì)酸一起溫育時，觀察到連接蛋白質(zhì)閉合蛋白和ZO-I表達(dá)的增加。應(yīng)當(dāng)指出，對于閉合蛋白在0.lmg/ml的濃度下和對于蛋白質(zhì)Z0-1在lmg/ml的濃度下獲得了最大表達(dá)。當(dāng)皮膚與低分子量的HA相接觸(這使得能夠增加細(xì)胞之間的粘聚力)時，皮膚(其為最暴露于環(huán)境的多重攻擊的器官之一)可以能夠更好地抵抗各種攻擊例如大氣污染實(shí)施例3包含本發(fā)明的分子的用于皮膚的美容組合物由下述配方來描述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例4對于腸細(xì)胞通過使用本發(fā)明中所描述的透明質(zhì)酸而增加了在維持細(xì)胞接近中所牽涉的蛋白質(zhì)的表達(dá)的實(shí)例將人結(jié)腸細(xì)胞(上皮人類高加索人結(jié)腸腺癌R51，Caco-2)在補(bǔ)充有非必需氨基酸(Invitrogen11140-035)、2mM谷氨酰胺(Invitrogen25030024)、50IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素(Invitrogen15070063)、10%胎牛血清(FCS,Invitrogen10270098)的MEM培養(yǎng)基(Invitrogen21090-022)中于37°C在5%CO2下溫育24小時，然后去除培養(yǎng)基并且在本發(fā)明的透明質(zhì)酸分子存在或不存在(對照)下放置所述細(xì)胞。所測試的透明質(zhì)酸濃度為0.lmg/ml、lmg/ml禾口5mg/ml。在37°C和5%CO2下溫育72小時后，去除培養(yǎng)基，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞，隨后立即在-80°C下冷凍。提取由所述細(xì)胞表達(dá)的總蛋白質(zhì)，然后與偶聯(lián)至檢測系統(tǒng)的抗ZOl抗體(Cliniscience33-9100)和抗閉合蛋白抗體(Cliniscience33_1500)相接觸，所述檢測系統(tǒng)涉及與過氧化物酶相綴合的二抗。在過氧化物酶的底物存在下著色的表現(xiàn)提供了關(guān)于根據(jù)培養(yǎng)基中存在的HA的量標(biāo)志物ZOl和閉合蛋白表達(dá)的信息。在圖6和7中，看起來連接蛋白質(zhì)閉合蛋白和ZOl的表達(dá)通過本發(fā)明的透明質(zhì)酸的存在而受到調(diào)節(jié)。在高濃度的透明質(zhì)酸時閉合蛋白以更大的量進(jìn)行表達(dá)，而關(guān)于蛋白質(zhì)Z01，在0.lmg/ml的濃度下觀察到最大表達(dá)。通過攝入低分子量的透明質(zhì)酸而引起的消化道細(xì)胞之間的接觸例如使得能夠增加連接蛋白質(zhì)的表達(dá)，這表明由上皮屏障所執(zhí)行的防御功能的加強(qiáng)。實(shí)施例5包含本發(fā)明的分子的用于腸粘膜的食品組合物由下述配方來描述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求至少一種分子量為30,000至45,000道爾頓，優(yōu)選地40,000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽在制備組合物中的用途，所述組合物用于在發(fā)生攻擊的情況下保護(hù)和/或恢復(fù)上和下呼吸道粘膜、腸粘膜、皮膚或眼的完整性，所述攻擊源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子，并且在所述攻擊中牽涉上皮細(xì)胞，特別是上皮細(xì)胞的連接復(fù)合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的透明質(zhì)酸的用途，另外還包括化合物B，所述化合物B選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的透明質(zhì)酸的用途，以0.lg/Ι至4g/l，優(yōu)選地0.2至lg/Ι的濃度。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的透明質(zhì)酸的用途，其特征在于，所述組合物是用于治療和/或預(yù)防由源于物理、化學(xué)或微生物學(xué)因子的攻擊而引起的病理學(xué)狀態(tài)的藥物。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的透明質(zhì)酸的用途，其特征在于，所述組合物是美容組合物或食品組合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的透明質(zhì)酸的用途，所述用途為用于制備用于預(yù)防病理學(xué)狀態(tài)例如哮喘、呼吸性變態(tài)反應(yīng)、呼吸窘迫綜合征的藥物，其中所述上皮細(xì)胞是上和下呼吸道粘膜的細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3和5之一的透明質(zhì)酸的用途，所述用途為用于制備用于在皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂的情況下改善皮膚的保護(hù)功能的組合物，所述皮膚的功能和結(jié)構(gòu)性紊亂尤其是皺紋、細(xì)小皺紋、皮膚的張力和彈性的減少、皮膚脫水，其中所述上皮細(xì)胞是皮膚的細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求1-3和5之一的透明質(zhì)酸的用途，所述用途為用于制備用于在消化性病癥的情況下改善腸粘膜的保護(hù)功能的組合物，所述消化性病癥特別是胃腸炎、缺血性壞死和腸粘膜潰瘍，其中所述上皮細(xì)胞是腸粘膜的細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求1-3和5之一的透明質(zhì)酸的用途，所述用途為用于制備用于在眼病癥的情況下改善眼的保護(hù)功能的組合物，所述眼病癥特別是水應(yīng)激、眼干燥、角膜損傷和角膜病變，其中所述上皮細(xì)胞是眼的細(xì)胞，尤其是角膜的細(xì)胞。10.藥物組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含至少一種分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽，以及與之相聯(lián)合的藥學(xué)上可接受的載體。11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其另外還包含化合物B以及與之相聯(lián)合的藥學(xué)上可接受的載體，所述化合物B選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的藥物組合物，其被配制成用于以50mg/天至300mg/天，優(yōu)選地IOOmg/天至200mg/天的劑量通過局部途徑進(jìn)行施用，或者以0.66mg/kg/天至4mg/kg/天，優(yōu)選地1.33mg/kg/天至2.66mg/kg/天的劑量通過口服途徑進(jìn)行施用。13.根據(jù)權(quán)利要求10-12之一的藥物組合物，其為腸溶包衣型形式。14.美容組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽，以及與之相聯(lián)合的美容學(xué)上可接受的載體。15.根據(jù)權(quán)利要求14的美容組合物，其另外還包含通式B的化合物以及與之相聯(lián)合的美容學(xué)上可接受的載體，所述通式B的化合物選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的美容組合物，其被配制為以Img/天至300mg/天，優(yōu)選地4mg/天至150mg/天的劑量通過局部途徑可施用的。17.食品組合物，其以0.lg/Ι至lg/Ι的濃度包含分子量為30，000至45，000，優(yōu)選地40，000道爾頓的透明質(zhì)酸或其相應(yīng)的鹽。18.根據(jù)權(quán)利要求17的食品組合物，其另外還包含通式B的化合物，所述通式B的化合物選自維生素，特別是抗壞血酸、維生素E或生育酚。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的食品組合物，其被配制為以50mg/天至300mg/天，優(yōu)選地IOOmg/天至200mg/天的劑量通過口服途徑可施用的。20.根據(jù)權(quán)利要求17-19之一的食品組合物，其為腸溶包衣型形式。全文摘要本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸在制備用于改善皮膚、眼和粘膜，特別是上和下呼吸道以及腸粘膜的保護(hù)功能的組合物中的用途。文檔編號A61P1/04GK101801391SQ200880106313公開日2010年8月11日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日發(fā)明者A·布里辛,E·皮謝勒,J-M·贊姆,M·米利奧申請人:農(nóng)業(yè)工業(yè)研究發(fā)展公司;國家健康醫(yī)學(xué)研究所