專利名稱：替代途徑的血清滅菌蛋白調(diào)節(jié)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用抗血清滅菌蛋白(properdin)抗體選擇性激活替代途徑 (alternative pathway, AP)。特別地，本發(fā)明涉及通過將對象與抗血清滅菌蛋白抗體接觸 來治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥(pathology)或AP介導(dǎo)的狀況的方法。同樣，本發(fā)明提 供血清滅菌蛋白敲除轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物以及它們的用途。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體系統(tǒng)提供宿主對侵入病原體的第一道防御屏障。補(bǔ)體激活經(jīng)由3個不同的 途徑發(fā)生經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑通過抗原-抗體結(jié)合啟動。當(dāng)結(jié) 合甘露糖的凝集素(marmose-bindinglectins，MBL)與微生物表面糖分子相互作用時引發(fā) 凝集素途徑。這兩種途徑的激活引起經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)變酶C4b2a的裝配——盡管也可以發(fā) 生MBL-相關(guān)的絲氨酸蛋白酶對C3的直接剪切。替代途徑(AP)是AP C3轉(zhuǎn)變酶——C3bBb 驅(qū)動的自身放大環(huán)(self-amplification loop)。AP激活可發(fā)生在經(jīng)典途徑或凝集素途 徑激活之后，或被獨(dú)立地啟動。在后一種情況下，低水平的自發(fā)C3 “慢速運(yùn)轉(zhuǎn)”產(chǎn)生最初的 C3bBb，其在缺乏適當(dāng)調(diào)節(jié)的情況下快速增殖AP。因此，不具有負(fù)調(diào)節(jié)或具有不足負(fù)調(diào)節(jié)的 非自身表面上的AP補(bǔ)體激活被認(rèn)為是缺省過程，而自體細(xì)胞通常在多種膜_結(jié)合和液相補(bǔ) 體抑制蛋白的幫助下來避免這種結(jié)果。與許多抑制蛋白的存在形成對比，血漿蛋白血清滅菌蛋白是唯一已知的補(bǔ)體激活 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)劑。50多年以前被發(fā)現(xiàn)時，血清滅菌蛋白最初被認(rèn)為是AP補(bǔ)體的啟動劑，其 以類似于經(jīng)典途徑抗體的方式發(fā)揮作用。血清滅菌蛋白和AP的存在沒有被立即接受并成 為爭論的主題，其中AP曾經(jīng)被認(rèn)為是“血清滅菌蛋白途徑”。盡管AP在補(bǔ)體激活中的重要 性已經(jīng)被證實并且現(xiàn)在是教科書知識，但血清滅菌蛋白是AP激活驅(qū)動力的概念本質(zhì)上被 拋棄了，取而代之的是目前持有的觀點血清滅菌蛋白通過延長新生C3bBb轉(zhuǎn)變酶的半衰 期來促進(jìn)AP補(bǔ)體激活。最近，證實了表面C3b-結(jié)合血清滅菌蛋白可以作為新C3bBb組裝 的平臺。這指出了血清滅菌蛋白在AP補(bǔ)體激活中更復(fù)雜的作用機(jī)理并且?guī)砹诉M(jìn)一步研 究的需要，所述研究針對血清滅菌蛋白功能及其在賦予血清滅菌蛋白-缺乏的個體免疫性 方面的應(yīng)用。發(fā)明概述在一個實施方式中，本發(fā)明提供治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括給予 所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體、從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供抑制對象中血清滅菌蛋白依賴性的、微生物抗 原引發(fā)的、非生物外源表面引發(fā)的或改變的自身組織引發(fā)的AP補(bǔ)體激活的方法，包括給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體、從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟。在一個實施方式中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物及其子代，其基因組包含血 清滅菌蛋白編碼基因的破壞，以便所述哺乳動物缺乏功能性血清滅菌蛋白或具有降低的功 能性血清滅菌蛋白的水平。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供鑒定化合物體內(nèi)生物活性的方法，所述方法包 括下列步驟提供不能表達(dá)血清滅菌蛋白的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物；向所述非人哺乳動物給 予所述化合物；測定所述非人哺乳動物表現(xiàn)的病癥；以及鑒定所述化合物的體內(nèi)生物活 性。在一個實施方式中，本發(fā)明提供制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，包括將多核苷 酸導(dǎo)入非人哺乳動物的胚胎中，所述多核苷酸包含編碼血清滅菌蛋白編碼基因的破壞的內(nèi) 含子的編碼區(qū)；將所述胚胎轉(zhuǎn)移至代孕母體小鼠中；將所述胚胎妊娠；以及選擇所述代孕 母體小鼠生出的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的特征在于當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因哺乳 動物比較時，其具有降低的AP補(bǔ)體激活。附圖簡述結(jié)合附圖閱讀以下的詳細(xì)描述將更好地理解本發(fā)明，在附圖中，類似的指代符號 用于指示類似的要素，以及其中

圖1顯示血清滅菌蛋白+小鼠的產(chǎn)生。A.小鼠血清滅菌蛋白基因座位的示意圖。 垂直柱表示外顯子(E)的位置。水平長方框表示用于ES細(xì)胞篩選的cDNA探針的位置。
B.靶載體。大箭頭表示LoxP位點以及小箭頭表示FRT位點。Neo:新霉素，DT:白喉毒素。
C.實際重組的血清滅菌蛋白基因座位。D.野生型和重組等位基因的期望的限制性片段長 度以及Hinc II和ScaI消化后ES細(xì)胞的代表性DNA印跡篩選結(jié)果。E.野生型(WT)和血 清滅菌蛋白敲除(P+)小鼠組織中血清滅菌蛋白mRNA的RNA印跡分析。F.血漿中血清滅 菌蛋白的免疫擴(kuò)散分析。將抗人血清滅菌蛋白抗體置于中央孔中并將小鼠血漿(10μ 1)和 人(5μ 1)血漿或純化的人血清滅菌蛋白(0. 5μ g)置于周圍孔中。在中央孔和周圍孔之間 的沉淀線表示測試樣品中血清滅菌蛋白的存在；圖2顯示通過NEO缺失來拯救血清滅菌蛋白基因敲除。A.顯示FLPe-介導(dǎo)的NEO 缺失后期望的重組血清滅菌蛋白基因座位示意圖。B.源自血清滅菌蛋白+XFLPe-轉(zhuǎn)基因 小鼠雜交的7只小鼠的PCR基因型分型。使用LoxP或FLPe-特異性引物，兩只小鼠(#1和 #5)鑒定為具有重組血清滅菌蛋白基因以及4只小鼠(#1至#4)是FLPe轉(zhuǎn)基因的。如所期 望的，F(xiàn)LPe-陰性、LoxP-陽性小鼠(#5)含有NEO而FLPe-陽性、LoxP-陽性小鼠(#1)不含 有ΝΕΟ。C.血漿血清滅菌蛋白的免疫擴(kuò)散分析，其顯示在小鼠#5 (血清滅菌蛋白-/-)中不 存在血清滅菌蛋白，而在小鼠#1(敲除拯救的)中檢測到血清滅菌蛋白。將抗人血清滅菌 蛋白抗體置于中央孔中并將小鼠#1、#2、#5、#6(參見圖B)的血漿樣品置于周圍孔中；圖3顯示LPS-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的ELISA測定。A.在包被LPS的板上進(jìn)行LPS 的ELISA檢測。B.在野生型(WT)或血清滅菌蛋白敲除(P+)小鼠血清中通過結(jié)合板的傷 寒沙門氏菌(S.typhoSa)LPS進(jìn)行AP補(bǔ)體激活。為了重建血清滅菌蛋白_/_小鼠血清中 的AP活性，將C3-/-血清或純化的人血清滅菌蛋白(hP)與血清滅菌蛋白-/_小鼠血清預(yù) 混合?？蛇x地，在暴露于血清滅菌蛋白-/_血清前，將包被LPS的板與人血清滅菌蛋白溫 育并且洗滌(hP包被)。用結(jié)合板的明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S. mirmesota) (S) (C)或大腸桿菌(E. coli) (D)的LPS進(jìn)行類似的測定。E.和F.與板-結(jié)合的LPS相互作用的人血清滅菌 蛋白的ELISA測定。首先用不同濃度的LPS包被板，然后與固定濃度的純化人血清滅菌蛋 白(62.5ng/孔)溫育(E)。在圖F中，首先用固定濃度的LPS(5yg/ml)包被板，然后與遞 增濃度的純化人血清滅菌蛋白溫育。在洗滌后，通過抗血清滅菌蛋白抗體來檢測結(jié)合板的 血清滅菌蛋白的量；圖4顯示Crry+紅細(xì)胞誘導(dǎo)的和酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活。A.野生型(WT) 或血清滅菌蛋白+小鼠中生物素標(biāo)記的Crry+小鼠紅細(xì)胞(1X109)的存活率。通過FACS 測定轉(zhuǎn)輸后5分鐘在受體小鼠中Crry+紅細(xì)胞的百分比并作為100%。B.在與Mg++_EGTA 中的WT、血清滅菌蛋白-/-或B因子敲除(fB+)小鼠血清溫育后在酵母聚糖上C3沉積的 代表性FACS分析。C.在酵母聚糖上C3沉積的定量。用兩個血清稀釋度(1 10,1 20) 和兩個酵母聚糖濃度(0. 025mg/ml,0. 125mg/ml)來進(jìn)行試驗。N =每組3只小鼠并且每只 小鼠血清進(jìn)行兩次測定。MFI 熒光強(qiáng)度均值。P值指Student t檢驗；圖5顯示CVF誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活和抗-0VA/0VA-誘導(dǎo)的經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活。A和 B.野生型㈧或血清滅菌蛋白+(B)小鼠血清中C3激活的蛋白印跡分析。在用Mg++-EGTA 中的CVF處理的血清中檢測到C3 α -鏈的剪切產(chǎn)物，但在未處理的血清中或用EDTA中的 CVF處理的血清中沒有檢測到該產(chǎn)物。C.圖A和B中剪切的和完整的C3 α-鏈的光密度測 定。D.在野生型(WT)、血清滅菌蛋白+和B因子敲除(fB—勺的小鼠血清或用抗人fB抗體 處理的血清滅菌蛋白+血清中對抗0VA/0VA誘導(dǎo)的經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活的ELISA板測定；圖6顯示體內(nèi)和體夕卜LOS和LPS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活。A和B. LOS (A)或LPS (B)處理 后Ihr野生型(WT)和血清滅菌蛋白+小鼠中血漿C3激活產(chǎn)物的ELISA測定。LOS或LPS 以20mg/kg給予(腹膜內(nèi))并且將PBS用作載體對照。N =每組3只小鼠并且以兩個重復(fù) 孔進(jìn)行ELISA測定。將體外用CVF處理的野生型小鼠血漿樣品用作C3激活參照(100%)。 C和D.GVB++緩沖液中的野生型(WT)、血清滅菌蛋白-/_或B因子敲除(fB+)小鼠血清中 LOS誘導(dǎo)的(C)或LPS誘導(dǎo)的⑶總補(bǔ)體激活的ELISA測定；圖7顯示血清滅菌蛋白敲除小鼠對關(guān)節(jié)炎發(fā)展具有抗性；圖8顯示單克隆抗體克隆1.1、2. 9和2. 11是LPS-誘導(dǎo)的替代途徑(AP)補(bǔ)體激 活的封閉性抗體。單克隆抗體7. 11是非封閉性抗體(圖A)。EDTA封閉AP補(bǔ)體并在此處 用作陽性對照(對于補(bǔ)體抑制)(圖A)。培養(yǎng)基對照用作陰性對照以顯示抑制與mAb有關(guān) (圖A)。mAb克隆2. 9和2. 11的劑量反應(yīng)曲線(圖B)。Calf IgG表明細(xì)胞培養(yǎng)基的IgG。 方法用作為AP補(bǔ)體激活劑的LPS包被ELISA板并在GVB_Mg++-EGTA緩沖液中進(jìn)行測定；圖9顯示mAb克隆2. 9和2. 11，以及多克隆抗P抗體抑制酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體 激活。將20mM EDTA用作酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活抑制的陽性對照。方法將酵母聚糖 與10%正常人血清(NHS)溫育，其中含有或不含GVB-Mg++-EGTA中的抗-P抗體或EDTA，通 過FACS測定酵母聚糖上C3沉積的量；圖10顯示mAb克隆2. 9和2. 11劑量-依賴性地抑制人補(bǔ)體-介導(dǎo)的兔紅細(xì)胞裂 解。多克隆抗-P抗體和EDTA被用作兔紅細(xì)胞裂解抑制的陽性對照。方法將兔紅細(xì)胞與 在GVB-Mg++-EGTA中的7. 5%正常人血清溫育，其含有或不含抗P抗體或EDTA。使用分光 光度計通過血色素釋放來測定裂解的程度。通過低滲休克而完全裂解的細(xì)胞被用作對照 (100% 裂解)；
圖11顯示mAb都不(多克隆Ab也不)抑制經(jīng)典途徑(CP)補(bǔ)體激活(圖A)。EDTA 封閉CP補(bǔ)體并且在此用作陽性對照(對于補(bǔ)體抑制)(圖A)?？寺?. 9和2. 11的劑量反應(yīng) 曲線顯示缺乏抑制(圖B)。方法用OVA/抗OVA免疫復(fù)合物包被ELISA板并且在GVB-Mg++ 緩沖液中進(jìn)行測定；圖12顯示mAb克隆2. 9和2. 11對液相經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活沒有影響，所述補(bǔ)體激 活由免疫復(fù)合物(IC)誘導(dǎo)并且通過SC5b-9的產(chǎn)生來測量，將不包含免疫復(fù)合物(w/o IC) 或在存在EDTA的情況下包含IC的樣品用作陰性對照。正常人血清(NHS)與OVA/抗OVA 溫育；圖13顯示mAb克隆2. 9和2. 11對液相經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活沒有影響，所述補(bǔ)體激 活由免疫復(fù)合物(IC)誘導(dǎo)并且通過C3a的產(chǎn)生來測量，將不包含免疫復(fù)合物(w/o IC)或 在存在EDTA的情況下包含IC的樣品用作陰性對照。正常人血清(NHS)與OVA/抗OVA溫 育；圖14顯示mAb克隆2. 9和2. 11對人補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體敏化的羊紅細(xì)胞裂解沒有影 響，經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活的另一個已建立的測定——如多克隆抗-P抗體——也對人補(bǔ)體介導(dǎo) 的抗體敏化的羊紅細(xì)胞裂解沒有影響。相反，EDTA抑制人補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體敏化的羊紅細(xì)胞 裂解并且用作抑制作用的陽性對照。方法將抗體敏化的羊紅細(xì)胞與GVB-Mg++緩沖液中的 7. 5%正常人血清溫育，其含有或不含有抗-P抗體或EDTA。使用分光光度計通過血色素釋 放來測定裂解的程度。將通過低滲休克而完全裂解的細(xì)胞用作對照(100%裂解)；以及圖15顯示血清滅菌蛋白在缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用。將小鼠進(jìn)行腎蒂閉塞 22分鐘，然后進(jìn)行24hr再灌注。在處理前(Ohr)和后(24hr)測定血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。與WT小鼠比較，DAF-⑶59雙敲除小鼠(DKO)導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷。這 種腎損傷的惡化取決于C3，原因在于在它們的損傷方面，缺乏C3的DKO小鼠(DK0-C3)類似 于WT小鼠。腎損傷的惡化也取決于B因子，原因在于在它們的損傷方面，缺乏B因子的DKO 小鼠(DK0-fB)類似于WT小鼠。腎損傷的惡化也取決于血清滅菌蛋白，原因在于在它們的 損傷方面，缺乏血清滅菌蛋白的DKO小鼠(DKO-P)類似于WT小鼠。發(fā)明詳述在一個實施方式中，本發(fā)明涉及使用抗血清滅菌蛋白抗體選擇性激活替代途徑 (AP)。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過將對象與抗血清滅菌蛋白抗體接觸來治療對 象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥或AP介導(dǎo)的狀況的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供血清滅 菌蛋白敲除的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物及它們的應(yīng)用。在一個實施方式中，血清滅菌蛋白在結(jié)構(gòu)上由N端結(jié)構(gòu)域和六個I型血小板反應(yīng) 蛋白重復(fù)(TSR)結(jié)構(gòu)域組成。在生理條件下，其作為環(huán)狀聚合物(二聚體、三聚體、四聚體) 存在于血漿中，通過單體的首尾相連而形成。在X染色體的短臂上編碼人血清滅菌蛋白，在 另一個實施方式中，人血清滅菌蛋白的缺乏——尤其當(dāng)與C2、MBL或IgG2缺乏組合時—— 構(gòu)成致死的奈瑟氏菌感染的高外顯率風(fēng)險因素。在另一個實施方式中，本文提供的方法顯示在AP補(bǔ)體激活中對血清滅菌蛋白的 激活劑特異性要求，并在一個實施方式中表明血清滅菌蛋白作為AP補(bǔ)體引發(fā)劑的潛能。免疫系統(tǒng)識別“自身”抗原和“非自身，，抗原的能力對于免疫系統(tǒng)行使對抗侵入微 生物的特異性防御的功能是重要的。“非自身”抗原是進(jìn)入體內(nèi)或存在于體內(nèi)的物質(zhì)上的那些抗原，其可檢測到不同于或異源于動物自己的成分，而“自身”抗原是在健康動物中的那 些抗原，其不能檢測到不同于或異源于動物自己的成分。在一個實施方式中，本文提供治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，其包括給予 所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體、從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟，該抗 體在另一個實施方式中不損害經(jīng)典途徑。因此，本文描述的方法不影響經(jīng)典途徑補(bǔ)體，該方 法在一個實施方式中利用所描述的mAb。在一個實施方式中，經(jīng)典途徑由抗原-抗體復(fù)合物啟動，而替代途徑由特異性多 糖激活，所述特異性多糖常見于細(xì)菌、病毒和寄生蟲細(xì)胞表面。經(jīng)典途徑由成分C1-C9組 成，而替代途徑由成分C3和幾個因子如B因子、D因子和H因子組成。包含經(jīng)典補(bǔ)體途徑 的事件順序由三個階段組成a.識別，b.酶激活，以及c.導(dǎo)致細(xì)胞死亡的膜攻擊。補(bǔ)體激 活的第一階段始于Cl。Cl由三個不同的蛋白構(gòu)成識別亞基Clq以及絲氨酸蛋白酶亞成分 Clr和Cls，它們一起結(jié)合在鈣依賴性四聚體復(fù)合物Clr. sub. 2s. sub. 2中。完整的Cl復(fù)合 物對引起Cl生理激活是必需的。當(dāng)完整的Cl復(fù)合物結(jié)合到復(fù)合有抗原的免疫球蛋白時，發(fā) 生激活。該結(jié)合激活Cls，然后Cls剪切C4和C2蛋白以產(chǎn)生C4a和C4b以及C2a和C2b。 C4b和C2a片段結(jié)合形成C3轉(zhuǎn)變酶，C3轉(zhuǎn)變酶進(jìn)而剪切C3形成C3a和C3b。經(jīng)典途徑和 替代途徑都能夠單獨(dú)誘導(dǎo)C3轉(zhuǎn)變酶的產(chǎn)生，以將C3轉(zhuǎn)變成C3b，C3b的產(chǎn)生是補(bǔ)體途徑的 中心事件。C3b結(jié)合至存在于嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的C3b 受體，從而激活末端裂解的補(bǔ)體序列C5-C9。當(dāng)抗體結(jié)合抗原時經(jīng)典途徑的啟動開始。Clg結(jié)合已結(jié)合抗原的IgG或IgM的改 變的Fc區(qū)。一旦結(jié)合，Clr激活Cls，Cls通過剪切來自C4和C2的肽來啟動激活單元。從 而Cls將C4剪切成C4a和C4b，Cls將C2剪切成C2a和C2b。C2a結(jié)合C4b形成C4b2a。 C4b2a——C3轉(zhuǎn)變酶——是蛋白水解酶。它將C3剪切成C3b和C3a，其中C3b可以結(jié)合到 激活的表面，C3a被釋放入液相(9)中。C3轉(zhuǎn)變酶具有剪切許多C3分子的能力。這可以導(dǎo) 致大量C3b分子沉積在激活的表面上。但是，由于C3b的不穩(wěn)定性，很少有分子實際結(jié)合。 當(dāng)剪切C3時，形成C4b2a3b——C5轉(zhuǎn)變酶。C5轉(zhuǎn)變酶——也是一種酶——可以將許多C5 分子剪切成C5a和C5b。因此，當(dāng)靶向細(xì)菌和其它AP-補(bǔ)體激活劑時，必須維持這種免疫應(yīng)答系統(tǒng)。在一個 實施方式中，用于本文描述的方法的mAb不影響CP補(bǔ)體的激活。由于替代途徑C3轉(zhuǎn)變酶的底物是C3，因此C3既是反應(yīng)成分又是反應(yīng)產(chǎn)物。隨著 C3轉(zhuǎn)變酶產(chǎn)生越來越多量的C3b，放大環(huán)被建立。在一個實施方式中，經(jīng)典途徑也產(chǎn)生C3b， 由此C3b結(jié)合B因子并且參與替代途徑。在另一個實施方式中，這使得更多的C3b沉積在 靶標(biāo)上。在一個實施方式中，抗體結(jié)合到抗原啟動經(jīng)典途徑。如果抗體附著在細(xì)菌上，則經(jīng) 典途徑產(chǎn)生C3b，C3b偶聯(lián)到靶向病原體。在一個實施方式中，用于本文描述方法和組合物 中的抗體不影響經(jīng)典途徑補(bǔ)體的AP放大環(huán)。因此，在一個實施方式中，本文提供治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括 給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體或其功能片段、從而抑制C3bBb蛋白 產(chǎn)生的步驟。在另一個實施方式中，本文提供抑制對象中血清滅菌蛋白依賴性的，微生物抗原、 非生物外源表面或改變的自身組織引發(fā)的AP補(bǔ)體激活的方法，包括給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體或其功能片段、從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟。在一個實施方式中，根據(jù)抗體的重鏈結(jié)構(gòu)將抗體分為不同的種類。這些包 括IgG、IgM、IgA和IgE。在一個實施方式中，具有相同重鏈結(jié)構(gòu)的抗體是同一“同種 型”(“isotype”)。在另一個實施方式中，由于不同等位基因的遺傳而具有不同抗原決定簇 的相同同種型的抗體稱為“同種異型”(“allotypes”)。在一個實施方式中，主要(但不是全 部)在抗體的抗原結(jié)合位點的高變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的抗原決定簇稱為“獨(dú)特位”(“idiotopes”)。 在另一個實施方式中，具有共用或共享的獨(dú)特位的抗體被認(rèn)為是相同獨(dú)特型(idiotype) 的成員。在一個實施方式中，L鏈可變區(qū)上的抗原決定簇或在另一個實施方式中，H鏈可 變區(qū)上的抗原決定簇——其與抗體的抗原結(jié)合位點結(jié)合——在某些實施方式中稱為“獨(dú)特 型”。在另一個實施方式中，針對獨(dú)特型(獨(dú)特件)產(chǎn)生的抗體或在某些實施方式中與獨(dú)特 型(獨(dú)特件)反應(yīng)的抗體稱為“抗獨(dú)特型抗體”。在一個實施方式中，術(shù)語“抗體”包括完全抗體(例如，二價的IgG，五價的IgM)或 抗體片段，所述抗體片段在其它實施方式中包含抗原結(jié)合位點。在一個實施方式中，這些片 段包括Fab、F(ab' )2、Fv和單鏈Fv (scFv)片段。在一個實施方式中，這些片段可以包括或 可以不包括抗體恒定結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，F(xiàn)ab' s缺乏恒定結(jié)構(gòu)域，所述恒定結(jié) 構(gòu)域?qū)τ谘a(bǔ)體結(jié)合是必需的。ScFvs由抗體可變輕鏈組成，所述抗體可變輕鏈通過柔 性鉸鏈連接到可變重鏈(Vh)。ScFv能夠結(jié)合抗原并且可以在細(xì)菌或其它系統(tǒng)中快速產(chǎn)生。 本發(fā)明包括在細(xì)菌中和在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體和抗體片段。從噬菌體文庫獲 得的抗體可以是完全抗體或抗體片段。在一個實施方式中，在這種文庫中存在的結(jié)構(gòu)域是 共同包含F(xiàn)v或scFv的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(\)，在另一個實施方式中， 外加重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(Chi)和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(C)。四個結(jié)構(gòu)域(即，Vh-Chi和VfCJ包含 Fab0在一個實施方式中，一旦期望的結(jié)合物已經(jīng)被鑒定，通過替代缺失的恒定結(jié)構(gòu)域 從這種文庫獲得完全抗體。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體(mAb)或在另一個實施方式 中是多克隆抗體。用于本發(fā)明組合物、方法和試劑盒的本發(fā)明的抗體可以來自任意來源，以 及另外可以是嵌合的。在一個實施方式中，抗體來源可以來自小鼠或大鼠，在其它實施方式 中來自植物或人。用于本發(fā)明組合物和方法的本發(fā)明的抗體具有降低的人抗原性(以降低 或消除形成抗人抗體的風(fēng)險)，以及在另一個實施方式中，在人類中不具有抗原性。在一個 實施方式中，用于本發(fā)明的嵌合抗體含有人氨基酸序列，并包含為非人抗體的人源化抗體， 所述非人抗體被人來源的序列取代以降低或消除免疫原性，但其保留非人抗體的抗原結(jié)合 特征。在一個實施方式中，在應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的PCR構(gòu)建期間，重鏈和輕鏈被隨意 配對。在一個實施方式中，術(shù)語“噬菌體展示”或“噬菌體展示技術(shù)”指這樣的方法學(xué)其利 用編碼感興趣的外源多肽的核酸序列與編碼噬菌體外殼蛋白的序列的融合，以便在噬菌體 顆粒的表面上展示外源多肽。在另一個實施方式中，該技術(shù)的應(yīng)用包括利用親和相互作用 來從多肽文庫(如在本文描述的組合物中提供的抗血清滅菌蛋白單克隆抗體)選擇具體的 克隆，所述多肽文庫的成員展示在單獨(dú)的噬菌體顆粒表面上。在一個實施方式中，多肽展示 是由于來自噬菌體載體的編碼它們的序列的表達(dá)，該序列已經(jīng)插入噬菌體載體中。在一個實施方式中，多肽編碼序列文庫被轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的展示噬菌體載體以形成噬菌體文庫，其在 另一個實施方式中可以用來篩選感興趣的多肽。在一個實施方式中，術(shù)語“噬菌體表面蛋白”指在噬菌體表面通常發(fā)現(xiàn)的任意蛋 白，其可以適于作為具有異源多肽的融合蛋白而表達(dá)并且仍然可以裝配入噬菌體顆粒中， 以便在噬菌體表面上展示多肽。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，在某些實施方式中，術(shù)語“抗體或它們的片段”所 包括的免疫學(xué)上的結(jié)合試劑延伸至來自所有物種的所有抗體，包括二聚體、三聚體和多聚 體抗體；雙特異性抗體；嵌合抗體；人和人源化抗體；重組和改造的抗體以及它們的片段。 在另一個實施方式中，術(shù)語“抗體或它們的片段”指具有抗原結(jié)合區(qū)的任意抗體樣分子，該 術(shù)語包括小分子物質(zhì)片段如Fab'、Fab、F(ab' )2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)、Fv, scFv(單鏈 Fv)、線性抗體、雙抗體等等。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建物和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中 是公知的。在一個實施方式中，用于本文描述的方法和組合物的抗血清滅菌蛋白片段是Fc， 或在其它實施方式中是Fab、F(ab' )、F(ab' )2或其組合。在另一個實施方式中，用于本文 描述的方法和組合物的抗血清滅菌蛋白片段是Fe，或在其它實施方式中是Fab、F(ab')、 F(ab' )2或其組合。術(shù)語“抗體片段”也包括任意合成的蛋白或基因工程蛋白，其通過結(jié)合到特異性抗 原形成復(fù)合物來起到小分子劑的作用。在一個實施方式中，抗體片段包括分離的片段、“ Fv” 片段——由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成、重組單鏈多肽分子——其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過 肽連接體(“sFv蛋白”)而連接，以及由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元。在 一個實施方式中，抗體是重鏈和輕鏈的可變區(qū)，或者在其它實施方式中，抗體是重組單鏈多 肽分子——其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽連接體(“sFv蛋白”)而連接，以及由模擬高變 區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元。在一個實施方式中，用于本文描述的方法和組合物的抗血清滅菌蛋白mAb選擇性 抑制AP補(bǔ)體激活并且對CP的AP放大環(huán)沒有影響。在另一個實施方式中，本文描述的mAb 不同于已開發(fā)的抗血清滅菌蛋白mAb，已開發(fā)mAb抑制AP和CP補(bǔ)體。因此，在一個實施方式中，本文提供治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，或治 療血清滅菌蛋白依賴性的，微生物抗原、非生物外源表面或改變的自身組織引發(fā)的AP補(bǔ)體 激活的方法，其包括下列步驟給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體，從而 抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生，因此該抗體不影響經(jīng)典途徑補(bǔ)體的AP放大環(huán)。在一個實施方式中，血清滅菌蛋白對于LPS誘導(dǎo)的和LOS誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活是不 可缺少的；在另一個實施方式中，血清滅菌蛋白對AP補(bǔ)體介導(dǎo)的Crry缺乏紅細(xì)胞的血管外 溶血是不可缺少的。在一個實施方式中，通過缺乏血清滅菌蛋白，酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體 激活被適當(dāng)?shù)叵魅?。在另一個實施方式中，血清滅菌蛋白起無關(guān)緊要的作用，或者在另一個 實施方式中，血清滅菌蛋白在CVF引發(fā)的AP補(bǔ)體放大和經(jīng)典途徑引發(fā)的AP補(bǔ)體放大中沒 有任何作用。在一個實施方式中，血清滅菌蛋白與非依賴性AP補(bǔ)體啟動的相關(guān)性大于與繼 發(fā)于其它激活途徑的AP補(bǔ)體放大的相關(guān)性。在另一個實施方式中，在AP補(bǔ)體啟動中對血 清滅菌蛋白的需要是可變的并且取決于激活表面的性質(zhì)。在一個實施方式中，外源和內(nèi)源 的AP補(bǔ)體激活劑的活性都關(guān)鍵取決于血清滅菌蛋白。在一個實施方式中，在給定表面上的AP激活代表經(jīng)由C3bBb穩(wěn)定的血清滅菌蛋白依賴性促進(jìn)和C3 “慢速運(yùn)轉(zhuǎn)”的H因子(fH)_依賴性抑制之間的平衡。在另一個實施方式 中，血清滅菌蛋白對其不重要的AP激活劑可以具有與fH有限的相互作用，以及由于缺乏足 夠的fH_依賴性抑制，自發(fā)的C3激活和放大可以作為缺省過程發(fā)生而無需血清滅菌蛋白的 協(xié)助。在另一個實施方式中，純化的人血清滅菌蛋白恢復(fù)在血清滅菌蛋白—ζ—血清中傷寒沙 門氏菌LPS-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體活性，但不恢復(fù)明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S)或大腸桿菌LPS-誘導(dǎo)的 AP補(bǔ)體活性(圖3)。在另一個實施方式中，血清滅菌蛋白直接結(jié)合到AP激活劑，或在另一個實施方式 中，血清滅菌蛋白經(jīng)由最初沉積的C3b結(jié)合到AP激活劑——通過充當(dāng)新C3bBb組裝的平臺 引導(dǎo)補(bǔ)體激活。在一個實施方式中，表面結(jié)合的血清滅菌蛋白促進(jìn)C3bBb形成；在另一個實 施方式中，在血清滅菌蛋白—ζ—小鼠血清中，人血清滅菌蛋白恢復(fù)LPS-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體活性的 能力與其LPS親和力相關(guān)(圖3)。在一個實施方式中，在不存在任何溶液血清滅菌蛋白的 情況下，LPS結(jié)合的人血清滅菌蛋白激活缺乏血清滅菌蛋白的對象血清中AP補(bǔ)體(圖3)。在一個實施方式中，由于其對激活表面的親和力，血清滅菌蛋白發(fā)揮AP補(bǔ)體啟動 的專性模式識別分子的作用。在另一個實施方式中，在缺乏血清滅菌蛋白的對象血清中，酵 母聚糖引起劇烈的AP補(bǔ)體激活，這表明其它一個或多個因素以類似激活劑特異性的方式 對AP補(bǔ)體啟動發(fā)揮作用。在一個實施方式中，缺乏血清滅菌蛋白的個體易遭受細(xì)菌感染。在另一個實施方 式中，體內(nèi)LOS-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活在血清滅菌蛋白-缺乏的個體中消失而由LPS誘導(dǎo)的補(bǔ)體 激活僅僅部分被削弱(圖6)。在另一個實施方式中，AP在LOS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活中而不是在 LPS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活中是主要途徑。在一個實施方式中，尤其是當(dāng)在另一個實施方式中與低 抗體組合或在另一個實施方式中與甘露糖結(jié)合凝集素水平組合時，血清滅菌蛋白的缺乏消 除了對含有LOS的meningitide的補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌活性。在一個實施方式中，血清滅菌蛋白在宿主防御中起作用。在另一個實施方式中，在 炎癥部位由白細(xì)胞產(chǎn)生的血清滅菌蛋白啟動AP補(bǔ)體并擴(kuò)大組織損傷。因此，在一個實施方式中，本文提供治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括 下列步驟給予所述對象血清滅菌蛋白活性抑制劑，從而治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥。在一個實施方式中，通過使對象與血清滅菌蛋白活性抑制劑接觸來治療的AP補(bǔ) 體介導(dǎo)的病癥是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥是 缺血再灌注損傷。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥是關(guān)節(jié)炎(參見圖7)。在另一 個實施方式中，AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥是陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)綜合征。在另一個實施 方式中，AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥是非典型溶血尿毒(aHUS)綜合征。在一個實施方式中，使用治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法抑制的血清滅菌 蛋白活性，或在另一個實施方式中，由脂寡糖(LOS)誘發(fā)的AP補(bǔ)體激活；或在另一個實施 方式中，抑制模式識別受體_介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活；或在另一個實施方式中，抑制替代途徑 (AP)補(bǔ)體激活的啟動是C3bBb蛋白的產(chǎn)生。在另一個實施方式中，用于本文提供的方法 的血清滅菌蛋白活性抑制劑不抑制所述對象中經(jīng)典途徑引發(fā)的補(bǔ)體激活；在一個實施方式 中，其不抑制凝集素途徑引發(fā)的AP補(bǔ)體激活、酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活或眼鏡蛇毒因子 誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活。在一個實施方式中，用于本文提供的方法的血清滅菌蛋白活性抑制劑 不抑制凝集素途徑引發(fā)的AP補(bǔ)體激活、酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活或眼鏡蛇毒因子誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活。在一個實施方式中，術(shù)語“補(bǔ)體激活”指補(bǔ)體放大。在另一個實施方式中，用于本 文提供的方法的血清滅菌蛋白活性抑制劑阻止AP補(bǔ)體的激活。在一個實施方式中，用于治 療或抑制或阻抑或減輕AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥癥狀的方法——包括給予所述對象血清滅菌蛋 白活性抑制劑的步驟——的抑制劑可以是抗體，諸如，在另一個實施方式中，可以是結(jié)合血 清滅菌蛋白的抗體，或在其它實施方式中是小分子、肽、擬肽(P印tidomimetic)、環(huán)肽或它 們的組合。在一個實施方式中，本文提供治療AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括向所述對象給 予組合物的步驟，所述組合物降低所述對象組織或體液中的血清滅菌蛋白水平。在另一個 實施方式中，本文提供抑制對象中替代途徑(AP)補(bǔ)體介導(dǎo)的紅細(xì)胞或血小板破壞的方法， 包括給予所述對象本文描述的血清滅菌蛋白活性抑制劑的步驟。在另一個實施方式中，本發(fā)明的方法顯示這樣的優(yōu)勢其保存對象使用經(jīng)典補(bǔ)體 激活途徑抗擊感染的能力。在另一個實施方式中，本文提供抑制對象中由細(xì)菌脂寡糖(LOS) 誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的方法，包括下列步驟給予所述對象血清滅菌蛋白活性抑制劑，從而 抑制對象中細(xì)菌LOS誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活。在另一個實施方式中，用于抑制對象中細(xì)菌脂寡 糖(LOS)誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的方法的抑制劑是本文描述的抑制劑實施方式中任意一個。因 此，在另一個實施方式中，本文提供抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的方法。在一個實施 方式中，AP補(bǔ)體激活由傷寒沙門氏菌LPS誘導(dǎo)，以及用于本文提供的方法的抑制劑不抑制 由明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S)或大腸桿菌LPS或兩者誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體活性。在一個實施方式中，本文提供抑制對象中模式識別受體介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的方 法，包括下列步驟給予所述對象血清滅菌蛋白活性抑制劑，從而抑制對象中模式識別受體 介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別產(chǎn) 生；所述微生物抗原是胞壁酰二肽(MDP)。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識 別受體對微生物抗原的識別產(chǎn)生；其中微生物抗原是來自細(xì)菌DNA的CpG基序。在另一個實 施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別產(chǎn)生；其中微生物抗原是 肽聚糖。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別產(chǎn)生; 其中微生物抗原是脂磷壁酸質(zhì)。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體 對微生物抗原的識別產(chǎn)生；其中微生物抗原是來自伯氏疏螺旋菌(Borreliaburgdorferi) 的外表面蛋白A。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗 原的識別而產(chǎn)生；其中微生物抗原是合成的支原體巨噬細(xì)胞激活的脂蛋白_2，三棕櫚酰 基-半胱氨酰基-絲氨?；鵢(賴氨酰基)3-賴氨酸(P3CSK4)。在另一個實施方式中，AP 補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別而產(chǎn)生；其中微生物抗原是二棕櫚酰 基-CSK4(P2-CSK4)。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原 的識別而產(chǎn)生；其中微生物抗原是單棕櫚?；鵢CSK4(PCSK4)。在另一個實施方式中，AP補(bǔ) 體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別而產(chǎn)生；其中微生物抗原是兩性霉素B。 在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原的識別而產(chǎn)生；其中 微生物抗原是三?；幕蚨；募?xì)菌多肽。在另一個實施方式中，AP補(bǔ)體激活由所 述模式識別受體對微生物抗原的識別而產(chǎn)生；其中微生物抗原是它們的組合。
在一個實施方式中，本文提供抑制對象中替代途徑(AP)補(bǔ)體激活啟動的方法，包 括下列步驟給予所述對象血清滅菌蛋白活性抑制劑，從而抑制對象中AP補(bǔ)體激活啟動。在另一個實施方式中，本發(fā)明的方法顯示這樣的優(yōu)勢其保存了對象經(jīng)由經(jīng)典激 活途徑激活補(bǔ)體的能力。在另一個實施方式中，本發(fā)明的方法顯示這樣的優(yōu)勢其保存了對 象經(jīng)由凝集素激活途徑激活補(bǔ)體的能力。在一個實施方式中，本文提供轉(zhuǎn)基因敲除動物，所述動物的基因組包含內(nèi)源血清 滅菌蛋白基因中的純合破壞，其中所述純合破壞阻止血清滅菌蛋白的功能并且導(dǎo)致所述轉(zhuǎn) 基因敲除小鼠顯示與野生型小鼠相比減少的AP補(bǔ)體。在另一個實施方式中，本文提供選擇用于治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的潛在 治療化合物的方法，或在另一個實施方式中，本文提供選擇用于治療脂寡糖(LOS)誘導(dǎo)的 AP補(bǔ)體激活的潛在治療化合物的方法；或者在另一個實施方式中，本文提供選擇用于抑制 模式識別受體介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的潛在治療化合物的方法；或者在另一個實施方式中，本 文提供選擇用于抑制替代途徑(AP)補(bǔ)體激活啟動的潛在治療化合物的方法，其包括a)將 化合物給予野生型動物或具有AP補(bǔ)體介導(dǎo)病癥的動物，或在另一個實施方式中，將化合物 給予具有脂寡糖(LOS)誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的動物；或在另一個實施方式中，將化合物給予 具有模式識別受體_介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的動物；或在另一個實施方式中，將化合物給予具 有替代途徑(AP)補(bǔ)體激活啟動的動物；b)測量野生型動物或所述動物形成的表型，所述動 物具有AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥，或在另一個實施方式中，具有脂寡糖(LOS)誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激 活；或在另一個實施方式中，具有模式識別受體-介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活；或在另一個實施方 式中，具有替代途徑(AP)補(bǔ)體激活的啟動；以及c)將野生型動物或所述動物形成的表型與 血清滅菌蛋白-/_敲除動物的表型進(jìn)行比較，其中所述動物具有AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥，或在 另一個實施方式中，具有脂寡糖(LOS)誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活；或在另一個實施方式中，具有模 式識別受體-介導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活；或在另一個實施方式中，具有替代途徑(AP)補(bǔ)體激活的 啟動。在一個實施方式中，本文提供制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，其包括將多核苷 酸導(dǎo)入非人哺乳動物的胚胎中，所述多核苷酸包含編碼血清滅菌蛋白編碼基因的破壞的內(nèi) 含子的編碼區(qū)；將胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體小鼠中；使所述胚胎妊娠；以及選擇所述代孕母體 小鼠生出的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的特征在于當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因哺乳動物 比較時，其具有降低的AP補(bǔ)體激活。在另一個實施方式中，本文提供轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物及其子代，其基因組包含血 清滅菌蛋白編碼基因的破壞，以便所述哺乳動物缺乏功能性血清滅菌蛋白或具有降低的功 能性血清滅菌蛋白水平。在一個實施方式中，本文提供轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物及其子代，其基因組包含血清 滅菌蛋白編碼基因的破壞，以便所述哺乳動物缺乏功能性血清滅菌蛋白或具有降低的功能 性血清滅菌蛋白水平，其中新霉素盒(NEO)插入在所述血清滅菌蛋白基因的外顯子5和6 之間，在一個實施方式中，這導(dǎo)致外顯子5和6之間內(nèi)含子的破壞。在另一個實施方式中，本文提供從本文描述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物獲得的細(xì)胞、 器官、組織或它們的組合。在一個實施方式中，本文提供培養(yǎng)源自本文描述的轉(zhuǎn)基因非人哺 乳動物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，包括下列步驟提供非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的細(xì)胞以及在允許所述細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。在一個實施方式中，本文提供制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，其包括將多核苷 酸導(dǎo)入非人哺乳動物的胚胎中，所述多核苷酸包含編碼血清滅菌蛋白編碼基因的破壞的內(nèi) 含子的編碼區(qū)；將所述胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體小鼠中；使所述胚胎妊娠；以及選擇所述代孕 母體小鼠生出的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的特征在于當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因哺乳 動物比較時，其具有降低的AP補(bǔ)體激活。在一個實施方式中，在本文描述的方法中，選擇所 述代孕母體小鼠生出的轉(zhuǎn)基因小鼠的步驟包括將兩只選擇的轉(zhuǎn)基因小鼠交配；使胚胎妊 娠；以及選擇轉(zhuǎn)基因母體生出的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個實施方式中，制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物 的方法被重復(fù)一代以上。在另一個實施方式中，使用本文描述的轉(zhuǎn)基因動物，通過選擇潛在治療化合物的 方法來鑒定用于本文提供的方法的抑制劑。在一個實施方式中，術(shù)語“對象”指哺乳動物，其需要對狀況或其后遺癥進(jìn)行治療 或?qū)顩r或其后遺癥易感，包括人。所述對象可以包括狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和 小鼠以及人。術(shù)語“對象”不排除在所有方面正常的個體。提供下述實施例以便更充分地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。但是，它們決不應(yīng)該 解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。
實施例材料和方法血清滅菌蛋白基因靶向為了構(gòu)建靶向載體，使用pNDl載體，其包含新霉素(NEO)和白喉毒素(DT)，分 別作為陽性和陰性選擇標(biāo)記(由Dr Glen Radice, University of Pennsylvania善意 提供)。該載體含有用于Cre重組酶介導(dǎo)的基因移除的兩個LoxP位點，以及NEO側(cè)面 是用于FLPe重組酶潛在移除的兩個FRT位點。使用129/Sv小鼠基因組DNA作為模板 以及用Expand Long Template PCR System(Roche)通過PCR擴(kuò)增血清滅菌蛋白基因片 段。對于 3'同源臂，使用 5' -CTCGAGCATTCATCTTTGCCAGAAATC-3 ‘ (SEQ ID NO. 1)和 5' -TCCCCATACTCAGCACTATTG-3‘ (SEQ ID NO. 2)作為引物，將含有外顯子 6-9 的 3. 5kb 基 因片段擴(kuò)增，克隆至PCR 2. 1載體(Invitr0gen，CA)，以及然后亞克隆至pNDl中的EcoRI位 點(ΝΕΟ盒的下游，圖1B)。對于5'同源臂，使用下列引物對5' -GATATCATAACTTCGTATAA TGT-ATGCTATACGAAGTTATGTTCMTCACCCACCATCCCT-3 ‘ (SEQ ID Ν0. 4)和 5 ‘ -CTCGAGCATTCA TCTTTGCCAGAAATC-3‘ (SEQ ID N0. 5) ；5' -GCGGCCGATTCC-GGCTGTATCTGAGTC-3‘ (SEQ ID
N0. 6)和 5' -GATATCAGGAAGAAGTGAA-TATACAGG-3' (SEQ ID N0. 7)，擴(kuò)增兩個片段-含
有外顯子1-2的4kb NotI-EcoRV片段和含有外顯子3_5的1. 6kb EcoR V-XhoI片段——以 及摻入 34bp LoxP 位點(5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3 ‘ (SEQ IDN0. 3)。 在3段連接實驗中，在NotI-XhoI位點(Neo的上游)將這2段克隆至pNDl載體中。在轉(zhuǎn)染之前，通過Not I消化將靶向載體線性化。用G418 (0. 2mg/ml)選擇ES細(xì) 胞并且使用Hinc II和Sea I消化的基因組DNA和位于右側(cè)同源臂3 ‘的513bp探針通 過DNA印跡來篩選陽性克隆(圖1，A-D)。ES細(xì)胞培養(yǎng)、載體轉(zhuǎn)染、克隆選擇和嵌合體小 鼠產(chǎn)生如所述進(jìn)行。將雄性同窩出生的幼仔(Iittermate)用于全部實驗。為了 PCR基因型分型，將 5 ‘ -GGGTGGGATTAGATAAATGCC-3 ‘ (Pl，NEO-特異性；(SEQ ID NO. 8))和 5' -CAAGGTACGGCTTTGTTACACA-3‘ (P2，血清滅菌蛋白-特異性；(SEQ ID NO. 9))用于NEO 檢測(700bp產(chǎn)物)，將5' -ATMCTTCGTATMTGTATGCTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO. 10)和 P2 用于 LoxP 檢測(400bp 產(chǎn)物)。將 5 ‘ -CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC-3 ‘ (SEQ ID NO. 11) 和 5' -CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG-3‘ (SEQ ID NO. 12)用于 FLPe 轉(zhuǎn)基因檢測。所有動物 實驗獲得賓夕法尼亞大學(xué)動物管理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)批準(zhǔn)。其它小鼠和試劑C3+ 禾口 FLPe-Tg (B6 ；SJL-Tg (ACTFLPe) 9205Dym/J)小鼠來自 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)。fB+ 小鼠、兔抗 OVA 禾口 兔抗 C3c 抗體由 Dr J. Lambris (University of Pennsylvania)善意提 供。Crry+C3+ 小 鼠 由 Dr H. Molina (Washington University)善意提供。酵母聚糖 A (釀酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)、傷寒沙門氏菌、明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S)、大腸桿菌026 :B6 LPS、OVA和HRP 抗小鼠IgG來自Sigma-Aldrich。人血清滅菌蛋白來自Quidel (San Diego, CA) 抗核
心 LPS mAb—WNl 222-5-來自 Cell sciences (Canton，ΜΑ)。山羊抗人血清滅菌蛋
白和 fB 抗體來自 Complement Technologies (SanDiego, CA)。HRP 山羊抗 C3 抗體來 自 MP Biomedicals (Solon, OH)。腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis) LOS 由 Dr. Sanjay Ram (University ofMassachusetts, Worcester)善意提供。RNA印跡和免疫擴(kuò)散測定RNA 印跡分析如[Miwa T, Zhou L, Hilliard B, Molina H, Song WC. Crry, but not CD59 and DAF, is indispensable for murine erythrocyteprotection in vivo from spontaneous complement attack. Blood. 2002 ;99 :3707_3716.]所述進(jìn)行，其使用 700bp小鼠血清滅菌蛋白cDNA作為探針。血漿血清滅菌蛋白通過免疫擴(kuò)散測定來檢測，如 CurrentProtoco Is in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.)中描述的那樣，其使用 抗-人血清滅菌蛋白抗體。結(jié)合板的LPS檢測為了比較不同細(xì)菌物種(傷寒沙門氏菌、明尼蘇達(dá)沙門氏菌和大腸桿菌)LPS的 板包被效率，將板用稀釋濃度的LPS包被。在用BSA(10mg/ml)封閉Ih后，將板用PBS 洗滌并且與WNl 222-5(0. 5 μ g/ml)——鼠抗核LPS mAb—溫育lh，然后用HRP-抗小鼠 IgG(l 6000)檢測。BSA包被的孔用作背景對照。補(bǔ)體激活的ELISA測定將板用LPS (2 μ g/孔)或OVA/抗-OVA免疫復(fù)合物包被來進(jìn)行補(bǔ)體激活測定，如 前所述[Sfyroera G, Katragadda M, Morikis D, Isaacs SN, Lambris JD. Electrostatic modeling predicts the activities of orthopoxviruscomplement control proteins. J Immunol. 2005 ；174 :2143_2151.]。將稀釋的小鼠血清(每孔50 μ 1)在板上于37°C溫育 lh，然后使用HRP抗小鼠C3抗體(1 4000)檢測結(jié)合板的激活的C3。在Mg++_EGTA中測 定AP活性，在GVB++中測定總活性或經(jīng)典途徑活性。對于重組實驗，將1 10稀釋的(在 Mg++-EGTA中)C3V_血清與不同稀釋的血清滅菌蛋白-/_血清預(yù)混合(以1 1比例)?？?選地，將人血清滅菌蛋白添加到血清滅菌蛋白+血清(62. 5ng至50μ 1血清)或用于預(yù)處理LPS包被的板(62. 5ng在25 μ 1 Mg++_EGTA中，在37°C lhr，然后洗滌)。為耗盡fB，將血 清滅菌蛋白‘血清與抗人fB IgG (每1 μ 1血清8 μ g)預(yù)溫育，然后離心除去抗fB/fB免 疫復(fù)合物。LPS-血清滅菌蛋白結(jié)合在第一個測定中，將板用不同濃度的LPS包被，用BSA(10mg/ml)封閉，然后與純化 的人血清滅菌蛋白(2. 5 μ g/ml在Mg++-EGTA中，25 μ 1/孔)在室溫(RT)溫育Ihr，接著洗 滌并且用生物素化的抗血清滅菌蛋白IgG(2yg/ml)和抗生物素蛋白-HRP(1 10，000)檢 測。將沒有用血清滅菌蛋白處理的LPS包被的孔用作背景對照。在第二個測定中，將板用固 定濃度的LPS(5y g/孔)包被，然后與遞增濃度的純化人血清滅菌蛋白溫育。在酵母聚糖上 進(jìn)行AP激活的測量。將酵母聚糖(0. 025或0. 125mg/ml)與在Mg++_EGTA中的血清于37°C溫 育 15 分鐘，通過FACS評價C3沉積作用，如[Kim DD,Miwa T，Song WC. Retrovirus-mediated over-expression of decayaccelerating factor rescuesCrry-deficient erythrocytes from acute alternative pathway complementattack. J Immunol. 2006 ；177 5558-5566.]所述。體外CVF處理將血清(5 μ 1)與0. 01 μ g或0. 3 μ g CVF溫育不同時間長度。在溫育后，在還原 條件下將ο. 5μ 1血清在8%凝膠上泳動并且進(jìn)行蛋白印跡分析，如[Xu Y，Ma M，Ippolito GC, Schroeder HW, Jr. , Carroll MC, Volanakis JE. Complement activation in factor D-deficient mice. Proc NatlAcad Sci USA. 2001 ;98 :14577-14582.]所述，其使用 HRP-偶 聯(lián)的兔抗小鼠C3抗體。通過激活的和完整的C3 α -鏈的光密度掃描對C3剪切進(jìn)行定量。紅細(xì)胞轉(zhuǎn)輸和存活測定如[Miwa T, Zhou L, Hilliard B, Molina H, Song WC. Crry， but notCD59 and DAF,is indispensable for murine erythrocyte protection in vivofrom spontaneous complement attack. Blood. 2002 ；99 :3707_3716.]所述測定缺乏 Crry 的小鼠紅細(xì)胞對 AP 補(bǔ)體攻擊的體內(nèi)敏感性。LOS或LPS誘導(dǎo)的體內(nèi)補(bǔ)體激活用20mg/kg腦膜炎奈瑟氏菌LOS或傷寒沙門氏菌LPS注射小鼠(腹膜內(nèi))。在處理 后 lhr，如[Mastellos D，Prechl J, Laszlo G 等· Novelmonoclonal antibodies against mouse C3 interfering with complementactivation-description of fine specificity and applications to variousimmunoassays. MoI Immunol· 2004 ;40 :1213_122L ]所述測 定激活的C3的血漿水平。實施例1 血清滅菌蛋白敲除(血清滅菌蛋白-上、小鼠的產(chǎn)生小鼠血清滅菌蛋白基因位于X染色體上并且由9個外顯子組成(http://WWW. informatics, jax. org/searches/accession_report. cgi ？ id = MGI :97545)(圖 1A)。原 計劃是產(chǎn)生條件性血清滅菌蛋白基因敲除小鼠，以便可以研究其組織特異性產(chǎn)生的意義。 為了實現(xiàn)該目的，通過將5'和3'同源臂序列克隆至pNDl載體來構(gòu)建靶向載體，如圖IB 中所說明。根據(jù)該策略，在正確靶向后，新霉素盒(NEO)應(yīng)被插入在血清滅菌蛋白基因的外 顯子5和6之間，并且外顯子3-5的兩側(cè)應(yīng)是兩個LoxP位點(圖1B)，以使它們可通過組織 特異性Cre重組酶而缺失。外顯子3-5被靶向用于缺失，因為在人血清滅菌蛋白基因外顯子4-6中的突變與血清滅菌蛋白缺乏相關(guān)。使用位于3'同源臂外側(cè)的513bp探針，在對基 因組DNA進(jìn)行Hinc II和Sca I消化后(圖1，C和D)，通過RNA印跡分析來選擇靶向的胚 胎干(ES)細(xì)胞。獲得7個陽性ES細(xì)胞克隆并且將其中兩個用于嵌合小鼠的產(chǎn)生。源自兩 個ES細(xì)胞克隆的嵌合體通過種系成功地傳遞了突變。在突變小鼠和用于產(chǎn)生它們的兩個ES細(xì)胞克隆中進(jìn)行的重組血清滅菌蛋白基因 等位基因的后續(xù)分析證實了在擬定位置的NEO插入，但無法檢測到5' LoxP序列(圖1C)。 后者結(jié)果是沒有預(yù)料到的，但是其很可能由于同源重組發(fā)生在5' LoxP位點的序列下游 (即，外顯子3-5)而非上游(即，外顯子1-2和5'側(cè)翼區(qū))(圖1A，B)。然而，RNA印跡和 實時PCR分析在突變小鼠的各種組織中沒有檢測到血清滅菌蛋白mRNA表達(dá)(圖1E)，以及 免疫擴(kuò)散分析證實在它們的血漿中缺少血清滅菌蛋白(圖1F)。這些結(jié)果表明NEO插入至 外顯子5和6之間的小內(nèi)含子(201bps)可能已經(jīng)無意地破壞了血清滅菌蛋白基因。為了 驗證這個結(jié)論，將血清滅菌蛋白突變小鼠與FLPe轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。靶向構(gòu)建物中NEO盒的 側(cè)翼是兩個FRT位點，其可以被FLPe重組酶識別。FLPe重組酶的表達(dá)將NEO中從血清滅菌 蛋白基因靶向小鼠的基因組除去，并且相應(yīng)地恢復(fù)它們血漿中的血清滅菌蛋白(圖2)。因 此，通過NEO插入第5個內(nèi)含子，意外地產(chǎn)生整體的血清滅菌蛋白基因敲除小鼠(血清滅菌 蛋白_勺。實施例2 血清滅菌蛋白上小鼠血清中LPS-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活的消除為評價血清滅菌蛋白+小鼠血清中的AP補(bǔ)體活性，使用ELISA檢測來測量在 Mg++-EGTA中LPS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活。將LPS包被在96孔板上并且在暴露于小鼠血清后，測 定板上C3沉積的水平。使用廣泛交叉反應(yīng)的抗核心LPS mAb，首次證實三個不同細(xì)菌物 種——傷寒沙門氏菌、明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S)和大腸桿菌——的LPS以類似的親和力結(jié)合 到ELISA板(圖3A)。圖3B-D顯示這些LPS均激活了野生型(WT)小鼠血清中的AP補(bǔ)體。 相反，同樣的LPS沒有引起血清滅菌蛋白+小鼠血清中或用EDTA處理的WT小鼠血清中(陰 性對照)可檢測到的AP補(bǔ)體激活(圖3B-D)。添加C3+小鼠血清(作為鼠血清滅菌蛋白 來源)或純化的人血清滅菌蛋白至血清滅菌蛋白—ζ—小鼠血清，這使傷寒沙門氏菌LPS誘導(dǎo) 的AP補(bǔ)體活性恢復(fù)到WT水平或更高水平(圖3B)。重要的是，用人血清滅菌蛋白預(yù)處理傷 寒沙門氏菌LPS包被的板然后洗滌也在血清滅菌蛋白+小鼠血清中重建AP補(bǔ)體激活(圖 3B)。該結(jié)果表明純化的人血清滅菌蛋白能夠以足夠的親和力結(jié)合到傷寒沙門氏菌LPS， 以及固定化LPS-結(jié)合血清滅菌蛋白在不存在溶液血清滅菌蛋白的情況下激活A(yù)P補(bǔ)體。通過與C3+小鼠血清預(yù)混合，在血清滅菌蛋白+血清中觀察到明尼蘇達(dá)沙門氏 菌⑶和大腸桿菌LPS誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體活性的類似重建(圖3C、D)。令人驚訝的是，不像對 傷寒沙門氏菌LPS觀察的那樣，純化的人血清滅菌蛋白僅僅部分恢復(fù)血清滅菌蛋白+血清 中明尼蘇達(dá)沙門氏(S)和大腸桿菌LPS-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體活性，這與是否添加蛋白至血清滅 菌蛋白—ζ—血清或使用蛋白預(yù)處理LPS包被的板無關(guān)(圖3C、D)。接下來，比較純化的人血 清滅菌蛋白對三個細(xì)菌物種的LPS的相對結(jié)合親和力。圖3E、F顯示，在缺乏LPS包被的情 況下，人血清滅菌蛋白不結(jié)合到板上，但其顯示明確的LPS濃度依賴性和血清滅菌蛋白濃 度依賴性的對傷寒沙門氏菌LPS的結(jié)合。這與其對明尼蘇達(dá)沙門氏(S)和大腸桿菌LPS的 弱結(jié)合形成鮮明對比。因此，人血清滅菌蛋白恢復(fù)血清滅菌蛋白+血清中LPS依賴性AP補(bǔ) 體活性的能力與其對LPS的結(jié)合親和力有關(guān)。
3 :非{呆護(hù)的自體細(xì)胞,卜.的AP激活構(gòu),取決干血清滅菌蛋白為評價血清滅菌蛋白在該過程中的作用，將缺乏Ctty的小鼠紅細(xì)胞轉(zhuǎn)輸入WT和血 清滅菌蛋白+小鼠中。圖4Α顯示缺乏Crry的紅細(xì)胞在WT而不是血清滅菌蛋白+受體中 很快消除。因此，非保護(hù)的自體細(xì)胞上自發(fā)的AP補(bǔ)體激活也需要血清滅菌蛋白來啟動。_仿丨丨4 血j青碰舶又仔_纏-BK CVF- i秀馳AP躲稀·將酵母聚糖與WT或血清滅菌蛋白+小鼠血清溫育并且通過C3沉積的FACS分析 來評價AP補(bǔ)體激活。如圖4B、C中所示，可以發(fā)現(xiàn)，酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活在血清滅 菌蛋白+血清中僅僅被部分削弱。這與缺乏B因子的(fB+)小鼠血清形成明顯對比，其不 支持AP補(bǔ)體激活(圖4B)。眼鏡蛇毒因子(cobra-venom factor, CVF)以高親合力結(jié)合B 因子并且CVFBb充當(dāng)穩(wěn)定的C3轉(zhuǎn)變酶，以引起體內(nèi)和體外廣泛的AP補(bǔ)體激活。為評價血 清滅菌蛋白在CVF誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活中的作用，將WT或血清滅菌蛋白+小鼠血清用CVF 處理并且通過蛋白印跡分析來分析C3激活動力學(xué)。可以發(fā)現(xiàn)，在20分鐘內(nèi)CVF (對于5 μ 1 血清，0. 01 μ g)誘導(dǎo)兩種血清類型中全部C3剪切，但血清滅菌蛋白+血清中C3激活動力 學(xué)似乎被略微延緩(圖5A-C)。然而，當(dāng)使用更高劑量的CVF時(對于5μ1血清，0.3yg)， 沒有觀察到WT和血清滅菌蛋白+血清之間的差別。在這種情況下，兩種血清中全部C3剪 切在CVF處理的1分鐘內(nèi)完成。因此，血清滅菌蛋白在CVF-誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活中不起重 要作用。棚列5遍碰舶&肖赫制丨紙#丨謹(jǐn)經(jīng)典途徑和凝集素途徑的激活必然啟動AP途徑。為了確定血清滅菌蛋白在經(jīng)典 途徑引發(fā)的AP補(bǔ)體放大中是否起作用，使用基于板的測定來測量WT和血清滅菌蛋白+血 清中抗0VA/0VA誘導(dǎo)的補(bǔ)體活性。在該實驗中，fB+血清作為AP放大的陰性對照而被融 合。如圖5D所示，觀察到WT和fB+小鼠血清之間補(bǔ)體激活的明顯差別，這證明AP放大實 質(zhì)上有助于經(jīng)由經(jīng)典途徑而啟動的全面補(bǔ)體激活。相反，抗0VA/0VA誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活在血 清滅菌蛋白—ζ—血清中被最低程度地降低(圖5D)。該結(jié)果表明，在血清滅菌蛋白+小鼠中 AP放大環(huán)大部分是完整的或存在經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)變酶活性的補(bǔ)償性上調(diào)。為了區(qū)別這兩種 可能性，使用抗人fB抗體將fB從血清滅菌蛋白+血清中耗盡。可以發(fā)現(xiàn)，fB從血清滅菌 蛋白+血清的耗盡將抗-0VA/0VA-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活降低至相當(dāng)于fB+血清中所觀察到的 水平(圖5D)。該結(jié)果確證，在血清滅菌蛋白+小鼠中AP放大環(huán)大部分是完整的。實施例6 血清滅菌蛋白和AP在體內(nèi)LOS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活中起的作用比在體內(nèi) LPS-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活中更重要缺乏人血清滅菌蛋白的個體易患致命的腦膜炎球菌感染。因為腦膜炎奈瑟氏菌細(xì) 菌在它們的外膜中含有脂寡糖(LOS)而不含LPS，所以對血清滅菌蛋白在腦膜炎奈瑟氏菌 LOS-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活中的作用在體內(nèi)和體外進(jìn)行考察。使用Mg++-EGTA中LOS包被的板測 定，可以發(fā)現(xiàn)，LOS——像LPS 一樣——誘導(dǎo)WT小鼠血清中AP補(bǔ)體激活而不誘導(dǎo)血清滅菌 蛋白1小鼠血清中AP補(bǔ)體激活。而且，通過測量激活的C3的血漿水平，可以發(fā)現(xiàn)L0S注 射在體內(nèi)引起WT小鼠全身的補(bǔ)體激活卻不引起血清滅菌蛋白‘小鼠全身的補(bǔ)體激活(圖 6A)。顯著地觀察到，血清滅菌蛋白+小鼠中體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的全身補(bǔ)體激活被降低但沒有 消除(圖6B)。這些結(jié)果表明LOS主要經(jīng)由AP途徑體內(nèi)激活補(bǔ)體，而LPS通過AP依賴性 和AP非依賴性途徑激活補(bǔ)體。實際上，通過進(jìn)行GVB++緩沖液中LPS-或LOS-包被的板測定以實現(xiàn)所有三種補(bǔ)體激活途徑，可以證明fB或血清滅菌蛋白缺乏引起LOS誘導(dǎo)的補(bǔ)體 激活降低比LPS誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活更加明顯(圖6C，D)。_仿丨丨7 血j青碰舶X仔肖職AP社麻馳、■產(chǎn)生抗人血清滅菌蛋白的單克隆抗體。圖8至圖14中的數(shù)據(jù)證明抗血清滅菌蛋 白mAb選擇性抑制AP補(bǔ)體激活而對經(jīng)典途徑補(bǔ)體的AP放大環(huán)沒有影響。抗體的這些性質(zhì) 使得它們不同于以前公開的抗人血清滅菌蛋白抗體，其抑制AP途徑補(bǔ)體和經(jīng)典途徑補(bǔ)體 ■~ 者 ο在圖8至圖10中，使用三種不同的AP補(bǔ)體測定來證明抗血清滅菌蛋白mAb的抑制 效果。這些測定是LPS誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活(圖8)；酵母聚糖誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活(圖9) 以及兔紅細(xì)胞誘導(dǎo)的AP補(bǔ)體激活(圖10)。在圖11至圖14中，使用三種不同的經(jīng)典途徑 補(bǔ)體激活測定來證明抗血清滅菌蛋白mAb對經(jīng)典途徑AP放大環(huán)的影響缺失。這些測定是 板結(jié)合的OVA/抗OVA免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活(通過板C3沉積測量，圖11)； 在液相中OVA/抗OVA免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活(通過sC5b-9和C3a的釋放來 測量，圖12和13)以及抗體敏化的羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活(圖14)。圖15顯示使用血清滅菌蛋白敲除小鼠證明AP補(bǔ)體和血清滅菌蛋白在腎缺血再 灌注損傷中是至關(guān)重要的。因此，開發(fā)抗血清滅菌蛋白試劑(mAb、小分子抑制劑等)用于缺血再灌注損傷中 的治療。通過參考附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，可以理解的是本發(fā)明不限于所 述精確的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其中進(jìn)行各種變化和修改而不背離所附權(quán)利要 求限定的本發(fā)明的范圍和精神。
權(quán)利要求
治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體、從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟。
2.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病癥是黃斑變性、缺血再灌注損傷、關(guān)節(jié)炎、陣發(fā) 性夜間血紅蛋白尿(PNH)綜合征、非典型溶血尿毒(aHUS)綜合征、哮喘、器官移植膿毒癥或 它們的組合。
3.抑制對象中血清滅菌蛋白依賴性的，微生物抗原、非生物外源表面或改變的自身組 織引發(fā)的AP補(bǔ)體激活的方法，包括給予所述對象替代途徑特異性的抗血清滅菌蛋白抗體、 從而抑制C3bBb蛋白產(chǎn)生的步驟。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AP補(bǔ)體激活由所述模式識別受體對微生物抗原 的識別而產(chǎn)生，所述微生物抗原選自胞壁酰二肽(MDP)、細(xì)菌DNA的CpG基序、肽聚糖、脂 磷壁酸質(zhì)、伯氏包柔氏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白Α、合成的支原體巨 噬細(xì)胞_激活的脂蛋白_2、三棕櫚?；鵢半胱氨?；鵢絲氨?；鵢(賴氨?；?3-賴氨酸 (P3CSK4)、二棕櫚?；?CSK4 (P2-CSK4)、單棕櫚?；?CSK4 (PCSK4)、兩性霉素B、以及三酰 基化的或二?；募?xì)菌多肽、雙鏈病毒RNA、心-肺旁路術(shù)和腎透析中的輸血導(dǎo)管、凋亡 的、壞死的和缺血_應(yīng)激的自身組織和細(xì)胞或它們的組合。
5.權(quán)利要求1和3中任意一項所述的方法，其中所述抗體不影響補(bǔ)體經(jīng)典途徑的AP放 大環(huán)。
6.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物及其子代，其基因組包含血清滅菌蛋白編碼基因的破壞，以便 所述哺乳動物缺乏功能性血清滅菌蛋白或具有降低的功能性血清滅菌蛋白水平。
7.權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其中新霉素盒(NEO)插入在所述血清滅菌 蛋白基因的外顯子5和6之間。
8.權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其中所述NEO導(dǎo)致外顯子5和6之間內(nèi)含 子的破壞。
9.權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠相對于野生型小鼠顯 示降低的AP-補(bǔ)體激活。
10.權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠是可繁殖的并且將 所述轉(zhuǎn)基因傳遞至其后代。
11.從權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物獲得的細(xì)胞、器官、組織或它們的組合。
12.鑒定化合物體內(nèi)生物活性的方法，所述方法包括下列步驟a.提供不能表達(dá)血清滅菌蛋白的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物；b.向所述非人哺乳動物給予所述化合物；c.測定所述非人哺乳動物表現(xiàn)的病癥；以及d.鑒定所述化合物的體內(nèi)生物活性。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物活性是AP-補(bǔ)體激活。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述非人哺乳動物表現(xiàn)的病癥是黃斑變性、缺血再 灌注損傷、關(guān)節(jié)炎、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)綜合征、非典型溶血尿毒(aHUS)綜合征、 膿毒癥、細(xì)菌脂寡糖(LOS)感染或它們的組合。
15.組合物，其包括通過權(quán)利要求14所述的方法鑒定的化合物。
16.治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥的方法，包括向所述對象給予權(quán)利要求15所述組合物的步驟。
17.制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，其包括a.將多核苷酸導(dǎo)入非人哺乳動物的胚胎中，所述多核苷酸包含編碼血清滅菌蛋白編碼 基因的破壞的內(nèi)含子的編碼區(qū)；b.將所述胚胎轉(zhuǎn)移至代孕母體小鼠中；c.使所述胚胎妊娠；以及d.選擇所述代孕母體小鼠生出的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的特征在于當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因哺乳動物比較時，其具有降低 的AP補(bǔ)體激活。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中選擇步驟包括將兩只選擇的轉(zhuǎn)基因小鼠交配；使所 述胚胎妊娠；以及選擇轉(zhuǎn)基因母體生出的轉(zhuǎn)基因小鼠。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中將所述方法重復(fù)一代以上。
20.培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，其包括下列步驟a.提供權(quán)利要求11所述的細(xì)胞；以及b.在允許所述細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用抗血清滅菌蛋白抗體選擇性激活替代途徑(alternative pathway，AP)。特別地，本發(fā)明涉及通過將對象與抗血清滅菌蛋白抗體接觸來治療對象中AP補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥或AP介導(dǎo)的狀況的方法。同樣，本發(fā)明提供血清滅菌蛋白敲除的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物以及它們的用途。
文檔編號A61K39/00GK101932337SQ200880102656
公開日2010年12月29日 申請日期2008年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者W·宋 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會