專利名稱：用于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制因子(mic-1)活性的藥劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲和/或體重的方法和新型藥劑。此外，本發(fā)明還 涉及篩選與巨噬細(xì)胞抑制因子-l(MIC-l)受體復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)其活性的藥劑的方法。通過(guò)引用而并入本專利申請(qǐng)要求2007年8月16日提交的名稱為“Agents andmethods for modulating macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1) activity"^AU2007904412 ^^ 先權(quán)，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用并入本文中。此外，在下面的說(shuō)明書中參考下述專利說(shuō)明書-國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/AU2005/000525(W0 2005/099746)；以及-美國(guó)專利5,225,539。這兩篇專利說(shuō)明書每一篇的全部?jī)?nèi)容均在此通過(guò)引用并入本文中。
背景技術(shù)：
體重和食欲控制是復(fù)雜的、未完全表征的過(guò)程。其失調(diào)可導(dǎo)致肥胖，肥胖是一個(gè)重 要的世界性公共健康問(wèn)題。在另一個(gè)極端，食欲減退/惡病質(zhì)最常見是由于晚期癌癥而引 起的，在晚期癌癥中，認(rèn)為腫瘤或基質(zhì)細(xì)胞衍生分子(stromal cell derived molecule)干 擾了對(duì)食欲和體重的嚴(yán)格控制，導(dǎo)致消瘦、衰弱，并常常導(dǎo)致死亡h。已經(jīng)表明幾種細(xì)胞因 子與食欲減退/惡病質(zhì)的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，但是認(rèn)為白細(xì)胞介素_6 (IL-6)是最可能的發(fā)病原 因。然而，迄今為止還沒(méi)有抗IL-6單克隆抗體的人臨床試驗(yàn)表現(xiàn)出在治療癌癥食欲減退/ 惡病質(zhì)中的效力。MIC-1 (又稱為ffl)F-15、PLAB、PDF和NAG-1)是TGF- ^超家族的分支成員，其在基 礎(chǔ)條件下不表達(dá)，但是可被炎癥、損傷或惡性腫瘤形成所誘導(dǎo)7_13。MIC-1在許多癌癥(包括 前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和乳癌)中過(guò)表達(dá)14。在晚期癌癥患者中，這導(dǎo)致血清MIC-1水 平顯著升高，可升高10-100倍，從平均450pg/ml升高到5-50ng/ml的水平或更高。由于表 達(dá)水平的個(gè)體差異和通過(guò)前轉(zhuǎn)化酶(pro-convertase)加工成熟MIC-1的不同，單個(gè)腫瘤分 泌的MIC-1的量可不盡相同”。MIC-1前肽強(qiáng)有力地結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，導(dǎo)致MIC-1的 ECM儲(chǔ)備形成，這可在體外和體內(nèi)證實(shí)。僅加工后形式的MIC-1 (缺少結(jié)合前肽的基質(zhì))擴(kuò) 散到循環(huán)中。因此，所述前肽調(diào)節(jié)體內(nèi)ECM儲(chǔ)備和循環(huán)血中MIC-1水平之間的平衡”。本發(fā)明人之前在國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/AU2005/000525 (W02005/099746)中描述 了調(diào)節(jié)對(duì)象中食欲和/或體重的方法和藥劑，所述方法和藥劑涉及MIC-1活性的調(diào)節(jié)。其 中所述的具體藥劑類型是抗MIC-1抗體，其抑制MIC-1活性并且能增加對(duì)象的食欲和/或 體重。下文提供了過(guò)表達(dá)MIC-1的腫瘤誘導(dǎo)食欲減退/惡病質(zhì)的進(jìn)一步證據(jù)，所述食欲減 退/惡病質(zhì)可通過(guò)施用抗MIC-1抗體來(lái)逆轉(zhuǎn)，并且可通過(guò)注射重組MIC-1來(lái)誘導(dǎo)。此外，還 研究了 MIC-1的作用機(jī)制，導(dǎo)致了 MIC-1受體復(fù)合物以及影響食欲和能量動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)的 潛在中樞調(diào)節(jié)劑的表征。
因此，本發(fā)明人鑒定了用于調(diào)節(jié)食欲和/或體重的方法和新型藥劑等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制因子-l(MIC-l)活性的新型藥劑的鑒定，其中 所述藥劑調(diào)節(jié)包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-0)RII受體之MIC-1受體復(fù)合物的活性。通過(guò) 調(diào)節(jié)MIC-1的活性，所述藥劑能夠調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲和/或體重。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)對(duì)象中巨噬細(xì)胞抑制因子-l(MIC-l) 活性的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用有效量的調(diào)節(jié)包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-3) RII受體之MIC-1受體復(fù)合物的活性的藥劑，其任選地與藥理學(xué)上可接受的載體和/或賦形 劑相混合。本發(fā)明還提供了篩選調(diào)節(jié)MIC-1活性之藥劑的候選藥劑或藥劑庫(kù)的方法。因此，在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了篩選能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制因子-l(MIC-l) 活性之藥劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-0)RII受體的MIC-1受體復(fù)合物或 其單體接觸，以及(ii)檢測(cè)所述MIC-1受體復(fù)合物或其單體的任何活性變化。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了通過(guò)所述第二個(gè)方面的篩選方法鑒定的新藥劑。


圖1顯示a.對(duì)肋腹皮下注射DU145人前列腺癌細(xì)胞系的45只裸小鼠的體重和 腫瘤大小的影響，所述DU145人前列腺癌細(xì)胞系已經(jīng)用表達(dá)hMIC-1的質(zhì)粒構(gòu)建體或空質(zhì)粒 載體進(jìn)行了永久轉(zhuǎn)染。監(jiān)測(cè)所述小鼠的體重和腫瘤大小6周。處死時(shí)，通過(guò)ELISA測(cè)定血 清hMIC-1水平，以體重減輕程度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)血清hMIC-1水平范圍作圖；b.單次 劑量MIC-1-MAb對(duì)裸鼠平均體重變化的影響，所述裸鼠利用導(dǎo)致高血清MIC-1水平的構(gòu)建 體永久轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞進(jìn)行了異種移植。11天后，當(dāng)帶有表達(dá)MIC-1之腫瘤的小鼠的體 重顯著降低時(shí)，給小鼠腹膜內(nèi)注射單次劑量的MIC-1-Mab，每個(gè)劑量注射3只小鼠，給5只 小鼠注射對(duì)照緩沖液(載體)或不作處理。每日監(jiān)測(cè)其體重，監(jiān)測(cè)20天。繪圖顯示所述 小鼠的峰值體重增加相比于對(duì)照小鼠在此相同時(shí)間段內(nèi)平均體重變化的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差； c.顯示根據(jù)“l(fā)b”的小鼠的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間(定義為其體重恢復(fù)至注射抗體當(dāng)天的體重的時(shí) 間)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)所施用的MIC-1-Mab的劑量作圖；d.顯示利用導(dǎo)致高血清MIC-1 水平的構(gòu)建體永久轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞進(jìn)行異種移植的20只裸鼠和利用對(duì)照空載體轉(zhuǎn)染的 DU145細(xì)胞進(jìn)行異種移植的20只裸鼠的體重變化。注射后第8天，當(dāng)MIC-1小鼠的平均體 重減輕為7%時(shí)，監(jiān)測(cè)3個(gè)連續(xù)的24小時(shí)時(shí)間段的攝食量。將食物置于料斗內(nèi)并在0時(shí)間 點(diǎn)稱重。24小時(shí)后，從置入所述料斗中的食物中減去未進(jìn)食和溢失的食物來(lái)測(cè)定所消耗的 食物。結(jié)果以每天每克小鼠體重所消耗的食物重量(克)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。* = p < 0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001 ;e.給20只裸鼠植入利用導(dǎo)致高M(jìn)IC-1水平 的構(gòu)建體永久轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞，給20只小鼠植入對(duì)照空載體構(gòu)建體。當(dāng)帶有MIC-1腫瘤 的小鼠體重減輕約18%時(shí)，處死小鼠。剝離肩胛骨間棕色脂肪組織、腹股溝、附睪和腹膜后 白色脂肪組織以及脛骨肌和腓腸肌，取出并稱重?？偘咨敬砀构蓽?、附睪和腹膜后脂肪貯庫(kù)的總重量。結(jié)果以樣本重量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，所述樣品重量表示為注射腫瘤 當(dāng)天的小鼠體重的比例。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，= p < 0. 001 ；f.剝離之前， 對(duì)“l(fā).e”中的小鼠進(jìn)行DXA掃描以測(cè)定總的瘦肉質(zhì)量和脂肪質(zhì)量。所示結(jié)果表示為總重 量(以克計(jì))的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。*** = p < 0. 001 ；g.皮下注射10 y g高度純化的重組 hMIC-1來(lái)處理12只BALB/c小鼠，每日兩次。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，給一半小鼠腹膜內(nèi)單次注射 10mg MIC-1-PAb或?qū)φ?PAb。每日監(jiān)測(cè)小鼠體重，以其初始體重的百分?jǐn)?shù)表示，將結(jié)果繪 制為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；以及h.顯示監(jiān)測(cè)“ lg”中所述hMIC-1處理的小鼠的3個(gè)連續(xù)24小 時(shí)時(shí)間段的每日攝食量。將食物置于料斗中并在0時(shí)間點(diǎn)稱重。24小時(shí)后，從置入所述料 斗中的食物中減去未進(jìn)食和溢失的食物來(lái)測(cè)定所消耗的食物。結(jié)果表示為每天每克小鼠體 重所消耗的食物重量(克)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖2顯示a. (A)用空載體轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞進(jìn)行異種移植的裸鼠、⑶用過(guò)表達(dá) MIC-1的DU145細(xì)胞進(jìn)行異種移植后第14天的裸鼠以及(C)按照“B”處理但是預(yù)先腹膜 內(nèi)注射lmg MIC-1-Mab 9天的小鼠的代表性照片。箭頭表示腫瘤生長(zhǎng)部位；b.利用表達(dá) hMIC-1的質(zhì)粒構(gòu)建體或含有MIC-1的空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞和對(duì)照腫瘤進(jìn)行異種移 植的40只裸鼠的體重的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖3提供了得自利用導(dǎo)致高血清MIC-1水平的構(gòu)建體永久轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞進(jìn)行 異種移植的裸鼠的數(shù)據(jù)。11天后，當(dāng)帶有表達(dá)MIC-1的腫瘤的小鼠體重顯著減輕時(shí)，給小鼠 腹膜內(nèi)注射3種不同劑量的MIC-1-Mab或?qū)φ站彌_液(PBS)，每個(gè)劑量注射3只小鼠。每日 監(jiān)測(cè)其體重，監(jiān)測(cè)20天。就每組而言，以其相對(duì)體重變化的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程 的時(shí)間作圖。用箭頭標(biāo)出注射MIC-1-Mab的時(shí)間。圖4顯示MIC-1劑量對(duì)體重減輕的影響。給18只9周齡的BALB/c小鼠皮下注射 載體對(duì)照或指定量的重組MIC-1，每日兩次。每日監(jiān)測(cè)其體重，監(jiān)測(cè)3天，計(jì)算此期間的體重 變化。將結(jié)果歸一化為載體對(duì)照注射第一天的體重并以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)結(jié)果繪圖。圖5顯示a.MIC-l或載體(對(duì)照)處理的自由進(jìn)食的小鼠以及載體處理的配對(duì)進(jìn) 食的動(dòng)物的體重變化(每組6只)。給小鼠皮下注射10 u gMIC-1 (或載體)，每日兩次，注 射10天。將結(jié)果歸一化為MIC-1注射第一天的體重并以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)結(jié)果繪圖。與載 體處理的對(duì)照小鼠相比，MIC-1處理的小鼠(p < 0. 05)以及配對(duì)進(jìn)食的小鼠(p < 0. 001) 的體重顯著降低。MIC-1處理的小鼠與配對(duì)進(jìn)食的小鼠之間的差異不顯著(兩因素重復(fù)測(cè) 量的方差分析AN0VA)。b. 10天后，對(duì)5a中的小鼠進(jìn)行DXA掃描以測(cè)定全身脂肪質(zhì)量和兩 只后腿的瘦肉質(zhì)量。結(jié)果表示為平均值(克)和標(biāo)準(zhǔn)差。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，
氺氺氺=p < 0. 001。圖6顯示MIC-1對(duì)小鼠能量消耗的影響。將15只BALB/c小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在開放回 路量熱儀(open circuit calorimeter)中并使其在籠中適應(yīng)24小時(shí)。在開始夜晚循環(huán) 時(shí)，給8只小鼠皮下注射(箭頭UOygMIC-l，給7只小鼠皮下注射對(duì)照緩沖液。在下一個(gè) 循環(huán)初期給予第二次注射(箭頭)，其后立即撤除食物以監(jiān)測(cè)禁食狀態(tài)下MIC-1誘導(dǎo)的代 謝變化。測(cè)量每個(gè)27分鐘周期的能耗(熱量)、呼吸交換率(RER)、耗氧量以及運(yùn)動(dòng)(x和 y總計(jì)數(shù))。以橫條標(biāo)出12小時(shí)的黑暗和光照循環(huán)。數(shù)據(jù)是2個(gè)循環(huán)的平均值，并以平均 值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤對(duì)所述數(shù)據(jù)繪圖。通過(guò)兩因素重復(fù)測(cè)量的方差分析AN0VA來(lái)比較所述數(shù)據(jù)。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖7顯示MIC-1對(duì)ob/ob小鼠體重變化和攝食量的影響。給瘦素缺陷ob/ob小 鼠皮下注射載體對(duì)照(5只小鼠)或10i!g/20g體重的重組MIC-1(5只小鼠)，每日兩次。
a.每日測(cè)量體重，將結(jié)果歸一化為MIC-1注射第一天的體重并以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)結(jié)果繪 圖。b.測(cè)量最后一天的攝食量并歸一化為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的初始體重。利用雙尾t檢驗(yàn)分析所 述結(jié)果。* = p < 0. 05。圖8提供了(a)對(duì)照腫瘤小鼠以及(b)MIC-l腫瘤小鼠的下丘腦弓狀核中GHRH mRNA表達(dá)的原位雜交的乳液自顯影圖片。Arc:下丘腦弓狀核；3V:第三腦室。比例尺= 40 y m。圖9顯示晚期前列腺癌患者中MIC-1 (a)或IL_6 (b)的血清水平與體重變化之間 的關(guān)系。圖10顯示a 檢測(cè)出生后(0-48小時(shí)，N = 76)、3周齡(N = 36)以及8-9周齡(N =40)的fmsMIC-1轉(zhuǎn)基因小鼠以及其WT同窩小鼠的體重。針對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和性別將體重 歸一化。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。* = p < 0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001。
b.監(jiān)測(cè)8周齡的fmsMIC-1和WT同系對(duì)照小鼠的3個(gè)連續(xù)24小時(shí)時(shí)間段內(nèi)的每天攝食 量，如圖4a所示。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。* = p<0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001。c.在第52-54天齡處死5只雄性和5只雌性fmsMIC-1轉(zhuǎn)基因小鼠以及4只雄 性和5只雌性同系對(duì)照小鼠。按照?qǐng)Dle剝離脂肪貯積和脛骨肌以及腓腸肌，取出并稱重。 以樣本體重的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分開表示雄性和雌性小鼠的結(jié)果，所述樣品體重以小鼠體重 的比例表示，* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖11提供直接AAV介導(dǎo)的下丘腦中MIC-1過(guò)表達(dá)所引起的體重減輕的結(jié)果。給 小鼠單側(cè)下丘腦內(nèi)注射表達(dá)MIC-1的AAV或?qū)φ誂AV。監(jiān)測(cè)12只小鼠的體重，其中一半小 鼠單側(cè)下丘腦內(nèi)注射過(guò)表達(dá)MIC-1的AAV，另一半小鼠單側(cè)下丘腦內(nèi)注射對(duì)照AAV載體。每 日給小鼠稱重，以平均值和所述平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤對(duì)結(jié)果繪圖。發(fā)明詳述之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多癌癥(尤其是上皮細(xì)胞來(lái)源的癌癥)過(guò)表達(dá)MIC-1，導(dǎo)致循環(huán) 中MIC-1水平(即血清水平)升高。還發(fā)現(xiàn)這些水平與癌癥疾病的時(shí)期和程度成比例，在 晚期癌癥的情形下，這些水平尤其與顯著的體重減輕相關(guān)。相似地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)患有慢性腎衰 竭(通常伴隨體重減輕和食欲減退/惡病質(zhì)的病癥)的患者的血清MIC-1水平顯著升高， 這與體重指數(shù)(BMI)降低有關(guān)。通過(guò)降低MIC-1水平或MIC-1活性，預(yù)計(jì)與癌癥、慢性腎衰 竭或其它由血清MIC-1水平升高介導(dǎo)的病因相關(guān)的體重減輕可被逆轉(zhuǎn)或減輕。實(shí)際上，在 上述國(guó)際專利申請(qǐng)No PCT/AU2005/000525 (W0 2005/099746)中，本申請(qǐng)人證明了抗MIC-1 抗體(抑制MIC-1活性)實(shí)際上能引起過(guò)表達(dá)MIC-1的腫瘤小鼠的體重增加。實(shí)現(xiàn)體重減 輕的逆轉(zhuǎn)或減輕是一個(gè)重要的臨床結(jié)果，因?yàn)轭A(yù)計(jì)這導(dǎo)致提高患者健康程度，因此認(rèn)為能 成功治療患者的癌癥、慢性腎衰竭或其它病因的疾病或病癥，根據(jù)具體情況而定?，F(xiàn)在，本發(fā)明人研究了 MIC-1作用機(jī)制，這導(dǎo)致更深入了解通過(guò)MIC-1調(diào)節(jié)食 欲的途徑和潛在的中樞調(diào)節(jié)劑。更具體而言，現(xiàn)在將所述MIC-1受體復(fù)合物表征為含有 TGF-0RII受體。因此，本發(fā)明鑒定了用于調(diào)節(jié)食欲和/或體重的新型藥劑，其中所述藥劑 通過(guò)調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物的MIC-1受體活性起作用。此外，本發(fā)明人鑒定了篩選與MIC-1受體復(fù)合物相互作用并且調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物活性的新型藥劑的方法。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)對(duì)象中巨噬細(xì)胞抑制因子-1 (MIC-1)活 性的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用有效量的調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物活性的藥劑，其 任選地與藥理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑相混合，所述MIC-1受體復(fù)合物含有轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因子-3(TGF-3)的RII受體。優(yōu)選地，所述藥劑與MIC-1受體復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物的活性， 然而，所述藥劑還可通過(guò)調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物的量來(lái)起作用。通過(guò)調(diào)節(jié)MIC-1活性，所述藥劑能調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲和/或體重。更具體而言，通過(guò)抑制(即拮抗)MIC_1活性(例如通過(guò)結(jié)合和阻斷所述MIC-1受 體復(fù)合物)，所述藥劑能增加對(duì)象的食欲和/或體重。在此情形下，所述方法適用于治療與 由于癌癥、慢性腎衰竭或其它病因疾病、病癥或治療引起的MIC-1過(guò)表達(dá)相關(guān)的食欲減退/ 惡病質(zhì)。另一方面，通過(guò)提高(即激動(dòng))MIC_1活性(例如通過(guò)結(jié)合和刺激MIC-1受體復(fù)合 物活性而模擬MIC-1活性)，所述藥劑能降低對(duì)象的食欲和/或體重。在此情形下，所述方 法可適用于治療例如肥胖。TGF-0超家族蛋白(包括MIC-1)受體超家族的受體是四聚體復(fù)合物，其含有兩個(gè) RI受體單體和兩個(gè)RII受體單體。所述MIC-1受體是四聚體復(fù)合物，其含有兩個(gè)RI受體單體和兩個(gè)TGF-0RII受 體。存在TGF-0 RII受體的許多剪接變體和其它變體(參見例如Konrad，L等38所述的變 體)，因此，應(yīng)當(dāng)理解的是本文所用的術(shù)語(yǔ)“TGF- 0 RII受體”包括這些變體。用在所述第一個(gè)方面的方法中的藥劑可與一個(gè)或兩個(gè)所述TGF-0RII受體單體 和/或一個(gè)或兩個(gè)RI受體單體相互作用。然而，優(yōu)選地，所述藥劑與一個(gè)或兩個(gè)TGF- 0 RII 受體單體相互作用。優(yōu)選地，所述TGF- 0 II受體單體單體是下丘腦TGF- 0 RII受體單體。優(yōu)選地，所述方法包括抑制MIC-1活性并且是為了增加對(duì)象的食欲和/或體重而 進(jìn)行的，所述對(duì)象可能患有與以下原因引起的MIC-1過(guò)表達(dá)相關(guān)的食欲減退/惡病質(zhì)癌癥 (尤其是上皮細(xì)胞癌癥，例如前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和乳癌)、慢性腎衰竭或其它病因疾 病(例如炎性疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、病癥(例如損傷、炎癥或應(yīng)激)或治療(例如放 療或化療)。為了抑制MIC-1活性，所述藥劑優(yōu)選選自結(jié)合和阻斷TGF-0RII受體(優(yōu)選下 丘腦TGF-0 RII受體)的藥劑，但是預(yù)計(jì)結(jié)合和阻斷RI受體或其它方式抑制四聚體MIC-1 受體復(fù)合物的單體之間相互作用的藥劑也是合適的。結(jié)合和阻斷TGF-0 RII受體的合適的藥劑的實(shí)例包括MIC-1的抑制性肽片段和模 擬物。然而，優(yōu)選地，這樣的藥劑選自抗TGF-0RII抗體(例如抗TGF-0RII抗體AF532， 可得自R&D Systems, Inc.，Minneapolis, MI，美國(guó))和抗體片段(例如Fab片段和重組 scFV片段)。更優(yōu)選地，所述藥劑是人源化抗TGF-0 RII單克隆抗體?？筛鶕?jù)美國(guó)專利No 5，225，539(在此通過(guò)引用以整體并入本文)中所述的方法制備人源化抗TGF-0 RII單克隆 抗體。結(jié)合和阻斷RI受體的合適的藥劑的實(shí)例包括熟知的抑制劑，例如ALK5抑制劑，包 括SB-431542(4-(5-苯并(1,3) 二噁唑-5-基-4-吡啶-2基-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺) (Sigma Aldrich, St Louis，M0，美國(guó))、SB-505124 (2-(5-苯并[1，3] 二噁唑 _5_ 基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽)35、SD-20836 (Scios, Inc.，F(xiàn)reemont，CA，美國(guó)) 以及GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)37以及MIC-1的抑制性 肽片段和模擬物。然而，優(yōu)選地，這樣的藥劑選自抗RI抗體和抗體片段(例如抗ALK5細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)域的hAP-0016抗體，可得自Angio-Proteomie，Boston, MA，美國(guó))。更優(yōu)選地，所述 藥劑是人源化抗RI單克隆抗體。當(dāng)為了抑制MIC-1活性而進(jìn)行時(shí)，適用于利用所述第一個(gè)方面的方法治療的對(duì)象 可限于表現(xiàn)出MIC-1過(guò)表達(dá)或至少血清MIC-1水平一直處在200-1200pg/ml的正常人血 清水平的高端的那些對(duì)象。可利用針對(duì)MIC-1的分析(例如MIC-1ELISA33)來(lái)測(cè)定高血清 MIC-1水平(例如來(lái)自全血或血清樣品)來(lái)選擇這樣的對(duì)象。“高”血清MIC-1水平包括> 850pg/ml，更優(yōu)選> 1000pg/ml，最優(yōu)選> 1200pg/ml?；蛘?，所述方法包括提高M(jìn)IC-1活性，并且是為了降低對(duì)象的食欲和/或體重而進(jìn) 行的，所述對(duì)象可能患有肥胖或還可能出于健康或虛榮心原因而期望體重減輕。為了提高 MIC-1活性，所述藥劑優(yōu)選選自通過(guò)結(jié)合TGF-0 RII受體和刺激TGF-0 RII受體活性來(lái)模 擬MIC-1活性的藥劑，但是預(yù)計(jì)結(jié)合RI受體和刺激RI受體活性的藥劑也是合適的。結(jié)合 和刺激TGF-0RII受體的合適的藥劑的實(shí)例包括MIC-1的刺激性肽片段和模擬物。結(jié)合和 刺激RI受體的合適的實(shí)例包括MIC-1的刺激性肽片段和模擬物。此外，所述第一個(gè)方面的方法可包括通過(guò)調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物的量(即對(duì)象中 內(nèi)源性MIC-1受體復(fù)合物的量)來(lái)調(diào)節(jié)MIC-1活性。就調(diào)節(jié)MIC-1受體復(fù)合物的量而言， 所述藥劑優(yōu)選選自降低對(duì)象中MIC-1受體復(fù)合物的量的藥劑，并且可選自靶向抗編碼所述 MIC-1受體復(fù)合物之基因的催化性和抑制性寡核苷酸分子(例如核酶、脫氧核糖核酸酶、反 義RNA和小抑制性RNA (siRNA))以及MIC-1受體復(fù)合物轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制劑。優(yōu)選地，這 樣的藥劑降低內(nèi)源性TGF-0 RII受體(優(yōu)選內(nèi)源性下丘腦TGF-0 RII受體)的量，但是降 低內(nèi)源性RI受體的量的藥劑也是合適的。預(yù)計(jì)這樣的藥劑適于治療與由癌癥、慢性腎衰竭 或其它病因疾病、病癥或治療引起的MIC-1過(guò)表達(dá)相關(guān)的食欲減退/惡病質(zhì)。用在所述第一個(gè)方面的方法中的藥劑可以被配制成任意合適的藥物/獸用組合 物或劑型(例如用于口服、口含、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)施用的組合物)。通常，這樣的組合 物是以有效調(diào)節(jié)食欲和/或體重的量施用給所述對(duì)象的，因此其可提供約0.01-約100 i! g/ kg體重/天的藥劑，更優(yōu)選提供0. 05-25 u g/kg體重/天的藥劑。合適的組合物可旨在用 于每日施用一次、每日施用多次或控制釋放或緩慢釋放，根據(jù)達(dá)到的最大有效作用而定。此外，本發(fā)明還提供篩選用于調(diào)節(jié)MIC-1活性的候選藥劑或藥劑庫(kù)的方法。因此，在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于篩選能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制因子(MIC-1) 活性的藥劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-0 )之RII受體的MIC-1受體復(fù)合 物或其單體接觸，以及(ii)檢測(cè)所述MIC-1受體復(fù)合物或其單體的任何活性改變。優(yōu)選地，所述方法是利用例如表達(dá)MIC-1受體復(fù)合物或其單體的培養(yǎng)細(xì)胞(例如 CH0細(xì)胞)在體外進(jìn)行。MIC-1受體復(fù)合物或其單體活性的改變可通過(guò)檢測(cè)一種或多種信號(hào) 傳導(dǎo)分子例如erk l/2、P-stat3以及smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化與否來(lái)檢測(cè)。或者，MIC-1 受體復(fù)合物或其單體的活性改變可通過(guò)檢測(cè)akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)分子的活化與否來(lái)檢測(cè)，之前的報(bào)道表明所述akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑與MIC-1活性有關(guān)34。其中所述方法的步驟(i)是利用所述MIC-1受體復(fù)合物的單體進(jìn)行的，優(yōu)選地，所 述單體是TGF- 0 RII受體，更優(yōu)選地，所述單體是下丘腦TGF- ^ RII受體。所檢測(cè)的MIC-1受體復(fù)合物或其單體活性的降低可表明所述藥劑可能增加對(duì)象 的食欲和/或體重。另一方面，所檢測(cè)的MIC-1受體復(fù)合物或其單體活性的增加可表明所 述藥劑可能降低對(duì)象的食欲和/或體重。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供通過(guò)所述第二個(gè)方面的方法鑒定的新藥劑。在下文中，通過(guò)參考下述非限定性實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法腫瘤異種移棺樽型在8周齡BALB/c裸鼠的右肋腹皮下注射在200mi PBS中的5_7X 106個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的 DU145細(xì)胞。所述DU145細(xì)胞已經(jīng)用含有成熟MIC-1 (MIC-1)、全長(zhǎng)MIC-1、MIC-1前轉(zhuǎn)化酶 位點(diǎn)缺失突變體或空載體的PIRES2-EGFP質(zhì)粒(Clontech，Mountain View，CA，美國(guó))進(jìn)行 了轉(zhuǎn)染11。一旦腫瘤可見，就測(cè)量腫瘤大小，并每1-3天給小鼠稱重，稱重6周。通過(guò)以下測(cè)定瘦肉和脂肪質(zhì)量使用雙能X射線吸收儀(DXA) (Lunar Piximus II，GE Medical Systems, Madison, WI，美國(guó))并剝離白色和棕色脂肪組織貯積(adipose d印ot)、脛骨肌以及腓腸肌，然后將其重量表示為占注射腫瘤當(dāng)天小鼠體重的比例。過(guò)表達(dá)MIC-1的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生通過(guò)傳統(tǒng)方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。簡(jiǎn)而言之，將含有以巨噬細(xì)胞特異性方式驅(qū)動(dòng)嚙 齒動(dòng)物MIC-1全長(zhǎng)編碼序列表達(dá)的經(jīng)修飾c-fms啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒構(gòu)建體線性化并注射到 C57BL6卵母細(xì)胞中。然后使所得轉(zhuǎn)基因小鼠與WT C57BL6小鼠交配，基于通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR 評(píng)價(jià)脾臟(富含巨噬細(xì)胞的組織)中MIC-1表達(dá)的增加來(lái)選擇所得的轉(zhuǎn)基因小鼠系(稱為 fmsMIC-1)。MIC-1被強(qiáng)烈表達(dá)至在小鼠血清中可容易檢測(cè)到的程度。MIC-1 試劑如之前所述制備和純化所有MIC-1抗體和重組蛋白"’15’16。在巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)的條件化培養(yǎng)基中表達(dá)重組MIC_1并利用疏水性相互作用色譜、離子 交換色譜的組合從中純化，然后利用反相HPLC純化。分別通過(guò)用重組MIC-1免疫或未免疫 的綿羊的血清進(jìn)行蛋白G親和色譜來(lái)制備MIC-lPAb或?qū)φ誌gG。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)而言，通過(guò) 在偶聯(lián)純化重組MIC-1的瓊脂糖柱上純化MIC-lPAb來(lái)制備親和力純化的抗MIC-1抗體?？?MIC-1單克隆抗體來(lái)源于雜交瘤并通過(guò)蛋白G親和色譜純化。經(jīng)改造以表達(dá)MIC-1的AAV載體的制備將人MIC-1的cDNA亞克隆到受控于CBA(雞肌動(dòng)蛋白)啟動(dòng)子并含有WPRE (土 撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件)的AAV表達(dá)質(zhì)粒中，并具有側(cè)翼為AAV2反向末端重復(fù)序列 (ITR)的牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)。將不含轉(zhuǎn)基因插入片段的AAV表達(dá)質(zhì)粒裝配到AAV 中并用作對(duì)照載體。然后基本上如所述制備感染性AAV顆粒32。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣 轉(zhuǎn)染法利用AAV和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后60小時(shí)收獲細(xì)胞，通過(guò)碘克沙醇密度梯度超離心從細(xì)胞裂解液中純化AAV載體，然后濃縮并用PBS透析。利用實(shí)時(shí)PCR(ABI Prism7700)滴定載體，將所有載體儲(chǔ)備液稀釋為1 X 1013個(gè)基因組/ml。代謝諫率、呼吸變換率和物理活動(dòng)的測(cè)定利用八室開放回路量熱儀(Oxymax Series, Columbus Instruments, Columbus, 0H，美國(guó))通過(guò)間接量熱法測(cè)量了 8-10周齡雄性BALB/c、fmsMIC-1或C57B16小鼠的代謝 速率。將小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在特制的樹脂玻璃(Plexiglass)籠(20. lcmXIO. lcmX12. 7cm) 中。溫度維持在22°C，空氣流量為0.6升/分鐘。隨意進(jìn)食和飲水，或者在一些實(shí)驗(yàn)中，注 射MIC-1后將小鼠禁食12小時(shí)。在開始記錄之前使小鼠在籠中適應(yīng)24小時(shí)。然后給小鼠 皮下注射lOyg MIC-1或?qū)φ站彌_液，然后監(jiān)測(cè)12小時(shí)。每27分鐘測(cè)量耗氧量(V02)，呼 吸交換率計(jì)算為VC02/V02(RER)。能量消耗(所產(chǎn)生的千卡熱量)計(jì)算為熱值(CV)XV02， 其中CV是3. 815+1. 232XRER。通過(guò)兩因素重復(fù)測(cè)量的AN0VA分析對(duì)產(chǎn)熱數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析。配對(duì)飼養(yǎng)實(shí)騎利用3組8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開始前將小鼠單個(gè)飼養(yǎng)1周。 一組小鼠皮下注射10 u g MIC-1，每日兩次，并隨意進(jìn)食。第二組對(duì)照小鼠僅注射載體，也是 隨意進(jìn)食。第三組配對(duì)飼養(yǎng)組僅注射載體并且與注射MIC-1的小鼠配對(duì)飼養(yǎng)。通過(guò)測(cè)量MIC-1處理組每24小時(shí)所消耗的食物來(lái)進(jìn)行配對(duì)飼養(yǎng)。第二天，給予所 述配對(duì)飼養(yǎng)小鼠的食物量與MIC-1處理的小鼠在前一天所消耗的食物量相同。為了測(cè)量攝 食量，將顆粒狀食物稱重并置于食物料斗中，再次稱量24小時(shí)后剩余的食物，經(jīng)溢出和糞 便校正后的差異代表每日攝食量。癌癥惡病質(zhì)患者群組用于評(píng)價(jià)MIC-1水平的血清樣品得自之前所公開的癌癥惡病質(zhì)研究23中所招募 的患者。簡(jiǎn)而言之，對(duì)照組為10名未患有前列腺疾病的患者，一組為19名最近診斷患有器 官局限性前列腺癌(CaP)的患者，另一組為38名患有晚期CaP的患者。就進(jìn)一步的分析 而言，此組被分為兩個(gè)亞組未患有惡病質(zhì)和患有惡病質(zhì)的晚期前列腺癌。晚期前列腺癌 患者是根據(jù)參加本研究之前由腫瘤科醫(yī)生確定的臨床狀態(tài)來(lái)分類的。當(dāng)患者體重減輕3-6 個(gè)月并且失去食欲(食欲減退)時(shí)其被確定為惡病質(zhì)。如果兩種癥狀均不存在，則患者被 認(rèn)為非惡病質(zhì)。如果存在一個(gè)癥狀，那么僅當(dāng)存在低能量水平、疲勞或低運(yùn)動(dòng)耐受性癥狀 中之一時(shí)才診斷為惡病質(zhì)。未患有惡病質(zhì)的晚期PCa亞組由14名患者組成。在3/14的 患者中發(fā)現(xiàn)了體重減輕，其中體重減輕的平均值士SEM為0. 87士0. 51kg(中值0kg ；范圍 0-6. 2kg)。盡管一些患者的體重減輕，但是根據(jù)腫瘤科主治醫(yī)生所確定的其臨床狀態(tài)，他們 不被認(rèn)為是惡病質(zhì)。中值年齡是72. 5歲?；加袗翰≠|(zhì)的亞組由24名患者組成。僅一名患 者根據(jù)第二標(biāo)準(zhǔn)被置于惡病質(zhì)組中。此組中所有患者體重均減輕，體重減輕的平均值士 SEM 為 6. 89士 1. 00kg(中值4. 7kg ；范圍1. 5-21. 9kg)。中值年齡是 68. 5 歲。小鼠下丘腦內(nèi)注射利用下述步驟進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。將小鼠用100mg/kg氯胺酮和20mg/kg賽拉嗪(Parke Davis-Pfizer, Sydney, Australia and Bayer AG, Leverkusen,德國(guó))麻酉卒并置于 Kopf■立 體定位儀(stereotaxic frame) (David Kopf, CA，美國(guó))上，其中頭部處于平坦頭骨位置。 利用10 u 1漢密爾頓氏注射器以0. 1 yl/分鐘的速度向小鼠下丘腦內(nèi)單側(cè)注射相關(guān)物質(zhì)，所述注射器與 Micro4 微量注射泵控制器(World Precisionlnstruments Inc.，Sarasota, FL，美國(guó))相連。就細(xì)胞因子的直接注射而言，通過(guò)相對(duì)于前囟后部2. 3mm、外側(cè)士0.3mm、腹部 5. 6mm的坐標(biāo)(其對(duì)應(yīng)于ARC28)給成年WT小鼠注射lyl MIC-1、1 yl瘦蛋白或1 yl對(duì) 照溶液。注射開始后30分鐘，處死小鼠。通過(guò)灌注固定腦，如下文所述通過(guò)免疫組化鑒定 P-stat3神經(jīng)元?？筎GF-B警體抗體的施用就涉及注射抗TGF-3受體抗體的實(shí)驗(yàn)而言，以0. 1 ill/分鐘的速度將1.5 ill 抗體(0. lmg/ml)單側(cè)注射到3只成年小鼠的下丘腦后區(qū)域中。所注射的抗體是針對(duì) TGF-^RII(R&D Systems, Inc. ) ■ BMP RII(GeneTex, Inc. , San Antonio, TX, United States of America)或瘦蛋白受體(Upstate Biotech.，Lake Placid, NY，美國(guó))的抑制 性山羊抗體。在此情形下，注射后使針頭在原位置放置10分鐘以允許擴(kuò)散。注射坐標(biāo)為 (從前因開始)前后-2. 3mm;中外側(cè)-0.5mm;背腹-4. 5mm，對(duì)應(yīng)于下丘腦后區(qū)域29。注射 TGF-^RII抗體后24小時(shí)，在上午10點(diǎn)至下午12點(diǎn)間給動(dòng)物腹膜內(nèi)注射100 u g hMIC_l。 在注射后恰好30分鐘處死小鼠，收集腦，用于檢測(cè)下丘腦后區(qū)域中c-fos和TGF-0RII免 疫反應(yīng)性神經(jīng)元，如下文所述。在一個(gè)替代性實(shí)驗(yàn)中，將6只成齡雄性小鼠分成3個(gè)組將1. 5iU抗TGF-3 RII 抗體(0. lmg/ml) (R&D Systems, Inc.)、1. 5 ii 1 抗BMP RII 抗體(0. lmg/ml) (GeneTex Inc., San Antonio, TX，美國(guó))或 1. 抗瘦素抗體(0. lmg/ml) (Upstate Biotech.)單側(cè)注射 到所述ARC中。在此情形下，注射后使針頭在原位置放置10分鐘以允許擴(kuò)散。所述注射坐 標(biāo)定位(從前囟開始)前后-1. 94mm沖外側(cè)-0. 4mm ；背腹_5. 5mm,即對(duì)應(yīng)于下丘腦弓狀核 29o注射后24小時(shí)，在上午10點(diǎn)至下午12點(diǎn)之間給動(dòng)物腹膜內(nèi)注射100 iig hMIC-1。注 射后30分鐘，處死小鼠，收集腦，用于檢測(cè)下丘腦弓狀核區(qū)中c-fos免疫反應(yīng)性，如下文所 述。小鼠腦的免疫組化和免疫熒光在當(dāng)天的固定時(shí)間(上午10點(diǎn)至下午12點(diǎn))給BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射lOyg或 100 ug hMIC-1或?qū)φ站彌_液。為確保c-fos免疫反應(yīng)性可能的最小變化，在腹膜內(nèi)注射 10 u g hMIC-1后恰好60 士 1分鐘時(shí)處死所有小鼠。就P-stat3而言，用5mg/kg (約100 u g) 瘦蛋白、100 y g hMIC-1或?qū)φ站彌_液處理小鼠，并在腹膜內(nèi)注射后恰好30分鐘時(shí)處死小 鼠。將小鼠深度麻醉，通過(guò)用在磷酸鹽緩沖液中的25ml 0.9%鹽水、以及隨后在0. 1M磷酸 鹽緩沖液(PH7. 4)中的冷的4%多聚甲醛灌注來(lái)固定腦。立即取出腦并置于4%多聚甲醛中 30分鐘，然后置于在磷酸鹽緩沖液中的30%蔗糖溶液中過(guò)夜。將腦切成30 ym冠狀切片，并 用在50%乙醇中的1%H202中清洗20分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。按1 5000將 第一抗體艮口兔抗小鼠 c-Fos (sc-52 ；Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA,美 國(guó))稀釋在含有0. 曲拉通X-100的PBS中，然后孵育過(guò)夜。除分別按1 500、1 2000 和 1 2000 稀釋外，類似地處理兔抗小鼠 Phospho-Stat3(Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA，美國(guó))、兔抗 phosphoERK 1/2 抗體(Cell Signaling)以及山羊抗小鼠 TGF- 3 RII (R&D Systems, Inc.)。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分鐘)后，將切 片與在PBS中以1 250稀釋的生物素化抗兔第二抗體(Sigma Aldrich)或生物素化抗山羊第二抗體(ChemiC0n，TemeCula，CA，美國(guó))孵育2小時(shí)。在PBS中清洗切片30分鐘，然后 在室溫下與親和素_生物素_過(guò)氧化物酶(Vectastain，Burlingame，CA，美國(guó))孵育30分 鐘。就一些實(shí)驗(yàn)而言，在使用鎳增強(qiáng)染色來(lái)區(qū)分一個(gè)切片上兩種抗體的反應(yīng)性的情況下，在 PBS中清洗切片，然后在0. 04%硫酸鎳胺存在下用0. 05%二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(Sigma) 和0. 007%過(guò)氧化氫處理。然后在PBS中清洗切片并用來(lái)自DAKO(Carpinteria，CA，美國(guó)) 的二氨基聯(lián)苯胺處理5分鐘。在水中清洗載玻片，在封片之前通過(guò)二甲苯脫水。通過(guò)Zeiss Axioplan光學(xué)顯微鏡的格柵刻線和10X物鏡對(duì)核Fos陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)所述區(qū) 域(包括其中差異明顯的區(qū)域)中的c-fos陽(yáng)性核進(jìn)行計(jì)數(shù)。就每個(gè)目的腦核而言，根據(jù) Franklin和Paxinos所述的立體定位坐標(biāo)中的小鼠腦圖譜對(duì)每隔兩個(gè)切片進(jìn)行計(jì)數(shù)以定 量c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元29。比較同時(shí)染色的兩組(每組5只小鼠)，測(cè)定左側(cè)和右側(cè)的每個(gè)核 中計(jì)數(shù)的平均神經(jīng)元數(shù)。合并所有組用于最后的分析，通過(guò)AN0VA，然后通過(guò)Fisher' s事 后檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)組與組之間的差異。就免疫熒光而言，將所述第一抗體即兔抗小鼠P_Stat3 (細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo))和山羊抗 小鼠 a -MSH(AB5087 ；Chemicon)按 1 5000 和 1 4000 在含有 0. 曲拉通 X-100 的磷 酸鹽緩沖鹽(PBS)中稀釋，然后孵育過(guò)夜。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分鐘) 后，將切片在山羊抗兔和驢抗綿羊第二抗體中孵育3小時(shí)，所述第二抗體與Alexa熒光團(tuán) (AlexaFluor 594 和 Alexa Fluor 488 ；Molecular Probes,Eugene, 0R，美國(guó))綴合，按 1 250在PBS中稀釋。在PBS中清洗切片3次(每次清洗10分鐘)后，在Zeiss Axioplan 光學(xué)顯微鏡(Oberkochen，德國(guó))下觀察熒光團(tuán)信號(hào)(c-Fos神經(jīng)元為紅色，a-MSH神經(jīng)元 為綠色)。原位雜交在所述天的固定時(shí)間(上午10點(diǎn)至下午12點(diǎn))，給小鼠腹膜內(nèi)注射10 y g hMIC-1或?qū)φ站彌_液。在腹膜內(nèi)注射后恰好60分鐘時(shí)處死所有小鼠，立即取出腦并冷 凍在干冰上。在低溫恒溫器上切冠狀切片(20i!m)并解凍固定在Superfrost 切片 (Menzel-Glaser，Braunschweig，德國(guó))上。利用與小鼠 NPY(5，_GAGGGTCAGTCCACACAGCCCC ATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3，)(SEQ ID NO :1)、小鼠P0MC(5，_TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCAC ACATCTATGGAGG-3，)(SEQ ID NO :2)、小鼠GHRH(5，_GCTTGTCCTCTGTCCACATGCTGTCTTCCTGGCG GCTGAGCCTGG-3，) (SEQ ID NO 3)互補(bǔ)的放射性標(biāo)記的DNA寡核苷酸一起分析來(lái)自同一冠 狀腦水平的MIC-1注射和PBS注射小鼠(n = 5只小鼠/組)的匹配切片，如之前所述28。為評(píng)價(jià)分散的神經(jīng)元中的mRNA水平，利用固定在Zeiss Axiophot顯微鏡上的 ProgRes 3008相機(jī)(Zeiss，Jena，德國(guó))對(duì)浸漬切片進(jìn)行數(shù)字化處理。利用NIH-Image 1. 61 軟件(由Wayne Rasband編寫，可以從zippy, nimh. nih. gov的匿名FTP上獲得)評(píng)價(jià)單一 神經(jīng)元上的銀顆粒密度。背景標(biāo)記相同并且不超過(guò)特定信號(hào)的5%。組合免疫組化(原位雜交)如上所述利用重組hMIC-1處理C57B6小鼠，并且進(jìn)行相同處理用于P_stat3免疫 組化。如上所述加以微小改變來(lái)進(jìn)行P-stat3的免疫組化標(biāo)記。在含有0. 3%曲拉通X-100、 0. BSA和5mg/ml肝素的PBS中按1 2000稀釋抗P_stat3抗體。在4°C下孵育切片 48小時(shí)，利用如上所述的相同步驟檢測(cè)特異性抗體標(biāo)記。固定切片并如上所述進(jìn)行NPY原 位雜交。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析除線性回歸、單變量logistic回歸以及多變量logistic回歸外，還利用 Mann-ffhi tney-U檢驗(yàn)分析了前列腺癌患者的數(shù)據(jù)。利用McNemar檢驗(yàn)(GraphPad，San Diego，CA，美國(guó))比較了血清MIC-1和IL-6，作為用于預(yù)測(cè)癌癥相關(guān)體重減輕的獨(dú)立檢驗(yàn)。 利用PRISM 4通過(guò)兩因素重復(fù)測(cè)量的AN0VA比較了代謝數(shù)據(jù)。除非另外指明，否則利用未 配對(duì)的雙側(cè)T檢驗(yàn)進(jìn)行差異的所有其它統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。除非另外指明，圖表上的所有誤差線 均表示標(biāo)準(zhǔn)差。除非另外指明，利用 STATVIEWVERSION 4. 5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA，美國(guó))進(jìn)行所有分析。結(jié)果MIC-1誘導(dǎo)可通過(guò)抗MIC-1抗體逆轉(zhuǎn)的快諫體重減輕為了了解MIC-1的局部和全身過(guò)表達(dá)的作用，利用表達(dá)人MIC_l(h MIC-1)的質(zhì)粒 構(gòu)建體永久轉(zhuǎn)染了不組成性產(chǎn)生MIC-1的人前列腺癌細(xì)胞系DU145。這些構(gòu)建體保留了或 缺少介導(dǎo)MIC-1基質(zhì)結(jié)合的前肽結(jié)構(gòu)域“。將轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞系皮下注射到裸小鼠的肋腹 內(nèi)以建立異種移植腫瘤“。監(jiān)測(cè)所述小鼠6周，其后利用高度特異性ELISA測(cè)定血清hMIC-1 水平"’15’16。具有升高的腫瘤來(lái)源hMIC-1的小鼠體重進(jìn)行性減輕，與終點(diǎn)血清MIC-1濃度 成比例(圖la、2a和2b)。具有低血清水平腫瘤來(lái)源hMIC_l (0_1500pg/ml，與正常人中所 觀察到的水平相似)的小鼠的體重增加了約19%，與這些小鼠中的幼齡小鼠一致(圖la)。 具有中度升高的MIC-1水平(1501-8500pg/ml)的小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重減輕約3%，具有 顯著升高的MIC-1水平(> 8500pg/ml)的小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重減輕約28% (圖la)。由 于具有對(duì)照腫瘤的小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)增加體重，所以就對(duì)照組而言，MIC-1的凈作用是 使具有中度和高度血清hMIC-1水平的小鼠的體重分別減輕了 22%和47%。為直接證明MIC-1對(duì)體重減輕的作用的特異性，通過(guò)給荷瘤小鼠注射多克隆綿羊 抗MIC-lIgG(MIC-l-PAb)來(lái)逆轉(zhuǎn)其作用。當(dāng)利用對(duì)照IgG(CON-IgG)時(shí)未觀察到這種對(duì) MIC-1的體重減輕作用的逆轉(zhuǎn)(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，單次注射hMIC-1特異性單克隆抗體 (MIC-1-MAb)而不注射載體對(duì)照可快速逆轉(zhuǎn)此MIC-1相關(guān)的體重減輕(圖lb、lc、2a和3) 和對(duì)腫瘤大小的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。MIC-1誘導(dǎo)的體重減輕的逆轉(zhuǎn)幅度和持續(xù)時(shí)間與所 施用MIC-1-MAb的量成比例。注射lmgMIC-1-MAb導(dǎo)致14%的峰值體重增加，這導(dǎo)致完全逆 轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)的體重減輕。將這與施用載體對(duì)照的帶有MIC-1腫瘤小鼠顯著的持續(xù)體重減輕 相比較(圖3)。此MIC-1-MAb的作用持續(xù)時(shí)間是17天(圖lc)。此外，抗體處理對(duì)腫瘤大 小無(wú)影響(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，表達(dá)MIC-1的腫瘤所誘導(dǎo)的體重減輕是由MIC-1 特異性介導(dǎo)的。為進(jìn)一步證明是MIC-1引起此作用，給正常BALB/c小鼠皮下施用劑量遞增的純化 重組hMIC-1，每日兩次，施用3天，并測(cè)量此期間小鼠的體重變化。這證明MIC-1以劑量依 賴性方式誘導(dǎo)體重減輕(圖4)，其中10 y g劑量的純化重組hMIC-1導(dǎo)致顯著而立即的體重 減輕，所述體重減輕可被MIC-1-PAb完全逆轉(zhuǎn)，但不能被CON-PAb完全逆轉(zhuǎn)(圖lg)。MIC-1誘導(dǎo)的小鼠體重減輕的表征為更具體地表征表達(dá)MIC-1的腫瘤所誘導(dǎo)的體重減輕的性質(zhì)，通過(guò)以下測(cè)定了多 個(gè)區(qū)域中脂肪和瘦肉組織質(zhì)量的變化剝離白色和棕色脂肪組織貯積、脛骨肌和腓腸肌，然 后將其重量表示為占注射腫瘤當(dāng)天小鼠體重的比例(圖le)。具有過(guò)表達(dá)MIC-1之腫瘤的小鼠沒(méi)有剩余的腹膜后脂肪，腹股溝脂肪貯積和附睪脂肪貯積分別減少了 54%和89%。與 具有對(duì)照腫瘤的小鼠相比，具有MIC-1腫瘤的小鼠的肩胛間棕色脂肪組織貯積(40%)以及 脛骨肌和腓腸肌(分別25%和29%)的重量有較小但顯著的減少。雙能X射線吸收(DXA) 掃描數(shù)據(jù)證明，與對(duì)照相比，具有MIC-1腫瘤的小鼠平均減少5. 3g瘦肉質(zhì)量和1. lg脂肪質(zhì) 量(圖If)。為確定具有過(guò)表達(dá)MIC-1之腫瘤的小鼠的體重減輕是否是由于進(jìn)食減少而引起 的，測(cè)量了連續(xù)3日的攝食量。將具有與高血清MIC-1水平相關(guān)的DU145細(xì)胞腫瘤的小鼠 與具有利用空載體轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞腫瘤的小鼠進(jìn)行了比較。具有過(guò)表達(dá)MIC-1之腫瘤的 小鼠比具有對(duì)照腫瘤的小鼠的每日平均攝食量減少了 32% (圖Id)。還測(cè)量了注射重組 MIC-1的BALB/c小鼠的食物消耗量，所述BALB/c小鼠被施用MIC_l_PAb或CON-PAb。與所 述荷瘤小鼠的數(shù)據(jù)相似，施用重組MIC-1引起攝食量顯著降低(圖lh)。重要的是，此食欲 低下(hypophagia)被導(dǎo)致體重增加的MIC-1-Pab處理所逆轉(zhuǎn)(圖lh)，確定了攝食量降低 是MIC-1介導(dǎo)的體重減輕的主要原因。為查明MIC-1誘導(dǎo)的脂肪質(zhì)量、瘦肉質(zhì)量以及體重的降低是完全是由于食欲低下 引起，還是代謝性因素也起作用，以接受每日兩次注射MIC-1的小鼠所消耗的食物量配對(duì) 飼養(yǎng)注射載體的小鼠。配對(duì)飼養(yǎng)的注射載體的小鼠減輕的體重至少與注射MIC-1的動(dòng)物一 樣多，表明注射MIC-1的小鼠在瘦肉或脂肪質(zhì)量損失方面與注射MIC-1的小鼠沒(méi)有顯著性 差異(圖5a和5b)。在配對(duì)飼養(yǎng)的動(dòng)物中所觀察到的稍微大些的體重減輕很有可能是由于 所誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)和由食物限制引起的物理活動(dòng)(例如覓食行為)的增加而造成的17，而 注射MIC-1后未出現(xiàn)這樣的物理活動(dòng)增加。總之，這些數(shù)據(jù)確定了食欲低下是MIC-1減輕 體重和相關(guān)的脂肪和瘦肉質(zhì)量降低的方法。為完全排除增加的代謝速率是MIC-1處理小鼠中體重減輕以及機(jī)體組成改變的 貢獻(xiàn)，在以單次注射對(duì)照緩沖液或重組MIC-1處理的正常小鼠中通過(guò)間接量熱研究了能量 消耗。與對(duì)照相比，注射10 y g MIC-1的小鼠表現(xiàn)出小但顯著的能量消耗降低(圖6)。當(dāng) 注射MIC-1后將小鼠禁食12小時(shí)以上時(shí)，這種小的相對(duì)能量消耗降低消失(圖6)。因此， 能量消耗增加不能解釋MIC-1處理小鼠中的體重減輕和機(jī)體組成的改變，這進(jìn)一步作為單 獨(dú)原因支持了降低的能量攝取。為檢測(cè)MIC-1是否還對(duì)肥胖動(dòng)物起作用，給遺傳性肥胖的瘦蛋白缺陷型ob/ob小 鼠每20g體重注射lOiig MIC-1，每日兩次，注射3天。與瘦小鼠中MIC-1的作用相似，ob/ ob動(dòng)物顯示出體重顯著減輕(圖7a)。與注射對(duì)照的小鼠相比，注射MIC-1的ob/ob小鼠 中的此體重減輕是攝食量顯著降低的結(jié)果(圖7b)。這些數(shù)據(jù)表明，MIC-1強(qiáng)有力地誘導(dǎo)食 欲低下和體重減輕，即使在非常肥胖的動(dòng)物模型中也是如此。對(duì)激素和代謝物的血清水平的評(píng)價(jià)表明，具有MIC-1腫瘤的小鼠的游離脂肪酸、 甘油三酯、葡萄糖、胰高血糖素、瘦蛋白和IGF-1的血清水平顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)，這與 其瘦肉和脂肪質(zhì)量的減輕是一致的。具有MIC-1腫瘤的小鼠還顯示出血清皮質(zhì)酮水平升高 的趨勢(shì)。循環(huán)IGF-1水平的變化提示對(duì)下丘腦_垂體_生長(zhǎng)激素軸的抑制，并因此檢測(cè)了 下丘腦中生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)的mRNA表達(dá)。如圖8所示，具有MIC-1腫瘤的小鼠的 腦中GHRH表達(dá)水平顯著降低，這證實(shí)了這些動(dòng)物中生長(zhǎng)激素軸的中樞性介導(dǎo)的下調(diào)。雖然 降低的血清IGF-1水平可引起MIC-1的一些作用，特別是瘦肉組織減少18，但是此神經(jīng)內(nèi)分泌的變化并不能解釋MIC-1處理動(dòng)物中的脂肪減少。實(shí)際上，具有低血清IGF-1水平的同 系類小鼠顯示出顯著增加的身體脂肪19。對(duì)生長(zhǎng)激素軸的抑制可能是對(duì)MIC-1引起的食欲減退和體重減輕的保護(hù)性適應(yīng)。 與此相一致，受限的能量攝取抑制嚙齒動(dòng)物和人的下丘腦_垂體_生長(zhǎng)激素軸和/或降低 血清IGF-1水平2°’21’22。因此，MIC-1處理對(duì)生長(zhǎng)激素軸的作用可能是MIC-1主要作用(食 欲減退和體重減輕)的繼發(fā)后果，而不是MIC-1作用的主要調(diào)節(jié)者。具有MIC-1腫瘤的小鼠還表現(xiàn)出血清瘦蛋白水平的顯著降低，盡管伴有食欲低 下。這提示MIC-1掩蓋了血清瘦蛋白水平降低引起的食欲促進(jìn)作用，這與瘦蛋白缺陷型ob/ ob小鼠(例如瘦動(dòng)物)還表現(xiàn)出響應(yīng)于MIC-1的食欲低下和體重減輕這一觀察結(jié)果相一 致。血清MIC-1水平與晩i期前歹II腺癌患者的彳本重減輕首梓相關(guān)為確定MIC-1與人食欲減退/惡病質(zhì)的相關(guān)性，檢測(cè)了被招募到良好表征的晚 期前列腺癌(PCa)患者群組中的患者的血清MIC-1水平，其中血清IL-6水平與惡病質(zhì)相 關(guān)23。與未患有惡病質(zhì)的晚期癌癥患者相比，患有惡病質(zhì)的晚期癌癥患者中血清MIC-1 水平顯著升高(12416 士 10235pg/ml 與 3265 士 6370pg/ml (平均值 士 SD) ；p < 0. 0001 ； Mann-ffhitney-U檢驗(yàn))。類似地，惡病質(zhì)患者中血清IL-6水平升高(33. 8士64. 2pg/ml與 7. 8 士 3. 4pg/ml, p < 0. 002 ；Mann-ffhitney-U 檢驗(yàn))。血清 MIC-1 與血清 IL-6 水平弱但顯 著地正相關(guān)(r = 0. 2949，p < 0. 04 ；線性回歸)。此外，在單變量logistic回歸和多變量 logistic回歸中，血清MIC-1和IL-6水平均為癌癥惡病質(zhì)存在的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(分別為 p = 0. 0002，p < 0. 0001 ；單變量 logistic 回歸；分別為 p = 0. 0017，p < 0. 0005 ；多變量 logistic回歸)。然而，食欲減退/惡病質(zhì)最客觀的可定量衡量標(biāo)準(zhǔn)是體重減輕。血清MIC-1 水平與和前列腺癌相關(guān)的體重減輕程度顯著相關(guān)(圖4a ;p = 0. 0002,r = 0. 4899 ；線性回 歸)，而血清IL-6與和前列腺癌相關(guān)的體重減輕程度則沒(méi)有這樣的相關(guān)性(p = 0. 6303 ；線 性回歸)(圖％)。這些結(jié)果還提供了以下可能性血清MIC-1評(píng)價(jià)可用作預(yù)測(cè)前列腺癌相關(guān)性惡病 質(zhì)的檢驗(yàn)。為評(píng)價(jià)此可能性，通過(guò)接受器工作曲線(R0C)分析比較了癌癥診斷時(shí)存在的目 前最佳的血清標(biāo)記物(IL-6)和血清MIC-1水平。作為癌癥相關(guān)性體重減輕的預(yù)測(cè)因子，血 清MIC-1水平顯著優(yōu)于IL-6 (曲線下面積(AUC)為0. 6829和0. 3505 ；p = 0. 0046)?？紤] 到血清MIC-1水平對(duì)癌癥惡病質(zhì)的診斷能力，用于診斷前列腺癌的最廣泛應(yīng)用的血清標(biāo)志 物PSA的R0C的AUC為0. 678 (95%置信區(qū)間，0. 666-0. 689)24，幾乎等同于MIC-1的特征。 因此，血清MIC-1測(cè)量應(yīng)證明可用于預(yù)測(cè)與前列腺癌相關(guān)的癌癥惡病質(zhì)，并且還鑒定可能 受益于被設(shè)計(jì)成降低血清MIC-1水平的任何未來(lái)療法的患者。血清MIC-1水平與慢性腎衰竭患者中BMI相關(guān)如晚期癌癥一樣，慢性腎衰竭也可能與體重減輕和惡病質(zhì)相關(guān)。此過(guò)程的標(biāo)志例 如食欲減退、體重減輕和BMI是晚期腎衰竭死亡的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子3°。因?yàn)锽MI是死亡的強(qiáng)預(yù) 測(cè)因子，并且血清MIC-1水平升高與動(dòng)物中相似變化相關(guān)聯(lián)，所以研究了晚期腎衰竭中血 清MIC-1水平與BMI之間的相關(guān)性。為此，檢驗(yàn)了來(lái)自381名晚期腎衰竭患者群組的血清 樣品，所述樣品沒(méi)有被集合以研究惡病質(zhì)或其它代謝過(guò)程31。在研究期間(多達(dá)3年)死亡的患者具有顯著較低的BMI(26. 17 士 5.63 ;266(平均值士 SD ；n)，23. 15 士 4. 92 ； 104 :p < 0. 0001 ；非配對(duì)t檢驗(yàn))。在研究開始時(shí)獲得透析前 血清樣品，并測(cè)定血清MIC-1水平。血清MIC-1水平與BMI相關(guān)，從而血清MIC-1水平升高 與BMI降低相關(guān)(p = 0. 0003 ；r = 0. 189 ；線性回歸)。i寸表議MIC-1的轉(zhuǎn)某因小鼠￥痺小并曰底得￥4、為確定長(zhǎng)期施用MIC-1可能出現(xiàn)的作用，研究了過(guò)表達(dá)受控于CSF-1啟動(dòng)子的 MIC-1的C57BL6轉(zhuǎn)基因小鼠(fmsMIC-1小鼠)。當(dāng)在出生后最初48小時(shí)內(nèi)測(cè)量時(shí)，這些小 鼠與其WT對(duì)照具有相似的體重(圖10a)。然而，到21天齡時(shí)，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠 的體重均比其性別匹配的WT同窩小鼠輕18% (圖10a)，此差異持續(xù)到成年期。從絕對(duì)值 上講，fmsMIC-1小鼠吃得比對(duì)照小鼠少(圖10b)，但在依據(jù)小鼠體重校正攝食量時(shí)此差異 消失。可能出生后攝食量的降低可導(dǎo)致小鼠發(fā)育比同類系同窩小鼠瘦小，并因此吃得相應(yīng) 更少。與用MIC-1短期處理的小鼠相似，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠的所有測(cè)量貯庫(kù)中的脂 肪均減少(圖10c)。總的說(shuō)來(lái)，過(guò)表達(dá)MIC-1的轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)據(jù)與利用此細(xì)胞因子短期 處理的小鼠的數(shù)據(jù)大體一致。全身件施用MIC-1活化下丘腦神經(jīng)元食欲和體重控制的主要調(diào)節(jié)中樞位于下丘腦中，尤其是弓狀核區(qū)域(ARC)中，其 被認(rèn)為具有半通透性的血腦屏障，可能允許血液運(yùn)載的調(diào)節(jié)劑與腦的此區(qū)域直接相互作用 25o為確定MIC-1是否直接對(duì)腦發(fā)揮其作用，給小鼠腹膜內(nèi)注射重組hMIC-1，然后1小時(shí)后 將其處死以檢查即早期基因c-fos的腦表達(dá)模式。此轉(zhuǎn)錄因子由多種刺激快速誘導(dǎo)，是廣 泛使用的、可靠的神經(jīng)元活化指示劑26。注射MIC-1后，下丘腦ARC和室旁核(PVN)中c-fos 免疫反應(yīng)活性顯著增加，表明這些核中的神經(jīng)元是MIC-1作用的下游調(diào)節(jié)劑。有趣的是，腦 干最后區(qū)(AP)也顯示出c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的顯著增加(表1)，提示此核對(duì)MIC-1作用 做出響應(yīng)的潛在作用。孤束核(NTS)或下丘腦或腦干的任意其它區(qū)域中c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元 數(shù)目無(wú)變化(數(shù)據(jù)未顯示)。表1 對(duì)腦的多個(gè)區(qū)域包括ARC、PVN、AP和NTS中c-fos核染色進(jìn)行定量并以平均值和 標(biāo)準(zhǔn)偏差表示這些發(fā)現(xiàn)提示，MIC-1的核心作用在于ARC，其為食欲控制的主要中心。來(lái)自ARC 的映射到達(dá)其它下丘腦核(例如PVN)，在那里與腦干區(qū)域(包括所述AP)形成連接，通過(guò) 所述連接，它們特異性地調(diào)節(jié)迷走交感神經(jīng)系統(tǒng)活性27。然而，不能排除的MIC-1直接活化 AP。NTS中c-fos活化不改變，這表明通過(guò)迷走神經(jīng)由外周傳入的信號(hào)不參與介導(dǎo)MIC-1作用。T Ff.M MIC-1特異丨牛i寸表汰i秀導(dǎo)彳本重減輕為進(jìn)一步證實(shí)MIC-1誘導(dǎo)的體重減輕是通過(guò)下丘腦介導(dǎo)的作用而進(jìn)行的，將腺相 關(guān)病毒(AAV)直接單側(cè)注射到下丘腦弓狀核內(nèi)來(lái)誘導(dǎo)MIC-1表達(dá)。其被改造成表達(dá)受控于 神經(jīng)元特異性烯醇酶啟動(dòng)子的全長(zhǎng)人MIC-1。使用人MIC-1特異性抗體的免疫組化證明了 此蛋白質(zhì)由細(xì)胞在ARC中的表達(dá)(圖11)。以此方式注射表達(dá)MIC-1的AAV的小鼠快速減 輕體重，但是注射空對(duì)照載體的小鼠以正常方式增加體重。這為MIC-1直接作用于下丘腦 細(xì)胞提供了進(jìn)一步有力的證據(jù)。全身件施用的MIC-1通過(guò)TGF- P RII警體作用于ARCTGF-0超家族蛋白(例如MIC-1)結(jié)合高度保守的受體超家族并通過(guò)其起作用，所 述受體超家族由4種不同的II型(RII)受體和7種I型受體(RI)組成，其各自含有絲氨 酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。結(jié)合配體時(shí)，兩個(gè)RII和兩個(gè)RI受體組裝成四聚體，其中RII使 位于細(xì)胞質(zhì)RI結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基磷酸化。這開始了信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其常涉及保守smad 家族的轉(zhuǎn)錄因子。許多其它信號(hào)傳導(dǎo)分子也被活化，包括erk 1/2，其之前與MIC-1激發(fā)的 受體活化相關(guān)聯(lián)14’32。為確定MIC-1優(yōu)選的RII受體，利用多種抗不同RII受體的抗體進(jìn)行了免疫組化。 這表明，僅TGF-0 RII與c-fos共同定位于處死前30分鐘注射MIC-1的小鼠的下丘腦中 (數(shù)據(jù)未顯示)。為確定TGF-0 RII受體是否形成所述MIC-1結(jié)合受體復(fù)合物的一部分，將 此受體的封閉抗體單側(cè)注射到下丘腦中。24小時(shí)后，給這些小鼠腹膜內(nèi)注射lOy gMIC-1。 30分鐘后處死小鼠，檢測(cè)下丘腦c-fos表達(dá)。在注射TGF-0 RII抗體的一側(cè)將免疫組化核c-fos表達(dá)封閉，但是不封閉對(duì)側(cè)的 C-fos表達(dá)。重要的是，針對(duì)密切相關(guān)的骨形成蛋白(BMP)的RII或瘦蛋白受體注射封閉抗 體并不導(dǎo)致抑制MIC-1誘導(dǎo)的c-fos表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。這清楚地表明，TGF-0RII受體 必須形成復(fù)合物的一部分，MIC-1通過(guò)所述復(fù)合物在下丘腦中發(fā)揮其作用。為探究MIC-1誘導(dǎo)下丘腦中下游作用的機(jī)制，對(duì)處死前15分鐘至60分鐘之間腹 膜內(nèi)注射lOOiig MIC-1的小鼠的下丘腦進(jìn)行進(jìn)一步的免疫組化。使用對(duì)smad信號(hào)傳導(dǎo)途 徑成員的磷酸化形式具有特異性的抗體smad 2,smad 3和smad 1、5、8。在每種情形下，未 處理小鼠的ARC還表明用所有抗體染色的核的存在，提示下丘腦中這些途徑的組成性活化 (數(shù)據(jù)未顯示)。可檢測(cè)到MIC-1處理小鼠中smad染色無(wú)顯著性增加，表明這些途徑未被 利用或者可能這些途徑的組成性活化掩蓋了 smad磷酸化的任何顯著增加。然而，已經(jīng)有幾 個(gè)小組報(bào)道了 MIC-1直接誘導(dǎo)erk 1/2的磷酸化32。因此，檢測(cè)了處死前10分鐘至60分鐘 之間注射100 y g MIC-1的小鼠下丘腦中此分子的活化。腹膜內(nèi)注射MIC-1后，檢測(cè)了 ARC 中P-erk 1/2染色，最大值出現(xiàn)在注射MIC-1后20分鐘。在注射對(duì)照緩沖液的小鼠中不存 在此途徑的活化?？傊@些數(shù)據(jù)表明，MIC-1通過(guò)erk 1/2途徑的活化來(lái)介導(dǎo)作用。全身性施用的MIC-1調(diào)節(jié)ARC的NPY和P0MC表達(dá)并活化轉(zhuǎn)錄因子stat3為確定全身性注射MIC-1是否活化已知與食欲調(diào)節(jié)相關(guān)的ARC神經(jīng)元途徑，研究 了兩種主要的食欲調(diào)節(jié)劑NPY和P0MC的表達(dá)。利用原位雜交，觀察到注射MIC-1使ARC中 NPY mRNA表達(dá)水平降低34%，使P0MC mRNA水平增加47%，這與減少進(jìn)食動(dòng)力相一致(表 2)。
表2 對(duì)ARC中的表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了定量，結(jié)果表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。這種主要P0MC食欲減退途徑的上調(diào)和NPY促進(jìn)食欲途徑的下調(diào)在方式上與在瘦 蛋白處理小鼠中所觀察到的相似(數(shù)據(jù)未顯示)。由于此相似性，還用抗磷酸化Stat3(P-Stat3)抗體探測(cè)了 MIC-1處理小鼠的下丘 腦，所述磷酸化stat3是瘦蛋白受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要分子(數(shù)據(jù)未顯示)。這清楚地表 明，MIC-1處理小鼠的外側(cè)ARC和腹側(cè)正中下丘腦中P-stat3染色神經(jīng)元顯著上調(diào)。有趣 的是，MIC-1處理小鼠中P_stat3的染色方式與注射瘦蛋白所誘導(dǎo)的不同，與注射瘦蛋白時(shí) 為背部ARC相比，注射MIC-1的小鼠中大多數(shù)P_stat3陽(yáng)性神經(jīng)元存在于外側(cè)ARC中。因 此，MIC-1和瘦蛋白雖然均活化ARC中的stat3信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但卻誘導(dǎo)不同的ARC神經(jīng)元 子集上的P_stat3。這些發(fā)現(xiàn)提示，MIC-1和瘦蛋白通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)其作用。與此一 致，將MIC-1注射到瘦蛋白受體缺陷型db/db小鼠中，在ARC中產(chǎn)生的P-stat3染色與在注 射MIC-1的WT小鼠中所觀察的相當(dāng)，結(jié)論表明MIC-1不通過(guò)瘦蛋白受體起作用。為進(jìn)一步鑒定MIC-1誘導(dǎo)的P_stat3陽(yáng)性神經(jīng)元，進(jìn)行了 NPY的原位雜交以及 a -黑色素細(xì)胞刺激素(a -MSH，P0MC的生物活性加工產(chǎn)物)的免疫組化以及P_stat3的 免疫組化/免疫熒光(數(shù)據(jù)未顯示)。這證明了 a-MSH和NPY神經(jīng)元為主要的MIC-1靶 標(biāo)種類，并且表明導(dǎo)致此模型體重減輕的攝食量降低是由于NPY和a -MSH產(chǎn)生改變而引起 的。此外，與c-fos活化的結(jié)果一致，大部分這些P_stat3/NPY和P_stat3/ a -MSH陽(yáng)性神 經(jīng)元代表不同的被瘦蛋白活化的神經(jīng)元子集，從而代表了 MIC-1調(diào)節(jié)食欲的新途徑。將MIC-1肓接注射到ARC內(nèi)也活化stat3為提供MIC-1直接作用于ARC的進(jìn)一步證據(jù)，研究了將MIC-1、瘦蛋白或?qū)φ站彌_ 液直接單側(cè)注射到所述ARC內(nèi)。完成注射后20分鐘，處死小鼠，對(duì)腦切片染色用于P_stat3。 雖然對(duì)照注射沒(méi)有作用，但是瘦蛋白和MIC-1均明顯誘導(dǎo)所述ARC中P-stat3的活化(數(shù) 據(jù)未顯示)。染色模式與全身性施用調(diào)節(jié)劑所觀察到的相似，其中注射MIC-1誘導(dǎo)ARC外 側(cè)部和下丘腦腹側(cè)正中核(VMHDM)背部中神經(jīng)元中stat3的磷酸化。與之相反，瘦蛋白注 射活化ARC背部、VMHDM背部以及下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)的神經(jīng)元中Stat3途徑(數(shù)據(jù)未顯 示)。這進(jìn)一步表明這兩種調(diào)節(jié)劑作用于下丘腦中不同的神經(jīng)元子集。討論動(dòng)物模型和前列腺癌患者中腫瘤過(guò)表達(dá)MIC-1以及血清MIC-1水平與體重減輕的 強(qiáng)相關(guān)表明，MIC-1參與癌癥食欲減退/惡病質(zhì)以及可能的其它惡病質(zhì)病癥(例如與心臟衰 竭和腎臟衰竭相關(guān)的那些病癥)的發(fā)病機(jī)制。雖然許多研究描述了患有癌癥食欲減退/惡 病質(zhì)的人與不具有此并發(fā)癥的相比細(xì)胞因子水平升高，但是還沒(méi)有任何人證實(shí)細(xì)胞因子水平與對(duì)于MIC-1而言明顯的體重減輕程度之間的直接相關(guān)性。此相關(guān)性以及本文所提供的 機(jī)制性部分的數(shù)據(jù)表明，MIC-1作用于下丘腦神經(jīng)元中的TGF-0 RII受體來(lái)降低食欲，確定 了 MIC-1是癌癥相關(guān)的食欲減退和體重減輕的重要原因。此外，通過(guò)抗MIC-1抗體對(duì)食欲 減退/惡病質(zhì)的逆轉(zhuǎn)作用表明了利用治療性抗體(和其它MIC-1拮抗劑)治療此嚴(yán)重疾病 的潛力。最后，本文所示結(jié)果表明，MIC-1引起食欲低下并且能直接影響攝食量和能量動(dòng)態(tài) 平衡、NPY和P0MC源a-MSH的主要下丘腦調(diào)節(jié)劑。此外，雖然MIC-1誘導(dǎo)食欲減退、體重減 輕的瘦蛋白樣作用并且減少下丘腦NPY表達(dá)以及增加P0MC表達(dá)，但是由MIC-1活化的NPY 和P0MC神經(jīng)元的子集與由瘦蛋白活化的不同。這表明，神經(jīng)元的更多種功能性網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)能 量動(dòng)態(tài)平衡的不同方面，并且合起來(lái)證實(shí)MIC-1是食欲和體重的核心調(diào)節(jié)劑并且與其受體 復(fù)合物一起提供了作為用于治療癌癥食欲減退/惡病質(zhì)和肥胖之靶標(biāo)的相當(dāng)大的潛力。在整個(gè)說(shuō)明書中，詞語(yǔ)“包含”或者變化形式例如“包括”或“含有”應(yīng)當(dāng)理解為意 味著涵蓋所述元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組，但是不排除任意其它元素、整 體或步驟，或者元素、整體或步驟的組。本說(shuō)明書中所述的所有出版物在此通過(guò)引用并入本文。包含在本說(shuō)明書中的對(duì)文 獻(xiàn)、法案、材料、設(shè)備、文章等的任意描述僅用于提供本發(fā)明情形的目的。不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，由于 任意或所有這些材料在本申請(qǐng)每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日前存在于澳大利亞或其它地方而 就承認(rèn)其構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的一般常識(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可在不背離廣泛描述的本發(fā)明精神或范圍的情形下， 如具體實(shí)施方案所述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改動(dòng)和/或修改。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)在 所有方面被認(rèn)為是示例性的而不是限制性的。參考文獻(xiàn)1. Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2: 862-871(2002).2. Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-relatedweight loss. Lancet Oncol, 6 :334_343(2005) 3. Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res,61 :1432—1438(2001).4. Rubin, H. Cancer cachexia :its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci,100 5384-5389(2003).5. Rail, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia :metabolic abnormalities, mechanisms andinterventions. Rheumatology 43 1219-1223 (2004).6. Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85: 51-66(2002).7. Bootcov, MR.et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of theTGF—旦 superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94: 11514-11519(1997).8. Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in CancerTissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100 3410-3415(2003).
9. Buckhaults, P. et al. Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectaltumours. Cancer Res 61 :6996_7001 (2001) 10. Koopmann，J. et al. Serum Macrophage Inhibitory Cytokine 1 as a Marker of Pancreatic and otherPeriampullary Cancers. CI in Cancer Res 10: 2386-2392(2004).11. Bauskin，AR. et al.The propetide mediates formation of stromal stores of proMIC—1 :Role indetermining prostate cancer outcome. Cancer Res 65 2330-2336(2005).12. Hsiao, EC. et al. Characterization of growth-differentiation factor 15，a transforming growth factorbeta superfamily member induced following liver injury. Mol Cell Biol 20:3742-51 (2000).13. Schober. A. et al. Expression of growth differentiation factor-15/ macrophage inhibitory cytokine-1 (GDF-15/MIC-1)in the perinatal，adult，and injured rat brain. J Comp Neurol 439 32-45 (2001).14. Bauskin, AR. et al. Role of MIC-1 in Tumourigenesis and Diagnosis of Cancer. Cancer Res66 :4983_4986 (2006).15.Fairlie，WD. et al.Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-3 superfamily protein，Macrophage Inhibirory Cytokine-1 (MIC-1) Identification of at least five distinct epitopespecificities. Biochemistry 40: 65-73(2001).16.Brown, DA.et al. Concentration in plasma of macrophage inhibitory cytokine-1 and the risk ofcardiovascular events in women. Lancet 359 2159-2163(2002).17. Cha 1 let, E. et a 1. Involvement of cor t i co s t er one in the fasting-induced rise in protein utilization andlocomotor activity. Pharmacol Biochem Behav 50:405-412(1995).18. Kamel, HK.Maas，D. Duthie, EH. Role of hormonesin the pathogenesis and management ofsarcopenia. Drugs Aging 19 :865_877(2002) 19. Rosen, CJ. et al. Congenic mice with low serum IGF-1 have increased body fat,reduced bonemineral density,and an altered osteoblast differentiation program. Bone 35 1046-1058 (2004).20. Park，S. Sohn，S. Kineman，RD. Fast ing-induced changes in the hypothalamic-pituitary-GH axis inthe absence of GH expression :lessons from the spontaneous dwarf rat. J Endocrinol 180 369-378 (2004).21. Lewitt, MS et al. Responses of insulin-like growth factor (IGF)-I and IGF-binding proteins tonutritional status in peroxisome Proliferator-activated receptor-alpha knockout mice. Growth HormlGF Res 11 :303_313 (2001) 22. Friedl,KE. et al. Endocrine markers of semistarvation in healthy lean men in a multistressorenvironment. J Appl Physiol 88:1820-1830(2000).
20
23. Pfitzenmaier, J. et al. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 97:1211-1216(2003).24. Thompson, IM. et al. Operating characteristics of prostate-specific antigen in men with an initialPSA level of 3. Ong/ml or lower. JAMA 294 66-70(2005).25. Naylor, JL.et al. Further evidence that the blood/brain barrier impedes paraquat entry into thebrain. Human & Experimental Toxicology 14 587-594(1995).26.Karl,T. et al. Y1 receptors regulate aggressive behavior by modulating serotonin pathways. Proc. Natl. Acad. Sci 101 12742-12747 (2004).27.Bouret，S. et al. Formation of Projection Pathways from the Arcuate Nucleus of theHypothalamus to Hypothalamic Regions Implicated in the Neural Control of Feeding Behavior inMice. J NeuroSci 24 2797-2805 (2004).28. Sainsbury，A. Schwarzer, C. Couzens，M. Herzog, H. Y2 receptor deletion attenuates the type 2diabetic syndrome of ob/ob mice. Diabetes 51: 3420-3427(2002).29. Paxinos, G.Franklin，KBJ. The mouse brain in sterotaxic coordinates. 2001. Academic press. SanDiego，USA.30. Kovesdy, C. P.，Anderson，J. E. & Kalantar-Zadeh，K. Inverse association between lipid levels andmortality in men with chronic kidney disease who are not yet on dialysis :effects of case mix andthe malnutrition—inflammation—cach exia syndrome. J Am Soc Nephrol 18:304-311 (2007).31. Apple, FS.，Murakami，MM.，Pearce，LA. & Herzog, CA. Predictive value of cardiac troponin I andT for subsequent death in end-stage renal disease. Circulation 106:2941-2945(2002).32. Lee, DH. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer eellsby up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system. Cancer Res 63(15) 4648-4655(2003).33. Moore, AG.et al. TGF-旦 superfamily cytokine MIC-1 is present in high concentrations in theserum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788(2000).34. Wollman, W. et al. The macrophage inhibitory cytokine integrates AKT/ PKB and MAP kinasesignaling pathways in breast cancer cells. Carcinogenesis 26(5) 900-907(2005).35. DaCosta Byfield，S. et al. SB-505124 is a selective inhibitor of transforming growth factor-betatype I receptors， ALK4， ALK5 and ALK7.Mol Pharmacol 65:744-752(2004).36. Bonniaud,P. et al. Progressive transforming growth factor 3 1-induced lung fibrosis is blocked byan orally active ALK5 kinase inhibitor. Am J RespirCrit Care Med 171 :889_898(2005).37.de Gouville, AC. et al. Inhibition of TGF-beta signaling by an ALK5 inhibitor protects rats fromdimethylnitrosamine-induced liver fibrosis.Br J Pharmacol 145 166-177(2005).38. Konrad, L et al. Alternative splicing of TGF-betas and their high-affinity receptors T ^ RI,T ^ Rlland T3 RIII(betaglycan)reveal new variants in human prostatic eel Is. BMC Genomics 8:318(2007).
權(quán)利要求
一種調(diào)節(jié)對(duì)象中巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1)之活性的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)RII受體的MIC-1受體復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)其活性的藥劑，其任選地與藥理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑與MIC-I受體復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)其活性。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥劑抑制MIC-I的活性以增加對(duì)象的食欲和/或體重。
4.權(quán)利要求3的方法，其用于治療與MIC-I過(guò)表達(dá)相關(guān)的食欲減退/惡病質(zhì)。1
5.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑與所述TGF-βRII受體相互作用。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
7.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑選自ALK5抑制劑、MIC-I的抑制性肽 片段和模擬物、抗TGF-β RII抗體及其片段、抗RI抗體及其片段。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥劑提高M(jìn)IC-I的活性以降低對(duì)象的食欲和/或體重。
9.權(quán)利要求8的方法，其用于治療肥胖。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述藥劑與所述TGF-βRII受體相互作用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑選自MIC-I的刺激性肽片段和模擬物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥劑調(diào)節(jié)所述對(duì)象中MIC-I受體復(fù)合物的量。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述藥劑降低所述對(duì)象中MIC-I受體復(fù)合物的量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述藥劑選自靶向編碼所述MIC-I受體復(fù)合物之基因的 催化性和抑制性寡核苷酸分子以及MIC-I受體復(fù)合物轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制劑。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述藥劑通過(guò)降低內(nèi)源性TGF-βRII受體的量來(lái)降 低MIC-I受體復(fù)合物的量。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
18.權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的方法，其用于治療與MIC-I過(guò)表達(dá)相關(guān)的食欲減退/惡 病質(zhì)。
19.權(quán)利要求4或18的方法，其中所述MIC-I過(guò)表達(dá)是由癌癥引起的。
20.權(quán)利要求4或18的方法，其中所述MIC-I過(guò)表達(dá)是由慢性腎衰竭引起的。
21.一種用于篩選能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制因子(MIC-I)活性的藥劑的方法，所述方法 包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β) RII受體的MIC-I受體復(fù)合物或其單 體接觸，以及( )檢測(cè)所述MIC-I受體復(fù)合物或其單體的任何活性變化。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述MIC-I受體復(fù)合物或其單體在培養(yǎng)細(xì)胞的表面上提{共。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述MIC-I受體復(fù)合物或其單體活性的變化可通過(guò) 檢測(cè)erk l/2,P-stat3信號(hào)傳導(dǎo)分子或smad和/或akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化與否來(lái)檢測(cè)。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
25.通過(guò)權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的方法鑒定的新藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲和/或體重的方法和新型藥劑。此外，本發(fā)明還涉及篩選與巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1)受體復(fù)合物相互作用并調(diào)節(jié)其活性的藥劑的方法。
文檔編號(hào)A61P3/04GK101854947SQ200880103168
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者塞繆爾·諾貝特·布賴特, 大衛(wèi)·亞歷山大·布朗, 林舒, 赫貝特·赫爾佐克 申請(qǐng)人:圣文森特醫(yī)院悉尼有限公司;加文醫(yī)學(xué)研究所